iagnostic biologique des anticorps dits anticardiolipine:

peut-on envisager une standardisation ?

G. R E B E R , E B O E H L E N e t P. d e M O E R L O O S E *

R~:SUMf:

Malgr~ les ef forts d~ploy~s depuis son apparition, la stan- dardisation du test de dosage des anticorps dits anticar- diolipine n'a pas pu ~tre encore r~alis~e. En consequence, les r~sultats obtenus avec les trousses comrnerciales sont difficilement comparables et les coeff icients de variation importants. Des progr~s r~cents ont permis de mieux caract~riser l'h~t~rog~n~it~ de ces anticorps et de di f f , - rencier leurs cibles antig~niques. L'utilisation d'antig~nes et de composants purifies va permet t re d'am~liorer la situation actuelle.

MOTS-CL/:S

standardisation - anticorps anticardiolipine - antiphos- pholipides - ~zglycoprot~ine I - trousses cornmerciales.

SUMMARY

Standardization o f anticardiolipin antibody tests has not yet been achieved despite several international work- shops. This test is now widespread since many cornmer- cial kits are available, but there is poor agreement bet- ween them. These past years the antigens to which these antibodies are directed have been better characterized. It is likely that the use o f purified antigens and a better deft- nition o f the componen t s o f the assay sys tems will improve the present situation.

KEY-WORDS

standardization - anticardiolipin antibodies - antiphos- pholipids - /3zglycoprote in I - commercial kits.

Introduction

Les tests de dosage des anticorps dits anticardiolipine ont fait l 'objet de plusieurs tentatives de standardisao tion par le biais d'ateliers de travail (8-12). Ces der- nitres ann~es, l'utilisation de ces tests s'est g~n~ralio s~e suite ~ l'arriv~e dans ie commerce d'un grand nombre de trousses. La standardisation s'est averse indispensable apr~s la publication d'~tudes montrant une grande disparit~ des r~sultats obtenus avec diff~- rentes m~thodes de dosage (1, 16, 17). On retrouve d'ailleurs p~riodiquement ces differences dans les

r~sultats des contrSles de qualit~ externes britan- nique (UKNEQUAS) et am~ricain (CAP) (4). I1 faut donc admettre que ces tentatives de standardisation n'ont pas abouti.

* Division d'angiologie et h~rnostase HSpital universitaire de Gen@ve 1211 GENEVE 14 - SUISSE

TIRE.S A PART : M. le Dr G. REBER

article regu le 20 novembre 1996, accept~ le 24 f~vrier 1997.

Revue fran~aise des laboratoires, rnai 1997, N ° 293 57

Pour mieux comprendre les difficult~s rencontr&es, nous ailons aborder successivement le probl~me des cibles antig~niques, du choix de la microplaque, des antig~nes fixes, de l'~limination des liaisons non sp~-, cifiques, du tampon de dilution des ~chantillons, de la, d~termination du seuil de positivit~ et finalement )e probl~me des unit~s de mesure.

I. Cibles antig niques des anticorps dits anticardiolipine

Au cours de ces derni~res cinq ann~es, des connaissances nouvelles ont fait ~voluer le concept de l'antig~ne contre lequel les anticorps anticardiolipine sont dirig~s. Dans les ann~es 1980, on pensait que ces anticorps ~taient dirig~s contre les phospholipides uniquement (cardiolipine ou autres phospholipides) immobilis~s sur une surface solide. En 1990, on a pu montrer que certains de ces anticorps ne se liaient pas ~ la cardiolipine seule mais & des complexes entre prot~ines et phospholipides. La premi&re des prot~ines d~crites a ~t~ la [~2-glycoprot~ine I (5, 15). Puis d'autres com- plexes prot~ine*phospholipides ont ~t~ rapport~s comprenant la prothrombine, la prot~ine C, la prot~ine S o u les kinino- g~nes (6). La notion d'h~t~rog~n~it~ des anticorps antiphospholipides a pu @tre ainsi mieux comprise et il a ~t~ possible de distinguer deux grandes classes d'anticorps : - c e u x ne n~cessitant pas de ]~2-glycoprot~ine I (ou d'autres prot~ines) pour leur liaison ~ la cardiolipine (ou & un autre phospholipide), - ceux d~pendant de la presence de la [~2-glycoprot~ine I (ou d'une autre prot~ine) pour la liaison au phospholipide immo- bilis~ (13). Enfin, il a ~t~ montr~ ~galement que Iorsque la ~2-glycopro- t~ine I e s t fix~e sur du polystyrene enrichi en charges n~ga- tives par irradiation gamma et en absence de phospholipides, elle est reconnue par une population d'anticorps antiphospho- lipides (14). L'existence d'anticorps dirig~s contre la ~2-glycoprot~ine I exclusivement (en absence de phospholipides) a ~t~ rapport~e chez des patients pr~sentant un lupus ~ryth~mateux diss~min~ sans anticorps anticardiolipine associ~s (2) (tableau I). Les anticorps associ~s aux ~tats infectieux sont en g~n~ral ind~pendants de la presence de cofacteurs prot~iques (on peut m@me observer une inhibition de la liaison en presence de J32- glycoprot~ine I humaine) alors que ceux rencontres dans les maladies auto-immunes d~pendent de cette prot~ine. La sen- sibilit~ relative d'une trousse ~ ces diff~rents types d'anticorps va donc d~pendre des composants du syst~me d'analyse. II est d~s Iors ~vident que le type de s~rum analys~ ainsi que les conditions exp~rimentales peuvent favoriser la liaison d'anti- corps diff~rents, rendant tr~s al~atoire la comparaison des r~sultats.

TABLEAU I Principaux antig~nes utilis~s darts les ELISA mesurant les anticorps antiphospholipides

Cardiolipine Phosphatidyls~rine Acide phosphatidique Phosphatidylinositol Phosphatidylcholine Phosphatidylethanolamine M~lange de phospholipides

[~2-glycoprot~ine I Prothrombine Kininog~nes Prot~ine C Prot~ine S

2. La microplaque

Le mat~riau de la microplaque va jouer un r6le tr~s important car il va d~terminer la densit~ et le type de mol~cules adsor- b~es. Les propri~t~s d'adsorption des diff~rents plastiques sont variables. Le polystyrene irradi~ va favoriser la fixation de ]~2- glycoprot~ine I et ce type de microplaque va privil~gier la liai- son d'anticorps d~pendant de la ~2-glycoprot~ine I. L'effet des charges n~gatives introduites par irradiation gamma & la sur- face du polystyrene n'est pas totalement ~lucid~. II est possible que la conformation de la ~2-glycoprot~ine I ainsi fix~e soit semblable & celle qu'elle adopte apr~s liaison aux phospholi- pides. Une autre explication serait que la densit~ de ]~2-glyco- prot~ine I fix~e est plus grande, ce qui favoriserait la liaison d'anticorps ~ faible affinit~ par des liaisons bivalentes.

3. L'antig ne

Jusqu'& r~cemment la majorit~ des trousses commerciales uti- lisait la cardiolipine comme unique antigone. Certaines firmes ont d~velopp~ des trousses avec des m~langes de phospholi- pides afin d'~largir le spectre des sp~cificit~s. II sera d~s Iors plus difficile de comparer les r~sultats obtenus avec ces trousses & ceux obtenus avec les trousses utilisant seulement de la cardiolipine. Des trousses utilisant de la ]32-glycoprot~ine I fix~e sur des microplaques irradi~es viennent d'appara~tre sur le march~.

4. Elimination des liaisons non sp cifiques

Apr~s fixation de l'antig~ne, les liaisons non sp~cifiques sont habituellement ~limin~es par traitement avec des solutions prot~iques d'origine animale (albumine bovine, s~rum de bceuf, de veau, de ch~vre, etc.) ou des solutions de g~latine. Cette ~tape a une importance cruciale car elle peut modifier la nature de l'antig~ne. Contrairement & ]a g~latine ou & l'albumine bovine, l'utilisa- tion de s~rum animal va favoriser la fixation de prot~ines pou- vant se lier aux phospholipides et cr ier ainsi des antig~nes constitu~s de complexes prot~ine*phospholipide, par exemple [~2-glycoprot~ine l.phospholipide. D~s Iors, ce type de trousse va ~tre sensible aux anticorps anticardiolipine, mais aussi aux complexes de ce phospholi- pide avec diverses prot~ines. L'utilisation de g~latine ou d'albumine bovine favorisera au contraire la liaison d'anti- corps dirig~s contre la cardiolipine seule.

5. Tampon de dilution des chantillons

Dans certaines trousses, les prot~ines pouvant se lier & la car- diolipine fix~e sont fournies par le tampon de dilution des 6chantillons, souvent constitu~ de s~rum animal dilu~ (3). Dans d'autres, il peut contenir de la g~latine ou de l'albumine bovine. II est & noter que, avec la dilution de l'~chantillon au 1 /100 souvent utilis~e dans les tests, l 'apport de ~2-glycoprot~ine I encore pr~sente dans l'~chantillon dilu~ n'est pas n~gligeable (de l'ordre de 2 lJg/mL) et permet la creation de complexes prot~ine.phospholipide, bien que probablement avec une densit~ plus faible.

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II faut encore souligner qu'il peut y avoir des differences de r~activit~ entre la ~2-glycoprot~ine I d'origine animale et celle d'origine humaine. Ces points constituent donc des sources de variabilit~ suppl~mentaires.

6. D terrnination du seuil de positivit

/

Le seuil de positivit~ est d~termin~ en testant un collectif de personnes normales. La distribution n'est en g~n~ral pas gaus- sienne et la m~thode de calcul pour l 'obtention du seuil peut varier consid~rablement d'un syst~me & l'autre : moyenne plus deux, trois ou m~me quatre d~viations standard, multiples de la m~diane ou encore utilisation des percentiles. La m~thode de d~termination de ce seuil induit une variabilit~ suppl~mentaire car certains fabricants pr~f~rent privil~gier la sensibilitY, d'autres la specificitY.

7. Unit s de mesure

L'une des principales sources de confusion provient de l 'adop- tion g~n~ralis~e de standards communs, appel~s standards de Louisville University ou plus commun~ment standards de Harris (8, 12). Destines ~ l'origine & harmoniser et & standar- diser les diff~rents tests, ils ont en fait contribu~ & retarder ce processus et ~ freiner d'autres approches peut-~tre plus pro- metteuses. Exprim~s en unit~s GPL pour l'isotype G e t unit~s MPL pour l'isotype M, ils ont ~t~ largement utilis~s pour ~ta- ionner les trousses commerciales et les tests Iocaux. Les lots successifs de ces standards ont vari~ consid~rable- ment et ]e m~lange des anticorps qui les composaient ~gale- ment. Ainsi, en fonction du lot de standards et des compo- sants utilis~s par les fabricants des trousses, les seuils de positivit~ varient de 5 & 23 GPL et de 5 ~ 20 MPL selon la trousse choisie. Pour un lot donn~ de standards, la pente de la r~gression lin~aire entre les valeurs assignees ~ chaque stan- dard et les valeurs correspondantes mesur~es avec les calibra- teurs des trousses peut varier de 0 .159 ~ 0.931 suivant la trousse utilis~e (17). Ces differences impliquent ~galement que les crit~res de clas- sement entre positifs faibles, moderns et forts sont tr~s al~a- toires, 25 GPL pouvant signifier un positif fort avec une trousse et un r~sultat juste au-dessus du seuil avec une autre. Cette situation est d'autant plus regrettable qu'il existe une certaine relation entre le taux d'anticorps et les manifestations cliniques (7). II est donc important de garder ~ l'esprit que l 'expression des r~sultats en unit~s GPL et MPL ne signifie en aucun cas qu'une standardisation a ~t~ r~alis~e.

pouvoir disposer de trousses permettant de doser s~par~ment ces diff~rentes populations d'anticorps. Dans ces tests, l'utilisation de composants purifies (~2-glyco- prot~ine I humaine ou animale, g~latine, albumine) & la place de s~rums para~t indispensable afin de mieux contr61er la nature de l'antig~ne immobilis~ et sa densitY. Un ~l~ment plus difficile & r~soudre r~side dans l'~tablissement de crit~res permettant des comparaisons quantitatives entre les trousses. L'~chec des standards utilis~s jusqu'& present ne doit pas d~courager le d~veloppement de nouveaux materiels de r~f~rence et de nouvelles m~thodes d'expression des r~sul- tats. Mais il faut garder & l'esprit qu'il est illusoire de vouloir imiter la diversit~ rencontr~e dans les plasmas des patients.

9. Considerations pratiques

Compte tenu des divers probl~mes rencontres dans ces tests, il convient de prendre quelques precautions dans la pratique courante. II est souhaitable de v~rifier un r~sultat faiblement positif ou & la limite sup~rieure de la norme dans une s~rie ult~rieure. De plus, toute valeur positive devrait ~tre contr61~e

distance de la premiere sur un deuxi~me pr~l~vement. II est ~galement recommand~ d'inclure dans chaque s6rie un contr61e positif et un contr61e n~gatif, prepares par le labora- toire et stock,s en aliquots ~ - 20 °C (ou mieux ~ - 80 °C si cela est possible) de fagon & d~pister les ~ventuelles variations entre lots de r~actifs. Le contr61e positif peut ~tre ais~ment pr~par~ en m~langeant les reliquats d'~chantillons trouv~s positifs. En g~n~ral, l 'isotype G est le mieux corr~l~ & la s~v~rit~ des manifestations cliniques. II faut ~galement tenir compte du degr~ de positivit~ : des taux ~lev~s persistants sont associ~s un risque plus ~lev~ de complications cliniques. II peut ~tre souhaitable de completer le bilan biologique par une d~termi- nation du taux d'anticorps antiO2-glycoprot~ine I, qui sem- blent ~tre plus sp~cifiques de la maladie auto-immune et de la survenue d'~v~nements thromboemboliques. Avant de porter son choix sur une trousse, il est judicieux d 'en comparer plusieurs & l'aide d'un panel d'~chantillons compor- tant non seulement des cas fortement positifs (qui le seront probablement avec toutes les trousses) mais ~galement des cas faiblement positifs et borderline. Id~alement chaque labora- toire devrait d~terminer l'intervalle de r~f~rence. Cependant, l'acc~s & un nombre suffisant de donneurs sains n 'est souvent pas possible. Au vu de ces nombreuses difficult~s, il semble raisonnable que ce type de dosage ne soit effectu~ que dans des laboratoires specialists.

Conclusions

8. Limites de la standardisation

L'h~t~rog~n~it~ des anticorps rencontres chez les patients rend la standardisation tr~s difficile. De plus, chez un m~me patient, plusieurs types d'anticorps (ayant des cibles antig~- niques diff~rentes) peuvent coexister. Les connaissances actuelles indiquent qu'il est n~cessaire de pouvoir diff~rencier les anticorps d~pendant d'un cofacteur (dirig~s contre des complexes prot~ine*phospholipide) de ceux qui en sont ind~pendants (dirig~s contre les phospholipides seuls), ainsi que les anticorps dirig~s contre des prot~ines en absence de tout phospholipide. II est d~s Iors souhaitable de

Les premieres tentatives de standardisation se sont sold~es par des ~checs parce que beaucoup d'~l~o ments importants manquaient ~ notre connaissance et parce qu'on a voulu r~duire la diversit~ biologique de ces anticorps ~ un set de standards. Un des ~i~ments de r~ponse ~ ces probl~mes passe vraisemblablement par l'utUisation de trousses plus sp~cifiques pour les diff~rents types d'anticorps mesurer et par l 'emploi de composants purifi~s dans ies ~tapes de fabrication. Comme darts d'autres domaines de l'autooimmunit~, une standardisation complete des tests rel ive de l'utopie ; cependant il est permis d'esp~rer une meilleure comparabilit~ des trousses que celle obser- v~e jusqu'~ aujourd'hui.

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