M ~ d e c i n e e t M a l a d i e s I n f e c t i e u s e s . 1974 . 4 - 12 - 639 & 641

Diaonoslic s rolooique des brucelloses en microm thode par G. RYKNER**

Les di[[icult~s rencontr~es duns le diagnoslic direct des brucelloses, mdme au cours des [ormes 6volutives, conduisent it la recherche sgstdmatiqu,e des

�9 anticorps spdci[iques. La r~action d'agglutination en tubes est la plus habituelle- ment pratiquke ; lu rdaction de f ixation du compldment est es'sentiellement adaptde au diagnostic des brucelloses en mkdecine udt~rinaire- oh les sdrums d 'animaux vctccinds posskdent des agglutinines mc~is pas d'anticorps f ixant le comptdme~t.

Nou,s avons cherch~ it r~aliser un diagnostic s~rologiqu~e rapide en micro- mdthode pour let recherche des aggIutinines, ce qui nous a conduit ?t utiliser des antig~nes color~s par le t~trazolium, comme cela a ~td proposr pour certains antig~nes scdmonelliens (7) . Para'lI~lement, ant ~t~ e[[eeta~es avec les m~mes sdrums des r~actions de [ixation du compl~ment en microm~thode.

MATERIEL ET MI~THODES S 6 r u m s :

44 s~rums r e c u e i l l i s d e p u i s 5 ans chez des rou- l ades Suspects de Bruce l lo se aigu~, au C.H.U. de Bic6tre , on t 6t6 6tudi6s. 21 ava i en t ~t6 pos i t i f s h des t aux ~gaux ou s u p 6 r i e u r s au 1/40 ~ en s~ro-agglu- t i n a t i o n de W r i g h t ( S . A . W ) . .

P o u r les r 6 a c t i o n s d ' agg lu t i na t i on , un s6rum t~- m o i n pos i t i f a 6t~ ut i l i s4 : s~rum E l a b t i t r a n t 1 0 0 0 U I / m l du C e n t r e de R e c h e r c h e sur la F i b v r e O n d u l a n t e de Mon tpe l l i e r . P o u r la r6ac t ion de f ixa- t ion du c o m p l ~ m e n t (FC') , nous avons ut i l is6 le s~ rum t~moin c o m m e r c i u l i s 6 p a r M~rieux (Lot 01208).

A n t i g ~ n e s :

1. S.A.W. : l ' an t i g~ne c o m m e r c i a l i s ~ p a r l ' Ins t i - tut P a s t e u r de P a r i s a 6t6 ut i l is6 (lot 04.6324.1).

2. a g g l u t i n a t i o n en m i c r o m ~ t h o d e :

souche : l ' an t i g6ne a 6t6 p r~pa r6 ~ p a r t i r de la s o u e h e Brucella suis $6 du C.R.F.O. ;

preparation de la suspension antig~niqu!e : 1 li- t re d e b o u i l l o n t r y p t i c a s e - s o j a es t e n s e m e n c ~ a v e c des co lon i e s S e t po r t~ 48 h. h l '~ tuve h 37 ~ 10 ml de 2 -3 -5 - t r iph~ny l - t6 t r azo l ium h 1 % , s t~r i l is6 sur f i l t re m i l l i p o r e h 0,22 ~,, son t ajout~s. Le b o u i l l o n est a lors por t~ de n o u v e a u 24 h. /a 37 ~ . La s u s p e n s i o n est for- mol6e /t 4 %, chauff~e 30 m n ~ 60 ~ et c en t r i - fug6e. 750 ml du s u r n a g e a n t sont re je t~s e t ]a s u s p e n s i o n est ajust6e an p h o t o m ~ t r e de m a n i b r e h o b t e n i r Do = 0,60.

L ' a n t i g b n e se c o n s e r v e p lu s i eu r s moi s ~ + 4".

3. F i x a t i o n du c o m p l 6 m e n t : l ' an t i g~ne c o m m e r - c ia l i s6 p a r M6r ieux (lot n ~ 01405) a 6t6 d i lu~ ~ 3 % .

RI~ALISATION DES TESTS EN MICROMI~THODE

1) M i c r o - u g g l u t i n a t i o n : :

1 gout te de 0,025 ml d ' u n e so lu t i on de 0,015 MNaC] est d6pos6e h la p ipe t t e ca l ib r6e d a n s c h a q u e c u p u l e d ' u n e m i c r o - p l a q u e ' h u n seul usage. Les cupu le s en V p e r m e t t e n t d ' o b t e n i r des s ~ d i m e n t a t i o n s tr~s vi- s ibles . P a r cont re , il est assez d i f f i c i l e de r e m e t t r e les g e r m e s en s u s p e n s i o n l o r s q u e l ' on d6s i re effec- tuer le b loking- tcs t .

Une gout te de c h u c u n des s6 rums h ~ tud ie r d i l u t e au 1 / 1 0 est d6pos6e duns la p r e m i e r e cupu le de cha- que rang6e ; un t~moin p o s i t i f est r~alis6 avec le s6 rum Elab . Les d i l u t i o n s son t ef fectu6es au m i c r o - d i lu teur . Une gout te d ' a n t i g ~ n e est ajout~e. Les p l aques son t agit~es t ro i s m inu t e s , r e c o u v e r t e s d ' u n e p l a q u e de p a p i e r adh~s i f t r a n s p a r e n t et la iss6es 24 h e u r e s h t e m p 6 r a t u r e du l a b o r a t o i r e . La l e c tu r e est e f fec lu6e le l e n d e m a i n (fig. 1). Les r~sul ta ts sont

F1GURE 1

* Manuscrit requ le 31 ju i l l e t 1974. ** Laboratoire central de Baetdriologie, H6pital de Bi-

cdtre, Facultd Paris-Sud, 78, avenue du G6n6ral-Leclerc, 94 - Kremlin-Bic~fre.

Aspect d'une plaque en microagglutinat ion. Les s~ruins ti trent respectivement : A : 998 U I , B : 3994 UI, C : < 31 UI, D : -< 31 UI, E : 998 UI, F : 31 UI.

G est le t6moin positif, H l e t6moin n~gafif.

6 3 9

expr im6s en unit6s in te rna t iona les (U.I.). Bloking- test : il est effectu@ sur l e s s6rums n@gatifs afin de mettre en 6vidence d '6ventnels ant icorps bloquants. Le s6rum posi t i f est utilis6 h une concent ra t ion 10 fois plus 61ev6e que son t i t re limite.

2) Fixat ion du e o m p l 4 m e n t :

Les s6rums sont utilis4s sans di lut ion pr6alable. Puis des di lut ions sont effectu4es comme pr6c6dem- ment au micro-di lu teur . Le di luant est un tampon v6ronal pH 7,2. Une goutte d'antig@ne et une goutte de compl6ment pr@alablement titr6 sont ajout@es. Les t6moins habi tuels sont r6alis@s. La plaque recon- ver te d'adh@sif t r ansparen t est laiss~e une nuit h + 4 ~ puis 10 mn ~ 37 ~ . 0,050 ml de systbme h@moly- tique est ajout& La plaque est por t@ 30 mn 5 37 ~ puis centr i fugde 5 mn h 1 500 tours / ran. La lec ture est effectu6e imm~dia tement et les r6sultats sont not6s de 0 h + + .

TABLEAU I

R~sultas obtenus avec les s~rums positif~ dans les diff4reutes mdthodes.

SERUMS SAW

5 250

125

7 ~ 31

9 50o

lo 250

11 3998

12 3998

13 lOOO

1~ 1999

~5 1999

16 1000

17 1999

~8 < 31

19 < 31

20 50o

21 51

22 31

23 3 i

2~ 500

25 500

26 < 31

27 31

28 31

29 62

Agg F C '

5oo i / ~ ~25 r 3~ 1/32

500 ~/2 250 ~/8

399~ 1/256

399~ 1/256

1997 1/64

399~ 1/128

998 1/16

998 1/8

399~ 1/64

< 31 1/32

998 1/16

3~ ~/~

250 1/64

500 ~/~6

< 37 ~/32

3~ C/2 3~ (1/2 31 (1/2

Rs

Les r6sultats obtenns avec les s6rums posi t i fs sont consign~s dans le tableau I. Des cotirbes de correla- t ion ont 6t6 t rac@s en comparant , d 'une par t micro- agglut inat ion et s6ro-agglutination de Wr igh t (fig. 2), d 'au t re par t microagglu t ina t ion et f ixat ion du com-

p l 6 m e n t (fig. 3).

Les 23 s6rums n6gatifs en agglut inat ion ont montr6 de m6me des taux inf@rieurs an 1/40" en micro- agglutinat ion.

FIGURE 2

Comparaison des r4sultats obieuus en y. agg. et SAW, exprimds en U.I.

3 9 9 4 '

1997

9 9 8

5 0 0

2 5 0

o :=L

1 2 5

6 2

B I

+;t' I I I

51 6 2 125

�9 m

I I ~ l

2 5 0 5 0 0 I 0 0 0

SAW(U.I.)

l$ ee

I I

1999 3 9 9 8 IL

FIGURE 3

Comparaison des r~sultats obtenus en t~ agg. exprimds ell U.L et en fixation du compldmcnt exprim4s par

l'inverse des dilutions.

3 9 9 4

1997

9 9 8

5 0 0

2 5 0

o 2 5

6 Z

. / . (

t �9 �9

�9 IO

[ I I [ I I I

4 8 16 3 2 6 4 1 2 8 2 5 6

FC' ( inverse destoux dedilution)

640

Le bloking-test n'a pus r6v616 la presence d 'ant i - corps bloquants. Quatre des s6rums n6gatifs en agglut inat ion ont 6t6 posi t i fs en fixation du com- pl6ment.

DISCUSSION La compara i son entre S.A.W. et agglut inat ion en

micro-m6thode montre une bonne cor re la t ion entre les taux obtenus. Lorsque les rdsultats sont expr imds en taux de dilut ion, il existe un biais de 1 log~ pour cette derni~re technique.

Le s6rnm 6talon t i tre de m~me 1/640 en S.A.W. et 1/1280 en microagglut ina t ion . Ce biais d i spara i t lorsque les r6sultats sont co r rec tement exprim6s en U.I.

La mic rom6thode a ponr elle sa tr~s grande rapi- dit6 d 'ex6cut ion et, du fait qu 'el le uti l ise des anti- gbnes color6s, sa facil i t6 de lecture. Cependant , elle a l ' inconv6nient , comnle la S.A.W., d '6tre mise en d6faut pa r l ' exis tence d ' an t i co rps bloquanls . Cette difficult~ peut cependanl ~tre ais~ment r~so- lue p a r le bloking-test.

I1 n 'exis te pus, par contre, de ccrr61ation en micro- t echn ique entre agglut inat ion et f ixation du compl6- ment, colnme le montre la d ispers ion des po in t s sur la courbe (fig. 3). En effet, les ti tres en agglutinin.es

et sensibi l isa t r ices d 'un s~.rum sont ind6pendants (5). La technique de fixation du compldment est surtout int~ressante en m6decine v6t6r inaire off la vacci- nat ion fail appara i t re des a n t i c o r p s agglutinants, mats pas d ' an t icorps fixant le compl6inent (2). Chez l 'homme, Anderson et coll. (1) ont trouv~ une cor- respondance entre ant icorps fixant le compl6ment et agglut inines r~sistantes au mercapto-6thanol ; Herernans et coll. (4) ont montr6 que ]es IgG fixent for tement le compl6ment , les IgM ruod6r~ment ; les IgA ne le fixent pas. Ceci recoupe le fai t que les s6rulns posit ifs un iquement en FC' s 'observent es- sent ie l lement lors des brucel loses chroniques ou 6voluant depuis plusieurs ann~es de fa~on latente.

De tels r6sultats sont rappor t6s par Galtier et coll. (3).

Quelles que soi ent les m6thodes ulilis6es, les mic ro techn iques devra ien t supplanter les mdthodes classiques. L 'agglui inat ion en mic rop laque avec anti- g6nes co lor , s suivie 6veniuel lement du bloking-test peut ~tre effectu~e en pra t ique courante. Rapide, elle d~piste les agglut inines prSsentes lors des bru- celloses aigu~s. La fixation du compldment , bien que non standardis~e sur le plan internat ional , peut 8tre indiqu6e lorsque la s~roagglut inat ion semble faussement n~gative, au t ou r s d 'affect ions 6voluant depuis longtemps.

RESUME Une technique de diagnost ic s~rologique des brucel loses en mic rom~thode par agglut inat ion d 'ant igSnes color6s est p roposer . Les r~sultats compares aver ceux obtenus par le s~rodiagnost ic classique de Wright mont ren t une bonne corre la t ion. Par contre, l '~tude de ces s~rums en fixation du compl~ment , en microm~thode , confi rme l ' i nddpendance des t i tres d 'agglut in ines et de sensibil i- satrices.

M o t s - e l e f :

Agglut inat ion (test d') - F ixa t ion du compl~ment (test de) - Brucel lose (dia- gnost ic) - Techniques .

SUMMARY A micromethod for serologic diagnosis of brucellosis by agglutination of colored antigens is submitted. The results compared with those obtained by the Wright classical .serodiagnosis show a good correlation. On the contrary, the study of these serums in complement fixation test by micromethod con[irms the independance of agglutinating and complement f ixing antibodies.

Key-words :

Agglutinatlon test - Complement fixation test - Brucellosis diagnostic Methods.

B I B L I O G R A P H I E

1. ANDERSON R.K., JENNESS R., BRUMI?IELD H.P., GOUGH P. - - Brucella agglutinating antibodies. Re- lation of mercaptoethanol stability to complement fixation. Science, 1964, 143, 1344-1335.

2. Corn it6 Mixte FAO-OMS d'experts de la brucellose. O.M.S. Rapport technique, n ~ 464, 1970.

3. GALTIER M., PUEL J., JUAN R., SUC C., MOATTI N. et LARENG M.B. - - Diagnostic s4rologique de la bru- cellose humaine. Reo. C.H.U., 1970, 12, 43-46~

4. HEREMANS J.F., VAERMAN J.P. et VAERMAN C. - - Studies of the immune glebulins of human serum. II : A study of the distribution of antibrucella and

andidiphteria antibody activity atnong y ss-, y 1M- and ~/ 1A globulin fractions. J. lmmunol., 1963, 91, 11-17.

5. PILET C., TOMA B., BONNEAU M. - - Sur le choix d'une technique de fixation du compldment adaptde au diagnostic de la brucellose. Ann. Inst. Pasteur, 1967, 113, 947-950.

6. VERON M. - - Brucellose humaiue, in (< Techniques en Bact6riologie >). Flammarion 6dit., Paris, 1972, pp. 37-48.

7. WILLIAMS J.E. et WHITTEMORE A.D. - - Serological diagnosis of Pullorum Disease with the microaggluti- nation system. Appl Microbiol., 1971, 21, 394-399.

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