diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics

2012 • Volume 48 • Number 2 • 199-203

Praca poglądowa • Review Article

199

Diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych

Diagnostics of autoimmune diseases of liver and bile ducts

Marcin Komorowski, Joanna Cielecka-Kuszyk, Kazimierz Madaliński

Pracownia Immunopatologii Zakażeń Hepatotropowych Zakładu Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - Państwowego Zakładu Higieny, Warszawa

StreszczenieSchorzenia autoimmunizacyjne stanowią grupę chorób, u podłoża których leży proces nazywany autoimmunizacją. Polega on na wytwarzaniu przez układ odpornościowy - limfocytów T, limfocytów B i/lub przeciwciał (tzw. autoprzeciwciał) skierowanych przeciw własnym antygenom organizmu.Autoprzeciwciała wykrywane i różnicujące choroby autoimmunizacyjne wątroby i dróg żółciowych są następujące: ANA, ASMA (anty-SMA), anty-LKM, AMA, anty-SLA/LP, LC-1 oraz ANCA (pANCA, cANCA). Do chorób typu autoimmunizacyjnych zali-czamy: autoimmunizacyjne zapalenie wątroby typu I, II i III (AIH I, II, III), pierwotną żółciową marskość wątroby (PBC) oraz pierwotne stwardniejące zapalenie dróg żółciowych (PSC).Podstawową metodą diagnostyki chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych jest immunofluorescencja pośrednia (IIF). Komercyjnymi testami, powszechnie stosowanymi, są gotowe zestawy produkowane m.in. przez firmę EUROIMMUN. W Zakładzie Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego-PZH stosuje się własną metodę diagnostyczną, którą opisano w tekście. W artykule przedstawiono szczegółową specyfikację wymienionych testów.Inną metodą, stosowaną w diagnostyce chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych, jest immunoblotting.

SummaryAutoimmune diseases belong to the group of chronic disorders characterized by the process called autoimmunisation. The reaction of the immune system consists of the production of T and B lymphocytes and the release of autoantibodies directed against the own antigens of the patient. The following autoantibodies are characteristic for the autoimmune diseases of the liver and extrahepatic bile ducts: ANA, ASMA (anti-SMA), anti-LKM, AMA, anty-SLA/LP, LC-1 and ANCA (pANCA, cANCA). By use of these autoantibodies, the dif-ferential diagnosis of autoimmune hepatitis type I, II, III (AIH I, II, III), primary biliary cirrhosis (PBC) and primary sclerosing cholangitis (PSC) can be made.The main diagnostic method for the autoimmune diseases of the liver and extrahepatic bile duct is the indirect immunofluo-rescence test (IIF). Common commercial methods are ready to use tests produced by EUROIMMUN (Germany). At the De-partment of Virology, National Institute of Public Health, we have developed our own diagnostic test for IIF. In this article we compare the results of both tests. Another diagnostic method for the autoimmune diseases of the liver and extrahepatic bile ducts is immunoblotting.

Słowa kluczowe: autoprzeciwciała, autoimmunizacyjne zapalenie wątroby, choroby autoimmunizacyjne wątroby i dróg żół-ciowych, immunofluorescencja pośrednia, pierwotne stwardniejące zapalenie dróg żółciowych (PSC), pier-wotna żółciowa marskość wątroby (PBC)

Key words: autoantibodies, autoimmune hepatitis, autoimmune diseases of the liver and extrahepatic bile ducts, indirect immunofluorescence test (IIF), primary sclerosing cholangitis (PSC), primary biliary cirrhosis (PBC)

Podziękowanie. Praca częściowo finansowana z grantu badawczego NN 405 132539 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego.

Diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych

200

WstępSchorzenia autoimmunizacyjne stanowią grupę chorób, u podłoża których leży proces nazywany autoimmunizacją. Polega on na wytwarzaniu przez układ odpornościowy, lim-focytów T, B i/lub przeciwciał (tzw. autoprzeciwciał) skiero-wanych przeciw własnym antygenom organizmu.Poniżej przedstawiono autoprzeciwciała wykrywane w cho-robach autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych:

ANA1. - przeciwciała przeciwjądrowe, w tym anty-Sp100 - przeciwciała przeciw białkom wewnątrzjądrowym oraz anty-gp210 - przeciwciała przeciw białkom tzw. obręczy jądrowej,ASMA (anty-SMA)2. - przeciwciała przeciw mięśniom gładkim, anty-LKM3. - przeciwciała przeciw mikrosomom wątroby i nerki,AMA (MIT)4. - przeciwciała przeciwmitochon drialne, typ AMA-M2,anty-SLA/LP5. - przeciwciała przeciw rozpuszczalnym an-tygenom komórek wątroby i trzustki,LC-16. - przeciwciała przeciwcytozolowe,ANCA (pANCA, cANCA)7. - przeciwciała przeciw cytopla-zmie granulocytów (okołojądrowe i cytoplazmatyczne).

Autoprzeciwciała te są podstawą różnicowania chorób auto-immunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych na następujące typy:

Autoimmunizacyjne zapalenie wątroby (AIH)1. : charak-teryzuje się przewlekłym procesem zapalnym o nieznanej etiologii, obecnością w surowicy autoprzeciwciał skiero-wanych przeciwko różnym antygenom struktur tkanko-wych, podwyższonym poziomem immunoglobulin [1]. Wyróżniamy trzy typy choroby:AIH typu I– , dla którego charakterystyczne jest występo-wanie przeciwciał ANA i/lub ASMA. Przeciwciała ASMA skierowane są głównie przeciwko F-aktynie [1].AIH typu II– , w przypadku którego występują przeciwcia-ła anty-LKM. Wyróżniamy trzy rodzaje przeciwciał anty-LKM: LKM1, LKM2, LKM3. Dla AIH typu II typowe są przeciwciała anty-LKM1 (ich obecność można również wykazać w przypadku zakażenia wirusem zapalenia wą-troby typu C). Często też wykrywa się obecność przeciw-ciał anty-SLA/LP, LC-1 [2, 3].AIH typu III– , o przebiegu klinicznym podobnym do AIH typu I oraz charakteryzujące się obecnością przeciwciał anty-SLA/LP [2, 3].

Pierwotna żółciowa marskość wątroby (primary bilia-2. ry cirrhosis, PBC): jest to choroba przewlekła charaktery-zująca się niszczeniem drobnych wewnątrzwątrobowych przewodzików żółciowych i towarzyszącą cholestazą. Choroba ta może prowadzić do przewlekłej niewydol-ności wątroby i marskości. Dla rozpoznania PBC wyko-rzystywana jest ocena histopatologiczna biopsji wątroby oraz obecność przeciwciał przeciwmitochondrialnych (AMA). W przypadku PBC przeciwciała AMA są swoiste względem podjednostki E2 kompleksu dehydrogenazy

pirogronianowej M2 (przeciwciała AMA M2) [1]. Obiecu-jącymi markerami PBC są również przeciwciała ANA, któ-rych docelowymi antygenami są białka wewnątrzjądrowe (intra-nuclear protein, anti-Sp100) oraz białka obręczy jądrowej (nuclear rim pore protein, anti-gp210) [4].Pierwotne stwardniejące zapalenie dróg żółciowych 3. (primary sclerosing cholangitis, PSC): jest to choroba przewlekła charakteryzująca się uszkodzeniem nabłonka dróg żółciowych z następową reakcją zapalną i włóknie-niem okołoprzewodowym. W przebiegu tej choroby mogą występować przeciwciała ANA i ASMA. Cechą charakte-rystyczną jest także występowanie przeciwciał pANCA, których antygenem docelowym jest łańcuch 5 beta-tubu-liny (TBB5) [4].

Immunofluorescencja pośrednia (IIF) - podstawowa me-toda diagnostyczna chorób autoimmunizacyjnych wą-troby i dróg żółciowych

1. Zasada metodyImmunofluorescencja pośrednia polega na inkubacji skraw-ków mrożonych odpowiednich tkanek lub rozmazów hodowli komórkowych (stanowiących docelowy antygen) z surowicą pacjentów. W przypadku dodatniej reakcji autoprzeciwciała odpowiedniej klasy (IgA, IgG lub IgM) wiążą się z antyge-nem. Następnie, powstały kompleks antygen-przeciwciało uwidacznia się za pomocą przeciwciał anty-ludzkich zna-kowanych fluoresceiną i ocenia się charakterystyczny wzór świecenia przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego.

2. Rodzaje stosowanych testów2.1. Test komercyjnyZestawy gotowych testów, produkowane m.in. przez firmę EUROIMMUN, które oparte są na technologii BIOCHIP. Technologia ta polega na opłaszczeniu szkiełek nakrywko-wych komórkami, wycinkami tkanek i innymi substancjami biologicznymi, które są następnie cięte na milimetrowej wiel-kości fragmenty (BIOCHIP’y). Te z kolei są przyklejane przez komputerowo sterowane automaty do szkiełek podstawo-wych. Dzięki temu, jest możliwość umieszczenia na jednym polu reakcyjnym obok siebie kilku BIOCHIP’ów pokrytych różnymi substratami i ich jednoczesną inkubację z tą samą próbką surowicy (mozaika BIOCHIP®) [5].W przypadku diagnostyki chorób autoimmunizacyjnych wą-troby i dróg żółciowych stosuje się następujące zestawy:

panel wątrobowy: test LIVER MOSAIC 8 (EUROIM-–MUN); Mozaika BIOCHIP składająca się z 6 substratów - ludzkich komórek nabłonkowych (HEp-2), wątroby mał-py, nerki szczura, wątroby szczura, żołądka szczura oraz komórek linii VSM47 anty-aktyna) [5].panel do wykrywania przeciwciał anty-LKM: test LI-–VER MOSAIC 1 (nerka szczura/żołądek szczu-ra) (EUROIMMUN); Mozaika BIOCHIP składa się z 2 substratów: nerka oraz wątroba szczura [5]panel do wykrywania przeciwciał przeciwko granulocy-–

201

tom (cANCA, pANCA): test Granulocyte Mosaic 3 (EU-ROIMMUN); jest to mozaika BIOCHIP zawierająca gra-nulocyty utrwalone etanolem i formaldehydem, wątrobę małpy i komórki HEp-2 [5].

2.1.1 Potrzebny materiał biologicznySurowica pacjenta (100μl), którą należy przechowywać w 2-8°C do 14 dni lub w -20°C do 6 mies.2.1.2 Aparatura

mikroskop fluorescencyjny,–płytki reakcyjne, przeznaczone do nanoszenia reagen-–tów (dostarczane przez producenta),zestaw pipet automatycznych regulowanych,–szklany kominek bądź kuweta do płukania.–

2.1.3 Wymagane odczynniki10 płytek mikroskopowych, każda z 5 polami (na każdym –polu umieszczone są BIOCHIPy ze skrawkami mrożony-mi odpowiednich tkanek lub rozmazami hodowli komór-kowych),1,5 ml znakowanej fluoresceiną anty-ludzkiej IgG lub IgM –lub IgA, gotowej do użycia,0,1 ml pozytywnej surowicy kontrolnej; gotowej do uży-–cia,0,1 ml pozytywnej surowicy; gotowej do użycia,–0,1 ml negatywnej surowicy kontrolnej (negatywna wo-–bec przeciwciał); gotowej do użycia, 2 opakowania soli do przygotowania buforu fosforano-–wego pH 7,2; każde należy rozpuścić w 1 litrze wody destylowanej, 2 x 2,0 ml Tween 20 (zmieszać z buforem fosforanowym: –2 ml na 1 litr), 3,0 ml środka pokrywającego (gliceryna z buforem fosfo-–ranowym pH 8,4), 12 szkiełek nakrywkowych (62 mm x 23 mm) [5].–

2.1.4 Opis postępowania analitycznegopróbki surowicy pacjenta należy rozcieńczyć buforem –fosforanowym (PBS-Tween), zgodnie z protokołem,surowice kontrolne (pozytywne i negatywne) należy za-–mieszać pipetą przed użyciem,25 µl rozcieńczonej surowicy pacjenta i surowic kontrol-–nych należy nanieść na każde pole reakcyjne płytki reak-cyjnej (unikać pęcherzyków powietrza),płytki BIOCHIP umieścić w wycięciach płytek reakcyj-–nych,inkubować 30 min. w temperaturze pokojowej,–po inkubacji płytki BIOCHIP należy spłukiwać strumie-–niem buforu fosforanowego i natychmiast wkładać je do kuwety z buforem (PBS-Tween) na 1 min.,po umyciu płytki reakcyjnej, nanieść na jej pola reakcyjne –20 µl (uprzednio rozcieńczonej według protokołu) suro-wicy anty-ludzkiej znakowanej fluoresceiną (konjugatu),płytkę BIOCHIP wyjętą z kuwety z PBS-Tween (po osu-–szeniu papierową chusteczką tylnej powierzchni i brze-gów) należy umieścić w wycięciach płytki reakcyjnej, tak by BIOCHIPy zanurzyły się w kroplach,inkubować 30 min. w temperaturze pokojowej,–

po inkubacji płytki BIOCHIP należy spłukać strumieniem –buforu fosforanowego i natychmiast włożyć do kuwety ze świeżym buforem na 1 min.,środek pokrywający należy nakroplić na szkiełka na-–krywkowe,płytkę BIOCHIP wyjąć z kuwety (osuszyć papierową chu-–steczką tylną jej powierzchnię, brzegi i powierzchnię do-okoła) i umieścić BIOCHIPami skierowanymi ku dołowi na przygotowane szkiełko nakrywkowe [5].

2.1.5 Interpretacja wynikua) Preparaty ocenia się w mikroskopie fluorescencyjnym. W przypadku braku różnicy pomiędzy obrazem preparatu inkubowanego z negatywną surowicą kontrolną a surowicą pacjenta stwierdza się brak poszukiwanych autoprzeciwciał. W przypadku obecności autoprzeciwciał obserwuje się cha-rakterystyczny obraz fluorescencji elementów komórkowych substratu, który porównuje się z pozytywną surowicą kon-trolną.Dla poszczególnych autoprzeciwciał obserwuje się następu-jące wzory fluorescencji:

ANA– : charakterystyczne świecenie komórek Hep-2 (Ryc. 1) oraz wątroby małpy [5],

Rycina 1Wykrywanie autoprzeciwciał ANA metodą IIF. Charakterystyczne świecenie substratu: komórki Hep-2.

AMA– : obecność AMA charakteryzuje się ziarnistym, cy-toplazmatycznym typem fluorescencji na 6 substratach. Standardowym substratem do oznaczania AMA jest ner-ka szczura, na której obserwowana jest fluorescencja w obrębie pierwszo- i drugorzędowych kanalików nerko-wych. W tym przypadku możliwe jest oznaczenie prze-ciwciał AMA M2, przez zastosowanie odpowiedniego substratu (system EUROPLUS) [5],ASMA– : wykazują fluorescencję w obrębie warstwy mię-śniowej żołądka szczura (Ryc. 2), warstwy mięśnio-wej błony śluzowej oraz w warstwie śluzowej żołądka. Przeciwciała ASMA skierowane są głównie przeciwko F-aktynie, które reagują również z cytoszkieletem komó-rek Hep-2, komórek linii VSM47 oraz z kanalikami żółcio-wymi wątroby małpy [5],anty-LKM– : na substracie wątroby szczura wykazują flu-orescencję w obrębie cytoplazmy hepatocytów (Ryc. 3).

Diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółciowych

202

Na nerce szczura obserwowana jest fluorescencja w ob-rębie proksymalnych kanalików nerkowych (Ryc. 4) [5],pANCA– : świecenie typu okołojądrowego granulocytów utrwalonych etanolem (gładka fluorescencja otacza-jąca wstążkowato jądro granulocytu) (Ryc. 5), które jest często trudne do odróżnienia od przeciwciał ANA. W celu ich rozróżnienia stosuje się substrat wątroby małpy (świecenie jąder granulocytów obojętnochłonnych wyraźniejsze niż jąder hepatocytów), komórki nabłonko-we HEp-2 (świecą tylko przeciwciała ANA) oraz granu-locyty utrwalone formaldehydem (stłumienie przeciwciał przeciwjądrowych) [5].

Rycina 2Wykrywanie autoprzeciwciał ASMA metodą IIF. Charakterystyczne świecenie substratu: żołądek szczura.

Rycina 3Wykrywanie autoprzeciwciał anty-LKM metodą IIF. Charakterystycz-ne świecenie substratu: wątroba szczura.

Rycina 4Wykrywanie autoprzeciwciał anty-LKM metodą IIF. Charakterystycz-ne świecenie substratu: nerka szczura.

Rycina 5Wykrywanie autoprzeciwciał pANCA metodą IIF. Charakterystyczne świecenie substratu: granulocyty.

b) Kolejnym etapem badania jest ocena miana autoprze-ciwciał (ocena półilościowa), czyli takiego rozcieńczenia surowicy, w którym występuje jeszcze charakterystyczna fluorescencja. Wynik oznaczenia uznaje się za dodatni, kie-dy miano autoprzeciwciał ANA, AMA, ASMA i anty-LKM jest wyższe niż 1:100, a autoprzeciwciał pANCA jest wyższe niż 1:10.2.2. Test opracowany w Zakładzie Wirusologii Narodo-wego Instytutu Zdrowia Publicznego - Państwowego Za-kładu Higieny w Warszawie. Polega ona na własnoręcznym przygotowaniu skrawków mrożonych tkanek (substratów) utrwalonych na szkiełkach podstawowych. Wycinki tkanek wątroby, nerki, trzustki, żo-łądka oraz jelita pochodzące z sekcji zdrowego szczura uśmierconego po uśpieniu chloroformem (20-30 min. po zatrzymaniu oddychania), układa się w blok o wymiarach ok. 1x1x1 cm. Następnie tak przygotowany blok, ustawio-ny na powierzchni metalowego kołeczka, pokrytej warstwą 10% roztworu gliceryny w 0.1M roztworze NaCl w buforze fosforanowym, pH 7.2 (PBS), zamraża się przez zanurzenie w eterze naftowym oziębionym do temp. -80°C w mieszani-nie suchego lodu i acetonu. Tak przygotowany blok, zawinięty w folię, przechowuje się w temp. -40°C do dalszego użycia.2.2.1 Potrzebny materiał biologicznyPróbka surowicy pacjenta (100μl), którą należy przechowy-wać w 2-8°C do 14 dni lub w -20°C do 6 mies.2.2.2 Aparatura

kriostat z mikrotomem pozwalającym uzyskiwać mro-–żone skrawki o grubości 6 mikronów, krojone w temp. -18°C,mikroskop fluorescencyjny,–zestaw pipet automatycznych regulowanych,–komora wilgotna (pudełko plastikowe wyłożone wilgotną –bibułą),szklany kominek bądź kuweta do płukania.–

2.2.3 Wymagane odczynniki i materiałychloroform; wymagany do uśpienia szczura,–eter naftowy, suchy lód i aceton; wymagane do przygo-–towania łaźni lodowej w celu zamrożenia bloków tkan-kowych,szkiełka podstawowe (76mmx26mm),–

203

szkiełka nakrywkowe (22mmx22mm),–0.1M roztwór NaCl w buforze fosforanowym, pH 7.2 –(PBS),poliklonalne przeciwciała anty-ludzkie IgA, IgM, IgG, –kappa, lambda znakowane izotiocjanianem fluoresceiny (FITC),10% roztwór gliceryny w PBS.–

2.2.4 Opis postępowania analitycznegoskrawki tkankowe mrożone, po skrojeniu w kriostacie, –należy nanieść na szkiełka podstawowe i suszyć w tem-peraturze pokojowej przez 30 min.,następnie utrwalić w acetonie przez 20 min.,–na tak przygotowane preparaty należy nanieść odpo-–wiednio rozcieńczoną surowicę pacjenta (1:40 w PBS) w ilości 400µl,jako kontrolę negatywną należy stosować skrawek inku-–bowany w normalnej surowicy ludzkiej odpowiednio roz-cieńczonej (1:40 w PBS) w ilości 400µl,inkubować w komorze wilgotnej przez 45 min. w tempe-–raturze pokojowej,po inkubacji preparaty przenieść do kuwety szklanej wy-–pełnionej buforem PBS i płukać 3 razy po 10 min. (za każdym razem bufor PBS należy wymienić na świeży),po osuszeniu obrzeża skrawków na szkiełku, nanieść –100µl przeciwciał anty-ludzkich znakowanych FITC w odpowiednim rozcieńczeniu (1:100 w PBS),inkubować w komorze wilgotnej przez 30 min. w tempe-–raturze pokojowej bez dostępu światła,po inkubacji szkiełka przenieść do kuwety szklanej wy-–pełnionej buforem PBS i płukać 3 razy po 5 min. (za każ-dym razem bufor PBS należy wymienić na świeży),po osuszeniu obrzeża skrawków na szkiełko należy na-–nieść kroplę 10% glicerolu w PBS i pokryć szkiełkiem nakrywkowym (nie dopuszczając do powstania pęche-rzyków powietrza pod szkiełkiem),do czasu oceny preparaty przechowywać w lodówce.–

2.2.5. Interpretacja wynikua) Preparaty ocenia się w mikroskopie fluorescencyjnym. W przypadku braku różnicy pomiędzy obrazem preparatu inkubowanego z negatywną surowicą kontrolną a surowicą pacjenta stwierdza się brak poszukiwanych autoprzeciwciał. W przypadku obecności określonych autoprzeciwciał obser-wuje się charakterystyczny obraz fluorescencji elementów komórkowych substratu:

ANA– : świecenie jąder wszystkich elementów komórko-wych na wszystkich substratach,ASMA– : świecenie cytoplazmy komórek mięśni gładkich (również warstwy mięśniowej tętniczek) wszystkich sub-stratów. W przypadku żołądka obserwujemy również nie-swoiste świecenie błony śluzowej i mięśniowej, AMA– : charakterystyczny ziarnisty, cytoplazmatyczny typ fluorescencji nerki, wątroby oraz trzustki szczura. W przypadku nerki, obserwuje się fluorescencję w ob-rębie kanalików nerkowych, natomiast w przypadku trzustki – komórek gruczołów wydzielania zewnętrznego

i wewnętrznego. Cechą charakterystyczną jest również świecenie cytoplazmy komórek okładzinowych błony ślu-zowej żołądka (APCA). Stwierdzenie obecności APCA jest pomocne w różnicowaniu pomiędzy AMA i anty-LKM. Test nie pozwala na określenie swoistości przeciw-ciał względem antygenu M2, co wymaga potwierdzenia innym testem (np. testem EUROIMMUN),anty-LKM– : charakterystyczne, cytoplazmatyczne świece-nie kanalików nerkowych i hepatocytów. Nie obserwuje-my świecenia cytoplazmy komórek okładzinowych APCA i cytoplazmy trzustki, co ułatwia różnicowanie z przeciw-ciałami AMA,

b) Kolejnym etapem badania jest ocena miana autoprze-ciwciał (ocena półilościowa), czyli takiego rozcieńczenia su-rowicy, w którym występuje jeszcze charakterystyczna flu-orescencja. Wynik oznaczenia uznaje się za dodatni, kiedy miano autoprzeciwciał ANA, AMA, ASMA oraz anty-LKM jest wyższe niż 1:80.

Immunoblotting - inna metoda stosowana w diagnosty-ce chorób autoimmunizacyjnych wątroby i dróg żółcio-wych.W metodzie tej stosuje się specjalne paski testowe z na-niesionymi w postaci linii, wysoko oczyszczonymi antyge-nami. W pierwszym etapie paski membrany inkubuje się z rozcieńczoną surowicą pacjenta. W pozytywnych przypad-kach swoiste przeciwciała klasy IgG (również IgA i IgM) wią-żą się z odpowiednimi antygenami. Podczas drugiego etapu inkubacji reagują z nimi sprzężone z enzymem przeciwciała skierowane przeciwko ludzkim immunoglobulinom klasy IgG (koniugat enzymatyczny). Enzym katalizuje następnie reak-cję barwną z roztworem substratu.Pozwala ona na analizę rozszerzonego panelu przeciwciał, m.in.: AMA M2, anty-LKM1, anti-Sp100, anti-gp210, SLA/LP, LC-1. W tym celu stosuje się zestawy komercyjne, np. produkowane przez firmę EUROIMMUN, nazywane EURO-LINE [5].

PiśmiennictwoBogdanos D, Invernizzi P, Mackay I, et al. Autoimmune liver 1. serology: Current diagnostics and clinical challenges. World J Gastroenterol 2008; 14: 3374-3387.Krawitt EL, Clinical features and management of autoimmune 2. hepatitis. World J Gastroenterol 2008; 14: 3301-3305.Mieli-Vergani G, Vergani D, Autoimmune hepatitis. Nat Rev Ga-3. stroenterol Hepatol 2011; 8:320-9.Czaja A, Autoantibodies as prognostic markers in autoimmune 4. liver disease. Dig Dis Sci 2010; 55:2144–2161.www.euroimmun.p5. l

Zaakceptowano do publikacji: 05.03.2012

Adres do korespondencji:Prof. dr hab. med. Kazimierz Madaliński00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24tel. +48 22 5421326, fax:+48 22 5421237e-mail: kmadalinski@pzh.gov.pl; mkomorowski@pzh.gov.pl