SYSTEMS ANALYSIS OF TRANSCRIPTION FACTOR

ACTIVITIES IN ENVIRONMENTS WITH STABLE AND

DYNAMIC OXYGEN CONCENTRATIONS

Matthew D. Rolfe, Andrea Ocone, Melanie R.

Stapleton, Simon Hall, Eleanor W. Trotter, Robert K.

Poole, Guido Sanguinetti and Jeffrey Green

Maria Alejandra Lugo

Marcela Osorio Santos

Molecular Biology

September 4

Universidad Pontificia Bolivariana

INTRODUCTION

Transcription is the process responsible for the

synthesis of an RNA molecule from the genetic

information contained in a template sequence of one of

the DNA strands (3-5).

Has a promoter: Start Marker

Operons: regulate transcription

Steps: Initiation: recognize the promoter

Elongation: stick the RNTP

Finishing: the sequence is transcribed

INTRODUCTION

A transcription factor is a protein involved in regulating

DNA transcription, but not forming part of the RNA

polymerase.

It can act by recognizing and binding to specific DNA

sequences, binding to other factors, or by directly

binding to the RNA polymerase.

It is stimulated by cytoplasmic signals.

INTRODUCTION

E. coli is a facultative anaerobic organism, can grow

both in the presence or absence of oxygen, because

when it is available, uses it as a terminal electron

acceptor, but when oxygen is absent, other biochemical

pathways used to generate energy.

INTRODUCTION

The bacterium Escherichia coli K-12 is a key model

organism that is able to grow in the presence or

absence of oxygen.

INTRODUCTION

Escherichia coli K-12 has two major oxygen-

sensing transcription factors (TFs): the indirect

oxygen sensor ArcBA and the direct oxygen sensor

FNR [7]. Together, these regulators optimize growth

in the presence or absence of oxygen by

remodelling central metabolism.

Consequently, regulatory circuits that react to key

metabolic signals must be integrated into the

bacterial response to oxygen

INTRODUCTION

To fully understand the complex regulatory

remodelling underpinning responses to changes in

oxygen availability requires detailed knowledge of

the changes in activity of multiple TFs

OBJETIVE

Identify systems analysis of transcription factor

activities in environments with stable and dynamic

oxygen concentrations

MATERIALES Y METODOS

CEPAS: Escherichia coli K-12 MG1655 y sus

derivados JRG6009 (a lac mutante que lleva el FF

(-41,5) FNR-plásmido reportero y JRG6031

( pdhR mutante) fueron utilizados. En estados de

cultivo equilibrados, manteniendo condiciones

estables o dinámicas de oxigeno.

MATERIALES Y METODOS

Aislamiento de ARN: Se extrajo el ADN de las

cepas cultivadas y luego se cuantificó por

espectrometría.

MATERIALES Y METODOS

Transcripcion de perfiles: es un método utilizado

para recolectar y analizar los genes que son

expresados.

Se deposita en un Microarray

Suelen utilizarse para identificar genes con una

expresión diferencial bajo condiciones distintas

(aerobio-anaerobio)

MATERIALES Y METODOS

PCR: fue descrita Kary Mullis, se usa para obtener ungran número de copias de un fragmento de ADN

Etapas: Desnaturalización

Alineamiento

Síntesis

Caracteristicas: Rendimiento

Duración

Especificidad

Capacidad de detección

Fidelidad

MATERIALES Y METODOS

Transcriptomic : utilizado para deducir la actividad

de TFS 134.

TFI NFER se basa en un modelo probabilístico

que se basa en una aproximación log-lineal de la

dinámica de la transcripción.

MATERIALES Y METODOS

Transcripcion In vitro: Se realizo la transcripcion de

un fragmento ADN de 426 pb de longitud y se

amplificó con los siguientes cebadores:

adelante CGAATTCTGTGGGTCGGATA y

CAGCTGTGTTGCCATTTCC inversa

MATERIALES Y METODOS

Fosforilación de la proteína arcA: Se fosforiló en

condiciones necesarias para dicho proceso, luego

se cuantifico su fosforilación usando Phos-tag-

electroforesis.

La proteína Arca es un sensor indirecto de la

presencia de oxigeno, la cuantificación de la

fosforilación se realiza para determinar presencia o

no de O2

RESULTADOS

LA ACTIVIDADES DE 7 REGULADORES GLOBALES

QUE REGULAN LA EXPRESION GENETICA EN

RESPUESTA A LA DISPONIBILIDAD DE OXIGENO:

E. Coli cultivada en entornos estables.

Los siete TFS globales mostraron una actividad alterada a

través de la escala de aerobiosis.

Están conectados al estado energético de la bacteria, y

recuperar que la disponibilidad de oxígeno tiene efectos

profundos en E. coli K-12.

RESULTADOS

TF: Arca y FNR regular la respiración en respuesta a la

disponibilidad de oxígeno;

PCR y Lrp censan el estado nutricional

Fis, H-NS y IHF modifican la topología del ADN, que es a

su vez depende de la condición de energía.

La actividad de H-NS es el más bajo en el rango de

aerobiosis; y la actividad Fis es mucho mayor en

condiciones de suministro de un exceso de oxígeno.

RESULTADOS

Las actividades de ARCA, FNR, IHF y Lrp disminuyó a

medida que aumentó aerobiosis.

EFECTOS ESPACIALES PUEDEN DAR CUENTA DE LA

RESPUESTA DEL FNR EN CULTIVOS DE ESTADO

ESTACIONARIO MANTENIDOS A PUNTOS FIJOS EN LA

ESCALA DE AEROBIOSIS

Aunque el oxígeno está presente en concentración suficiente

para alterar la fisiología celular y la actividad ArcBA , el citoplasma

bacteriano sigue siendo esencialmente anaeróbico

RESULTADOS

El consumo eficiente de oxigeno por las oxidasas

terminales, que están localizadas en la membrana celular

impidiendo que el oxigeno alcance la mayor parte del

citoplasma.

RESULTADOS

PERTURBACIÓN DE ESTADO ESTACIONARIO EN

CULTURAS CON IDENTIFICACION DE UN NÚCLEO

SENSIBLE A OXÍGENO Y LA RED DE TF.

Se obtuvieron muestras de perfiles de transcripción: para

transición de anaerobio-aerobio transición aeróbica-

anaeróbica: la tasa de cambio en la disponibilidad de

oxígeno para las dos transiciones fue similar, pero con

signo opuesto.

RESULTADOS

Cambios en la disponibilidad de oxígeno (detectada

directamente por FNR, y indirectamente por ARCA)

afectan el estado redox del sistema, lo que conduce a

las consecuencias de la homeostasis de iones

metálicos (cobre, molibdato, hierro, detectada por

CusR, modo y piel), el exceso de producción de

metabolito (formiato y piruvato; detectada por FhlA y

PdhR) y la envoltura celular,-estrés (detectada por

CPXR).

RESULTADOS

La influencia de la disponibilidad de oxígeno en el E.

coli K-12 es controlado por el regulador sensible al

oxígeno , Arca y FNR, y tambien se sugiere que la

actividad de una red central de 16 TFS se modula para

coordinar la expresión de genes en la E. coli K-12 en

entornos con diferentes, pero estables, o en entornos

inestables de la disponibilidad de oxígeno.

RESULTADOS

Arca, CRP, Fis, FNR, H-NS, IHF y Lrp son

reguladores verdaderamente globales, con respecto

a la respuesta a la disponibilidad de oxígeno, en el

sentido de que sus salidas crear el marco

transcripcional en el que los reguladores locales

funcionan en respuesta a determinados entornos

inestables.

RESULTADOS

PDHR COMPORTAMIENTO DURANTE TRANSICIONES

PARA EL IRREVERSIBILIDAD DEL PERFIL DE

TRANSCRIPCIÓN NDH

Una de las adaptaciones hechas por E. coli en respuesta a la

alteración disponibilidad de oxígeno es la "mezcla y

combinación“ de deshidrogenasas (NDH-I, codificada por el

operón nuo, y, NDH-II, codificado por ndh) y oxidasas

terminales (por ejemplo, citocromo bo0, codificada por el

operón CYOA-E, y el citocromo bd-I, codificada por el operón

cydAB) para optimizar conservación de la energía y el

potencial de crecimiento.

RESULTADOS

Las respuestas de las transcripciones NUO operón

que codifica para la conservación de la energía NDH-

I fueron mínimos.

Por el contrario, la transcripción ndh, que codifica la

nonproton NDH-II, respondió fuertemente en la

transición de anaeróbico a condiciones aeróbicas

RESULTADOS

Además de la regulación por Arca y FNR, la expresion

de ndh es reprimida por la TF-piruvato sensible a

PdhR.

La expresión ndh fue rápida y fuertemente mejorado en

la transición anaeróbico a aeróbico lo que se podría

explicar por Arca, FNR y PdhR :todo reprimir la

expresión ndh bajo condiciones anaeróbicas seguido

por una rápida remoción de la represión tras la

introducción de oxígeno, para inactivar Arca, FNR y

PdhR.

DISCUSSION

Who said What he said Yes No

Alexeeva S At 0 per cent aerobiosis, cultures are anaerobic, whereas

at 100 per cent aerobiosis, cultures have just sufficient

oxygen to grow entirely by aerobic respiration (at

aerobiosis values greater than 100%, the oxygen supply

exceeds the amount required to support aerobic

respiratory growth). The region between 0 and 100 per

cent aerobiosis is the micro-aerobic range.

X

Martinez-

Anatonio A

suggested that global TFs can be identified by the

breadth of their regulons, their interactions with co-

regulators and alternative s factors, the

number of ‘slave’ TFs, the size of their evolutionary

families and the range of conditions under which they are

active

X

Crack JC y Jervis

AJ

mediates changes in gene expression through its

cognate regulator ArcA when the supply of oxygen is

insufficient to fully penetrate the cytoplasm and inactivate

the direct oxygen sensor FNR.

X

Storz G OxyR and SoxS are the major regulators of the oxidative

stress response in E. coli K-12

X

CONCLUSION

E.coli is a microorganism suitable for in vitro

experiments, due to its adaptability to the

environment, either aerobic or anaerobic, since these

conditions modify their growth in terms of gene

expression but not stop growing.

There are sensors for the presence of oxygen, as are

the protein FNR ARCBA and both are responsible for

gene expression in the presence or absence of this gas.

CONCLUSION

E. coli is a microorganism highly variable, which

can grow in different environmental conditions.

transcription factors are important for the

transcription of DNA, and as discussed in this

article have important functions in the proper

development of the E. coli