Diarréia Viral Bovina

Bovine viral diarrhea - BVD

Bovine diarrhea virus – BDV

Bovine viral diarrhea virus- BVDV

Bovine viral diarrhea virus

Importância Econômica: as perdas

produtivas e reprodutivas.

Subclínica a fatal. Sistemas imune, respiratório, reprodutivo e entérico.

Ruminantes Outras espécies (porcos)

Contaminação de cultura de células. Utilização de soro fetal bovino.

Histórico

1946. Olafson et al. Bovine viral diarrhea.

Gastroenterite com severa diarréia em um rebanho leiteiro, NY, US.

Diarréia, úlceras nas mucosas nasal e oral. Abortos.

Morbidade alta. Mortalidade baixa.

1953. Ramsey e Chivers. Doença das Mucosas Gado de corte e de leite em Iowa, US.

Similar a Olafson, lesões ulcerativas na mucosa e diarréia. Mortalidade alta.

Imunidade cruzada no gado e cultivo celular:

O mesmo vírus.

Desafio Atual

Maior desafio: controle da doença.

Cosmopolita.

Alta Prevalência Infecções Persistentes

Superinfecção

Biótipos: Citopatogênico (CP)

Não-citopatogênico (NCP)

Diferentes manifestações clínicas. Desafio para Genética molecular

Genótipos: BVD1 e BVD2

Taxonomia

Família: Flaviviridae.Gênero: Pestivirus Peste Suína Clássica (PSC); Vírus da doença das fronteiras (ovinos).

Podem atravessar a fronteira de espécies

Nomenclatura problemática

Reatividade antigênica deixa a sorologia insatisfatória

Identificação: seqüências genômicas. Genótipo.

Características da família

Vírus envelopados

Nucleocapsídeo

Genoma: RNA ss (+)

Endocitose mediada por receptores

Organização do genoma é similar para todos os gêneros

Proteínas estruturais e não estruturais

Replicação do RNA é citoplasmática

Imunofluorescência Indireta de células infectadas com Pestivirus.

Freitas, T.R.P. et al. J. Basic Microbiology 2003.

Virion

Morfologia

Estrutura e composição

Virion

Construção complexa: Virions são envelopados

esféricos a pleiomórficos

Diâmetro: 40-60 nm.

Projeções na superfície: espículas distintas subunidades como anéis “ring–like” de 10 nm

Cápside/nucleocapsídeo arredondados com simetria poliédrica. Icosaedro regular.

O core é isométrico

Virion

Virion

Propriedades físicas e físico-químicas

• Massa molecular: ~ 60 x106.

• Densidade de flutuação em glicose:

1.12-1.13 g cm-3.

• Coeficiente de sedimentação: 140 S20w.

• Ponto de inativação térmica:(TIP) 40°C.

• “in vitro”: – Estáveis em meio alcalino - pH 8.

– Sensíveis : solventes orgânicos e detergentes.

Genoma Viral

Ácido Ribonucléico

RNA

Características

RNA fita única.Não segmentado. Polaridade positiva. Infeccioso.

12.000 a 13.000 nu.

Terminal 5’ sem cap

Terminal 3‘ não tem trato poly (A)

RNAm no citoplasma célula infectada.

Cópia única do genoma BVDV citopatogênico: Seções do genoma podem ser duplicadas resultando num aumento significativo do RNA genômico

RNA viral

Organização

Contém um longo ORF. Codifica um grande polipeptídeo.

Processamento co e pós-traducional.

Quatro proteínas estruturais

Seis proteínas não estruturais (NS)

O grande ORF é flanqueado por regiões não traduzidas (UTR) no término 5' e 3'.

As regiões 5' e 3' UTR contém 360-390 bases e 200-240 bases, respectivamente.

As seqüências 5' UTR são as mais conservadas do genoma.

Organização do genoma

Replicação viral

Replicação de Pestivírus em culturas de células

Replicação

Ocorre em dois passos:

Proteínas NS e RNA viral formam um complexo de replicação.

Catalisam a transcrição do RNA (-)

RNA intermediário que será molde das moléculas do RNA (+) genômico

RNA subgenômico

RNA subgenômico

“Replicon”

Contém NTRs e a região codificante das proteínas NS3−NS5B

Replicam-se automaticamente nas células transfectadas (Behrens et al., 1998)

Ponto focal: NTRs

Supõem-se que orquestram a tradução e a replicação do RNA

RNA subgenômico

Olaf Isken et al. 2003. The EMBO Journal 22, 5655–5665 22, 5655–5665

Término 5’:'hairpin‘

Término 5’:

Estrutura stem−loop: 'hairpin Ia‘

Regulação:

Codifica diferentes sinais

Determina a eficácia do IRES

Essencial para o início do ciclo de replicação (Yu et al., 2000)

Término 3’: Hairpin

'3'C' do 3'NTR

Região conservada

Seqüências e elementos estruturais

Componentes do Promotor da fita negativa no complexo replicação inicial (Yu et al., 1999)

Regiões variáveis

Regiões variáveis porção '3'V' portion da 3'NTR,

Heterogeneidade no tamanho e seqüência

Cepas diferentes

Modulação do início e fim da tradução (Isken et al.)

Conclusão: hairpin Ia e 3'V cruciais para a regulação das proteínas virais e da síntese do RNA

Isken et al., 2003

Modulação: regiões variáveis no término 3’

Coordenação e Regulação

O “switch” para tradução ?

RNA vírus: Ribossomas (Barton et al., 1999)

Regulação: “ feedback” Proteínas virais nascentes

Coordenação da tradução e Replicação do RNA

Envolve a conformação circular genoma viral (Gamarnik e Andino, 1998; Barton et al., 2001)

Proteínas Celulares Olaf Isken et al, 2003.

Proteínas do grupo NFAR “nuclear factors” no citoplasma.

NF90/NFAR-1,

NF45

RNA helicase A,

Se associam especificamente com o 5' NTR

com o 3'NTR envolvem hairpin Ia and 3'V,

Conformação circular do RNA

Fluxo de informação

RNA ss (+) =RNAm

Proteínas Não estruturais

Proteínas Estruturais/Capsidais

Tradução:Ribossomas

RNA ss (-)

Tradução

Inicia - se através de um sítio de entrada ribossomal (tipo IV) – IRES

Região 5'NTR .

Síntese da poliproteína 4000 aa

NH2-Npro, C, Erns, E1, E2, p7, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B-COOH

Processamento

Co e pós- tradução

Proteases celulares e Proteases virais

Proteínas estruturais: C, Erns, E1, E2, p7

Não estruturais: Npro, NS2-NS5B

C: proteína do capsídeo: p14: 14 kD

Eerns + E1= gp62

E0 (?): gp48

E1= gp25

E2= gp53

E2 (gp53)

As seqüências menos conservadas dentro do genoma:

Região codificante de E2 (gp53)

Epítetos neutralizantes

Mutações nessa região induz variações antigênicas

permite o vírus escapar da resposta imune.

Ciclo replicativo de Pestivirus

BVDV

Biotipos em cultivos celulares

Biotipos

Citopatogênico (cp)

Não citopatogênico (ncp)

Fatores genéticos

Tipos de células usadas

Os biotipos de BVDV

Cultivos primários

Alguns cultivos de linhagem

Hipótese:

NCP Mutações CP

BVDV NCP possui p125

BVDV CP possui p80 e p125

BVDV: Efeito Citopático

BVDV- NCP. MDBK. BVDV-CP. MDBK.

Botton et al., 1998.

BVDV

Aspectos da Enfermidade em bovinos

Manifestações clínicas

1. Infecção aguda com o BVDV

2. Infecções congênitas

3. Infecções crônicas

4. Doença das Mucosas

1. Infecção aguda com o BVDV

Infecções sub-clínicas,

Diarréia bovina,

Infecções venéreas,

Imunossupressão,

Infecções em neonatos,

Infecções mistas

2. Infecções congênitas

Abortos,

Natimortos,

Reabsorção fetal e mumificação.

Defeitos congênitos.

Nascimento:

bezerros fracos e abaixo do peso,

bezerros normais (soropositivos),

bezerros imunotolerantes

3. Infecções crônicas 4. Doença das Mucosas

Infecções crônicas

Viremia Persistente

Doença das Mucosas

MD aguda

MD crônica

BVDV: Infecções Agudas

A. Infecções sub-clínicas,

B. Diarréia bovina,

C. Infecções venéreas,

D. Imunossupressão.

A.Infecções Sub-clínicas

70 a 90% das infecções em animais susceptíveis e imunocompetentes.

Podem apresentar: pequena elevação de temperatura corporal e leucopenia.

Desenvolvimento de anticorpos neutralizantes específicos.

Alta prevalência em rebanhos bovinos com anticorpos contra o BVDV, mas sem história prévia da doença.

Infecção subclínica é mais comum

B.Diarréia Bovina

Idade: seis meses a dois anos.

Incubação: 5 a 7dpi (febre e leucopenia).

Viremia: 4 a 7 dpi (até 15 dias).

Sinais clínicos:

Infecção Aguda em bovinos soro-negativos e imunocompetentes

Depressão; Anorexia; Descargas óculo/nasais; Lesões erosivas nas mucosas,

Diarréias,

Trombocitopenia: Sangramentos: fezes sanguinolentas,

hemorragias petequiais, equimoses.

BVDV: Erosões

Lesões na língua

Lesões na boca

Lesões nas Patas

C. Infecções Venéreas

Sêmen de touros imuno-competentes

Infeccioso para fêmeas susceptíveis

Maior risco: serviço natural

Sêmen de touros persistentemente infectados podem conter vírus

Sêmen: baixa motilidade e alterações morfológicas.

Redução na taxa de concepção

Fracassos na fertilização.

D. Imunossupressão

Parainfluenza tipo 3; Rinotraqueíte infecciosa; Coronavírus; Rotavírus; Pasteurella spp.; Salmonella spp. Actinomyces pyogenes; Coccidia e helmintos.

Interações entre Hospedeiro, meio ambiente e agente infeccioso.

Patogenicidade de agentes patogênicos co-infectantes:

Infecções Congênitas

Adquiridas durante a gestação

Gravidade varia de acordo com a

idade fetal

Infecções Congênitas

Similar a infecções subclínicas e BVD

Notável capacidade de dispersão viral transplacentária.

Infecções Agudas e Infecções persistentes

Idade fetal no momento da infecção

Séria conseqüência no início da gestação

Vacas prenhas imunocompetentes

Idade Fetal e Infecção

<125 dias: aborto, reabsorção ,

múmias e infecções persistentes (PI).

<100-150 dias: distúrbios fetais no

cérebro e olhos, retardo no

desenvolvimento, bezerros fracos

>180 dias: feto imunocompetente

nascimento de bezerros normais

Defeitos congênitos

Estágio final da organogênese do sistema nervoso e desenvolvimento da resposta à inflamações

Lesões nas células tronco defeitos congênitos

Infecção em fetos com 100 a 150 dias de gestação

Defeitos Teratogênicos:

hipoplasia cerebelar;

hipomielogênese;

cegueira;

baixo desenvolvimento;

morte.

Infecções intra-uterinas: defeitos congênitos

Infecções intra-uterinas morte de neonatos

Retardo no desenvolvimento

Bezerros Normais soropositivos

Infecções no final da gestação

depois do desenvolvimento da imunocompetência

Normais

Anticorpos neutralizantes

Bezerros Imunotolerantes

Imunotolerância:

Infecções nos primeiros estágios da gestação – antes de completar a maturação do sistema imune

Infecção persistente -PI

Sem anticorpos

Cepas ncp

Infecções Crônicas

Infecções Persistentes

Infecção persistente

Prevalência ?

Variações por áreas geográficas e entre os rebanhos.

Virêmicos.

Constantemente disseminam vírus para o meio.

Anticorpos neutralizantes: pouco ou em baixa concentração.

Podem ser “saudáveis”.

Bezerro: Infecção Persistente

Doença das Mucosas

Mucosal Disease

MD

Doença das mucosas

Infecção esporádica

Bovino entre 6 meses e dois anos.

Sinais severos

Baixa morbidade

Alta mortalidade

“Superinfecção”

Várias tentativas de se reproduzir a doença das mucosas falharam.

1970. MD só foi reproduzida quando:

O vírus BVDV cp foi inoculado em um animal persistentemente infectado com BVDV ncp

MD só ocorre em animais PI depois da “superinfecção” com um BVDV cp. Goes, D. 2002. Can Vet J. 43(12): 946–954

Doenças das Mucosas

Quando bovinos imunotolerantes e virêmicos com BVDV ncp se infectam com BVDV cp

Homologia entre ncp e cp

Similaridade antigênica: BVDV ncp BVDV CP

Doença das Mucosas

OBS: Similaridade antigênica num vírus cp pode ser obtida através de mutações no vírus ncp.

Infecção Persistente Doença das Mucosas

Epizootiologia e Patogênese

Infecção aguda

Epizootiologia

Ainda não esclarecida. cepa viral, idade do hospedeiro, estado imunológico e fisiológico.

presença de outros patógenos.

A maioria das formas agudas envolve vírus NCP.

Fontes primárias do vírus:

Animais infectados: eliminam vírus nas secreções nasais e orais, fezes e urina.

Patogênese

Via de entrada principal: oro- nasal.

Outras: sêmen; picadas de insetos, instrumentos.

Replicação Viral inicial

Após o contato com a mucosa, a replicação inicial ocorre nas células epiteliais: tonsilas palatinas.

Dispersão pela corrente sangüínea.

Disseminação viral no organismo

Vírus livres no soro e leucócitos infectados,

especialmente linfócitos e monócitos.

Dispersão sistêmica, o vírus é capaz de entrar na maioria dos tecidos mas tem tropismo pelos tecidos linfóides.

Vacas prenhas habilidade do vírus de atravessar a placenta e causar a infecção intrauterina no feto.

Genótipos:BVDV 1 e BVDV-2

Espécies distintas

BVDV-2 mais recente: escape de vacina

comparação das

seqüências da região

5’UTR

Diferenças antigênicas

BVDV-2: Doença severa e aguda

Diagnóstico

Virológico

Sorológico

Diagnóstico virológico

Cultivo de células

Primário ou de linhagem

Observação CPE

Detecção de Antígenos

Imunofluorescência Indireta

Imunoperoxidase

Polymerase Chain Reaction

Diagnóstico sorológico

Rastreamento de anticorpos ?

Estudos epidemiológicos

Proteção vacinal

ELISA

NIFI

NPLA

Controle

Complexo

Erradicação de animais PI

Controle rigoroso de entrada

Vacina

Rastreamento de anticorpos?

Rastreamento de vírus