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elise-schnobrich
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Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional
DNA-Polymerasen starten die Replikation am Replikations-Startpunkt = “Origin“
Replikationsgabel
Wie funktioniert der einzige “Origin of Replication“ in E.
coli?
DnaA(ATPase)
Erkennung
Startkomplex
OffenerKomplex
30°CDnaB = HelikaseDnaCATP
„Prä-Priming“Komplex
- Primase- DNA-PolymeraseReplikation
leichtes „Schmelzen“ der
DNA
OriC
AT CG AT
5'
A TG
AT
GA TGCC
AAAT CG ATTC A TT
5'
3'
3'
Elternstrang 1Elternstrang 2
Brechen der H-Brücken( Helicase)
entlang der Basenpaare
ori
Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung
Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut?
o 5‘ > 3‘ Verknüpfung (Phospho-Diester-Brücken)
o 5‘-Ende mit Phosphat-Gruppe
o 3‘-Ende mit freier OH-Gruppe
5‘
3‘Nukleophiler Angriffder 3‘-OH Gruppeam -Phosphoatom
allgemein gilt: Desoxynukleosid-5‘-Triphosphate sind die aktivierten Vorstufen bei der DNA-Synthese:
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
(dNMP) n + dNTP
(dNTP) n+1+ PPi
DNA-Polymerase
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Neu-eintretendes Desoxy-Nukleosid-Triphosphat
5‘
3‘
00O + 0
Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung
Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut?
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(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1+ PPi
DNA-Polymerase
grundsätzlich gilt, daß DNA-Polymerasen nur synthetisieren können5‘>3‘
d. h . DNA-Polymerasen besitzen eine 5‘>3‘ Polymerase-Aktivität
T3'
T
C
G AA
TAG
ATGC
AA
A5'
T GT
C
AC
GA
TTC
A TT
3‘
5‘
5‘
3‘
Bewegung
der Replikationsgabel
5‘3‘ DNA-Polymerase
DNA-Polymerase
Die Biochemie der DNA-Replikation
Das Problem der “lagging strand“ DNA-Replikation
DNA-Polymerasen besitzen eine 5‘>3‘ Polymerase-Aktivität
5‘
3‘Bewegungder
ReplikationsgabelQuickTime™ and a
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DNA-Polymerase
3‘5‘
5‘3‘5‘
3‘
kontinuierlicher Strang
(“leading strand“)
dis-kontinuierlicher Strang
(“lagging strand“)
Noch ein anderes Problem bei der DNA-Replikation......
DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen “RNA-Primer“ zum Start der Replikation
PrimerDNA-Polymerase
DNA-Polymerasen verwenden den einzelsträngigne DNA-Strang als Matritze, aber der Einzelstrang muß einen Primer gebunden haben (doppelsträngiger Abschnitt),damit die DNA-Polymerase den 2. Strang auffüllen kann
DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen “RNA-Primer“ zum Start der Replikation
5‘
3‘
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3‘5‘5‘3‘
5‘
3‘leading strand
lagging strand
DNA-Polymerase
PrimerQuickTime™ and a
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Primer PrimerOkazaki Fragment
Die vollständige Synthese des Folgestrangs
Die Ligase-Reaktion
DNA-Ligase + ATP
+ PPi
Die einzelnen Schritte der Ligase-Reaktion
ATP
PPi
Enzym-AMPAMP
-Aminogruppe eines Lysins
Vergleich der drei DNA-Polymerasen von E. coli
Anzahl der UntereinheitenSynthese-Rate (Nukleotide/sec)
Prozessivität (eingefügte Nukleotide vor dem Abdissoziieren)
3‘>5‘ Exonuclease (Korrekturlesen)
5‘>3‘ Exonuclease
Molekulargewicht
ja ja ja
ja nein nein
103 kDa 88 kDa 900 kDa
DNA-ReparaturDNA-ReparaturDNA-Replikation
Untereinheiten und Struktur der DNA-Polymerase III von E. coli
Die DNA-Polymerase III (Holoenzym) bildet einen Dimer und kann dadurchgleichzeitig sowohl am Leitstrang wie am Folgestrang synthetisieren.
Die Synthesegeschwindigkeit beträgt: V = 1000 BP/sec
DNA-Polymerase III
-Untereinheit mit DNA-Polymerase- Aktivität (5‘>3‘)
-Untereinheit für die Bindung an die DNA
-Untereinheit3‘>5‘ Exonuclease
vermutlich Schleifenbildung
„Akzessorische Proteine“ der DNA-Polymerase
Klammer Griff
Der Griff-Klammer-Komplex (RFC-PCNA) kann armreifartig an der DNAentlanggleiten. An den Griff-Klammer-Komplex bindet die DNA-Polymerase III, die während der Replikation dadurch mit hoher Prozessivität an der DNA entlangwandern kann, ohne dabei abzufallen
DNA-Polymerase III
DNA
Kristallstruktur vonKlammer-Dimer
Komplex
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Das E. coli Replisom mit seinen verschiedenen Komponenten
Bewegungsrichtung der
Replikationsgabel
Leitstrang Folgestrang
SSB
RNA-Primer
Helicase
DNA-Polymerase I+ Ligase
Okazaki-Stücke
Pol III(DNA-Polymerase)
5‘3‘
3‘
Primase
Primosom
Damit die DNA-Replikation in der Replikationsgabel kontinuierlich voran-schreiten kann, muß die doppelsträngigeDNA in der Gabel in die Einzelstränge getrennt werden.
>> Eine DNA-Helicase windet unter ATP-Verbrauch die DNA auf.
Damit die entwundene DNA kurzzeitig einzelsträngig bleibt,bindet das SSB (“single-strandedDNA-binding protein“) an die nochnicht replizierte DNA. Damit wirddie Verknäuelung der ss-DNAverhindert.
Später wird das SSB von der vorrückendenDNA-Polymerase wieder von der Matritzeabgetrennt.
Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang
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jedoch: ein- und dieselbe DNA-Polymerase III synthetisiert gleichzeitig Leit- und Folgestrang!
PrimosomHelicase
DNA-Polymerase IIIHoloenzym-Dimer
Primer
Schleifenbildung
Leitstrang Folgestrang
Primer
Okazaki-Stück
Bewegungsrichtung der
Replikationsgabel
DNA-Polymerase IIIHoloenzym-Dimer
„Schleifenbildung“ am Folgestrang bei der DNA-Replikation
PrimosomHelicase
DNA-Polymerase IIIHoloenzym-Dimer
Primer
Schleifenbildung
Schleifenbildung bei der Synthese von Leit- und Folgestrang
5‘
DNA-Polymerase IIIHolonenzym-Dimer
Okazaki-Stück
3‘
5‘
3‘
5‘
DNA-Polymerase IIIHolonenzym-Dimer
Die Schleifenbildung an der DNA-Folgestrangmatritze ermöglicht der dimeren
DNA-Polymerase III die Synthese beider Tochterstränge in der Replikationsgabel. Dadurch wird die physikalische Richtung am Folgestrang, nicht aber die biochemische Richtung (5´>3´) umgedreht
Topoisomerase
Bewegungsrichtung der
Replikationsgabel
Leitstrang
Folgestrang
DNA-Polymerase III
Griff
RNA-Primer
SSB
RNA-Primer
Primase
Okazaki-Stücke
Helicase
Ligase
Klammer
DNA-Polymerase I
Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang
Die gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch die dimere DNA-Polymerase III
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Eine Computer-Animation: gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch das Holo-
Enzym DNA-Polymerase III
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Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
53Essentielle Grundlage des Lebens ist die Fähigkeit der identischen Reduplikation des genetischen Materials und damit letztendlich der Vererbung einer funktionsfähigen Zellstruktur.
Welche Aussage zur Replikation der DNA trifft zu?
(A) Beim Start der Replikation werden RNA-Primer synthetisiert.(B) Die Neusynthese der DNA erfolgt an beiden Strängen einer
Replikationsgabel in kürzeren Stücken, so genannten Okazaki-Fragmenten.(C) Für die Verknüpfung der DNA-Fragmente nach Entfernen der Primer
phosphoryliert die DNA-Ligase das 3’-OH-Ende eines Fragmentes.(D) Helicasen schützen intermedär gebildete einzelsträngige DNA-Bereiche
vor Schädigungen und Strangbrüchen.(E) Interkalatoren, die als Zytostatika in der Tumortherapie eingesetzt werden,
binden spezifisch die DNA-Polymerasen.
Die Entwindung des DNA-Matritzenstrangs während
der DNA-Replikation führt zu Verdrillungen
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dadurch Verdrillung der DNA
Entwinden der DNA während der Replikation durch die Helicase
Transienter Bruch des einen Strangserlaubt freie Rotation der DNA-Strängeund Entdrillung der beiden Stränge
>>katalysiert durch DNA-Topoisomerase
Replikation
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
Nukleosomen-Assemblierung nach DNA-Replikation in Eukaryonten
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Die Enden der menschlichen Chromosomen sind linear>>> Probleme bei der Replikation
Telomerasemit RNA Primer