Die enzymatische N-Demethylierung durch Leber-Mikrosomen bei der Morphin-Gewöhnung

Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Path. u. Pharmak. 237, 319--333 (1959)

Aus dem Pharmakologisehen Institut der Freien Universit~t Berlin

Die enzymatische N-Demethylierung durch Leber-Mikrosomen bei der Morphin-Gewiihnung +

Von

HANS [-[ERKEN~ DIETHER NEUBERT u n d R&IMUND TIMMLER

Mit 6 Textabbildungen

(Eingegangen am 23. Juli 1959)

Das P rob l em der Gew5hnung an Morph ia und morphin/£hnlich wirkende Stoffe is t noch n ich t gel6st, obwohl es an Expe r imen ten , die de r Aufk l~rung dieses Ph/~nomens dienen sollten, n ieh t gefehlt ha t .

Bere i ts f r i ihzei t ig is t yon FAUST (1900) die M5glichkei t d i sku t i e r t worden, dab es bei der GewShnung an Arzne imi t t e l zu einer VerKnderung des Abbaues der Verb indungen dureh den Organismus kommt . Diese F rage wurde in den letzter~ J a h r e n wieder aufgegriffen, n a c h d e m neue Befunde darf iber e rha l t en wurden, au f welehem Wege ein A b b a u yon Morph ia erfolgt . Bei den im Vorde rg rund s tehenden , ,En tg i f tungsreak- t i onen" hande l t es sich u m eine P a a r u n g an Glueurons/~ure sowie u m eine N-Demethy l i e rung . Die f e rmen ta t i ve Deme thy l i e rung ffihrt zu Nor- Verb indungen , die keine oder vergl iehen mi t de r Ausgangssubs tanz wesent l ich ger ingere analget ische W i r k u n g e n besitzen.

Enzymsysteme, die eine derartige Abspaltung yon Formaldehyd aus Morphin oder morphin~hnlichen Substanzen -- ebenso wie yon einer grof~en Zahl anderer kSrperfremder Verbindungen -- katalysieren kSnnen, sind in der Mikrosomen- fraktion der Leber nachgewiesen worden (AXELROD 1956). Es lag daher nahe, Untersuchungen dariiber anzustellen, ob Beziehungen zwischen dem Vorgang der GewShnung an Morphin und der N-demethylierenden F~higkeit der Leber bestehen. Befunde ungarischer Autoren (KoML6S 1956) und yon HERK~¢, HOFF~A~ u. 1V[AIBAUER. (1956) k6nnten in diesem Sinne gedeutet werden:

KOML6S glaubt, nach Experimenten mit Tetrachlorkohlenstoff bei der Morphin- gewOhnung zwei Phasen unterscheiden zu kSnnen. Das erste Stadium einer ,,sympto- matischen" GewShnung, bei dem die Leber eine wiehtige Rolle spielen sell, wird yon einer Periode der ,,eehten" GewShnung, die yon Stoffwechselvorg~ngen tier Leber unabh~ngig verl~uft, abgelSst. Auch Versuche von HERKEN U. Mitarb., bei denen durch den Di/ithylamino/ithanolester der Phenyldiallylessigs~ure eine Ge- wShnung an Morphin kurzfristig aufgehoben werden komlte, wiesen auf eine Be- teiligung der Leber hin. Diese Verbindung ist als Hemmstoff bestimmter, in den Lebermikrosomen lokalisierter Enzyme bekannt, die am Morphin-Abbau (N-De. methylierung) beteiligt sind.

* Herrn Prof. Dr. SIEGFRIED LOEWE, Salt Lake City zum 75. Geburtstag gewidmet.

Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Path. Pharmak., Bd. 237 22

320 HA~s HEI~KEN, DIETI:[ER NEUBERT und I~AIMU.~D TIMMLEt¢:

Die u n t e n angefi ihr ten Versuehe sollten zur Klfirung folgender Fragen bei t ragen :

1. Welehe Vorg/inge wirken bei der , ,Aufhebung der Gew6hnung" an Morphin durch Tetraehlorkohlenstoff (KOMLdS) mi t ?

2. Worau f beruht die , ,Aufhebung der Morphin-Gew6hnung" dureh Phenylessigs/iure-Derivate (HnRKE~ et al.)?

3. Bestehen Beziehungen zwiseheit dem Vorgang der Gew6hnung an Morphin und der Aktivitf i t N-demethyl ierender Fermente in der Leber, wie AX~LnOD (1956b) a n n i m m t ?

Methodik Versuchstiere waren etwa 800 teils gekaufte, tells selbstgezogene Albinoratten

im Gewicht yon 120--180 g. Die Bestimmung der Analgcsie erfolgte durch Messung des Schwellenwertes

ffir elektrische Schmerzreize (Schwanzwurzel) nach der Methode yon REIN~RDT u. DE BEER (1950). Variiert wurde die Stromst~rke (0,1--6,0 mA) bei konstant gehaltener Impulsdauer (10 msec), Impulsfrequenz (30 Hz) und einer Gesamtreiz- dauer von 1 sec.

Die Herstellung der Mikrosomenfraktion erfolgte nach Homogenisieren des Lebergewebes mit Kalium-Phosphat-Puffer (PH 7,4) im VerhMtnis 1:1,5 in der von NEUBERT U. MAIBAUER (1959) angegebenen Weise. Zur Aktivit~tsmessung wurde die ,,supernatant fraction" (Mikrosomen in Leberzellplasma) einer Leber 1--2 Std bei 37 ° C mit den Substraten und notwendigen Zusatzen inkubiert. Das Inkubationsmedium yon AXELROD (1956) wurde nur unwesentlich ver~tndert:

Der Ansatz bestand aus: 2,0 ml ,,supernatant fraction" (Beim Pethidin-Abbau 1,5 m]). 1,0 ml Semicarbazid-Hydrochlorid-L6sung (50/,Mol in aqua dest., mit KOH

auf pr[ 7,6 eingestellt). 1,0 ml Substrat-L6sung, mit 4 pMol Dimethylaminoantipyrin oder 30/~Mol

Morphin bzw. Cocain oder 40/*Mol Pethidin. 1,0ml,,TPN-Puffer", in m/15 Kaliumphosphat-Puffer (pH7,4) enthaltend:

25/~Mol MgC12, 90/tMol Nicotins~ureamid, 55/tMol Glucose und etwa 1/~Mol TPN.

Die Gasphase war Luft. Die fermentative Umsetzung wurde durch Zugabe yon 30°/oiger Trichloressig-

s~ure unterbrochen und die freigesetzte (als Semicarbazon vorliegende) Menge Formaldehyd nach Destillation bestimmt (MAcF=~DYEN 1945). Der Nachweis der N-Demethylierung von Dimethylaminoantipyrin erfolgte durch Diazotierung des entstandenen 4-Aminoantipyrins (NEUBERT U. MAIBAUER 1959). Die Aktivit~t der N-demethylierenden Fermente wurde entweder auf das Leberfeuehtgewicht oder auf Milligramm Mikrosomen-Protein bezogen. Protein-Bestimmung nach LOWRY et al. (1951). Weitere methodische Einzelheiten bei TIMMLER (1959).

Io

Ausgeher~d von dem Gedanken, dab in einer bes t immten Phase der Morphin-Gew6hrmng ein vermehr ter Abbau dieser Substanz in der Leber yon Bedeutung sein k6nnte , versuchte KOMLdS 1956, eine an R a t t e n durchgeffihrte Gew6hnung an Morphin dutch Erzeugung einer Leber-

N-Demethylierung bei Morphin-Gew6hnung 321

sch/~digung aufzuheben. Es gelangtats/~ehlich, den beobaehteten Wirkungs- verlust yon Morphin durch reversible Sch/~digung der Leberzellen mit Tetraehlorkohlenstoff kurzfristig zu beheben. Dies zeigte sieh in einer Vers~rkung des analgetisehen Effektes.

Wir haben versueht, diesen Befund zu reproduzieren. In zwei Versuehsserien erhielt die eine Gruppe yon Ratten t/~glieh 20 mg/kg Morphin subcutan, verabreicht. Die Testung der Reizschwelle fiir elektrische Schmerzreize ergab bei beiden Gruppen nach 10 Tagen eine partielle Ge- w6hnung an das Anal- getieum. Daraufhin erhielten alle Tiere am 10. Tage eine einmalige subcutane Gabe yon 3,5 ml/kg Tetra- ehlorkohlenstoff. Abb. 1 zeigt die Ergebnisse der Analgesiemessung am Tage naeh der CCh- Gabe im Ver- gleieh zum Tage vor der Applikation des leberseha- digenden Pharmakons. Bei allen an intraperitoneal applizierte Dosen gew6hn- ten Ratten ffihrt die Test- dosis Morphin wieder zur deutlieh naehweisbaren Analgesie.

Dies ist bei den Tieren, die das Analgetieum subcutan erhielten, nur tell- weise und im wesentlieh geringerem MaBe der Fall. Dieses Ergebnis zeigt, dab die Art der Applikation des Analgeticums yon entschei- derider Bedeutung fiir die Ausl6sung dieses Effektes ist.

die andere die gleiehe Dosis intraperitoneal 7

b-

+ J

2 •

CCL#

O.q. Tag I/. 9. Tag IZ /4opph/n /p. /qoPph/n ~.c.

Abb. 1. EinfluB einer Lebersch~digung durch Te t rach lo r - kohlens tof f a u f die Schmerzschwelle nach Gabe yon 20 m g / k g Morphin. l~I~innliche R a t t e n an in t raper i tonea le bzw. subcutane l~Iorphingaben gew6hnt . CCI~ 3,5 ml ]kg

subcutaia, 20 Std v o r de r le tz ten Ana lges i emessung

Zur weiteren K1/~rung der Frage haben wir die analgetische Wirkung einer akuten subcutanen bzw. intraperitonealen Morphingabe getest~t.

22*

322 HANS HERKEN, DIETHER NEUBERT u n d P~AIMUND TIMMLER:

Es zeigte sieh, da6 der analgetisehe Effekt naeh subeutaner Verabreichung wesentlieh ausgepr/~gter war als naeh intraperitonealer Applikation der gleiehen Menge (Tab. 1). Dieser Befund stimmt mit Ergebnissen fiberein, die BIaNCHI u. FRANCESCHIN~ (1954) bei einer fihnliehen Versuehsanord- hung erhielten. Bei der intraperitonealen Verabreiehung passiert sicher der gr56te Teil des applizierten Pharmakons sogleich die Leber und wird

Tabelle 1. Ein/lufi der Applil~ationsart au/ die analgetische Wirlcung des Morphins Mgnnliche Ratten (150--200g), lnjektion yon 10 mg/kg Morphin-Hydrochlorid. Die Zahlen geben die Reizschwelle in Milliampere an. Bestimmung der Reiz-

schwelle vor der Morphingabe und 60 min danach

Applikationsar t intraperitoneal subcutan

Zeit der geizsehwellen- bestimmung

Mittelwert (Milliamp.) yon je 12 Tieren

0

0,4

60 rain

1,3 ± 0,2

0

0,4

60 min

3,4 ~ 0,9

dort vergtldert oder zur/iekgehalten. Wir haben gefunden, dab das Ver- hSltnis yon ,,abgefangener" und zur Wirkung gelangter Menge bis zu eiaem gewissen Grade yon der applizierten Dosis abhgngt. In eigenen Ver- suehen iibten 10 mg/kg Morphin subeutan gegeben noeh einen wesentlieh stgrkeren anMgetisehen Effekt aus als 15mg/kg intraperitoneal. I-Iieraus kann man absehgtzen, dab naeh intraperitonealer Gabe in dieser Gr6Ben- ordnung etwa die H~il[te des Analgetieums in der Leber unwirksam gemaeht oder bloekiert wird.

Aueh yon anderen Pharmaka, die in der Leber einen Wirkungsverlust erleiden, ist ein ghnliehes Verhalten bekannt.

Aus diesen Versuehen sehlieBen wit, dab die Ratten naeh intraperito- healer Gabe nut scheinbar an (tie gesamte verabreiehte N[orphinmenge gewShnt werden. Unter Gew6hnung verstehen wit dabei wie SCHaU~ASN (1957) einen allmghliehen Wirkungsverlust bei mehr/acher Verabreichung. Naeh dieser Definition wird der Organismus offenbar nieht an die Morphin- menge ,,gew6hnt", die vom ersten Tage ab regelmggig in der Leber verbleibt. Dureh Lebersehgdigung -- z.B. mit CCI 4 -- wird diese ,,Ent- giftung" bloekiert, so dab die verabreiehte Dosis yon 20 mg/kg am 11. Tag erstmalig roll zur Wirkung kommt. DaB aueh bei eingetretener t, eilweiser Gew6hnung dureh Gabe einer hohen Dosis Morphin noeh ein analgetiseher Effekt erzielt werden kann, zeigen Versuehe yon TIMML~R (1959). Bei Tieren, die an 10 mg/kg Morphin gew6hnt wurden, erfolgte in dem untersuehten Zeitabsehnitt noeh eine deutliehe Erh6hung der analgetisehen Wirkung, wenn die doppelte Morphinmenge gegeben wurde.

Die in Abb.2 wiedergegebenen Befunde stfitzen diese Ansieht. In diesen Versuchen haben wit Ratten wiederum ehroniseh Morphin

N-Demethylierung bei Morphin-GewShnung 323

verabreicht (subcutan oder intraperitoneM) und eine Wirkurtgsabnahme erzielt. Naeh 10tiigiger intraperitonealer Applikation erhielten die Tiere die gleiehe Dosis subeutan. Daraufhin t ra t eine deutliche Erh6hung der Schmerzsehwelle auf. Bei einem umgekehrten Vorgehen war ein weiterer Wirkungsverlust zu beobachten, i

Der Ausdruck ,,Anfhebung der Gew6hnung" durch CC14 ist daher nnserer Ansicht nach nicht zutreffend. Tats/~chlich findet keine .,,Auf- hebung der Gew6hnung" an Morphin, sondern nur eine ,,Aufhebung" des immer vorhandenen, bei einigen Applikations- arten besonders deutlieh nachweisbaren alcuten Wir- ]cungsverlustes start, der sehr wahrscheinlich auf einer Entgiftung durch die Leber beruht. Zur Kl~rung dieser Frage bew~hrt sich die intraperiton.eale Gabe yon Morphin besonders gut. Natfirlich wird auch bei subcutaner Applikation ein Teil des Analgeticums nach und nach in der Leber ab- gefangen. Auch unter diesen Bedingunge~l kanI~ ein -- wenn auch g e r i n g e r e r - Effekt des Tetrachlorkoh- lenstoffes nachgewiesen werden (KoMLds). Neben dem geschilderten Vorgang mag in geringerem Mage noch eine Ver£rtderung der Zellpermeabilit/~t durch Tetrachlorkohlenstoff eine Rolle spielem Derartige Wirkungen des CCl 4 sind bekannt.

Die Abb.3 soll unsere Ansicht zusammenfassend veranschaulichen.

b

raA ¢

2

0 Tag 2. 8. Tag ,.q

gubculan - - ~ in~Paper# /ntpgpei,#. ~ xubcutan

l~l~/ff~ Mofph//7

Abb,2. Einflug der Applikationsart auf die GewShnung an ~Iorphin. Analgesiemessung durch elektrische l~eizung (RechteckimDulse) der Schwanzwurzel.Die Ratten wurden 8 Tage lang an subcutane bzw. intraperitoneale Morphin- gaben gewOhnt. Am 9. Tag wurde den Tieren, die bisher das Analgeticum subcutan erhielten, die gleiche Dosis

intraperitoneal appliziert und umgekehrt

Auf welche Weise die Inaktivierung des Morphins in der Leber durch CC14 verhiadert wird, k6nnen wir mit dieser Versuchsanordnung nicht kl/iren. Es ist in diesem Zusammenhange bemerkenswert, dab nach einer

3 2 4 g A ~ s HERKEN, DIETttER NEUBERT u n d ]:~AIMUND TIMMLER:

Leberschtidigung durch gelben Phosphor keine Steigerung der analgetische• Wirkung des Morphins erreicht werden kann (Tab. 2), obwohl die

Toxicit/it wesentlich h6her liegt. Bei einer Leberschiidigung durch gelben Phosphor scheinen die flit den enzy-

t ~ akutep ~'r2uzgsrerlu# matischen Abbau des Morphins in .~ gLe~er) Frage kommenden Reaktionen intakt ~ zu bleiben.

~ II. :~ In weiteren Experimenten wollten ~ wir klitren, welcher Vorgang bei der

Morphin-Inaktivierung in der Leber c,~fgz/'~c,~f M'f+~l/zg~,ef/ bevorzugt betroffen wird.

~ ("&w~nuRg';) Die in Tab. 2 beschriebenen Be- funde weisen eine gewisse Parallelitiit

~ zu frfiher von uns angestellten Ver- .~ suchen auf (NEvBERT u. MAIBAUER

1959): Bei der Untersuchung der N- ~l~u/sr ~n¢t,zgsrerle~/ demethylierenden F~higkeit definier-

Abb. 3 ter Enzymsysteme in den Leber- mikrosomen zeigte sich, dab z.B. die

Demethylierung yon Dimethylaminoantipyrin nach einer Lebersch~digung durch CCl 4 fast vollst~ndig, nach Leberseh~digung durch gelben Phosphor jedoch nur unwesentlich vermindert wird.

Tabelle 2. Ein/lufl einer LeberscMidigung dutch gelben Phosphor au/ die analgetische Wirkung von Morphin bel gew6hnten Ratten

M~nnliche Tiere, Testung der Analgesie vor der Morphininjektion (0) und 60 rain nach der Gabe des Analgeticums. Am 10.Tag wurden 7,5 mg/kg gelber Phosphor (0,125°/o in Paraff. liqu.) oral verabreicht (20 Std vor der letzten Analgesiemessung).

Die Zahlen bezeichnen die l%eizschwelle in Milliam )ere

Morphin- vorbehandlung

20 mg/kg intraperitoneal

20 mg/kg subcutan

0,7 0,8 0,5 0,4 0,6

0,8 0,8 0,4 0.8 016 0,6 0,6

l. Tag

60 rain

I 9. T a g I

60min

10. Tag 11. Tag

Applik. yon

> 10 10 10 10 10

10 10 10 10 10 10 10

1,0 1,0 1,7 2,5 1,5

3,0 2,5 1,5 2,0 0,9 3,5 1.3

Phosphor

Phosphor

0 60 rain

0,2 0,5 0,2 0,7 0,3 1,3 t ¢

0,3 0,8 0,3 0,7 ¢ +

?


Daher war eine Beteiligung bestimmter N-demethylierender Ferment- systeme in der Leber bei der Morphia-Inaktivierung zun~chst nicht auszusehlieBen. Auch der von HERKEN U. Mitarb. (1956) besehriebene Be- fund, dal~ ein typiseher Hemmstoff der ,,Mikrosomen-Enzyme" eine Ver- st~rkung der analgetisehen Wirkung des Morphins bei gewShnten Tieren erzeugt, liefl vermuten, dab die oxydative Demethylie- rung des Pharmakons an der Ausbildung der GewShnung beteiligt sein kSnnte.

Es ist allerdings fraglich, ob die N-Demethylierung von Morphia unter normalen Bedingungen eine wesent- liehe Rolle bei der ,,Entgif- tung" spielt, da Versuehe mit 14C gezeigt haben, dab dieses Pharmakon nur zu einem relativ geringen Prozentsatz im Organismus demethyliert wird {ira Gegensatz zum Pethidin). Natiirhch w~re es abet denkbar, dab dieser Prozentsatz mit dem Eintritt der GewShnung ansteigt.

Wie aus der Abb. 4 her- vorgeht, ist es jedoeh nicht nur mit dem ,,Mikrosomen-

8

1

0t/o. Tag qz qO. Tag 4'Z Abb.4. EinfluB yon Phenylessigs~ure-Derivaten auf den Anaigesieverlauf bei MorDhin-gew~hnten, m~innlichen Ratten. T~gliche Gabe yon 10 mg/kg Morphia subcutan. Applikation yon CFT 1201 (Di~thylamino~ithanolester der Phenyldiallylessigs~iur e) bzw. CF T1218 (entsprechende Monoallyl-Situreamidverbindung intraperitoneal I Std vor der letzten Analgesiemessung. (50 mg/kg C~'T 1201

oder eine ~tquimol. Dosis CtZT 1218)

hemmstoff" CFT 1201 m6glich, eine Analgesieverst~rkung hervor- zurufen, sondern auch mit der Verbindung CFT 1218 (der ent- sprechenden Monoallyl-Verbindung des S~ureamids) die naeh Versuehen yon TIMMLER (1959) keine Hemmwirkung auf die N-demethylierenden Fermente in den Lebermikrosomen entfaltet. Es ist daher unwahrsehein- lich, dab die Versti~rkung der analgetischen Eigensehaften von Morphia, Leoorphan und anderen Verbindungen durch Stoffe dieser l~eihe auf einer ttemmung der N-Demethylierung der Analgetica durch die Enzym- systeme in den Lebermikrosomen beruht.

Mit den Phenylessigs~ureverbindungen kann auBerdem bereits im akuten Versuch eiae Steigerung der Analgesie erreicht werden, l~ber entspreehende Befunde mit anderen Phenylessigs~ure-Verbindungen wurde yon CooK, NAvis u. FELLOWS {1954) mit dem Ester der Diphenyl- propylessigs~ure (SKF 525A), yon MERCIE~ U. MA~MACCA ( 1951) und yon LEvY u. EDWARDS (1956) mit Trasentin und Benadryl berichtet.

326 H A ~ s HERKEN, DIETt tER NEUBEI~T u n d RAIMUND T I ~ L E n :

Die Tatsache, dab die analgetische Wirkung einer intraperitonealen Mor- phingabe - - bereits im akuten Versuch -- auch mit den von uns untersuchten Substanzen dieser Stoffklasse regelm/~l~iger und deutlicher verst/irkt wird als die einer subcutaIl verabreichten gleichen Dosis (Abb.5), l&Bt darauf

5- ~A

7

0 z. Tag Z 7. Tag Z /Sn~g/hg Mof4hin ip. 70~g/kg l@f4h/n ~c

Abb. 5, Wirkung yon C F T 1218 (Phenylmonoallyl- essigsiiure-Di/ithylamino~ithylenamid) auf die Anal- gesie nach intraperitonealer und s ubcutaner Morphin- Gabe, 76mg/kg C F T 1218 oral am 2. Tage, l Std vor der Morphininjektion. Ffir beide Versuche wurden die gleiehen Tiere benutzt. In der 14tiigigen Pause zwischen beiden Experimenten wurden keine

lnjektionen gegeben

schlieBen, dab hierbei die Leber eine Rollc spielt.Der Unterschied zwischen diesen beiden Applika- tionsarten ist jedoch sicher nicht so deutlich, wie es bei den Ver- suchen mit CC14 der Fall war.

M6glicherweise kommt bei der Wirkung der Phenylessig- sgure-Derivatc noch eiue zen- trale Komponentc hinzu, die diesel1 Stoffen eigen ist. Auf- fallend ist, dab der Effekt nur bei einem gewissen Prozentsatz der Tiere auszul6sen war, wgh- rend dic anderen l~atten keine Verstgrkung der analgetischen Wirkung erkennen lieBen.

Bei der Wirkung der uns zur Vcrffigung stehenden Pheayl- essigs~ure-Derivate handelt es sich -- soweit die Leber daran beteiligt ist -- um eine Minde- rung des akuten Wirkungs- verlustes (s. Abb. 3). Vort eider geaerellen ,,Aufhebung der Gewbhnung" kann hierbei nicht gesprochen werden.

Die Versuchc mit einem Phenylessigs/iure-Derivat, das

keine Wirkung auf die , ,Mikrosomen-Fermente" besitzt, schlieBe~l eine N- Demethylierung als urs/ichlichen Faktor zur Erklgrung des analgesie- verstgrkenden Effektes dieser Verbindungea aus. Es liegt daher nahe, an eine Beeinflussung der Glucurons/iurepaarung in der Leber dutch diese Verbindungen zu denken. Eine Wirkung aufdie Kopplung vo~Morphin an Glucuronsgure durch bestimmte Phenylessigs/iure-Derivate ist yon HosoYA u. BRODY (1954) beschrieben. Eitt derartiger Effekt der vort uns untersuchten Stoffe wfirde dann jedoch mit ihrer Fghigkeit, N-demethylierende Vorggnge in den Lebermikrosomen zu hemmen, nicht unbedingt gekoppelt sein (z.B. CFT 1218).


HOFFMANN (1956) konnte nachweisen, dab die Verst/~rkuag der analgetisehen Wirkung dureh CFT 1201 bei gewShntea Rat ten nur kurzfristig zu beobachten ist. Auch bei dauernder Zufuhr des Hemmstoffes CFT 1201 ist der Anstieg der Sehmerzschwelle naeh Morphia nach 2- -3 Tagea aicht mehr zu beobachten. Wir glauben aueh diesen Befund mit den vorliegenden Befunden erkl/~ren zu kSnnen. Unter diesen Bedin- gungen wird offensiehtlich relativ schnell auch eine GewShnung an den- jenigen Anteil des Morphins erzielt, der vorher in der Leber inaktiviert wurde.

I IL

Diese Versuche leiten zu der Frage fiber, ob Beziehungen zwischen dem Ablauf der GewShaung an Morphin und der Aktivit~t N-demethylierender Fermente bestehen.

Naeh Experimeaten voaAxELROD (1956, 1959)sollenVorg/~nge an be- s t immten N-demethylierenden Fermentsystemen in der Leber einen ,,Spiegel" fiir die AblAufe darstellen, die sich an den Receptoren f/Jr diese Analgetica im Gehirn abspielen und daher als ,,Modell" geeignet sein. AuBerdem soll naeh einer Theorie yon B~.CKETT (1956) eine oxyda- t i re Desalkylieruag und die damit verbundeae Bildung yon Nor-Ver- bindungen den ersten Schritt der l~eaktiomen darstellen, die zur Anal- gesie fiihren. Wir haben daher versucht, experimeatelle Argumente f/ir oder gegen diese Ansehauungen zu erhalten.

In der Abb.6 sind die Ergebnisse yon vergleiehenden Analgesie- messuagen und Bestimmungen der AktivitAt N-demethylierender Fer- mentsysteme in den Lebermfl~rosomen wiedergegeben. Die Experimente wurdea in der Weise durehgef/ihrt, daft eine geafigend grol]e Zahl yon Versuehstieren an t~gliehe Gaben yon 10 oder 20 mg/kg Morphia ge- w6hnt wurde. Wir haben es vermieden, eine Gew5hnung an steigende Dosen Morphin durchzuffihren, um die Versuehsbediagungen aicht unnStig kompliziert zu gestalten. Bei hohen Dosen - - AXELI~OD hat seiaen l~atten bis zu 150 mg/kg Morphia appliziert - - ist vermutlich auch in erhShtem MaBe mit weiteren ,,unspezifisehen" Nebenwirkungen des Morphins zu rechnen (z. B. an eadokrinen Organen). Der Ablauf einer GewShaung ist bei t~tglicher Gabe der gleichen Dosis sehr gut zu verfolgen. Die Analgesie wurde in der Regel in dreit/tgigen Abst£aden kontrolliert. Nach best immten Zeiten wurden Kontrolltiere uad Ratten, die t~tglich Morphia erhalten hatten, getStet, die Leber aufgearbeitet und die N-Demethylierung yon Morphia, Pethidin, Levorphan sowie in einigen Versuchen auBerdem zus~tzlieh yon Cocain und Dimethylaminoaat ipyrin bestimmt. In gewissem Umfange kSnnen wir die Ergebnisse, die bereits von AxEL~O]) (1956, 1957) erzielt wurden, best/itigen. Im einer Reihe von Versuehen kam es, /~hnlich wie bei der Messung der Reizschwelle (diese wurde yon den Voruntersuehern in der Regel nicht mitbestimmt), aueh

328 H A ~ S H E R K E N , D I E T H E R N E U B E R T u n d t:~AIMUND TIMMLER:

zu einer Abnahme der Aktivit~t der N-demethylierenden Fermentsysteme in der Leber. AXELROD hat seine Fermentuntersuchungen erst nach

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Abb.6. Yergleich des Analgesieverlaufes und der ~-demethyl ierenden F~ihigkelt von Lebermikro- somen bei der Gew6hnung yon Ra t ten (m~innliche Tiere) an 10 mg/kg Morphin subcutan. Reizschwelle in Milliampere, 60 min nach der Gabe des Analget icums gemessen. Die Aktivit~it der l~-demethylieren- denFermente is t in ~Mol gebi ldet .Formaldehyd (Pethidin, Morphin, Levorphan) bzw. in #Mol gebildet. 4-Aminoant ipyr in (4-AA) (Dimethylaminoant ipyr in) angegeben. Inkubat ionsdauer 2 Std, Re- akt ionsansatz wie unter Methodik angegeben. Die Akt iv i t~ t wurde au f Mil l igramm Mikrosomen- Prote in bezogen. Jeder Punk t s te l l t den Mit te lwert yon 12--14 Versuchstieren dar. , - - - - , Pethidin;

× - - - × Morphin; o - - . - - o Levorphan; . . . . . . . Dimethylaminoant ipyr in

30ti~giger Morphingabe an Rat ten durchgeffihrt. Abb.6 zeigt, da0 es bereits nach wenigen Tagen zu entsprecheaden Ver~nderungen kommen kann.


Die Auswertung der yon uns durchgefiihrten enzymatischen De- methylierungen bei welt fiber 100Morphin-gew6hnten Rat ten zeigt jedoch eindeutig, dab keine Parallelit/~t zwischen der Abnahme der analgetischen Wirksamkeit und der Verminderung der Aktivit/~t der untersuchten Fermentsysteme besteht! Bei gleich stark ausgepr/igter Ge- w6tmung kann die Aktivit/it der Enzyme bereits naeh wenigen Tagen in sehr verschiedenem Grade vermindert, oder abet auch nach 30t~giger Morphingabe v6llig normal sein. Die direkten Ursaehen, die zu einer Aktivit/~tsminderung ffihren, sind noch urrbekannt. Mit dem Vorgang der Gew6hnung an Morphin hat dieser Effekt jedoch offensichtlich nichts zu tun.

Die Tatsache, dal~ es sich um eine relativ unspezifische Wirkung handelt, wird noch dutch einen anderen Befund unterstrichen : Nach den Befunden yon AXELROD soll bei der Gew6hnung an Morphin nur die

Tabelle 3. N-Demethylierung yon Pethidin und Dimethylaminoantipyrin durch Lebermikrosomen (supernatant ]faction) Morphin.gew6hnter m~innlicher Ratten

Versuchsansi~tze siehe Methodik. Die vorbehandelten Tiere erhielten 30 Tage lang je 10 mg/kg Morphin subeutan. Die Zahlen geben beim Pethidin die im Ans~tz gebildete Menge Formaldehyd (in ~Mol), beim Dimethylaminoantipyrin die gebildete Menge 4-Aminoantipyrin (in #Mol) an. Fermentmenge beim Pethidin 1,5 ml supernatant fraction (entsprechend etwa 30 nag 1Y[ikrosomen-Protein), beim Dimethyl- aminoantipyrin 2,0 rnl (entsprechend etwa 40 rag Mikrosomen-Protein). Mittelwerte

± a, n = Anzahl der Versuchstiere

/g -demethyl . Subs t r a t n M d : a n M : t : a

Pethidin [ 6 5,00 :~ 2,43 ] 5 5,60 ± 0,83 ])imethylaminoantipyrin ] 6 0,64 :[: 0,11 I 5 0,44 -4- 0,13

N-Demethylierung derjenigen Analgetica vermindert werden, die zum Morphia eine ,,gekreuzte GewShnung" zeigen. So soil die fermentat ive Umsetzung yon Cocain z.B. nicht beeintr~chtigt werden. Unter den yon uns gew/ihlten Versuehsbedingungen war in einigen untersuchten F/illen auch die N-Demethylierung yon Cocain durch die Lebermikrosomen herab- gesetzt. Ebenso fanden wir die fermentative, oxydative Demethylierung yon Dimethylaminoantipyrin in einigen F/~llen ver/~ndert. Wir verfiigen sogar fiber Experimente, bei denen die Umsetzung vor~ Dimethylamino- ant ipyrin deutlieh vermindert , eine entsprechende Ver/inderung yon Pethidin dagegen nicht zu erkennen war (Tab.3).

Der Befund yon AXS, LROD, dal~ die Aktivit/it best immter N-demethylierender Fermente unter gewissen experimentel len Bedingungen vermindert sein kann, bei unver/~nderter Funktion anderer, wfirde dafiir sprechen, dab es sich nicht um ein Enzym handelt. Wir st immen mit

330 HANS HERKEN, D1ETHEI~ NEUBERT und [~AIMUND TIMMLER:

AXELROD darin v611ig iiberein, dab versehiedene Systeme abgegrenzt werden k6ntten. Es ist wahrseheinlieh, dab nieht nur versehiedene oxydative Leistungen der ,,Mikrosomenfermente" wie Seitenkettenoxyda- tionen, Hydroxylierungen, N-Demethylierungen und andere yon ge- trennten Systemen durehgefiihrt werden, sondern dab aueh innerhalb der Gruppe N-demethylierender Fermente in dea Mikrosomen die Fghigkeit zur Demethylierung nieht auf das Konto eines Enzymsystems kommen muB. Gewisse Befunde, die bei der Entmethylierung yon Coeain erhoben wurden, weisen - - fihnlieh wie die Ergebnisse yon AXm,ROD (1956 b) -- auf eine Sonderstelhmg dieses Abbaues hia, der wahrscheinlieh yon einem Enzymsystem vorgenommen wird, das yon den anderen abgetrennt werden kann (NEt:BERT 1959).

Aueh die Tatsaehe, dab (lie fermentative, oxydative Umwandtung best immter Verbindungen (z. B. Morphin) einen erhebliehen Gesehleehts- untersehied aufweist, der Eintr i t t der Gew6hnung (AnMgesieverlauf) hiervon aber unabh/~ngig ist, sprieht ebenfalls gegen eine Beziehung zwisehen dem Ph/tnomen der Gew6hnung und der Aktivitgt der zur Diskussioa stehenden Fermentsysteme.

Auch Versuehe yon TAKEMORI n. MANNERING (1958) erlauben einen fihnlichen SehluB. Diese Autoren konnten zeigen, dab einige in vivo unwirksame Formen best immter Analgetiea yon den,,Mikrosomenfermen- ten" ia gleieher Weise entmethyliert wurden wie die eatspreehenden 1-Verbindungen. Die Stereospezifit/tt der Morphin-,,Reeeptoren" gilt also nieht allgemein ffir die ,,Mikrosomenfermente". Andererseits hemmen bestimmte, in vivo ebenfalls inaktive d-Formen sogenannter Morphia- antagoaisten die in den Mikrosomen gelegenen Fermente.

Dureh gleiehzeitige Verabreiehung yon Phenyl/~thylbarbiturs/~ure, das naeh Versuehen yon R]~I3~E]~ (1958, 1959) zu einer A]ctivierung best immter , ,Mikrosomenfermente" ftihrt, zusammen mit Morphia gelang es uns, einen , ,paradoxen" Effekt auszul6sen: W~hrend die Aus- bildung der Gew6hnung (Analgesieverlauf) nicht wesentlieh beeinflul]t wurde, kam es gleiehzeitig zu einem starken Anstieg der Aktivit/tt der Enzymsysteme, die Pethidi~l und andere Substanzen demethylieren!

Unsere Versuehe lieferten keinerlei Anhalt daf/ir, dab eine Beziehung zwischen dem Auftreten einer Gew6hnung und der Aktivit/it N-demethylierender Fermente in der Leber besteht. Nach den vorliegenden Unter- suehungen ist es aueh fraglieh, ob die Enzymsysteme als ,,Modell" fiir die Vorg/~nge, die sieh an den Reeeptoren der Analgetica im Gehirn abspielen, geeignet sind.

Naeh einer h~ufig diskutierten Theorie yon BECKETT (1956) soll tier erste Sehritt der Reaktionen, die zum Auftreten des analgetischen Effek- tes fiihren, in einer N-Demethylierung der Analgetiea bestehen. Nach dieser Hypothese k6nnte das Auftreten der Gew6hnung dureh eine ver-


minderte Fi~higkeit best immter Fermentsysteme zur Demethylierung der Analgetica verursacht sein.

Nach den vorliegenden Untersuchungen seheidet auch hier die N-De- methyliernng in der Leber aus. BECKETT hi~lt es ffir m6glich, dab sich der entscheidende Vorgang im Gehirn abspielt. Die Nor-Verbindungen besitzen n~mlich anseheinend nur in geringem Mal~e die F/ihigkeit, in das Gehirn einzudringen.

Eine Demethylierung kSrperfremder Substanzen wurde bisher dureh Gehirngewebe nicht nachgewiesen. A:(ELI~OD (1956) berichtet, da6 die Leber das einzige Organ darstellt, dessen Mikrosomenfraktion eine N-Demethylierung yon Narkotiea durchffihren kann.

Nach Versuchen yon TIMMLEIt {1959) verffigt allerdings auch das I-Iirngewebe yon Rat ten fiber eine gewisse F~higkeit, aus Pethidin Form- aldehyd abzuspalten.

Die relativ geringe gemessene Aktivit/~t k6nnte damit erklart werden, dal] eine ausreichende Enzymmenge rmr an wichtigen, umschriebenen Stellen des Zentralnervensystems vorhanden ist. Abgesehen davon haben wir die Existenz yon Hemmstoffen im Gehirn nicht ausgeschlossen.

Es ran6 zun£chst often bleiben, ob die Eigenschaften der N-demethylierenden Fermente des Gehirns und der Leber iibereiastimmen. Dies gilt ffir die Frage, ob solehen im Gehirn ablaufenden Umsetzungen eine Bedeutung ffir den Wirkungsmeehanismus tier Analgetica oder ffir die Entstehung einer GewShnung zugesprochen werden kann.

Summary The observation of Ko~L6s has been confirmed tha t in morphine

tolerance the effect of morphine can be increased by CC14. This action is certainly not based on the ,,abolishment of tolerance" but caused by the deminished inactivation in liver which does not depend on tolerance.

The effectiveness of certain phenylacetic acid-derivatives to increase the analgesic action of morphine and similar acting substances is not correlated to the inhibition of enzymatic N-demethylat ion which they cause in liver microsomes.

Morphine-tolerance is frequently combined with decreased N- demethylation but there is no close relation between these reactions as AXELROD assumed. In a few cases of pronounced tolerance we found tha t the N-demethylat ing ability of the liver was quite normal. I f there is a decreased N-demethylat ion it is not limited to morphine and compounds which show a ,,crossed tolerance" with morphine but is also observed with substances like cocaine and dimethylaminoantipyrine. Therefore it is not possible to use the studied enzyme systems as a ,,model" for the processes which occurs at the receptors of the morphine action in brain.

332 HA~s HERKEN, DIETHER NEUBERT und RAIMUND TIMMLER:

E v e n w i t h b r a i n t i s sue o f r a t s a r a t h e r sma l l b u t r e m a r k a b l e d e m e t h y - l a t i o n o f P e t h i d i n has been d e m o n s t r a t e d . T h e possible s ignif icance o f

th is o b s e r v a t i o n is d iscussed.

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Documents

Die enzymatische N-Demethylierung durch Leber-Mikrosomen bei der Morphin-Gewöhnung