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Die Rolle
des CD137-/CD137-Ligand-Systems
in der anti-Tumor-Immunantwort
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
der naturwissenschaftlichen Fakultät III
- Biologie und vorklinische Medizin -
der Universität Regensburg
vorgelegt von
Margarethe Wittmann
aus Hof/Saale
2003
Promotionsgesuch eingereicht am: 10. 12. 2003
Die Arbeit wurde angeleitet von: Prof. Dr. H. R. Kalbitzer (fakultätsintern)
PD Dr. H. Schwarz
Prüfungsausschuß:
Vorsitzender: Prof. Dr. R. Wirth
1. Prüfer: Prof. Dr. H. R. Kalbitzer
2. Prüfer: PD Dr. H. Schwarz
3. Prüfer: Prof. Dr. S. Schneuwly
Tag des Kolloquiums: 02.02.2004
Inhaltsverzeichnis
3
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis.................................................................................................................3
1. Einleitung................................................................................................................8
1.1. Das CD137-/CD137-Ligand-System .....................................................................8
1.1.1. CD137 und sein Ligand.......................................................................................8
1.1.1.1. Genomische Lokalisation, Molekularbiologie und Biochemie von CD137 .........8
1.1.1.2. Genomische Lokalisation, Molekularbiologie und Biochemie von CD137-
Ligand .............................................................................................................10
1.1.1.3. Expression und Gewebeverteilung von CD137 ................................................10
1.1.1.4. Expression und Gewebeverteilung des CD137-Liganden .................................12
1.1.2. Bidirektionale Signalübertragung durch das CD137-/CD137-Ligand-System.....13
1.1.2.1. Signaltransduktion durch CD137 und seinen Liganden ....................................14
1.1.2.1.1. Signaltransduktion durch CD137........................................................14
1.1.2.1.2. Signaltransduktion durch CD137-Ligand............................................15
1.1.2.1.3. Physiologische Funktionen, die durch CD137 vermittelt werden ........16
1.1.2.1.4. Physiologische Funktionen, die durch CD137-Ligand vermittelt
werden ...............................................................................................20
1.1.2.1.5. Physiologische Funktionen, die durch das CD137-/CD137-
Ligand-System vermittelt werden – Studien an knockout-
bzw. transgenen Tieren.......................................................................21
1.2. Die chronisch lymphatische Leukämie (CLL)......................................................22
1.3. Zielsetzung dieser Arbeit.....................................................................................24
2. Material und Methoden........................................................................................25
2.1. Material...............................................................................................................25
2.1.1. Organismen.......................................................................................................25
2.1.1.1. Bakterien .........................................................................................................25
2.1.1.2. Säugerzellen ....................................................................................................25
2.1.2. Nährmedien ......................................................................................................27
2.1.3. Antibiotika ........................................................................................................28
2.1.4. Antikörper und Konjugate.................................................................................28
2.1.4.1. Antikörper gegen CD-Antigene .......................................................................28
2.1.4.2. Antikörper gegen Immunglobuline...................................................................28
Inhaltsverzeichnis
4
2.1.4.3. Antikörper gegen sonstige Antigene.................................................................28
2.1.4.4. Isotypkontrollantikörper...................................................................................28
2.1.4.5. sonstige Immunglobuline .................................................................................29
2.1.5. Chemikalien und Reagenzien ............................................................................29
2.1.6. Enzyme.............................................................................................................30
2.1.7. Kits ...................................................................................................................30
2.1.8. Nukleinsäuren ...................................................................................................31
2.1.8.1. Desoxyoligonukleotide ....................................................................................31
2.1.8.2. Primer..............................................................................................................31
2.1.8.3. Plasmide und Konstrukte .................................................................................32
2.1.9. Molekulargewichtsstandards .............................................................................32
2.1.10. Puffer und Lösungen ..........................................................................................32
2.1.11. Sonstiges Material..............................................................................................35
2.1.12. Geräte ................................................................................................................35
2.2. Methoden ............................................................................................................37
2.2.1. Molekularbiologische Methoden .......................................................................37
2.2.1.1. Konzentrationsbestimmungen ..........................................................................37
2.2.1.1.1. Absorptionsmessungen.......................................................................37
2.2.1.1.2. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren mittels des Nucleic
Dot Metric Assays ..............................................................................38
2.2.1.1.3. Bestimmung der Konzentration von Proteinlösungen nach Bradford ..38
2.2.1.2. Arbeiten mit RNA............................................................................................38
2.2.1.1.1. Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen .....................38
2.2.1.1.2. Reverse Transkription ........................................................................39
2.2.1.3. Arbeiten mit DNA ...........................................................................................39
2.2.1.3.1. Präparation von Plasmid-DNA ...........................................................39
2.2.1.3.2. Reinigung und Fällung von DNA .......................................................41
2.2.1.3.3. Enzymatische Hydrolyse von DNA....................................................42
2.2.1.3.3. Elektrophorese von DNA in Agarosegelen .........................................42
2.2.1.3.4. Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mit dem QIA-
quick Gel Extraction Kit .....................................................................43
2.2.1.3.5. Ligation von DNA-Fragmenten mit dem pcDNA3.1/V5-His TA-
TOPO-Kit der Firma Invitrogen..........................................................43
2.2.1.3.6. DNA-Amplifizierung mittels PCR......................................................43
Inhaltsverzeichnis
5
2.2.2. Zellbiologische Methoden ..................................................................................45
2.2.2.1. Arbeiten mit E. coli..........................................................................................45
2.2.2.1.1. Kultur von E. coli-Stämmen...............................................................45
2.2.2.1.2. Aufnehmen von Wachstumskurven ....................................................46
2.2.2.1.3. Anlegen von Glyzerin-Dauerkulturen.................................................46
2.2.2.1.4. Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen ......................46
2.2.2.1.5. Chemische Transformation von E. coli-Zellen....................................46
2.2.2.1.5. Transformation von E. coli mittels des pcDNA3.1/V5-His TOPO
TA-Kits von Invitrogen.......................................................................46
2.2.2.2. Arbeiten mit Säugerzellen................................................................................47
2.2.2.2.1. Kultur löslicher Zellen........................................................................47
2.2.2.2.2. Kultur adhärenter Zellen.....................................................................47
2.2.2.2.3. Ermittlung von Zellzahl und -Konzentration (Trypanblaufärbung) .....48
2.2.2.2.4. Herstellung von Gefrierkulturen .........................................................48
2.2.2.2.5. Isolierung von PBMC über Dichtegradientenzentrifugation................48
2.2.2.2.6. Isolierung reiner B- bzw. T-Lymphozyten mittels magnetischer Se-
paration mit dem Dynabead-System...................................................49
2.2.2.2.7. In vitro-Stimulation von Zellen ..........................................................50
2.2.2.2.8. Proliferationsassays mittels 3H-Thymidin-Einbau...............................50
2.2.2.2.9. CARE-LASS (Calcein release assay).................................................51
2.2.3. Immunologische Methoden ................................................................................52
2.2.3.1. ELISA .............................................................................................................52
2.2.3.1.1. ELISA für sCD137.............................................................................53
2.2.3.1.2. ELISA für humanes IL-10..................................................................53
2.2.3.1.3. ELISA für humanes TGFß1 ...............................................................54
2.2.3.2. Aktivitätsassay für Caspase 3...........................................................................56
2.2.3.3. Durchflußzytometrie........................................................................................57
2.2.3.3.1. PI-Färbung toter Zellen ......................................................................57
2.2.3.3.2. Einfache Antikörperfärbung ...............................................................57
2.2.3.3.3. Antikörperdoppelfärbung ...................................................................57
2.2.3.3.4. AnnexinV-FLUOS/PI-Doppelfärbung mit dem AnnexinV-FLUOS
Staining Kit der Firma Roche Diagnostics (Mannheim)......................57
2.2.3.3.5. Messung und Auswertung am FACS-Calibur .....................................58
2.2.3.4. Immunhistochemie/ Immunzytochemie............................................................58
Inhaltsverzeichnis
6
2.2.3.4.1. Herstellung von Zytospins..................................................................58
2.2.3.4.2. Fixierung von Zytospins.....................................................................59
2.2.3.4.3. Fixierung für Immunfluoreszenzfärbungen.........................................59
2.2.3.4.4. Färbung mit der DAB-Methode..........................................................59
2.2.3.4.5. Immunfluoreszenzfärbung (Dreifachmarkierung) ...............................60
2.2.3.4.6. Einbettung der Präparate ....................................................................60
2.2.3.4.7. Photografie.........................................................................................61
3. Ergebnisse .............................................................................................................62
3.1. Screening des CLL-Patienten-Materials...............................................................62
3.1.1. Das verwendete Patientenmaterial .....................................................................62
3.1.2. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen..................................................62
3.1.2.1. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen auf RNA-Ebene.......................62
3.1.2.2. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen auf Protein-Ebene....................63
3.1.3. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen ...................................................66
3.1.3.1. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen auf RNA-Ebene ........................66
3.1.3.2. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen auf Protein-Ebene .....................67
3.1.3.2.1. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen in Zellkulturüber-
ständen...............................................................................................67
3.1.3.2.2. Nachweis von sCD137 in Patientenseren............................................67
3.1.3.2.2. Herkunft von sCD137 in Patientenseren .............................................69
3.2. Funktion von mCD137 in der CLL.......................................................................70
3.2.1. Die Rolle von mCD137 bezüglich des Überlebens von CLL-Zellen ...................70
3.2.2. Ursache der höheren Anzahl überlebender B-CLL-Zellen auf CD137-Fc ...........72
3.3. Die Rolle von mCD137 in der LAK-Antwort ......................................................73
3.3.1. Der Effekt von mCD137 in der LAK-Antwort...................................................74
3.3.2. Verifizierung der durch mCD137 vermittelten Verminderung der zytotoxi-
schen Lyse .........................................................................................................77
3.3.2.1. Nachweis der Spezifität des mCD137-Effekts durch die Transfektion mit
einem antisense-Vektor....................................................................................77
3.3.2.2. Nachweis der Spezifität des mCD137-Effekts durch die Vorinkubation
der Zielzellen mit dem anti-CD137-Antikörper bbk-2 ......................................80
3.3.3. Mechanismus der Verminderung der LAK-Antwort durch mCD137 ..................82
3.3.3.1. Verminderung der Lyserate mCD137-tragender Zellen durch Apoptose-
Inhaltsverzeichnis
7
induktion in LAK-Zellen .................................................................................82
3.3.3.2. Die Rolle von Zytokinen in der mCD137-vermittelten Reduktion der LAK-
Lyse..... ............................................................................................................87
3.3.3.2.1. Die Rolle von IL-10 in der mCD137-vermittelten Reduktion der
LAK-Lyse..........................................................................................88
3.3.3.2.2. Die Rolle von TGFß1 in der mCD137-vermittelten Reduktion der
LAK-Lyse..........................................................................................89
3.3.3.3. Spezifität der Zytokinwirkung..........................................................................91
3.3.3.4. Induktion der TGFß-Freisetzung durch mCD137 oder den CD137-Ligand.......94
3.4. Die Rolle von sCD137 während der LAK-Antwort...............................................99
3.4.1. Die Wirkung von sCD137 auf die LAK-Zellen..................................................99
3.4.2. Die Wirkung von sCD137 auf die Target-Zellen .............................................100
4. Diskussion ...........................................................................................................106
4.1. Screening des CLL-Patientenmaterials hinsichtlich der Expression von CD137..106
4.2. Die Funktion von mCD137 in der CLL .............................................................109
4.3. Die Rolle von mCD137 in der LAK-Antwort ....................................................110
4.3.1. Der Effekt von mCD137 in der LAK-Antwort..................................................110
4.3.2. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –
direkte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts..........................................112
4.3.2. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –
indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts.......................................115
4.3.2.1. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –
indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts durch IL-10 .................116
4.3.2.1. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –
indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts durch TGFß.................117
4.3.2.3. Vermittlung der TGFß-Freisetzung durch CD137 oder CD137-Ligand ..........119
4.4. Die Rolle von sCD137 in der LAK-Antwort.......................................................122
4.5. Ausblick.............................................................................................................129
5. Zusammenfassung ..............................................................................................130
6. Literaturverzeichnis ...........................................................................................132
7. Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................167
8. Danksagung ........................................................................................................174
Einleitung
8
1. Einleitung
1.1. Das CD137-/CD137-Ligand-System
1.1.1. CD137 und sein Ligand
1.1.1.1. Genomische Lokalisation, Molekularbiologie und Biochemie von CD137
Abb. 1.-1.: Schematischer Überblick über die Molekülstruktur von humanem CD137 (Darstellung
nach der Analyse der Proteinsequenzen in VINAY D. S. und KWON B. S., 1998; ALDERSON M. R. et al.,
1994; SCHWARZ H., et al., 1993). Der zytoplasmatische Teil des Proteins ist hellblau unterlegt.
CD137 gehört zur Familie der TNF-Rezeptoren. Dies ist eine Molekülfamilie strukturell ver-
wandter Glykoproteine. Die Liganden dieser Moleküle bilden die Proteine der korrespondie-
renden TNF-Superfamilie (GRUSS H.-J. und DOWER S. K., 1995).
Das humane CD137 wurde 1993 von H. SCHWARZ (SCHWARZ H. et al., 1993) als ILA (induced by
lymphocyte activation) bei der Suche nach induzierbaren Rezeptoren auf aktivierten T-Lym-
phozyten entdeckt. Vier Jahre zuvor wurde das murine CD137 oder 4-1BB von B. S. KWON
erstmalig beschrieben (KWON B. S. und WEISSMANN S. M., 1989). Die homologen Gene wurden
1996 unter der Bezeichnung CD(w)137 in die CD (cluster of differentiation)-Nomenklatur
aufgenommen (KISHIMOTO T. et al., 1996). Innerhalb der TNFR-Familie firmiert CD137 unter
TNFRSF9 (http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/genefamily/ tnfrec2.html).
Das humane CD137 ist auf Chromosom 1p36 lokalisiert. Dort befinden sich weitere Gene der
TNFR-Familie, wie TNFR2, HVEM, OX40 und TRAMP. Deletionen in dieser chromosoma-
len Region werden mit soliden Tumoren, Translokationen mit verschiedenen hämatopoeti-
schen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht (SCHWARZ H. et al., 1997).
Das murine CD137-Gen liegt auf Chromosom 4 (KWON B. S. und WEISSMANN S. M., 1989; KWON B.
S. et al., 1994).
Leader-Peptid
Cys-reiche Domäne (CRD)((CRD)
N-Glykosy-lierungs-stellen
Ser/Thr-reicheRegion
Trans-membran-
Region
Casein-Kinase
II
1
IFKQPF-Motiv
saure Sequenzen(TRAF-
Interaktion)
p56Ick-Bindungs-
stelle
GG-Sequenz
255
Einleitung
9
Als Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie ist CD137 ein Typ I-Transmembranprotein. Das hu-
mane Protein besteht aus 255 AS, das murine aus 256. Die Aminosäuresequenz der beiden
Moleküle ist zu 60 % identisch (VINAY D. S. und KWON B. S., 1998).
Sowohl das humane als auch das murine Homolog enthalten ein leader-Peptid für den Mem-
brandurchtritt. Darauf folgt die Cys-reiche Region, welche die TNF-Rezeptor-Proteine cha-
rakterisiert und der Ligandbindung dient. Beim humanen CD137 besteht diese Region aus
drei, beim murinen aus vier Wiederholungen der CRD (SCHWARZ H. et al., 1993; KWON B. S. et al.,
1994).
Vergleiche des errechneten mit dem tatsächlichen Molekulargewicht von CD137 machen so-
wohl für das murine (25 kD vs. 30 kD) als auch für das humane Homolog (28 kD vs. 35 kD)
posttranslationale Modifikationen wahrscheinlich. Die Sequenz des murinen 4-1BB beinhaltet
mehrere Stellen für eine potentielle O-Glykosylierung (POLLOK K. E. et al., 1993). Das humane
CD137 enthält zwei Asn-Reste, an denen N-Glykosylierung möglich ist (SCHWARZ H. et al.
1993).
In der intrazellulären Domäne von CD137 finden sich kurze homologe Sequenzabschnitte
zwischen Mensch und Maus. Dazu gehören ein IFKQPF-Motiv und zwei aufeinander folgen-
de Tyr-Reste, die mögliche Phosphorylierungsstellen der Casein Kinase II darstellen, sowie
zwei kurze Sequenzabschnitte mit sauren AS, die die Interaktion mit TRAF-Molekülen
vermitteln. Zudem liegt im zytoplasmatischen Teil eine potentielle Bindungsstelle für die T-
Zell-spezifische Proteinkinase p56Ick, gefolgt von mehreren Gly-Resten (SCHWARZ H. et al., 1993;
VINAY D. S. und KWON B. S., 1998; YE H. et al., 1999).
Innerhalb der TNFR-Familie zeigt das murine CD137 Homologien zu CD27, OX40 und
GITR (NOCENTINI G. et al., 1997), das humane Homolog zu CD40 und HVEM (SCHWARZ H. et al.,
1993).
In der Maus konnten zwei splice-Varianten der mRNA für CD137 mit einer Größe von 1,5 kb
und 2,4 kb nachgewiesen werden. Die kürzere mRNA codiert für ein lösliches Protein, dem
die Transmembranregion fehlt (SETAREH M. et al., 1995; WILCOX R. A. et al., 2002). In humanen
aktivierten T-Zellen wurden drei CD137-mRNA-Isoformen beschrieben: Sie sind 4,4 kb, 4,0
kb und 1,8 kb lang. In Chondrozyten kommen zusätzlich Isoformen von 3,2 kb, 1,5 kb und
1,2 kb vor (VON KEMPIS J. et al., 1997). Das Vorhandensein von löslichem CD137 konnte auch für
den Menschen nachgewiesen werden (MICHEL J. et al., 1998; SHARIEF M. K., 2002).
Murines CD137 bindet außer an seinen Liganden an extrazelluläre Matrixproteine, wie Fibro-
nectin, Vitronectin, Laminin und Collagen VI (CHALUPNY N. J. et al., 1992; LOO D. T. et al., 1997).
Einleitung
10
1.1.1.2. Genomische Lokalisation, Molekularbiologie und Biochemie von CD137-
Ligand
In der Maus und im Menschen gibt es einen Liganden für CD137. Das murine CD137-Li-
gand-Gen befindet sich auf Chromosom 17, in der Nähe der murinen Gene für TNF und LTß.
Die Gene für CD137-Ligand in Maus und Mensch werden jeweils von einem einzigen ORF
gebildet. Das Gen für den humanen CD137-Ligand liegt auf Chromosom 19p13.3. Es lokali-
siert in einem Bereich, in dem weitere Gene der TNF-Familie, wie z. B. der CD27-Ligand, zu
finden sind. (GOODWIN R. G. et al., 1993; ALDERSON M. R. et al., 1994).
Sowohl in der Maus als auch im Menschen wird der CD137-Ligand als Typ II-Transmem-
branprotein synthetisiert (GOODWIN R. G. et al., 1993; ALDERSON M. R. et al., 1994; POLLOK K. E. et al.,
1994). Das murine CD137-Ligand-Protein hat eine Länge von 309 AS und ein errechnetes
Molekulargewicht von 34 kD. Das tatsächliche Gewicht von 50 kD läßt auf
posttranskriptionelle Modifikation schließen. In der Aminosäuresequenz finden sich neben 3
Asn-Resten für eine N-Glykosylierung, ein Pro/Ser/Thr-reicher Bereich, an dem O-Glykosy-
lierung möglich wäre. Die Analyse des Proteins unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigt,
daß der Ligand in der Zelloberfläche als ein Homodimer vorliegt, dessen Untereinheiten über
Disulfidbrücken verknüpft sind (GOODWIN R. G. et al., 1993).
Der humane CD137-Ligand umfaßt nur 254 AS. Ihm fehlen die Asn-Reste, sowie die Pro/-
Ser/Thr-reiche Region im Extrazellulärteil (ALDERSON M. R. et al., 1994). Aus der Membran kann
CD137-Ligand durch Metalloproteinasen als biologisch aktives lösliches Protein freigesetzt
werden (SALIH H. R. et al., 2001).
Die Homologie des CD137-Ligand-Proteins zu anderen TNF-Familienmitgliedern beschränkt
sich auf die Extrazellulärdomäne. Dies läßt auf Unterschiede der durch den Liganden in die
Zelle vermittelten Funktionen schließen. Zwischen dem menschlichen und dem murinen Ho-
molog ist die Ähnlichkeit mit 36 % vergleichsweise gering. Andere Mitglieder der TNF-Fa-
milie weisen zwischen den Arten zwischen 70 % und 80 % Homologie auf (GOODWIN R. G. et
al., 1993; ALDERSON M. R. et al., 1994).
1.1.1.3. Expression und Gewebeverteilung von CD137
CD137 wurde in der Maus und im Menschen bei der Untersuchung aktivierungsabhängig ex-
primierter T-Zell-Gene gefunden (KWON B. S. und WEISSMANN S. M., 1989; SCHWARZ H. et al., 1993).
CD137 wird in der Maus auf den Zellen lymphatischen Ursprungs strikt aktivierungsabhängig
exprimiert. Stimulation mit Concavalin A, PMA und Kalziumionophor, PHA oder anti-CD3-
Antikörpern induziert die CD137-Expression in T-Lymphozyten auf RNA- und Proteinebene
Einleitung
11
(KWON B. S. und WEISSMANN S. M., 1989; KWON B. S. et al., 1989; GRAVESTEIN L. A. et al., 1993; POLLOK K.
E. et al., 1993; POLLOK K. E. et al., 1995; ZHANG X. et al., 2002). CD137 wird transient exprimiert: Die
Dichte des Rezeptors steigt langsam an und erreicht nach 60 h ein Maximum (POLLOK K. E. et
al., 1993).
Auch auf NK1.1-Zellen der Maus wird CD137 aktivierungsabhängig exprimiert (MELERO I. et
al., 1998).
In Zellen der myelotischen Reihe konnte die Expression von CD137 ebenfalls nachgewiesen
werden, so auf Makrophagen (SETAREH M. et al., 1995), Mikroglia (PAULY S., 2000) und dendriti-
schen Zellen (DCs) (FUTAGAWA T. et al., 2002; WILCOX R. A. et al., 2002).
Außerdem wurde in der Maus die mRNA für CD137 in 3T3-Fibroblasten und Epithelzellen
gefunden (SETAREH M. et al., 1995).
Die Expression des menschlichen CD137 kann über den MEK/ Erk- und JNK/ SAPK-Signal-
weg induziert werden (KIM J. O. et al., 2003). Wie murines wird humanes CD137 in gesunden
Zellen lymphatischen Ursprungs ausschließlich aktivierungsabhängig synthetisiert (SCHWARZ
H. et al., 1995; VON KEMPIS J. et al., 1997). Die CD137-mRNA kann in T-Lymphozyten 90 min
nach der Stimulation detektiert (SCHWARZ H. et al., 1995), das Protein nach 17 h nachgewiesen
werden. Die Expression erreicht nach ca. 48 h einen Höhepunkt und fällt in den nächsten vier
Tagen wieder auf das Ausgangsniveau ab (MICHEL J., 1998). Die Transienz ist eine Folge von
proteolytischem shedding des membranständigen Rezeptors (TARABAN V. Y. et al., 2002). Die
lösliche Form des Proteins ist wie die membranständige 17 h nach Stimulation nachweisbar
und erreicht nach drei Tagen ein Expressionsmaximum. Induzierbar ist humanes CD137 in T-
Zellen durch anti-CD3-Antikörper, IL-2, PMA und Kalziumionophor und PHA (MICHEL J.,
1998). In primären B-Lymphozyten kann die mRNA anti-IgM- oder SAC-Behandlung nach-
gewiesen werden, während das Protein nicht detektierbar ist (KIENZLE G. et al., 1997; MICHEL J.,
unveröffentlichte Daten). Anders als gesunde, nicht aktivierte Lymphozyten können entartete oder
transformierte Lymphozyten konstitutiv CD137 exprimieren (SCHWARZ H. et al., 1995).
Auf Zellen myelotischer Herkunft wird CD137 konstitutiv exprimiert, so auf Monozyten/Ma-
krophagen (KIENZLE G. und VON KEMPIS J., 2000; SÖLLNER L., 2001) und neutrophilen Granulozyten
(HEINISCH I. V. et al., 2000). Mikrogliazellen synthetisieren CD137 aktivierunsabhängig (PAULY S.,
2000).
Als Zellen des Immunsystems unbestimmter Herkunft exprimieren FDCs in Keimzentren
CD137 (PAULY S. et al., 2002; LINDSTEDT M. et al., 2003). Mastzellen synthetisieren das Molekül
nach Aktivierung (HEINISCH I. V. et al., 2001; NAKAJIAMA T. et al., 2002).
Einleitung
12
CD137 kommt beim Menschen – und bei der Maus – auch in Geweben außerhalb des Im-
munsystems vor: So konnten J. VON KEMPIS et al. die differenzierungs- und stimulusabhängi-
ge Expression von CD137 in Chondrozyten zeigen (VON KEMPIS J. et al., 1997). Endotheliale Zel-
len der Lunge und basale epitheliale Lungenzellen gesunder Probanden zeigen konstitutiv
eine deutliche CD137-Expression (BOUSSAUD V. et al., 1998). Bei immunhistochemischen Un-
tersuchungen konnte CD137 in den Gefäßwänden der Kapillaren maligner Tumore detektiert
werden (BOUSSAUD V. et al., 1998; BROLL K. et al., 2001).
Lösliches CD137 kann beim gesunden Probanden im Serum nur in geringer Menge gefunden
werden, während es bei Patienten mit rheumatoider Arthritis (M ICHEL J. et al., 1998) oder
hämatopoetischen Erkrankungen – insbesondere der CLL – im Serum erhöht auftritt (FURTNER
M., 2001). MS-Patienten zeigen in aktiven Stadien ihrer Erkrankung eine deutlich gesteigerte
Konzentration an sCD137 in Serum und Cerebrospinalflüssigkeit (SHARIEF M. K., 2002).
1.1.1.4. Expression und Gewebeverteilung des CD137-Liganden
Der murine CD137-Ligand wird konstitutiv auf den Stromazellen des Knochenmarks und des
Thymus’ exprimiert (GOODWIN R. G. et al., 1993). Im murinen Immunsystem wird CD137-Ligand
von myelotischen Zellen konstitutiv synthetisiert: Er konnte auf Monozyten/Makrophagen
(POLLOK K. E. et al., 1994) und DCs (DEBENEDETTE M. A. et al., 1997) nachgewiesen werden. Von
den Zellen der lymphatischen Reihe exprimieren B-Zellen den Ligand (POLLOK K. E. et al.,
1994). Das bedeutet, daß CD137-Ligand von den APCs der Maus konstitutiv synthetisiert wird
(POLLOK K. E. et al., 1994; DEBENEDETTE M. A. et al., 1997).
Auf T-Lymphozyten der Maus wird CD137-Ligand aktivierungsabhängig synthetisiert (GOOD-
WIN R. G. et al., 1993). Darüber hinaus konnte der murinen CD137-Liganden auf verschiedenen
Maus-Lymphomzellinien gefunden werden (DEBENEDETTE M. A. et al., 1995).
Die mRNA des humanen CD137-Liganden konnte in Gehirn, Plazenta, Lunge, Skelettmuskel
und Niere nachgewiesen werden. Keine oder sehr wenig Transkripte sind in Herz, Leber und
Pankreas detektierbar (ALDERSON M. R. et al., 1994; PHILLIPS T. A. et al., 2001).
Auf Geweben myelotischen Ursprungs im humanen Immunsystem wird der CD137-Ligand
konstitutiv auf Monozyten/Makrophagen (ALDERSON M. R. et al., 1994; SALIH H. R. et al., 2001; SÖLL-
NER L., 2001) und in einer Unterklasse der dendritischen Zellen exprimiert, die in den T-Zell-
Zonen der Tonsillen in engem Kontakt zu den T-Lymphozyten stehen (SUMMERS K. L. et al.,
2001).
Einleitung
13
Auf Lymphozyten kommt der CD137-Ligand auf T-Zellen in geringer Dichte konstitutiv vor,
wird durch Aktivierung jedoch induziert (ALDERSON M. R. et al., 1994; ZHOU Z. et al., 1995). Primäre
B-Lymphozyten exprimieren humanen CD137-Ligand konstitutiv; sie reagieren auf Stimulie-
rung ebenfalls mit einer Synthesesteigerung (ALDERSON M. R. et al., 1994; PAULY S., 2000).
Transformierte und entartete Zellen tragen z.T. hohe Dichten an CD137-Ligand auf ihrer
Oberfläche: CD137-Ligand-Protein kann auf EBV-transformierten B-Zellen, verschiedenen
B- und monozytären Tumorzellinien, Zellinien aus soliden Tumoren, sowie primären Ovarial-
und Pankreaskarzinomen nachgewiesen werden (ALDERSON M. R. et al., 1994; SALIH H. R. et al.,
2000).
Die lösliche Form des CD137-Liganden konnte in den Zellkulturüberständen von nativen und
aktivierten B-Zellen sowie den Überständen aktivierter T-Lymphozyten und monozytärer
Zellen nachgewiesen werden. Gegenüber gesunden Probanden erhöhte Konzentrationen von
löslichem CD137-Ligand-Protein sind in den Seren von Patienten mit hämatopoetischen Er-
krankungen, u.a. der CLL, zu finden (SALIH H. R. et al., 2001).
1.1.2. Bidirektionale Signalübertragung durch das CD137-/CD137-
Ligand-System
Abb. 1.-2.: Schema der bidirektionellen Signalübertragung.
Einige Rezeptor-Ligand-Paare der TNFR-/TNF-Familie besitzen die Fähigkeit zur bidirektio-
nellen oder reversen Signalübertragung. Das bedeutet, sowohl der membranständige Rezep-
tor als auch der membrangebundene Ligand kann ein Signal in die jeweilige Zelle übertragen.
Signal 2 Signal 1
CD137
CD137-Ligand
Einleitung
14
CD137
TRAF-2
?
?
GCKR
MEKK1ASK1
MKK IKKa/ IKKß
p38JNK/ SAPK IkB/ NF-kB
jun ATF2 NF-kB
Bcl-xL, Bfl-1
LRR-1
1.1.2.1. Signaltransduktion durch CD137 und seinen Liganden
1.1.2.1.1. Signaltransduktion durch CD137
Murines CD137 interagiert mit der T-Zell-spezifischen src-Tyrosinkinase p56lck. Sie ist für
die optimale Aktivierung von T-Lymphozyten als Antwort auf die Antigenpräsentation essen-
tiell. Auch humanes CD137 enthält eine Konsensussequenz für diese Kinase (KIM Y.-J. et al.,
1993; SCHWARZ H. et al., 1993).
Die intrazellulären Domänen beider Homologe binden TRAF1 und 2 (ARCH R. H. UND THOMPSON
C. B., 1998; JANG I. K. et al., 1998; SAOULLI K. et al., 1998), humanes CD137 auch TRAF3 (JANG I. K. et
al., 1998). TRAF2 rekrutiert seinerseits ASK1. Dies hat die Aktivierung der JNK/SAPK bzw.
der p38 MAPK zur Folge (ARCH R. H. et al., 2000; CANNONS J. L. et al., 2000; KIM H. H. et al., 2000).
Die Assoziation von CD137 und TRAF2 führt zur Freisetzung von NFkB und dessen Trans-
lokation in den Zellkern (ARCH R. H. UND THOMPSON C. B., 1998; JANG I. K. et al., 1998). Diese Vor-
gänge haben in der Regel eine Aktivierung der betroffenen Zelle zur Folge.
Durch die Vernetzung von CD137 werden die antiapoptotischen Proteine Bcl-xL und Bfl-1
induziert (LEE H. W. et al., 2002). L. K. JANG et al. (2001) beschreiben, daß das Protein LRR-1
(leucine rich repeat protein) die mCD137-vermittelte NFkB-Aktivierung supprimiert und die
JNK1 herunterreguliert.
Abb. 1.-3. : Signaltransduktion durch CD137. Graphik nach CANNONS J. L. et al. 2000, ergänzt durch
JANG K. et al., 2001 und LEE H. W. et al. 2002.
Einleitung
15
CD137-Ligand
PTK
MEK1/ 2
p38 MAPK
z. B. IL-8
ERK1/ 2
PI3-Kinase
1.1.2.1.2. Signaltransduktion durch CD137-Ligand
Das CD137/CD137-Ligand-System funktioniert bidirektionell, d.h. der CD137-Ligand kann
in die ihn exprimierende Zellen ebenfalls ein Signal übertragen. Obwohl verschiedene Auto-
ren dies auf Grund der physiologischen Veränderungen von Zellen nach Stimulation mit
immobilisierten CD137 oder Antikörpern gegen CD137-Ligand belegen konnten (POLLOK K. E.
et al., 1994; DEBENEDETTE M. A. et al., 1995; 1997; CHU N. R. et al., 1997; LANGSTEIN J. et al., 1998;
SCHWARZ H. et al., 1998; LANGSTEIN J. und SCHWARZ H., 1999; MICHEL J. et al., 1999; TAN J. T. et al., 1999;
LANGSTEIN J. et al., 2000; SALIH H. R. et al., 2000; CANNONS J. L. et al., 2001; NOWAZA K. et al., 2001; SALIH
H. R et al., 2001), herrschte über die Signalwege lange Unklarheit.
2001 wies L. SÖLLNER in ihrer Dissertation nach, daß in monozytären Zellen durch die Liga-
tion des CD137-Liganden Tyr-Phosphorylierung unter der Betiligung von src-Kinasen indu-
ziert wird. An der Signaltransduktion wirken außerdem die p38 MAPK, MEK1, Erk1 und 2
mit. Die Proteinkinase A übt einen hemmenden Einfluß auf die reverse Signalübertragung
durch CD137-Ligand aus (SÖLLNER L., 2001).
Abb. 1.-4.: Signaltransduktion durch CD137-Ligand. Graphik nach SÖLLNER L., 2001.
Über cDNA-Arrays konnten u.a. folgende Zielgene einer Aktivierung monozytärer Zellen
über den CD137-Ligand identifiziert werden: die Proteintyrosinkinase hck, die Ser-/Thr-Kina-
se ILK, die a-Untereinheit des Fibronectin-Rezeptors, die g-Kette des IL-2-Rezeptors und der
Transkriptionsfaktor NFkB (SÖLLNER L., 2001).
Einleitung
16
1.1.2.1.3. Physiologische Funktionen, die durch CD137 vermittelt werden
Zellen myelotischer Herkunft können CD137 synthetisieren (KWON B. et al., 2002; 2003). Die Sti-
mulation von CD137 auf DCs erhöht die Sekretion von Zytokinen, wie IL-6 und IL-12, durch
die DCs. Zudem induziert es die Expression kostimulatorischer Moleküle (FUTAGAWA T. et al.,
2002; WILCOX R. A. et al., 2002). Die Proliferation antigenspezifischer T-Lymphozyten wird von
CD137-tragenden DCs gegenüber Kontrollzellen deutlich angeregt (WILCOX R. A. et al., 2002).
CD137 spielt bei der Aktivierung und der Fähigkeit von DCs ihrerseits T-Zellen zu aktivieren
eine Rolle (FUTAGAWA T. et al., 2002; KWON B. et al., 2002; WILCOX R. A. et al., 2002).
In Monozyten bewirkt die Vernetzung von CD137 Aktivierung, erkennbar an der Induktion
der proinflammatorischer Zytokine sowie der Inhibition von IL-10. Die Stimulation von
CD137 auf Monozyten führt in der Kokultur zur Apoptose von B-Lymphozyten. Dazu ist ein
direkter Kontakt zwischen B-Zellen und Monozyten notwendig (KIENZLE G. und VON KEMPIS J.,
2000).
NK-Zellen exprimieren CD137 nach Aktivierung durch IL-2 oder IL-15. Für die Entwicklung
einer effizienten anti-Tumor-Antwort nach der Gabe von anti-CD137-Antikörpern in Mäusen
ist dieser Zelltyp verantwortlich. CD137-stimulierte NK-Zellen fördern die Proliferation und
die IL-2-Empfindlichkeit aktivierter CTLs. Daher kann CD137 als kostimulatorischer Rezep-
tor auf NK-Zellen betrachtet werden, der in der anti-Tumor-Antwort als Vermittler zwischen
angeborenem und erworbenem Immunsystem fungiert (MELERO I. et al., 1998; WILCOX R. A. et al.,
2002i).
Entdeckt wurde CD137 bei Studien zur differentiellen Genexpression in aktivierten T-Zellen
(KWON B. S. und WEISSMANN S. M., 1989; SCHWARZ H. et al., 1993). Die Vernetzung von CD137 auf
der Oberfläche stimulierter T-Lymphozyten führt zu einem Signal, das die Proliferation der
T-Zellen, deren Produktion an proinflammatorischen Zytokinen und die Entwicklung zytoly-
tischer Effektorfunktionen steigert (GOODWIN R. G. et al., 1993; POLLOK K.E.. et al., 1993; ALDERSON
M. R. et al., 1994; DEBENEDETTE M. A.. et al., 1995; HURTADO J. C. et al., 1995; DEBENEDETTE M. A. et al.,
1997; SEO G. K. et al., 2001; WEN T. et al., 2002). CD137-Ligation fördert die Adhäsion humaner T-
Lymphozyten an Fibronectin. Somit könnte CD137 zusätzlich zur Aktivierung von T-Zellen
an deren Migration aus den Blutgefäßen ins Gewebe beteiligt sein (KIM Y.-J. et al., 1999). Fehlt
T-Zellen das kritische kostimulatorische Signal durch CD28 für die Aktivierung, kann über
CD137 CD28-unabhängig Kostimulation erfolgen. Die Proliferation der Zellen, die Synthese
von Zytokinen, von Aktivierungsmarkern und von erhöhten Perforinspiegeln und die Stei-
gerung der zytolytischen Effektorfunktion und ein verlängertes Überleben der Zellen durch
Einleitung
17
die Induktion des antiapoptotischen Moleküls Bcl-xL sind die Folge dieser Kostimulation (DE-
BENEDETTE M. A. et al., 1997; BUKZYNSKI J. et al., 2003). Werden CD3-aktivierte T-Zellen über
CD137 kostimuliert, exprimieren sie FasL und erlangen die Fähigkeit Tumorzellen in die
Apoptose zu treiben (EBATA T. et al., 2002).
Für Effektor-T-Zellen stellt CD137 ein starkes kostimulatorisches Molekül dar.
Chronisch aktivierte T-Zellen treibt ein Signal durch CD137 in die Apoptose (ALDERSON M. R.
et al., 1994).
Im allgemeinen wird zwischen den Funktionen CD4- und CD8-positiver T-Zellen differen-
ziert. T-Lymphozyten, die CD8 als kostimulatorisches Molekül tragen, werden als zytotoxi-
sche T-Zellen bezeichnet. CD4-positive T-Zellen unterschiedet man in Th1- und in Th2-Zel-
len. Th1-Zellen sekretieren proinflammatorische Zytokine, wie z.B. IL-2, TNF und IFN-g. Ih-
re Aufgabe ist die Unterstützung der zellvermittelten Immunität gegen intrazelluläre Patho-
gene durch Makrophagen. Th2-Zellen sekretieren IL-4, -5, -6, -10 und -13. Sie fördern da-
durch die humoralen Immunantworten gegen extrazelluläre Erreger (JANEWAY C. A. et al., 2002).
CD4-positive T-Zellen können durch Quervernetzung von CD137 zur Sekretion von Il-2, IL-4
und IFN-g angeregt werden. Unter CD137-Kostimulation erhöht sich sowohl die
Proliferation, als auch die Anzahl an langzeitüberlebenden Zellen (HURTADO J. C. et al., 1995;
CANNONS J. L. et al., 2001; WEN T. et al., 2002). Stimuliert man CD3-aktivierte Th2-Lymphozyten
über CD137, antworten sie mit verstärkter Proliferation und IL-4-Sekretion. Th1-Zellen
reagieren auf dieselbe Kostimulation durch CD137 deutlich weniger stark, entsprechend ihrer
weitaus geringeren CD137-Expression (VINAY D. S. und KWON B. S., 2000).
Insgesamt stellt CD137 ein wichtiges kostimulatorisches Molekül für die Aktivierung CD4-
positiver T-Zellen dar.
Im Gegensatz dazu steht, daß in Mäusen durch Injektion von CD137-Antikörpern Langzeit-
Anergie antigenspezifischer CD4-T-Zellen induziert werden kann. Dadurch wird auch die hu-
morale Immunantwort beeinträchtigt: Die so behandelten Tiere sind nicht mehr in der Lage,
nach Antigenkontakt adäquate Antikörperantworten zu entwickeln (KWON B. et al., 2000; MITTLER
R. S. et al., 2002).
Während des Alterns erhöht sich die Empfindlichkeit gegenüber infektiösen Substanzen
parallel zu einer verminderten Fähigkeit des Körpers, angemessen auf diese Antigene zu rea-
gieren. Dafür verantwortlich ist, daß gealterte CD4-positive T-Zellen in ihrer Kapazität be-
einträchtigt sind, nach Antigenkontakt zu proliferieren und zu überleben. Ähnliche Gründe
bringt man mit dem Phänotyp der Toleranz in Zusammenhang. Quervernetzung von CD137
durch agonistische Antikörper können die Toleranz junger Individuen im Tierversuch
Einleitung
18
aufheben und darüber hinaus das korrekte Antigen-priming der T-Lymphozyten älterer Tiere
wiederherstellen (BANSAL-PAKALA P. und CROFT M., 2002).
Differentiert man naive CD8-positive Nabelschnurblut-T-Zellen in Richtung zytotoxischer T-
Zellen und stimuliert diese Zellen über die Vernetzung von CD137, unterziehen sich die Lym-
phozyten massiven phänotypischen Veränderungen: Sie synthetisieren Oberflächenmarker,
die für Gedächtniszellen charakteristisch sind. Ihr Gehalt an Granzym B steigt und die CTLs
weisen eine erhöhte zytolytische Aktivität auf. Zudem zeigen diese Zellen ein verlängertes
Langzeitüberleben. Dies alles deutet darauf hin, daß der CD137-Signalweg an der Differen-
zierung zu von CD8-positiven zytotoxischen T-Zellen zu Effektor-Gedächtniszellen beteilt ist
(KIM Y.-J. et al., 2000).
Die Kostimulation von CD8-positiven T-Zellen durch Vernetzung der CD137-Moleküle auf
ihrer Oberfläche führt zur Steigerung der Zellteilung, der Produktion proinflammatorischer
Zytokine, verlängertem Überleben sowie erhöhten zytolytischen Effektorfunktionen (ZHOU Z.
et al., 1994; SHUFORD W. W. et al., 1997; VINAY D. S. und KWON B. S., 1999i; CANNONS J. L. et al., 2001;
LADERACH D. et al., 2002; WEN T. et al., 2002; MAUS M. V. et al., 2003). Das Überleben der Effektor-T-
Zellen nach einem CD137-Signal kann auf eine NF-kB-vermittelte Expressionssteigerung von
Bcl-xL und Bfl-1 zurückgeführt werden; Änderungen in der Expression von Bcl-2 werden
durch die CD137-Kostimulation nicht induziert (TAKAHASHI C. et al., 2000; LADERACH D. et al.,
2002; LEE H.-W. et al., 2002). Der Interaktion zwischen CD137 und seinem Liganden kommt
daher eine bedeutende Funktion hinsichtlich der Regulation zytotoxischer T-Zell-Antworten
zu.
Im Falle viraler Infektionen werden Virus-infizierte Zellen von CD8-positiven T-Zellen er-
kannt und zerstört. Werden Influenza TypA-infizierte Mäuse mit agonistischen monoklona-
len Antikörpern gegen CD137 behandelt, zeigen diese eine gesteigerte CD8-T-Zell-Antwort.
Diese äußert sich in einer vermehrten Anzahl antigenspezifischer CD8-T-Zellen in der Lunge
er-krankter und behandelter Tiere, sowie einer stark erhöhten ex vivo-Zytotoxizität dieser T-
Lymphozyten (HALSTEAD E. S. et al., 2003).
In der Erkennung und Abwehr von Tumoren spielen CD8-positive, zytotoxische T-Zellen
eine zentrale Rolle. Die Vernetzung von CD137 stellt die Induktion, Amplifikation und Auf-
rechterhaltung der CTL-Antwort sicher. Dieses „priming“ tumor-spezifischer T-Zellen durch
anti-CD137-Antikörper ist ebenso effektiv wie durch Helfer-T-Zellen (DIEHL L. et al., 2002).
Einleitung
19
Eine Behandlung tumortragender Mäusen mit agonistischen anti-CD137-Antikörpern führt
zur T-Zell-vermittelten Tumorabnahme. In vivo-Depletionsexperimente zeigen, daß dieses
Phänomen auf CD8-positive T-Zellen, nicht aber CD4-positive T-Lymphozyten oder NK-
Zellen zurückgeht. CD4-positive T-Zellen sind jedoch für die Aufrechterhaltung eines effek-
tiven Antitumorgedächtnisses erforderlich (MILLER R. E. et al., 2002; TARABAN V. Y. et al., 2002).
Helfer-T-Lymphozyten werden außerdem bei der Induktion neuer CTL-Antworten benötigt,
indem sie DCs aktivieren, CTL-Vorläuferzellen Antigene zu präsentieren. Zudem erhöht der
auf CD4-Helferzellen exprimierte CD137-Ligand Proliferation und Überleben von CTLs
während der Tumorantwort (GIUNTOLI R. L. et al., 2002).
CD137-Signalen kommt während der anti-Tumor-Immunantwort eine große Bedeutung zu.
Tragen Tumorzellen in Mäusen, beispielsweise durch Transfektion, CD137-Ligand, so ent-
wickeln die Tiere eine starke CTL-Antwort gegen diese Tumoren und erlangen langanhal-
tende Immunität gegen den Wildtyp-Tumor (MELERO I. et al., 1998i).
1997 veröffentlichte I. MELERO, daß die intraperitoneale Gabe von anti-CD137-Antikörpern
etablierte hoch- sowie niedrig-immunogene Tumoren in Mäusen zum Verschwinden bringt.
Diese Immunantwort benötigt CD4- und CD8-positive Lymphozyten. Begleitet wird sie von
einer deutlich gesteigerten tumorspezifischen CTL-Aktivität (MELERO I. et al., 1997; KIM J. A. et
al., 2001).
Um die immunologische „Ignoranz“ durch Anergie oder Deletion der CTLs im Falle niedrig-
immunogener Tumoren zu brechen, setzen R. A. WILCOX et al. zur Behandlung außer anti-
CD137-Antikörpern Tumorpeptide ein, die alleine für eine kurative CTL-Antwort nicht
ausreichen. Darufhin tritt die Regression der Tumore ein (WILCOX R. A. et al., 2002ii). Eine
weitere Arbeit aus dieser Gruppe kann IFN-g als entscheidenden Faktor für die CD137-ab-
hängige Regulation der Infiltration antigen-spezifischer CTLs in das Tumorgewebe charak-
terisieren (WILCOX R. A. et al., 2002iii).
In jüngerer Zeit werden Vakzinierungen als therapeutische Maßnahme gegen etablierte
Tumoren diskutiert. Die meisten tumordestruktiven Immunantworten sind zellvermittelt. Es
erscheint daher sinnvoll, mit DCs zu impfen, die mit Tumor-Antigen beladen wurden. DCs
präsentieren die Antigene dann den Effektor-T-Zellen, die für die anti-Tumor-Antwort verant-
wortlich sind. Um die anti-Tumor-Antwort noch zu steigern, können die DCs außerdem zur
Expression kostimulatorischer Moleküle veranlaßt werden. Bringt man im Mausmodell mit-
tels eines Vektors ein Modellantigen sowie das Gen für CD137-Ligand in DCs ein und ver-
wendet diese Zellen zur Immunisierung, zeigen die so behandelten Tiere eine deutlich erhöhte
Effektor- und Gedächtnis-CTL-Antwort gegenüber Mäusen, denen nur das Modellantigen
Einleitung
20
transferiert wurde (WIETHE C. et al., 2003). Transfiziert man zusammen mit dem CD137-Ligand-
das IL-12-Gen in DCs, erreicht man eine Regression der Tumoren und ein verstärktes
Überleben der therapierten Tiere (MARTINET O. et al., 2002; MARTINET O. et al., 2000).
Auch durch modifizierte Tumorzellen kann Immunisierung erfolgen (MOGI S. et al., 2000). Hu-
mane LAK-Zellen bzw. PBMCs, die mit CD137-Ligand-infizierten Tumorzellen kokultiviert
wurden, zeigen eine deutlich erhöhte Antitumor-Aktivität gegen diese Zellen. Dies ist auf eine
gesteigerte Sekretion von IFN-g, IL-2 und GM-CSF der LAK-Zellen zurückzuführen. Inhibi-
tion des Tumorwachstums durch die Gabe von LAKs und Vektor konnte auch für ein huma-
nes Tumormodell in SCID-Mäusen gezeigt werden (KATAYOSE Y. H.. et al., 2003).
1.1.2.1.4. Physiologische Funktionen, die durch CD137-Ligand vermittelt werden
Nicht nur durch den CD137-Rezeptor, auch durch den Liganden können Signale transduziert
werden. Immobilisiertes CD137-Fc stellt einen starken Aktivator für Monozyten dar. Die
Ligation des CD137-Liganden induziert die Expression proinflammatorischer Zytokine und
die Inhibition der Freisetzung von IL-10 und IL-1-RA. Die Vernetzung des CD137-Liganden
kann den aktivierungs-abhängigen Zelltod (AICD) in Monozyten und die Synthese apoptose-
assoziierter Proteine wie z.B. Fas-L auslösen. Zudem erhöht die Stimulation über den Ligan-
den die Adhärenz von Monozyten und die Vermittlung der Migration in Sphäroide. Damit in
Einklang steht die gesteigerte Expression von Adhäsionsmolekülen (LANGSTEIN J. et al., 1998;
LANGSTEIN J. und SCHWARZ H., 1999; LANGSTEIN J., 1999; LANGSTEIN J. et al., 2000; BECKE F., LANGSTEIN J.:
unveröffentlichte Daten). CD137-Ligand-Signale verlängern das Überleben von Monozyten durch
eine starke Induktion von GM-CSF. Außerdem können durch immobilisiertes CD137 – als
einzigem bislang bekannten Molekül – Proliferation und Endomitosen in Monozyten induziert
werden (LANGSTEIN J. et al., 1998; LANGSTEIN J. und SCHWARZ H., 1999; LANGSTEIN J., 1999; LANGSTEIN J.
et al., 2000). Myeloide Vorläuferzellen erhalten über den CD137-Ligand Signale, die sie dazu
veranlassen, erhöhte CD11c-Level zu synthetisieren. Die Produktion immunstimulatorischer
Moleküle, wie IL-12, CD86, MHC II und CD137-Ligand selbst, wird ebenfalls gesteigert.
Diese Veränderungen werden von einer morphologischen Differenzierung hin zu adhärenten
Zellen begleitet (KIM Y.-J. et al., 2002). Dies bedeutet, daß CD137 für Monozyten CD137 einen
wichtigen Aktivierungs-, und Differenzierungsfaktor darstellt.
Die Vernetzung des CD137-Liganden auf stimulierten murinen oder humanen B-Zellen führt
zu einer erhöhten Proliferation der Zellen und gesteigerter IgM-Produktion (POLLOK K. E. et al.,
1994; PAULY S. et al., 2002). Dies bedeutet die Aktivierung der B-Zellen durch CD137-Ligand-
Signale.
Einleitung
21
In stimulierten humanen T-Lymphozyten kann die Vernetzung des CD137-Liganden die anti-
CD3-induzierte Proliferation vollständig verhindern (SCHWARZ H. et al., 1996). Signaltransduk-
tion durch CD137-Ligand induziert Fas-unabhängig Apoptose (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J.
et al., 1999).
Funktioneller CD137-Ligand wird auf verschiedenen Karzinomzellinien exprimiert. Eine
Ver-netzung von CD137-Ligand auf der Oberfläche dieser Zellen führt zur Steigerung der IL-
8-Expression. Keine signifikanten Änderungen konnten für IL-6, IL-12, TNF, IL-10 und
TGFß nachgewiesen werden (SALIH H. R. et al., 2000).
1.1.2.1.5. Physiologische Funktionen, die durch das CD137-/CD137-Ligand-System
vermittelt werden – Studien an knockout- bzw. transgenen Tieren
Eine Sonderstellung nehmen Studien ein, die mit CD137- bzw. CD137-Ligand-defizienten
Mäusen durchgeführt wurden, da sich hier die Rolle der bidirektionellen Signalübertragung
direkt offenbart. Phänotypen, die sich in knockout-Tieren zeigen, können sowohl von einem
fehlenden Signal durch den Rezeptor, als auch durch ein ungenügendes Signal durch den Li-
ganden verursacht sein. Dies trifft jedoch nur zu, wenn für das jeweilige Molekül keine
weiteren Interaktionspartner zur Verfügung stehen.
Die CD137-knockout-Maus entwickelt sich normal, ist lebensfähig und fertil. Die humoralen
Immunantworten auf virale Infektionen sind mit denen von wt-Mäusen vergleichbar. Die
IgG2a- und IgG3-Antworten auf KLH sind reduziert. CD137-defiziente Tiere zeigen nach Sti-
mulation erhöhte T-Zell-Proliferation, sind in ihrer Fähigkeit IL-2, IFN-g, sowie IL-4 zu se-
kretieren jedoch eingeschränkt. Auch die CTL-Aktivität der knockout-Mäuse ist verringert.
Darüber hinaus zeigt sich die Rolle von CD137 in der Regulation des Zellwachstums myelo-
ider Vorläuferzellen darin, daß sich diese Zellen im peripheren Blut, im Knochenmark und in
der Milz CD137-defizienter Mäusen anreichern (KWON B. S. et al., 2002).
CD137-Ligand-defiziente Mäuse entwickeln weitgehend normale humorale Immunantworten
gegen Viren. Ihre antivirale CTL-Aktivität ist im Vergleich zu wt-Mäusen jedoch geschwächt
(BERTRAM E. M. et al., 2002; DEBENEDETTE M. A. et al., 1999; TAN J. A. et al., 1999). Dies kann als
Hinweis darauf gewertet werden, daß CD137-Kostimulation in vivo in erster Linie für CD8-
T-Zell-Antworten von Bedeutung ist. Ein weiteres Modell für intrazelluläre Infektionen stellt
das Bakterium L. monocytogenes dar. Während Infektionen mit diesem Organismus ist in
CD137-Ligand-defizienten Mäusen die CD8-T-Zell-Antwort gestört (SHEDLOCK D. J. et al. ,
2003).
Einleitung
22
Stellt man das CD137-Ligand-Gen unter die Kontrolle des MHCII-Ea-Promotors und expri-
miert ihn in APCs über, so entwickeln transgene Mäuse Splenomegalie und eine selektive De-
pletion von B-Zellen. Die Mäuse zeigen unzureichende humorale Antworten nach Antigen-
Kontakt. Milzzellen transgener Tiere sind nicht mehr imstande, allogene T-Zellen zu stimu-
lieren. Aus diesen Untersuchungen ergibt sich für den CD137-Liganden eine weitere Funktion
in der Regulation humoraler Immunantworten und der Antigenpräsentation (ZHU G. et al.,
2001).
1.2. Die chronisch lymphatische Leukämie (CLL)
Die chronisch lymphatische Leukämie vom B-Zell-Typ ist ein niedrig-maliges Non-Hodgkin-
Lymphom. Die CLL stellt die häufigste Leukämieerkrankung des höheren Lebensalters in der
westlichen Welt dar.
Der schleichende Verlauf der CLL manifestiert sich durch eine Vielzahl diffuser Symptome,
wie Lymphknotenschwellungen, Gewichtsabnahme, Müdigkeit, Kopfschmerzen, Blutungen
und Infektneigung. Im fortgeschrittenen Stadium kommt es zu Spleno- und Hepatomegalie.
Es treten Zeichen der Knochenmarksinfiltration auf, so Anämie, Thrombo- und Neutropenie
trotz peripherer Leukozytose durch die malignen B-CLL-Zellen. Außerdem neigen CLL-
Patienten zu Autoimmunphänomenen. Das mittlere Überleben nach Diagnosestellung beträgt
ca. 12 Jahre (ACHENBACH W., 1997; BERGER D. P. et al., 1998).
Charakterisiert ist die CLL durch klonale Expansion und Akkumulation morphologisch reif
erscheinender, immunologisch inkompetenter B-Lymphozyten in der G0/G1-Phase des Zell-
zyklus. Die Zellen zeigen Expression von CD5 sowie Membranimmunglobulin mit niedriger
Affinität gegenüber Autoantigenen (BERGER D. P. et al., 1998; JURLANDER J., 1998).
Beim Auftreten der Erkrankung spielen zytogenetische Faktoren eine Rolle. Es wurden in B-
CLL-Zellen Deletionen und Translokationen des kurzen Arms von Chromosom 13 beobach-
tet. Dort lokalisieren u.a. bekannte Onkogene, wie BRCA und Rb. Chromosom 6 maligner
Zellen kann im Bereich der Gene für TNF und LT-ß von Deletionen betroffen sein,
Chromosom 11 in der Bcl1-Region, wo das Cyclin1-Gen lokalisiert. All diese Gene spielen
bei der Zellzyklus- und/ oder Apoptoseregulation eine Rolle. Eine weitere genetische Abnor-
malität stellen t(14;19)-Translokationen dar, welche die Isotypwechselregionen von IgA auf
Chromosom 14 betreffen und in einer gesteigerten Expression von Bcl3 resultieren, einem
Transkriptionsfaktor der IkB-Familie. Assoziiert ist diese Translokation häufig mit einer Tri-
somie von Chromosom 12. Auf Chromosom 17 gehen Aberrationen häufig mit dem Verlust
des Tumorsuppressorgens TP53 einher. Diese chromosomale Mutation ist einer der wenigen
Einleitung
23
Faktoren, die eine Prognose über den Krankheitsverlauf zulassen (DÖHNER H. et al., 1998;
JULIUSSON G. und MERUP M., 1998; KIPPS T. J., 1998; REED J. C., 1998; STILGENBAUER S. et al., 1998;
KEATING M. J., 1999).
Außerdem spielen zur Zeit für die klinische Prognose folgende Parameter eine Rolle: Lym-
phozytenverdopplungszeit, Knochenmarksinfiltration, CD20-Expression auf CD5-positiven
B-CLL-Zellen, sowie die ICAM1-, CD23- und IL-2R-Spiegel im Serum. Die Konzentration
an löslichem ß2-Mikroglobulin, einem Bestandteil des HLA-Komplexes, gibt gute
Anhaltspunkte für das Überleben der Patienten. Als Zytokinlevel, die eine Vorhersage
erlauben, gelten die Mengen an TNF, bFGF, IL1, IL1ß, IL-6 und IL-10. Außer für ß2-
Mikroglobulin sind die Korrelationen mit dem Krankheitsverlauf jedoch wenig zufriedenstel-
lend (MAVRIDIS A. K., et al., 1998; ZWIEBEL J. A. UND CHESON B. D.., 1998; AGUILAR-SANTELISES M. et al.,
1999; MOLICA S. et al., 1999;).
Die scheinbare Expansion und Akkumulation der malignen B-Lymphozyten in der CLL ist
auf eine gestörte Apoptoseregulation dieser Zellen zurückzuführen. B-CLL-Zellen exprimie-
ren große Mengen der antiapoptotischen Proteine Bcl2 und Bcl-xL. Dagegen wird nur wenig
Bax und Bcl-xS synthetisiert. Dies verschiebt das Gleichgewicht zwischen pro- und antiapo-
ptotischen Faktoren in Richtung der antiapoptotischen. Da diese Moleküle in Form von
Homo- und Heterodimeren wirken, beeinflußt dies die Apoptoseempfindlichkeit der CLL-
Zellen. CLL-Zellen sind imstande, selbst der Apoptoseinduktion durch Fas-Ligation nach
CD40-Stimulation zu widerstehen (KIPPS T. J., 1997; OSORIO L. M. et al., 1997; KITADA S. et al., 1998;
JURLANDER J., 1998; KIPPS T. J., 1998; MEINHARDT G. et al., 1998; OSORIO L. M und AGUILAR-SANTELISES
M., 1998; REED J. C.; 1998; SÖDERBERG O., 1998; KEATING M. J.; 1999; LAGNEAUX L. et al., 1999; FURMAN R.
R. et al., 2000).
Da CLL-Zellen in Kultur spontan apoptotisch absterben, wird postuliert, daß die für das
Langzeitüberleben notwendigen Signale u.a. auf Interaktionen der B-CLL-Zellen in vivo zu-
rück zu führen sind. Autokrine Zytokine, die B-CLL-Zellen vor Apoptose zu schützen vermö-
gen, sind IL-1, -6, -8, -10 bFGF und IFN-g. Zudem üben IL-4, IL-13 und IFN-a eine antiapo-
ptotische Funktion aus (KIPPS T. J., 1998; MEINHARDT G. et al., 1998; SÖDERBERG O.; 1998).
Direkte Wechselwirkungen zwischen CLL-Zellen und anderen Zelltypen tragen ebenfalls zum
Überleben des malignen Klons bei. Hierbei spielen Zell-Zell-Kontakte über CD11b/ CD18 so-
wie die Ligation von CD6 und die Stimulation über den BCR eine Rolle (KIPPS T. J., 1998;
MEINHARDT G. et al., 1998; SÖDERBERG O.; 1998).
Einen Faktor mit umstrittenen Funktionen stellt TGFß dar: In in Kultur zur Proliferation sti-
mulierten Zellen inhibiert TGFß die DNA-Synthese, wenn auch in schwächerem Maß als bei
gesunden B-Lymphozyten. B-CLL-Zellen zeigen eine deutlich erniedrigte Expression für den
Einleitung
24
TGFß-Rezeptor. So erlangen diese Zellen trotz der gesteigerten Produktion von TGFß einen
Überlebensvorteil. B-CLL-Zellen zeigen darüber hinaus Resistenz gegenüber den Apoptose-
induzierenden Effekten von TGFß (MEINHARDT G. et al., 1998; SÖDERBERG O.; 1998).
1.3. Zielsetzung dieser Arbeit
M. FURTNER wies in seiner Dissertation nach, daß CLL-Patienten erhöhte Serumspiegel an
sCD137 aufweisen und die Konzentration an CD137 mit der Leukozytenzahl dieser Patienten
korreliert (FURTNER M., 2001). Weitere Vorarbeiten von Dr. S. POLEY vom Klinikum der
Ludwig-Maximilians-Universität München Großhadern beinhalten FACS-Analysen, die die
Synthese der membrangebundenen Form von CD137 auf Leukozyten von Patienten mit
verschiedenen Leukämieerkrankungen belegen. Normalerweise exprimieren B-Lymphozyten
jedoch kein CD137-Protein (KIENZLE G. et al., 1997; MICHEL J., unveröffentlichte Daten).
Dies und die Tatsache, daß immobilisiertes CD137 Apoptose in aktivierten T-Lymphozyten
induzieren kann (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al. , 1999), weisen darauf hin, daß die
Expression von CD137 Tumorzellen einen Vorteil bieten kann.
Die hier vorliegende Arbeit untersucht die Freisetzung von löslichem CD137 in den Seren
von B-CLL-Patienten und den Kulturüberständen von Patientenzellen, sowie die Expression
von membrangebundenen CD137 auf den B-CLL-Lymphozyten. Ein weiteres Ziel dieser
Arbeit stellte die Charakterisierung der Funktion von mCD137 auf Tumorzellen und die
Beleuchtung der dahinterstehenden Mechanismen dar.
Material und Methoden
25
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Organismen
2.1.1.1. Bakterien
E.coli-Stämme
DN10B
F-, mcrA, D(mrr-hsdRMS-mcrBC), F80d, lacZDM15, Bethesda Research Laboratories
DlacX174, deoR, recA1, araD139, D(ara, leu) 7697,
galU, galK, l-, rpsL, endA1, nupG
TOP10
F-, mcrA, D(mrr-hsdRMS-mcrBC), F80lacZDM15, Invitrogen, Paisley, UK
DlacX74, deoR, recA1, araD139, D(ara, leu)7697,
galU, galK, rpsL (StrR), endA1, nupG
2.1.1.2. Säugerzellen
Zellinien
CHO ATCC-Nr.: CLL 61, Ovarialepithelzellen des Chinesischen Hamsters
COS-1 ATCC-Nr.: CRL 1650, Passage 9 der CV-1 Zellinie, mit Origin-defekter Mu-
tante des SV-40 transfiziert, Nierenepithelzellen der grünen Meerkatze
Jurkat ATCC-Nr.: CRL 8130; akute T-Zell-Leukämie, T-Lymphozyten
K562 ATCC-Nr.: CCL 243; Chronisch myelotische Leukämie (CML), Lympho-
blasten
Raji ATCC-Nr.: CCL 86; Burkitt-Lymphom, B-Lymphozyten
Primäre humane Zellen
PBMC gesunder männlicher Probanden als Isolate aus Frischblut im Rahmen dieser
Arbeit
PBMC von CLL-Patienten als Kryopräparationen; M. GOLLER, Würzburg
Material und Methoden
26
Anteil an
Name
Ge-
schlecht Alter
x 103
Leuko-
zyten/
µl Blut
B-
Zellen
CD5+
B-
Zellen
CD23+
B-
Zellen
T-
Zellen
HLA-
DR+
T-
Zellen
NK-
Zellen
ß2-
Mikro-
globulin
[mg/ l]
1 w 73 14,0 90,3 90,3 n.b. 4,8 n.b. n.b. n.b.
2 m 67 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.
3 w 65 50,7 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.
4 m 64 16,0 65,0 61,0 55,0 29,0 11,0 19,0 n.b.
5 m 62 n.b. 88,8 n.b. 75,6 5,0 n.b. n.b. n.b.
6 n.b. n.b. n.b. 79,0 19,2 55,2 11,4 n.b. n.b. n.b.
7 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.
8 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.
9 w 79 40,0 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.
101
102
m 77 n.b.
122,0
83,5
96,6
79,3
97,3
68,0
78,2
10,5
1,1
n.b.
1,1
n.b.
13,0
n.b.
2,88
11 m 65 110,0 96,6 0 93,5 1,2 1,2 1,2 2,40
12 m 62 52,0 69,0 18,0 17,0 17,0 11,0 8,0 1,80
13 n.b. 57 57,0 94,5 n.b. 88,3 2,7 n.b. n.b. n.b.
14 m 69 71,5 97,0 95,0 92,0 1,0 0,2 7,0 2,60
15 m 57 66,7 93,8 93,8 88,6 3,1 1,6 3,3 0,90
16 m 67 84,0 91,0 91,0 74,0 1,0 0,2 14,0 4,10
17 m 85 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.
18 m 61 16,8 81,4 79,6 69,1 14,9 2,7 7,7 1,99
19 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.
20 w 61 233,0 97,5 19,2 86,6 11,4 n.b. n.b. n.b.
21 w 60 19,5 83,0 83,0 63,8 13,1 1,8 10,6 1,20
22 m 61 30,0 90,0 89,2 80,1 3,1 3,1 7,6 1,50
23 n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b. n.b.
24 w 63 39,0 90,0 91,0 90,0 5,0 5,0 n.b. n.b.
25 m 57 54,1 87,2 n.b. 85,9 2,5 n.b. n.b. n.b.
Tab. 2.-1.: Klinische Parameter des Würzburger CLL-Patientenkollektivs, (GOLLER M.: persönliche
Mitteilung); die Lymphzytenpopulationen sind in Prozent an der Lymphozytengesamtzahl an-
gegeben; 101: Proben vom 11.02.99, 102: Proben vom 27. 10. 99, n.b.: nicht bekannt
Material und Methoden
27
Einordnung oben stehender Daten zu den Würzburger CLL-Aliquots: Die Leukozyten-
zahl Gesunder beträgt 4,8 – 10,0 x103 Leukozyten/µl Blut. 20 bis 30 % der zirkulierenden
Lymphozyten sind B-Zellen. Bei der CLL sind Leukozytenzahl, sowie der Anteil an B-Zellen
stark erhöht. ß2-Mikroglobulin ist ein Marker für den klinischen Verlauf der CLL (ZWIEBEL J.
A. und CHESON B. D., 1998; MAVRIDIS A. K. et al., 1998; MOLIKA S. et al., 1999). Eine Konzentration von
0,8 bis 2,4 mg/l findet man auch im Serum gesunder Individuen (PSCHYREMBEL, 1998). Das hohe
Lebensalter der Patienten (>57 y) und der Anteil von 68 % männlichen Patienten am Gesamt-
kollektiv spiegelt die Epidemiologie der B-CLL wieder (vgl. auch BERGER D. P. et al., 1997).
2.1.2. Nährmedien
für Bakterien
LB-Medium 10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
für Platten: 15 g/l Agar
autoklavieren
zur Selektion: 100 µg/ml Ampicillin
für Säugerzellen
RPMI 1640 (MOORE G. E. et al., 1967) Sigma, Deisenhofen
DMEM (DULBECCO R. und FREEMAN G., 1959) Biochrom, Berlin
RPMI 1640 und DMEM wurden als vorgemischtes Pulver bezogen und in demineralisiertem
Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit NaHCO3 für DMEM auf 7,3 und für RPMI auf 8,1
eingestellt. Nach Sterilfiltration wurden die Medien mit folgenden Zusätzen versehen:
10% (v/v) FKS
0,1% (v/v) Penicillin/ Streptomycin
und je nach Pulvercharge:
1 mM Natriumpyruvat
2 mM L-Glutamin
sowie 0,0005% (w/v) Phenolrot, wenn es die Fragestellung erforderte.
Material und Methoden
28
2.1.3. Antibiotika
Penicillin Pansystems, Aidenbach
Streptomycin Pansystems, Aidenbach
Ampicillin Sigma, Deisenhofen
2.1.4. Antikörper und Konjugate
2.1.4.1. Antikörper gegen CD-Antigene
anti-human CD3-FITC (Klon UCHT1, Maus IgG1k) Dako, Glostrup, Dänemark
anti-human CD5-RPE (Klon DK23, Maus IgG1k) Dako, Glostrup, Dänemark
anti-human CD19-FITC (Klon HD37, Maus IgG1k) Dako, Glostrup, Dänemark
anti-human CD20 (Kaninchen) Dako, Glostrup, Dänemark
anti-human CD20-PE (Klon B-Ly1, Maus) Dako, Glostrup, Dänemark
anti-human CD95 (Klon SM1/23 Maus IgG2b) Bender Med Systems,Wien,
Österreich
anti-human CD137 (Klon m127, Maus IgG1) Immunex, Seattle, USA
anti-human CD137 (Klon BBK-2, Maus IgG1) Biosource Int., Camarillo,
CA, USA
anti-human CD137 (polyklonales Serum, Ziege) R&D Systems, Wiesbaden
anti-human CD137-RPE (Klon 4B4-1, Maus IgG1k) Ancell, Bayport, MN, USA
2.1.4.2. Antikörper gegen Immunglobuline
anti-Multilink: anti-Ziege, -Maus, -Kaninchen (Schwein) Dako, Glostrup, Dänemark
anti-Maus IgG-FITC (Ziege) Dianova, Hamburg
anti-Maus IgG-RPE (Ziege) Dianova, Hamburg
2.1.4.3. Antikörper gegen sonstige Antigene
anti TGFß1 (Klon 9016.2 Maus IgG1 anti-human) R&D Systems, Wiesbaden
anti IL-10 (Klon 23738.111 Maus IgG2B anti-human) R&D Systems, Wiesbaden
2.1.4.4. Isotypkontrollantikörper
Maus-IgG Sigma Deisenhofen
Maus-IgG1k Sigma, Deisenhofen
Maus-IgG1-bio Cymbus Biotechnology, Chandlers Ford, UK
Maus-IgG1-FITC Dako, Glostrup, Dänemark
Material und Methoden
29
Maus-IgG1-FITC Cymbus Biotechnology, Chandlers Ford, UK
Maus-IgG1-RPE Dako, Glostrup, Dänemark
Maus-IgG1-RPE Cymbus Biotechnology, Chandlers Ford, UK
2.1.4.5. sonstige Immunglobuline
rek. CD137-humanIgG-Fc-Fusionsprotein Ancell, Bayport, USA
human IgG, Fc-Fragment Accurate Chemical & Scientific Corp, Westbury,
USA
2.1.5. Chemikalien und Reagenzien
Wenn nicht gesondert aufgeführt, wurden die verwendeten Chemikalien mit dem Reinheits-
grad p. a. von der Firma Merck (Darmstadt) bezogen.
ABTS Roche Diagnostics, Mannheim
ABTS-Puffer Roche Diagnostics, Mannheim
Agar Behrens, Hamburg
Agarose Ultra PureTM Gibco, Eggenstein
AP-Substrat (p-Nitrophenylphosphat,
20 mg-Tabletten) Sigma, Deisenhofen
Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen
BSA (Rinderserumalbumin) Sigma, Deisenhofen
CalceinAM Molecular Probes, Leiden, Niederlande
DAB-Tabletten Dako, Glostrup, Dänemark
DMEM (D-2902) Sigma, Deisenhofen
EDTA (Ethylendiamintetraacetylsäure) Sigma, Deisenhofen
Ethidiumbromid Sigma, Deisenhofen
FKS (F-7524) Sigma, Deisenhofen
Heparin Novo Nordisk, Mainz
Histopaque-1077 Sigma, Deisenhofen
Hoechst 33342 Sigma, Deisenhofen
Humanes rekombinantes IL-2 R&D Systems, Wiesbaden
Kalziumionophor A23187 Sigma, Deisenhofen
L-Glutamin Pansystems, Aidenbach
Magermilchpulver (Trockenmilch) Nestle, Vevey, Schweiz
Material und Methoden
30
Methyl-3H-Thymidin (1 mCi/ ml wäßrige Lösung) Pharmacia, Freiburg
MikroscintTM 20 Packard Bioscience, Groningen, Nieder-
lande
MoBiGlow MoBiTec, Göttingen
Natrium-Pyruvat Sigma, Deisenhofen
PHA Boehringer Mannheim, Mannheim
PMA Calbiochem, Bad Soden
Phenol Roth, Karlsruhe
Phenolrot Biochrom, Berlin
PI Sigma, Deisenhofen
Pyruvat Pansystems, Aidenbach
RNAzolB AMS, Lugano, Schweiz
RPMI 1640 Biochrom, Berlin
Streptavidin-Alkalische Phosphatase Dako, Glostrup, Dänemark
Trypanblau Biochrom, Berlin
Trypsin Gibco, Eggenstein
Vectashield H-1000 Linaris GmbH, Wertheim-Bettingen
2.1.6. Enzyme
Superscript II Reverse Transkriptase Gibco, Eggenstein
Taq-Polymerase Pharmacia, Freiburg
HindIII Roche Diagnostics, Mannheim
NotI Roche Diagnostics, Mannheim
BamHI Roche Diagnostics, Mannheim
2.1.7. Kits
Annexin-V-FLUOS Staining Kit Roche Diagnostics, Mannheim
Caspase3 Cellular Activity Assay Kit Calbiochem, La Jolla, CA, USA
CD3 pan T-Dynabeads M450 Dynal, Oslo, Norwegen
Nucleic Dot Metric Geno Technology, St. Louis, MO, USA
Nucleobond, DNA-Präparationskit Macherey & Nagel, Düren
pcDNA3.1./V5-His TOPO TA Expression Kit Invitrogen, Paisley, UK
Quantikine human IL-10 R&D-Systems, Wiesbaden
Quantikine human TGFß1 R&D-Systems, Wiesbaden
Material und Methoden
31
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden
StreptABComplex/HRP Duet Detection Kit Dako, Glostrup, Dänemark
T Cell Negative Isolation Kit Dynal, Oslo, Norwegen
2.1.8. Nukleinsäuren
2.1.8.1. Desoxyoligonukleotide
dNTPs Pharmacia, Freiburg
Hexanukleotid (N6) Pharmacia, Freiburg
2.1.8.2. Primer
Primer für die RT-PCR zur Analyse der CD137-Expression
Primer für humanes mCD137
G-ILA-sen 5´-ATC ATG GGA AAC AGC TGT TAC AAC-3´ (nt 3-21)
G-ILA-AS 5´-TGG TCC ACA GAC CAC GTC CCT CTC-3´ (nt 480-457)
Primer für humanes mCD137 und sCD137:
ILA-241-sen 5’-ACC AGC AAT GCA GAG TGT GAC-3’ (nt 241-262)
ILA-3’-UTR-AS 5’-TAT GTA GGA TGG TGT TCT TGC-3’ (in der 3’ untranslatierten
Region nt 840-861))
Primer für G3PDH
G3PDH-S 5´-TGG TAT CGT GGA AGG ACT CAT GAC-3´
G3PDH-AS 5´-ATG CCA GTG AGC TTC CCG TTC AGC-3´
Primer für die Klonierung mittels des pcDNA3.1/V5-His TOPO TA Expression Kits
Primer für das ILAtrunc-Fragment:
5’ ILA 5’-CAC CAT GGG AAA CAG CTG TTA CAA C-3’ (nt 1-21)
3’ ILAtrunc 5’-TCA TCA GAA ACG GAG CGT GAG GAA GAA-3’ (nt 613-639)
Primer für das ILAw/otm-Fragment:
5’ ILA 5’-CAC CAT GGG AAA CAG CTG TTA CAA C-3’ (nt 1-21)
3’ ILAw/otm 5’-TCA TCA CTG CGG AGA GTG TCC TGG CTC-3’ (nt 534-560)
Die fett gedruckten Basen sind für die Integration des Fragments in den pcDNA3.1/V5-His-
TOPO-TA-Vektor notwendig.
Material und Methoden
32
2.1.8.3. Plasmide und Konstrukte
pcDNA3 Invitrogen, Paisley, UK
pcDNA3.1./V5-His TOPO Version G Invitrogen, Paisley, UK
pcDNA3::(h)CD137 ( = pcDNA-ILA-sense) H. SCHWARZ, Regensburg
pcDNA3::gfp H. SCHWARZ, Regensburg
pcDNA3.1.::ILAtrunc diese Arbeit
pcDNA3.1.::ILAw/otm diese Arbeit
pRc/RSV (= RSV) Invitrogen, Paisley, UK
pRc/RSV::ILA-sense (= RIS) H. SCHWARZ, Regensburg
pRc/RSV::ILA-antisense (= RIA) H. SCHWARZ, Regensburg
2.1.9. Molekulargewichtsstandards
DNA-Standard II Roche Diagnostics, Mannheim
DNA-Standard VI Roche Diagnostics, Mannheim
DNA-Standard X Roche Diagnostics, Mannheim
2.1.10. Puffer und Lösungen
10 x Agarosegel-Ladepuffer 0,25 % (w/v) Bromphenolblau
0,25 % (w/v) Xylencyanol
30 % (v/v) Glyzerin
1 mM EDTA
Ampicillin-Stammlösung (1000x) 50 mg/ ml Ampicillin
in Aqua bidest
AP(Alkalische Phosphatase)-Puffer (VOLLER A. et al., 1976)
1 mM MgCl2
1 mM ZnCl2
100 mM Glyzin
pH 10,4 (mit NaOH einstellen)
Material und Methoden
33
AP(Alkalische Phosphatase)-Puffer (alternativ zu obigem)
48 ml Diethanolamin
50 ml HCl
24,5 mg MgCl2
ad 500 ml mit Aqua bidest
pH 9,8
DEPC-H2O 0,1 % DEPC (v/v) in Aqua bidest
ün unter Rühren inkubiert und autoklaviert
DNA-Präparationslösung I 50 mM Glukose
25 mM Tris/ HCl, pH 8,0
10 mM EDTA
DNA-Präparationslösung II 0,2 M NaOH
1 % SDS
DNA-Präparationslösung III 60 ml 5 M NaOAc
11,5 ml Eisessig
28,5 ml Aqua bidest
Erythrozyten-Lysepuffer 8,2 g/l NH4Cl
0,84 g/l NaHCO3
3,7 mg/l EDTA
pH 7,4
Ethidiumbromid-Stammlösung Ethidiumbromid (10 mg/ml)
in Aqua bidest
EtBr-Gebrauchslösung 0,004 % (v/v) der Stammlösung
in Aqua bidest
Material und Methoden
34
Hämalaun 2,0 g Hämatoxylin
in 2 l Aqua bidest lösen
0,4 g Natriumjodat
100 g Aluminiumkaliumsulfat (Kalialaun)
bei RT lösen
100 g Chloralhydrat
2 g Zitronensäure-Monohydrat
Hämatoxylin-Eosin-Lösung 2 l Hämalaun
20 g Eosin
lösen und filtrieren
einige Tropfen 96% Essigsäure dazu
FACS-Puffer 0,5 % FKS
0,1 % NaN3 in PBS
2% Paraformaldehyd-Lösung 1 g Paraformaldehyd
25 ml Aqua bidest
50 µl 10 N NaOH
bei 650C unter Rühren lösen
25 ml 0,2 M Phosphatpuffer
10x PBS (phosphate-buffered saline)
80,0 g/l NaCl (150 mM)
2,0 g/l KCl (2,5 mM)
14,4 g/l Na2HPO4 (8 mM)
2,4 g/l KH2PO4 (2 mM)
ad 1 l Aqua bidest
pH 7,4 mit HCl
0,2 M Phosphatpuffer 6,35 g NaH2PO4 * H2O
55,25 g Na2HPO4 * 2 H2O
ad 1 l Aqua bidest
Material und Methoden
35
5 x TAE-Puffer 200 mM Tris/Acetat, pH 8,0
5 mM EDTA
pH 8,3
10 x TBE-Puffer 890 mM Tris/Acetat pH 8,0
890 mM H2BO3
2 mM EDTA
pH 8,0
X-Gal-Stammlösung 40 mg/ml X-Gal in DMS
zur Selektion: 40 µl/Platte
Lagerung bei –20°C im Dunkeln
2.1.11. Sonstiges Material
Deckgläser Engelbrecht, Edermünde
Einmalartikel für die Zellkultur Greiner, Frickenhausen
Einmal-Sterilfilter Millipore, Eschborn
ELISA-Platten (Falcon 3912) Becton Dickinson, Oxnard, Kalifornien
FACS-Röhrchen, Falcon-2052 Labor Schubert, Schwandorf
Filterplatten UniFilterTM-96 (6F/CTM) Packard, Meriden, USA
Gewebekulturplatten Costar, Corning, New York
Halbmikroküvetten Sarstedt, Nümbrecht
Silicagelsäulen Nucleobond AX 500 Macherey & Nagel, Düren
Slide-A-Lyzer 10 kD Pierce, Rockford, IL, USA
Superfrost+-Objektträger Labor Schubert & Weiss, Iphofen in den
Weinbergen
Thomakammern Labor Schubert, Schwandorf
TopSealTM-A (Sealing Film) Packard, Meriden, USA
2.1.12. Geräte
Spannungsgeräte
200/2,0 Constant Voltage Power Supply Bio-Rad, München
Gene Power Supply GPS 200/400 Pharmacia, Freiburg
LKB 2303 Multidrive XL LKB, Heidelberg
Material und Methoden
36
Zentrifugen
Zentrifuge 5417 C Eppendorf, Hamburg
J2-21 M/E Ultrazentrifuge Beckmann, Palo Alto, USA
Biofuge 13 Heraeus, Osterode
Sepatech Heraeus, Osterode
Waagen
R160P Sartorius, Göttingen
L2200S Sartorius, Göttingen
Mikroskope
Labovert FS Leitz, Wetzlar
HM Lux 3 Leitz, Wetzlar
Axiovert 10 Zeiss, Jena
Leica DMLS Leica, Bensheim
Axiovert S 100 Zeiss, Jena
Objektive
Plan-Neofluar 10x, 20x, 40x Zeiss, Jena
Plan-Apochromat 63x/1,40 Zeiss, Jena
C-Plan 4x, 10x, 20x, 40x Leica, Bensheim
Periplan GF 12,5x, 10x Leitz, Wetzlar
sonstige Geräte
Autoklav 2540 EK Tuttnauer/ Systec, Wettenberg
DNA Thermal Cycler Perkin Elmer, Norwalk, USA
Durchflußzytometer FACSCalibur Becton Dickinson, New Jersey, USA
Emax Microplate Reader (Molecular Devices) MWG-Biotech, Ebersberg
Fluoroskan II Titertek, Meckenheim
Geldokumentationssystem 2000i MWG-Biotech, Ebersberg
Gelelektrophoresekammer DNA SUB CELLMM Bio-Rad, München
Harvester Unifilter-96 Canberra Packard, Frankfurt a. M.
Heizblock TR-L288 Liebisch, Bielefeld
Lamin Air HBB 2472S, 2448 Heraeus, Hanau
Material und Methoden
37
Magnetrührer-Heizblock MR 2002 Heidolph, Kehlheim
Magnetständer Boehringer-Mannheim, Mannheim
Mikrowelle MR 6415 Hitachi, Feldkirchen
pH-Meter pH 522 WTW, Weilheim
Photometer Ultraspec II LKB, Heidelberg
Pipettus Akku Hirschmann, Eberstadt
QSH Gelelektrophoresis Unit Int. Biotechnologies, New Haven, Con-
neticut, USA
Rührer Universität Regensburg, TZ
Schüttler IKA-Vibrax VXR IKA-Labortechnik
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg
TopCount Microplate Scintillation Counter Canberra Packard, Frankfurt a. M.
UV-Transilluminator Bachofer, Regensburg
Vortex REAX 2000 Heidolph, Kehlheim
Wasserbad 5P Haake, Karlsruhe
Zellinkubator 6000 Haereus, Hanau
2.2. Methoden
2.2.1. Molekularbiologische Methoden
2.2.1.1. Konzentrationsbestimmungen
2.2.1.1.1. Absorptionsmessungen
Die Absorptionsmessungen wurden am LKB-Spektralphotometer Modell Ultraspec II durch-
geführt. Für Messungen im Bereich des sichtbaren Lichts wurden Kunststoffküvetten benutzt.
Die optische Dichte von Bakterienkulturen wurde bei 578 nm gemessen. Die DNA-Konzen-
tration wäßriger Lösungen wurde durch Absorptionsmessung bei 260 nm und 280 nm in
Quarzküvetten bestimmt. Dabei gilt, daß 1 A260 einer DNA-Konzentration von 50 µg ds-
DNA/ ml, 40 µg RNA/ ml oder 33 µg Oligonukleotid/ ml entspricht (SAMBROOK J. et al.,
1989).
Der Quotient A260/A280 gibt den Reinheitsgrad an und sollte zwischen 1,8 und 2,0 für DNA
liegen, für RNA zwischen 1,6 und 1,8.
Material und Methoden
38
2.2.1.1.2. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren mittels des Nucleic Dot
Metric Assays
Die Konzentrationsbestimmung mittels des Nucleic Dot Metric-Kits (Geno Technology, St.
Louis, MO, USA) beruht auf einer Farbreaktion der Nukleinsäure mit einem Farbstoff und
wurde nach dem dem Kit beiliegenden Protokoll ausgeführt. In Kürze: Auf ein Filterpapier
wird 1 µl der geeignet verdünnten Nukleinsäure über Kapillarkräfte aufgebracht. Anschlie-
ßend wird der Filter mit Nucleic Dye angefärbt und gewaschen. Der Durchmesser des Farb-
flecks wird bestimmt und von einer beigepackten Schablone die Konzentration der aufgetra-
genen Verdünnung abgelesen. Diese Methode ist für die Bestimmung der Konzentration mini-
maler Volumina von DNA-, RNA- und Oligonukleotidlösungen geeignet.
2.2.1.1.3. Bestimmung der Konzentration von Proteinlösungen nach Bradford
Für die Bestimmung der Proteinkonzentration in Lösung wurde der „Protein-Assay” von Bio-
Rad verwendet, der auf der Methode von Bradford basiert (BRADFORD M. M., 1976).
Dazu wurde 1 ml Farbstoffreagenz (20 % (v/v) Protein-Assay-Farbstoffkonzentrat in Aqua
bidest.) mit 20 µl Proteinlösung bzw. 20 µl Aqua bidest. als Referenz versetzt und gemischt.
Nach einer Inkubationszeit von 5 min bei RT wurde die Absorption der Lösung bei 595 nm
gegen die Referenz gemessen. Die Proteinkonzentration wurde anhand einer mit BSA- bzw.
IgG-Lösung erstellten Eichgerade ermittelt.
2.2.1.2. Arbeiten mit RNA
2.2.1.1.1. Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen
Gemäß des Protokolls der Firma AMS Biotechnology wurde die Gesamt-RNA aus 106 Zellen
isoliert, indem die in PBS gewaschenen, pelletierten Zellen in 200 µl RNAzolB aufgeschlos-
sen wurden. Das Homogenat wurde mit 1/10 Volumen Chloroform überschichtet, 15 sec hef-
tig geschüttelt und für 5 min auf Eis inkubiert. Nach der Zentrifugation (12.000g) für 15 min
bei 4°C wurde die obere wäßrige Phase abgenommen, die die RNA enthält, und in ein
frisches Reaktionsgefäß überführt. In der unteren organischen Phase sowie der Interphase rei-
chern sich die Zellproteine und -lipide an. Die wäßrige Phase wurde mit demselben Volumen
an Isopropanol versetzt und 15 min auf Eis gefällt. Hieran schloß sich ein 15minütiger Zentri-
fugationsschritt bei 12.000g und 4°C an. Das so erhaltene RNA-Pellet wurde mit 75 % EtOH
gewaschen und in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Danach wurde es in 25 µl DEPC-H2O
aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
Material und Methoden
39
2.2.1.1.2. Reverse Transkription
Die reverse Transkription dient dem Umschreiben von zellulärer RNA in cDNA, die später in
spezifischen PCR-Reaktionen zur Transkriptionsanalyse eingesetzt wurde. Als Primer für die
Transkriptionsreaktion dienten Hexanukleotide (N6) mit zufälliger Sequenz. Ein Ansatz für
RNA aus 106 Zellen wurde nach folgendem Protokoll revers transkribiert:
23 µl RNA-Lösung
8 µl 5 x RT-Puffer
4 µl 100 mM DTT
2 µl 10 mM dNTPs
1 µl Superscript II
1 µl RNAse-Inhibitor
1 µl Hexanukleotid (2 mg/ml)
Die Ansätze wurden im Heizblock für 120 min bei 42°C inkubiert. Anschließend wurde die
reverse Transkriptase für 15 min bei 72°C inaktiviert. In einer späteren PCR wurden in der
Regel 2 µl der so gewonnenen cDNA eingesetzt.
2.2.1.3. Arbeiten mit DNA
2.2.1.3.1. Präparation von Plasmid-DNA
2.2.1.3.1.1. Präparation von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab
Plasmide wurden aus Flüssigkulturen isoliert, die zur Selektion Antibiotikum enthielten. Für
kleine Mengen DNA wurde mit 2 ml-ÜNKs gearbeitet, die jeweils aus Einzelkolonien ange-
impft wurden. Die DNA wurde über alkalische Lyse mit anschließender Phenol/ Chloroform-
Extraktion gewonnen (BIRNBOIM H. C. und DOLY J., 1979).
Hierzu wurden die Bakterien aus 1,5 ml Kultur pelletiert und nacheinander mit 100 µl Lö-
sung I, 200 µl Lösung II und 150 µl Lösung III (DNA-Präparationslösungen) versetzt. Nach
5-minütigem Aufschluß der Zellen bei 4°C wurden die Zellproteine und –lipide durch Zen-
trifugation abgetrennt und die DNA aus dem Überstand mit eiskaltem, absolutem EtOH ge-
fällt. Das DNA-Pellet wurde mit 70 % EtOH gewaschen. Das luftgetrocknete Pellet wurde in
20 µl H2O aufgenommen und bei -20°C gelagert.
Material und Methoden
40
2.2.1.3.1.3. Isolierung von Plasmid-DNA im großen Maßstab (Maxiprep)
ÜNKs für die Isolierung von Plasmid-DNA im großen Maßstab wurden in 300 ml LB mit
geeignetem Antibiotikum aus einer 3 ml-ÜTK angesetzt. Die ÜTK wurde aus einer Einzelko-
lonie von einer Platte mit E. coli-Klonen, die das gewünschte Plasmid trugen, angeimpft.
Die Zellen aus der 300 ml ÜNK wurden durch Zentrifugation (8.000 rpm, 4°C, 10 min) ge-
erntet und in 24 ml S1-Puffer resuspendiert. Zur Lyse wurden 24 ml S2-Lösung für 5 min bei
RT zugegeben. 4 ml S3-Puffer zur Fällung von Zelltrümmern und Proteinen vervollständig-
ten den Ansatz, der 15 min auf Eis inkubiert wurde. Anschließend wurde die Lösung durch
einen Faltenfilter auf eine mit 5 ml N2-Puffer äquilibrierte AX50-Säule (Nucleobond) aufge-
bracht. Das Filtrat wurde mit 3 x 12 ml N3-Puffer gewaschen und die DNA mit 2 x 6 ml auf
50°C vorgewärmtem N5-Puffer eluiert. Die Fällung der DNA erfolgte durch Zugabe von 0,7
Volumina Isopropanol und anschließender Zentrifugation (10.000 rpm, 4°C, 45 min). Nach-
dem die DNA mit 70 % EtOH gewaschen und für 5 min luftgetrocknet worden war,
wurde sie in 300 µl H2O bidest aufgenommen. Anschließend wurden Konzentration und
Reinheitsgrad spektralphotometrisch bestimmt.
S1-Puffer 10 mM EDTA
50 mM Tris-HCl, pH 8,0
100 µg/ml RNaseA
pH 8,0
S2-Puffer 200 mM NaOH
1 % SDS
S3-Puffer 2,55 M Kaliumacetat
pH 4,8
N1-Puffer 100 mM Tris/H3PO4
400 mM KCl
15 % Ethanol p.a.
pH 6,3
Material und Methoden
41
N2-Puffer 100 mM Tris/H3PO4
900 mM KCl
15 % Ethanol p.a.
pH 6,3
N3-Puffer 100 mM Tris/H3PO4
1150 mM KCl
15 % Ethanol p.a.
pH 6,3
N5-Puffer 100 mM Tris/H3PO4
1000 mM KCl
15 % Ethanol p.a.
pH 6,3
2.2.1.3.2. Reinigung und Fällung von DNA
2.2.1.3.2.1. Phenolextraktion
Dazu wurde die zu deproteinierende DNA-Lösung zunächst mit TE-Puffer auf ein Mindestvo-
lumen von 200 µl gebracht. Anschließend erfolgte die Zugabe von einem Volumen Phenol-
Tris und die Lösung wurde 1 min gründlich von Hand gemischt, so daß eine trübe Suspension
entstand. Zur Phasentrennung schloß sich eine 10-minütige Zentrifugation bei 8.000 rpm und
4°C an. Die wäßrige, DNA-haltige Oberphase wurde nun in ein frisches Eppendorfgefäß
überführt und mit einem Volumen Phenol/Chloroform extrahiert. Nach erneuter Zentrifuga-
tion zur Phasentrennung für 10 min bei 8.000 rpm und 4°C erfolgte wiederum ein Transfer
des Überstandes in ein neues Eppendorfgefäß. Zur Entfernung verbliebener Phenolmoleküle
aus der DNA-Lösung wurde noch 2 x mit je einem Volumen Chloroform/IAA extrahiert, wo-
bei zur Phasentrennung jeweils 5 min bei 12.000 rpm und 4°C zentrifugiert wurde. Anschlie-
ßend wurde die DNA gefällt.
2.2.1.3.2.2. Ethanolfällung
Dazu wurden der DNA-Lösung 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 4.8) sowie 2,5 Volu-
mina 96 % Ethanol zugegeben. Nach gründlicher Durchmischung von Hand erfolgte die Fäl-
lung entweder über Nacht bei -20°C, mindestens 30 min bei -80°C oder 1 min in flüssigem
Stickstoff. Durch 30-minütige Zentrifugation bei 12.000 rpm und 4°C wurde das Na+-DNA-
Material und Methoden
42
Präzipitat pelletiert und zur Reinigung von überschüssigen Salzen zweimal mit 70 % EtOH
gewaschen. Zur Trocknung überführte man das Pellet für 30 min in die Vakuumzentrifuge.
Schließlich wurde die DNA in einem angemessenen Volumen TE-Puffer resuspendiert, wobei
berücksichtigt werden muß, daß bei einer Ethanolfällung mit 5 %, bei Fällung mit vorange-
gangener Phenolextraktion mit ca. 10 % Verlust an DNA zu rechnen ist. Die DNA-Lösungen
wurden kurzfristig bei 4°C, langfristig bei -20°C aufbewahrt.
2.2.1.3.2.1. Reinigung mit dem QIAquick PCR-Purification-Kit
Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers (Qiagen). Zur Kontrolle wurden
1-2 µl des Eluats durch Agarosegelelektrophorese auf Integrität überprüft.
2.2.1.3.3. Enzymatische Hydrolyse von DNA
Für die enzymatische Spaltung von DNA wurden Restriktionsendonukleasen vom Typ II
(ARBER W., 1978) verwendet, welche die DNA innerhalb spezifischer Erkennungssequenzen
hydrolysieren. Alle Reaktionen wurden unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen
durchgeführt. Bei Restriktionen mit verschiedenen Enzymen, die unterschiedliche Reaktions-
puffer benötigen, wurden die Hydrolysen nacheinander – mit dazwischen liegender Reinigung
mit Hilfe des QIAquick PCR-Purification Kits der Firma Qiagen – durchgeführt.
2.2.1.3.3. Elektrophorese von DNA in Agarosegelen
Analytische Auftrennungen von DNA-Molekülen wurden in horizontalen Kammern mit Gel-
volumina zwischen 10 ml und 200 ml durchgeführt. Je nach Größe der Fragmente wurde
Aga-rose in Konzentrationen von 0,6 % bis 2 % (w/ v) in TAE- bzw. TBE-Puffer suspendiert,
im Mikrowellenherd verflüssigt und in die vorbereiteten Flachbettapparaturen gegossen. Nach
dem Festwerden wurde das Agarosegel mit 1 x TAE- bzw. TBE-Puffer überschichtet. Die
DNA-Proben wurden mit 1/10 Volumen 10 x Ladepuffer für Agarosegele versetzt, in die Gel-
taschen pipettiert und mit einer Spannung von 0,5 - 1 V/cm Elektrodenabstand aufgetrennt.
Als Größenstandard dienten die Standards II, VI und X von Roche Diagnostics. Nach Ab-
schluß der Elektrophorese wurden die Agarosegele für ca. 10 min in 10 µg/ml EtBr-Lösung
gefärbt und anschließend für weitere 10 min zum Auswaschen von überschüssigem EtBr ge-
wässert. Auf einer UV-Durchlichtbank (Bachofer, 254 nm) wurden die angefärbten DNA-
Fragmente sichtbar gemacht und mit dem Geldokumentationssystem 2000i (MWG-Biotech)
photografiert.
Material und Methoden
43
2.2.1.3.4. Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mit dem QIAquick Gel
Extraction Kit
Die zu untersuchende DNA wurde nach Hydrolyse in einem präparativen Agarosegel elektro-
phoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde mit EtBr angefärbt. Das gesuchte DNA-Fragment wur-
de durch UV-Beleuchtung im Gel lokalisiert, mit einem Skalpell ausgeschnitten und gewo-
gen. Die Extraktion der DNA erfolgte mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit der Firma
Qiagen.
Pro 100 mg Gelbande wurden 300 µl QX1-Puffer zugegeben. Durch 10-minütige Inkubation
bei 50°C unter gelegentlichem Vortexen wurde die Agarose-Matrix solubilisiert. Das Ge-
misch (max. 800 µl) wurde auf eine QIAquick-Zentrifugensäule aufgetragen, welche vorher in
ein 2 ml Elutionsgefäß überführt wurde. Durch einminütige Zentrifugation erfolgte der Ein-
tritt und die Bindung der DNA an das Säulenmaterial. Nachfolgende Waschschritte und Elu-
tion der DNA entsprechen dem Protokoll des QIAquick Nucleotide Removal Kits.
Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers (Qiagen).
2.2.1.3.5. Ligation von DNA-Fragmenten mit dem pcDNA3.1/V5-His TA-TOPO-Kit
der Firma Invitrogen
Hierbei wurden 4 µl des frischen PCR-Ansatzes mit den amplifizierten, zu klonierenden
DNA-Fragmenten, 1 µl der dem Kit beigepackten Salzlösung (1,2 M NaCl, 0,06 M MgCl2)
und 1 µl des pcDNA3.1/V5-His TOPO-Vektors für 5 min bei RT inkubiert. Aus dieser Mix-
tur wurden je 200 µl zu transformierender Zellen 2 µl verwendet.
Am verwendeten Vektor ist auf beiden Seiten der Klonierungsstelle kovalent ein Molekül
Topoisomerase gebunden, das den Einbau des PCR-Fragmentes über überstehende Adenin-
moleküle katalysiert. Die Primer der PCR-Reaktion dürfen keine 5’-Phosphatgruppen tragen,
da das Phosphat, an das die Topoisomerase an den Vektor gebunden ist für den Einbau des
PCR-Fragments verantwortlich ist. Beim Einbau des PCR-Fragments an diese Phosphatgrup-
pe wird die Topoisomerase vom Vektor freigesetzt.
2.2.1.3.6. DNA-Amplifizierung mittels PCR
Zur spezifischen Amplifikation von DNA-Fragmenten wurde die Polymerasenkettenreaktion
angewendet (SAIKI R. K. et al., 1985; MULLIS K. B. und FALOONA F. A., 1987).
Material und Methoden
44
2.2.1.3.6.1. PCR-Reaktion mit der Vent DNA-Polymerase
In die PCR für Klonierungen wurde wegen der höheren Genauigkeit und ihrer proofreading-
Fähigkeit die Vent-DNA-Polymerase statt der Taq-DNA-Polymerase eingesetzt. Da aber für
die Klonierung mit dem pcDNA3.1/V5-His TA TOPO-Kit überhängende Adeninbasen, wie sie
von der Taq-Polymerase unspezifisch angehängt werden, notwendig waren, wurde an die
PCR mit der Vent-DNA-Polymerase eine PCR-Zyklus angeschlossen, vor dem 1µl Taq-DNA-
Polymerase in den PCR-Ansatz gegeben wurde.
Für Klonierungen wurde folgender PCR-Ansatz gewählt:
5 µl 10 x PCR-Puffer
0,5 µl 50 mM dNTPs (je 12,5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
100 ng sense-Primer (entspricht 2 µM)
100 ng antisense- Primer (entspricht 2 µM)
10 – 100 ng Matrizen-DNA
1 µl Vent-Polymerase
ad 50 µl steriles Aqua bidest
Der Ansatz wurde auf Eis pipettiert und mit sterilem Mineralöl überschichtet.
Die PCR wurde in einem Thermocycler der Firma Perkin Elmer durchgeführt: Zum
Aufschmelzen wurde die DNA für 5 min bei 94°C inkubiert. Daran schlossen sich 20 Zyklen
an, auf die, nach einer Aufschmelzphase von 1 min bei 94°C, das annealing des Primers bei
53 - 63°C (je nach Primer) für 1 min und ein Extensionsschritt bei 72°C für 1 min pro kb
Fragmentlänge folgten. Zur Vervollständigung angefangener Amplifikate endete die PCR mit
10 min bei 72°C. Danach wurde das PCR-Gemisch auf 4°C gehalten.
10 x Reaktions-Puffer: 100 mM Tris-HCl, pH 8.3
500 mM KCl
15 mM MgCl2
0,01 % (w/v) Gelatine
Material und Methoden
45
2.2.1.3.6.2. Semiquantitative PCR
Die semiquantitative PCR wurde in der Regel im Rahmen von Transkriptionsanalysen mittels
RT-PCR angewendet. Sie erfolgte üblicherweise in einem 50 µl-Ansatz mit
5 µl 10 x Puffer (vom Hersteller der Polymerase mitgeliefert)
0,5 µl 10 mM dNTPs
0,5 µl sense-Primer (20 µM oder 200 µg/ ml)
0,5 µl antisense-Primer (20 µM oder 200µg/ ml)
0,5 µl Taq-Polymerase
2 µl cDNA
ad 50 µl Aqua bidest
Nach einem Denaturierungsschritt von 3,5 min bei 94°C wurde zur semiquantitativen Ampli-
fikation üblicherweise ein Programm mit 35 Zyklen aus folgenden Komponenten gefahren
Denaturierung: 30 sec bis 1 min bei 94°C
annealing: 1 min bei 55 bis 63°C
Extension: 1 min/ kb Fragmentlänge bei 72°C
Am Ende wurde ein weiterer Extensionsschritt für 10 min bei 72°C angefügt und die Proben
dann auf 4°C abgekühlt.
Zur Quantifizierung wurde jeweils in einem parallelen Ansatz eine PCR für das Haushaltsgen
G3PDH durchgeführt, von dem man annimmt, daß es in jeder Zelle unabhängig von einer
Stimulation der Zellen gleich stark exprimiert ist. Da dieses Gen sehr stark exprimiert wird
und in der linearen Phase der PCR quantitative Unterschiede der eingesetzten cDNA besser
sichtbar sind, wurde diese PCR-Reaktion bereits nach 20 Zyklen abgestoppt.
2.2.2. Zellbiologische Methoden
2.2.2.1. Arbeiten mit E. coli
2.2.2.1.1. Kultur von E. coli-Stämmen
E. coli-Zellen wurden bei 37°C in LB-Flüssigmedium (5 - 500 ml) oder auf LB-Agarplatten
angezogen. Vorkulturen wurden mit Einzelkolonien von LB-Platten angeimpft. Das
Wachstum der Bakterien wurde durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm spektro-
metrisch verfolgt. Eine OD600 von 1,0 entspricht etwa 8x108 Bakterien pro ml Kultur (SAM-
BROOK J. et al., 1989).
Material und Methoden
46
2.2.2.1.2. Aufnehmen von Wachstumskurven
Für jede Wachstumskurve wurden 100 ml des entsprechenden Mediums (gegebenenfalls mit
Antibiotikum) mit einer ÜNK des entsprechenden Bakterienstammes auf eine OD578 von 0,05
inokuliert und bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Änderungen der OD578 der Kulturen
wurden in 1/2- bis 1-stündigen Abständen gemessen.
2.2.2.1.3. Anlegen von Glyzerin-Dauerkulturen
Von dem zu konservierenden Bakterienstamm wurde eine 4-ml-ÜNK angelegt, von der 1 ml
mit 200 ml sterilem Glycerin versetzt und 2 min gründlich gevortext wurde. Diese Suspension
wurde 2 h bei RT belassen und in regelmäßigen Abständen durchmischt, abschließend 1 h bei
4°C inkubiert und dann bei -80°C gelagert.
2.2.2.1.4. Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen
Nach der Methode von CHUNG C. T. et al. (1989) konnten kompetente Zellen in einem Ein-
schrittverfahren hergestellt und ohne weitere Behandlung bei -80°C eingefroren werden.
2.2.2.1.5. Chemische Transformation von E. coli-Zellen
Aliquots von 200 µl kompetenten Zellen wurden auf Eis aufgetaut. Nach Zugabe der zu
transfizierenden DNA (ca. 0,1 µg) wurden die Zellen 30 min lang auf Eis inkubiert, 45 sec bei
42°C hitzegeschockt, mit 1 ml SOC-Medium ohne Antibiotikum versetzt und 1 h bei 37°C
geschüttelt. Der Transformationsansatz wurde dann auf entsprechenden Selektionsplatten aus-
plattiert und ün bei 37°C inkubiert.
Am nächsten Tag ausgewachsene Einzelkolonien wurden zur DNA-Präparation angeimpft.
2.2.2.1.5. Transformation von E. coli mittels des pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-Kits
von Invitrogen
Die Transformation der TOP10-E. coli-Zellen im pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-Kit ist im
wesentlichen eine Variante der oben beschriebenen chemischen Transfektion und unterschei-
det sich davon nur geringfügig hinsichtlich der Inkubationszeiten.
200 µl-Aliquots kompetenten TOP10-Zellen wurden auf Eis aufgetaut. Zu diesen Zellen wur-
den 2 µl der „TOPO cloning reaction“ pipettiert, die dem Reaktionsansatz der Ligation ent-
spricht. Die Zellen wurden für 5 bis 30 min auf Eis inkubiert, anschließend 30 s bei 42°C hit-
zebehandelt und unmittelbar auf Eis transferiert. Nach der Zugabe von 250 µl SOC-Medium
wurden die Zellen 1 h bei 37°C sanft geschüttelt. Zwischen 25 und 200 µl des Transforma-
Material und Methoden
47
tionsansatzes wurden auf entsprechenden Selektionsplatten ausplattiert und ün bei 37°C inku-
biert.
Zur Kontrolle der Effizienz der Transfektion wurde die oben beschriebene Transfektion mit
dem pcDNA3.1/V5-His-TOPO/lacZ-Vektor durchgeführt, in den in die MCS das lacZ-Gen
hinter einem T7-Promotor kloniert wurde, das für eine bakterielle ß-Galaktosidase codiert.
Die Expression dieses Gens läßt sich leicht nachweisen, da Kolonien von Bakterien, die auf
X-Gal beschichteten Platten wachsen, wegen der Spaltung von X-Gal durch die ß-Galaktosi-
dase eine blaue Färbung annehmen.
Aus dem Verhältnis der blauen Kolonien zur Gesamtzahl der Kolonien kann man die Trans-
fektionseffizienz ermitteln.
Am nächsten Tag ausgewachsene Einzelkolonien wurden zur DNA-Präparation angeimpft.
SOC-Medium 2,0 % Trypton
0,5 % Hefeextrakt
10,0 mM NaCl
2,5 mM KCl
10,0 mM MgCl2
10,0 mM MgSO4
20,0 mM Glukose
2.2.2.2. Arbeiten mit Säugerzellen
2.2.2.2.1. Kultur löslicher Zellen
Zellinien und primäre Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2 in Wasserdampf-gesättigter Luft
im Brutschrank kultiviert. Lösliche Zellen wurden in der Regel in RPMI gehalten, das mit
10 % FKS sowie Natriumpyruvat, L-Glutamin und Penicillin/Streptamycinsulfat supplemen-
tiert wurde.
Lösliche Zellen wurden in regelmäßigen Abständen von 2 - 3 Tagen bei 300 g zentrifugiert,
der Überstand größtenteils verworfen und die Zellen in frischem Medium in verdünnter Form
wieder ausgesät. Für primäre Lymphozyten, CLL-Zellen und B-Zellinien wurden 5 bis 10 %
des konditionierten Überstand beibehalten.
2.2.2.2.2. Kultur adhärenter Zellen
Adhärente Zellen wurden beim Erreichen der Konfluenz mit PBS gewaschen und anschlie-
ßend mit Trypsin (0,1 µg/ml) oder EDTA (10 mM) in PBS im Brutschrank inkubiert, bis sich
Material und Methoden
48
die Zellen vom Boden des Gefäßes ablösten. Dann wurde FKS-haltiges Medium zugesetzt
und die Zellen pelletiert. Die Zellen wurden in frisches Medium überführt und verdünnt
wieder ausgesät. Für die Kultur adhärenter Zellen wurde mit FKS supplementiertes DMEM-
Medium verwendet.
2.2.2.2.3. Ermittlung von Zellzahl und -Konzentration (Trypanblaufärbung)
Die Zellen wurden im Verhältnis 1:1 mit Trypanblau versetzt und in einer Neubauerkammer
ausgezählt, gegebenenfalls nach Verdünnen der Zellsuspension in Medium oder PBS. Die
Zellkonzentration berechnet man nach der Formel:
Zellzahl / mm2 x Verdünnungsfaktor x 104 = Zellen/ ml
Da nur tote Zellen durch Trypanblau anfärbbar sind, können sie ausgeschlossen werden.
2.2.2.2.4. Herstellung von Gefrierkulturen
106 Zellen wurden in 1,8 ml des auch für die Kultur der Zellen verwendeten Mediums sus-
pendiert, mit 200 µl DMSO versetzt und über Nacht auf -70°C gelagert. Anschließend wurden
die Zellen in flüssigen Stickstoff überführt. Zum Auftauen wurden die Röhrchen im
Wasserbad bei 37°C geschwenkt, von außen mit Ethanol (70 % v/v) sterilisiert und der Inhalt
in ein Falcon-Röhrchen mit dem entsprechenden serumhaltigen Kulturmedium überführt.
Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert und in frischem Medium aufgenommen.
2.2.2.2.5. Isolierung von PBMC über Dichtegradientenzentrifugation
Einem gesunden männlichen Probanden wurden 50 ml Frischblut aus der Armvene entnom-
men. Diese wurden bereits in der Spritze mit 500 I.U. Heparin versetzt, um die Gerinnung zu
verhindern. Das heparinisierte Blut wurde auf zwei Falcon-Röhrchen aufgeteilt und zur Ab-
trennung des Serums bei 2.500 rpm 20 min bei RT zentrifugiert. Das Serum wurde abgenom-
men und das Pellet, in der Hauptsachen aus Erythrozyten und Leukozyten bestehend, wurde
mit serumfreiem RPMI, das 5 I.U. Heparin enthielt, auf 120 ml Gesamtvolumen gebracht. In
Falconröhrchen wurden 15 ml Histopaque vorgelegt und mit 30 ml des verdünnten Blutes
überschichtet. Die Gradienten wurden 35 min mit 1.800 rpm bei RT ungebremst zentrifugiert.
Während der Zentrifugation sammeln sich die PBMC an der Grenzschicht zwischen Histopa-
que und dem Blut/RPMI- Gemisch (BOYUM A., 1968). Diese Interphase wurde abgenommen
und in ein frisches Röhrchen überführt, wo sie zweimal mit serumfreiem RPMI gewaschen
wurde. Gegebenenfalls wurden die Lymphozyten mit 10 ml Erythrozyten-Lysepuffer behan-
delt, 5 min inkubiert und anschließend zweimal mit serumfreiem RPMI gewaschen. Danach
Material und Methoden
49
wurden die Zellen in supplementiertem RPMI aufgenommen, gezählt und in einer Dichte von
2,5 bis 3 x 106 Zellen/ml ausgelegt.
Aus 50 ml Frischblut können auf diese Weise je nach Spender zwischen 5 und 12 x 107 Zellen
gewonnen werden.
2.2.2.2.6. Isolierung reiner B- bzw. T-Lymphozyten mittels magnetischer Separation
mit dem Dynabead-System
B- bzw. T- Lymphozyten wurden aus CLL-Zellaliquots aufgereinigt. Dazu wurde die Metho-
de magnetischer Separation nach dem Dynabead-System angewandt, die darauf beruht, daß
die Zellen mit magnetischen beads inkubiert werden, an die Antikörper gegen die Oberflä-
chenantigene der betreffenden Zellsorte gekoppelt sind. Durch Bindung der Antikörper-beads
an die Zellantigene werden sich die betreffenden Zellen, wenn man sie in ein einseitiges Mag-
netfeld bringt, entland des Magneten anordnen, so daß man sie abtrennen kann. Um keine der
gewünschten Zellen über die Antigen-Antikörper-Bindung zu aktivieren, wurde im Rahmen
dieser Arbeit ausschließlich negativ separiert, d.h. „unerwünschte“ Zellen wurden mit den
magnetischen beads abgetrennt.
Es wurden zum einen magnetische anti-CD3-beads der Firma Dynal zur Abtrennung der T-
Zellen von den CLL-Zellen verwendet; zum anderen der T-Cell Negative Isolation Kit dersel-
ben Firma, um die T-Lymphozyten aus CLL-PBMC-Aliquots aufzureinigen. Die Aufreini-
gung erfolgte nach dem Protokoll der Firma. In Kürze:
Die beads wurden in PBS gewaschen, um Reste des zur Konservierung zugesetzten Azids zu
entfernen und in PBS/0,1 % BSA aufgenommen. Die Zellen wurden in geeigneter Konzentra-
tion geerntet, in PBS gewaschen und für die T-Zell-Isolierung in einer Dichte von 1 x 107 Zel-
len/ml aufgenommen. Pro 100 µl wurden 20 µl hitzeinaktiviertes FKS und 20 µl Antikörper-
Mix zugefügt. Unter sanftem Schütteln wurden die Zellen 10 Minuten bei 4°C mit dem Anti-
körper-Mix inkubiert und danach gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen erneut in
einer Dichte von 1 x 107 Zellen/ml in PBS/0,1 % BSA aufgenommen, die Zellen bei der B-
Zell-Isolierung wurden in dieser Dichte eingesetzt. Für 1 x 107 Zellen wurden 100 µl beads
verwendet. Das Zell-bead-Gemisch wurde 15 min bei 4°C unter sanftem Schütteln inkubiert,
dann in den Magnetständer eingespannt und der Überstand entnommen, der die gewünschte
Zellpopulation enthielt. Die Zellen wurden gewaschen und in Kultur genommen. Die Reinheit
der gewünschten Population lag bei > 98 %, wie die Überprüfung im FACS ergab.
Material und Methoden
50
2.2.2.2.7. In vitro-Stimulation von Zellen
Die Zellen wurden in Gewebekulturgefäßen ausgesät und, wie in Tabelle Tab. 2.-1. ange-
geben, mit verschiedenen Stimulanzien versetzt. Falls im Ergebnisteil nicht anders beschrie-
ben, wurden die Stimulanzien in löslicher Form direkt ins Medium gegeben. Zur Stimulation
mit immobilisiertem CD137-Fc- oder Fc-Kontrollprotein wurden die Gewebekulturgefäße mit
5 µg/ml CD137-Fc bzw. der äquimolaren Menge an Fc-Protein (2,5 µg/ml) in PBS ün bei 4°C
oder für 2 h bei 37°C beschichtet. Auf diese Weise binden beliebige Proteine über van der
Waals-Wechselwirkungen an die Polystyroloberflächen der Kulturgefäße. Lösliches CD137-
Fc-Protein wurde den Zellen in zuvor mit FKS beschichteten Gewe-bekulturplatten zugege-
ben, um zu verhindern, daß es seinerseits während der Kulturdauer an die Wände des Gefäßes
adhärieren konnte und auf diese Weise ungewollt immobilisiert wurde.
Agens Konzentration Zweck
anti-CD137 (Klon bbk-2) 10 µg/ml Blockieren von mCD137 und sCD137
anti-Fas 2,5 µg/ml Induktion von Apoptose
anti-IL-10 10 µg/ml Neutralisation von IL-10
anti-TGFß1 10 µg/ml Neutralisation von TGFß1
MausIgG1 10 µg/ml Isotypkontrolle zu obigen Antikörpern
CD137-Fc löslich 5 µg/ml Wirkung in dieser Arbeit untersucht
CD137-Fc immobilisiert 5 µg/ml Wirkung in dieser Arbeit untersucht
Fc löslich 2,5 µg/ml Kontrollprotein zu CD137-Fc
Fc immobilisiert 2,5 µg/ml Kontrollprotein zu CD137-Fc
IL-2 100 ng/ml Aktivierung von PBMCs
Differenzierung zu LAK-Zellen
PHA 5 µg/ml Aktivator für Lymphozyten
PMA/ A23187 10 µg/ ml/1 mM Aktivator für Lymphozyten
Tab. 2.-2.: In dieser Arbeit verwendete Aktivatoren und Antikörper zur in vitro-Stimulation von
Zellen.
2.2.2.2.8. Proliferationsassays mittels 3H-Thymidin-Einbau
Zu den Zellen wurde nach 24 h Kultur in einer 96-well-Platte pro well 0,5 µCi 3H-Thymidin
in 50 µl des entsprechenden Kulturmediums (entspricht 10 µCi/ml) gegeben. Nach weiteren
16 bis 24 h Inkubation im Brutschrank wurden die Zellen in einem Harvester der Firma Pa-
ckard-Canberra auf eine Filterplatte gebracht und nach mehreren Waschschritten der radio-
aktive Einbau in einem ß-Szintillisationszähler der gleichen Firma gemessen.
Material und Methoden
51
Zur Ermittlung von Mittelwert und Standardabweichung wurden Drei- oder Sechsfach-Be-
stimmungen durchgeführt.
2.2.2.2.9. CARE-LASS (Calcein release assay)
Um die Effekte von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAKs) zu untersuchen, wurde das
von R. LICHTENFELS et al. (1994) entwickelte CARE-LASS-Assay verwendet. Ähnlich dem
bekannteren Chrom-Release-Assay beruht das Prinzip des experimentellen Ansatzes darauf,
daß die Zielzellen der lytischen Aktivitäten von Effektorzellen mit Substanzen beladen wer-
den, die nach der Lyse der Targetzellen aus diesen ins umgebende Medium übertreten. Die
Konzentration dieser Substanzen wird dann bestimmt.
Beim CARE-LASS-Assay wird eine geeignete Anzahl an Zielzellen geerntet, in PBS/5 %
FKS gewaschen und in einer Konzentration von 1x 106 Zellen/ml in PBS/5 % FKS aufge-
nommen. Die Zellen wurden gegebenenfalls vorher ün mit 10 µg/ml eines entsprechenden
Antikörper bzw. eines Isotypantikörpers oder 5 µg/ ml CD137-Fc bzw. der äquimolaren Men-
ge Fc-Kontrollprotein vorinkubiert. Der Zellsuspension wurden 20 µg/ml CalceinAM beige-
fügt und diese 20 min bei 37°C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. Dabei tritt der organi-
sche Calcein-Acetomethylester durch die Membran in die Zellen ein, wird im Zytosol durch
dort vorhandene Lipasen zum ionischen Calcein gespalten und muß so in der Zelle ver-
bleiben. Calcein besitzt im Gegensatz zum farblosen Ester eine intensiv hellgrüne Farbe. Die
Zellen werden gewaschen und in einer Konzentration von 1 x 104 pro well in 100 µl PBS/5 %
FKS in eine U-well-Mikrotiter-Patte ausgesät. Die LAK-Zellen sind unspezifische Killer-T-
Zellen, zu denen PBMCs innerhalb von 3 d unter hohen Dosen IL-2 differenzieren. LAK-Zel-
len werden mindestens 3 Tage mit 100 ng/ml rIL-2 inkubiert. Die LAK-Zellen, die gegebe-
nenfalls vorher ün mit 10 µg/ml eines entsprechenden Antikörper oder 5 µg/ml CD137-Fc
bzw. der äquimolaren Menge Fc-Kontrollprotein vorinkubiert wurden, werden ebenfalls in
geeigneter Menge geerntet, gewaschen und in 100 µl PBS/5 % FKS im gewünschten
Effektor-:Targetzell-Verhältnis eingesetzt. Alle Bedingungen wurden als Sechsfachbestim-
mungen durchgeführt. Um den spontanen Austritt an Farbstoff zu bestimmen, wurden belade-
ne Targetzellen ohne Effektorzellen in 200 µl PBS/5 % FKS inkubiert. Die Farbstoffkonzen-
tration bei Lyse aller beladenen Targetzellen wurde durch Zugabe von 100 µl Lysepuffer (50
mM Na-Borat, 0,1 % Triton X 100, pH 9,0) zu 100 µl Targetzellsupension ermittelt. Spontane
Lyse, sowie die Gesamtlyse wurden jeweils als Zwölffachbestimmungen ausgeführt.
Material und Methoden
52
Das CARE-LASS-Assay wurde 4 h im Brutschrank inkubiert, bei längeren Inkubationszeiten
wird der Hintergrund an spontan lysierten Zellen zu hoch. Geringere Zeiten ergeben sehr nie-
drige Lyseraten, die keine Aussagen erlauben.
Die Platten wurden bei 1.200 rpm für 5 min zentrifugiert und 150 µl der Überstände in eine
neue Platte überführt. Die Fluoreszenz wurde in einem automatisierten Fluoreszenz-Scanner
(Titertek Fluoroskan II, Meckenheim) mit den Filtereinstellungen 2 für Extinktion und Emis-
sion (ex2 485 nm, em2 538 nm) gemessen.
Die prozentuale Lyse wurde wie folgt berechnet:
(FAssay – Fspontane Lyse)/ (FGesamtlyse – Fspontane Lyse) = % Zytotoxizität
2.2.3. Immunologische Methoden
2.2.3.1. ELISA
Zur Konzentrationsbestimmung von spezifischen Proteinen in Zellkulturüberständen und
Seren wurden Sandwich-ELISAs verwendet.
Hierzu wurden 96-well-Platten mit einem spezifischen Antikörper beschichtet, unspezifische
Bindungen durch Inkubation mit proteinhaltigem Puffer blockiert und dann die Zellkultur-
überstände oder Seren zugegeben. Die zu untersuchenden Proteine aus dem Überstand oder
dem Serum binden spezifisch an die immobilisierten Antikörper. Nach Inkubation wird über-
schüssiges Protein weggewaschen und das gebundene Protein durch einen zweiten spezifi-
schen, biotingekoppelten Antikörper erkannt. Mit Streptavidin gekoppelte alkalische Phos-
phatase bzw. Meerrettich-Peroxidase bildet über das Streptavidin einen Komplex mit dem
biotinylierten Zweitantikörper. Nach der Zugabe eines entsprechenden Farbsubstrates im
Überschuß wird dieses durch die Enzyme relativ zur Konzentration des zu untersuchenden
Proteins umgesetzt. Je nach Farbe des Substrates wird bei einer definierten Wellenlänge die
Farbstoffkonzentration photometrisch bestimmt, und über eine Standardreihe mit bekannten
Konzentrationen verglichen. Dazu wurde das Programm SOFTmax der Firma MWG Biotech
verwendet.
In dem für lösliches CD137 verwendeten ELISA wurde alkalische Phosphatase in Kombi-
nation mit dem Substrat pNPP von Sigma verwendet. Dieses entwickelt durch den Enzym-
umsatz eine gelbe Färbung, die durch Messung der Absorption bei 405 nm abzüglich 650 nm
in einem Emax Mikrotiterplatten-Lesegerät (Molecular Devices) und Vergleich mit einer
Standardreihe quantifiziert werden konnte.
Material und Methoden
53
In den ELISAs gegen humanes IL-10 und TGFß (R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt)
wurde mit Meerrettich-Peroxidase und dem Farbstoff ABTS (Roche Diagnostics, Mannheim)
detektiert, dessen Absorption bei 405 nm gemessen wird.
2.2.3.1.1. ELISA für sCD137
Um sCD137 nachzuweisen, entwickelte J. MICHEL einen ELISA, der auf dem oben beschrie-
benen sandwich-System beruht (MICHEL J.; 1998). Eine 96-well-Platte wurde bei 4°C ün mit 50
µl/well einer 1 µg/ml-Lösung des anti-CD137-Antikörpers M127 beschichtet. Die Platte wur-
de mit PBS gewaschen und für 1 h bei RT mit 200 µl/well PBS/3 % Trockenmilch (TM) blo-
ckiert. Die Blockierlösung wurde durch dreimaliges Waschen mit Waschpuffer (PBS/ 0,05 %
Triton X100) entfernt. Hierauf wurden 50 µl Aliquots der Proben, Leerwert und Standardwer-
te aufgetragen, die ggf. in PBS/0,3 % TM verdünnt worden waren. Als Standard diente ein
Fusionsprotein aus dem extrazellulären Teil von CD137 und einem His-tag, das in Konzentra-
tionen zwischen 20 und 0,2 ng/ml eingesetzt wurde. Die Proben wurden 1 h bei RT auf der
Platte belassen, die danach dreimal gewaschen wurde. Es wurden 50 µl/well des in PBS/0,3 %
TM 1: 3.000 verdünnten Zweitantikörper (4B4-1-bio; Ancell) aufgetragen und 30 min bei RT
inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden 50 µl/well eines Streptavidin-AP-Kon-
jugates (1: 1000 in PBS) (Dako) aufgetragen. Nach einer halben Stunde bei RT wurde die
Platte gründlich mit PBS/0,05 % Triton X100 gewaschen und ausgeklopft. Je 100 µl der Sub-
stratlösung aus einer Tablette pNPP (Sigma) und 30 ml AP-Puffer wurden zugegeben und der
ELISA im Dunkeln inkubiert, bis deutliche Intensitätsunterschiede beim Standard zu erken-
nen waren. Dann wurde der ELISA im Emax (MWG Biotech) bei 405 nm abzüglich einer
Korrekturwellenlänge von 650 nm gemessen und die Werte mit dem SOFTmax-Programm
analysiert.
Für Seren wurde zusätzlich ein ELISA auf einer mit dem Isotypantikörper MOP-C21
beschichteten Platte zu den gleichen Bedingungen durchgeführt, um individuelle, falsch posi-
tive Ergebnisse zu erkennen und ausschließen zu können.
2.2.3.1.2. ELISA für humanes IL-10
ELISAs gegen humanes IL-10 wurden mit dem Duo Set ELISA Development Kit der Firma
R&D Systems nach einem modifizierten Protokoll der Firma durchgeführt. In Kürze: Der
capture-Antikörper wurde auf eine Konzentration von 4 µg/ml in PBS verdünnt. Bei RT wur-
den ün je 100 µl/well in eine 96-well-Platte beschichtet. Nach dreimaligem Waschen mit
Waschpuffer wurden mit 300 µl Blockierlösung bei RT für 1 h unspezifische Bindungen ab-
Material und Methoden
54
gesättigt. Die Platte wurde erneut dreimal gewaschen. Daraufhin wurden die in Probenpuffer
verdünnten Proben (in der Regel: 1:2 bis 1:10), Standards und Probenpuffer alleine als Leer-
wert pipettiert. Als Standard diente im Kit enthaltenes rekombinantes humanes IL-10, das in
Konzentrationen von 4.000 – 40 pg/ml eingesetzt wurde. Nach 2 h Inkubation bei RT wurde
der ELISA erneut gewaschen und mit 100 µl 400 ng/ml Detektionsantikörper, ebenfalls ein
Bestandteil des Kits, versehen. Es schlossen sich 2 h Inkubation bei RT an, die Platte wurde
dreimal gewaschen und es wurden 100 µl eines Streptavidin-Peroxidase-Konjugates beige-
fügt. Die Platte wurde für eine halbe Stunde im Dunklen aufbewahrt, gewaschen und mit
einer 2 µg/ml ABTS-Lösung entwickelt. Nach 5 bis 10 min konnte bei 405 nm im Emax-
Gerät der Firma MWG Biotech gemessen werden. Die Werte wurden mit dem SOFTmax-
Programm der gleichen Firma ausgewertet. Inkubiert man bei 37°C, können die Zeiten um die
Hälfte verkürzt werden.
Waschpuffer 0,05 % Tween
in PBS
pH 7,2 – 7,4
Blockierungslösung 1 % BSA
5 % Sucrose
0,05 % NaN3
in PBS
Probenpuffer 1 % BSA
in PBS
pH 7,2 – 7,4
sterilfiltriert
Verdünnungspuffer für den Detektionsantikörper
400 ng/ml normales Ziegenserum
in Probenpuffer
2.2.3.1.3. ELISA für humanes TGFß1
Dieser ELISA wurde ebenfalls mit einem Duo Set ELISA Development Kit der Firma R&D
Systems nach einem modifizierten Protokoll der Firma durchgeführt. Der Ablauf des Experi-
Material und Methoden
55
ments war im Prinzip derselbe wie bei dem oben beschriebenen ELISA gegen IL-10.
TGFß1 liegt jedoch im Serum oder Kulturüberstand als „latent complex“, N-terminal nicht-
kovalent an das LAP (latency associated protein) gebunden, vor; dieser Komplex bindet wie-
derum an das LTBP (latent TGFß binding protein). An diese Proteine gebunden ist TGFß
immunologisch nicht aktiv. Um die Konzentration von TGFß bestimmen zu können, ist es da-
her notwendig, TGFß aus seinen Komplexen freizusetzen. Dies geschieht mittels Ansäuerung
und anschließender Neutralisierung: Die (verdünnten) Zellkulturüberstände werden mit 1/5
Volumen 1 N HCl gut gemischt und 10 min bei RT belassen. Danach werden sie mit 1/5 des
Ausgangsvolumen mit einem NaOH-Puffer neutralisiert. Die so aktivierten Proben werden im
ELISA eingesetzt.
Da in den gängigen Seren, die in der Zellkultur verwendet werden, nicht unbeträchtliche
Mengen TGFß zu finden sind, die im ELISA kreuzreagieren, ist es notwendig, zusätzlich zum
Leerwert, Mediumkontrollen anzufertigen und die Assaywerte um diesen „TGFß-Hinter-
grund“ zu bereinigen.
NaOH-Puffer 1,2 N NaOH
0,5 M HEPES
in Aqua bidest
Waschpuffer 0,05 % Tween 20
in PBS
pH 7,2 – 7,4
Blockierungslösung 5 % Tween 20
5 % Sucrose
0,05 % NaN3
in PBS
Probenpuffer 1,4 % delipidiertes Rinderserum
0,05 % Tween 20
in PBS
pH 7,2 – 7,4
sterilfiltriert
Material und Methoden
56
2.2.3.2. Aktivitätsassay für Caspase 3
Die Menge an aktiver Caspase 3 wurde mittels des Caspase-3 Cellular Activity Assay Kit der
Firma Calbiochem (San Diego, CA, USA) bestimmt. Caspase 3 ist eine der Effektorcaspasen
in der apoptotischen Zelle und verknüpft den Rezeptorweg der Apoptoseinduktion mit dem
mitochondrien-induzierten Weg.
Die Bestimmung der Caspaseaktivität erfolgt über die Spaltung ihres Substrates DEVD-pNA
zu einem farbigen, bei 405 nm im ELISA-Reader Emax (MWG Biotech) detektierbaren Sub-
strat pNA. Das Protokoll in Kürze:
2 x 107 Zellen wurden geerntet, in PBS gewaschen und in 1 ml eiskaltem Lysepuffer (im Kit
beigepackt) aufgenommen. Die Zellen wurden 5 min auf Eis inkubiert, bis sie vollständig ly-
siert waren. Nachdem die Proben bei 10.000 g für 10 min bei 4°C zentrifugiert worden waren,
wurden die Überstände, die die zytosolischen Proteine enthielten, abgenommen und entweder
auf Eis aufbewahrt oder bei -80°C bis zur Weiterverwendung gelagert.
Die Proteinkonzentrationen wurden mittels des Bradfordreagenzes bestimmt.
Für die Caspasebestimmung wurde zunächst der im Kit enthaltene Caspase-3-Inhibitor in
Assay-Puffer zu einer 5 x Stammlösung verdünnt. Dann wurde die gereinigte Caspase 3 auf
eine Konzentration von 2 U/µl gebracht.
Dann wurden Kontrollen und Proben nach unten stehendem Schema pipettiert.
Nach dem Pipettieren von Assay Puffer, Zellextrakt, Caspase3 und Inhibitor wurde das Assay
für 10 min bei 37°C inkubiert, um die Interaktion zwischen dem Enzym und dem Inhibitor zu
ermöglichen. Danach wurde das Substrat zugegeben und wieder bei 37°C im Dunkeln inku-
biert. Nach drei Stunden wurden die Proben bei 405 nm im Emax (MWG Biotech) gemessen.
Die gemessene OD405 der unbehandelten Zellextrakte wurde um die OD405 der Inhibitor-be-
handelten Extrakte bereinigt, um unspezifische Aktivitäten auszuschließen. Als Negativkon-
trolle fungierte der Leerwert, als Positivkontrolle die gereinigte Caspase 3.
Probe Assay-Puffer Zellextrakt
2U/ µl
Caspase 3 Inhibitor
2 mM
Substrat
Leerwert 90 µl --- --- --- 10 µl
Zellextrakt 80 µl 10 µl --- --- 10 µl
Inhibitor-behandelter
Zellextrakt 60 µl 10 µl --- 20 µl 10 µl
gereinigte Caspase 3 75 µl --- 15 µl --- 10 µl
Tab. 2.-3.: Pipettierschema des Caspase-Aktivitäts-Assays
Material und Methoden
57
2.2.3.3. Durchflußzytometrie
Die durchflußzytometrischen Messungen wurden an einem FACS-Calibur der Firma Becton-
Dickinson durchgeführt. Die Experimente wurden entweder mit dem Programm CellQuest
derselben Firma ausgewertet oder mit dem Programmen FCSPress (Mac) und winMDI (Win),
die als shareware-Versionen vorliegen.
2.2.3.3.1. PI-Färbung toter Zellen
1 x 106 Zellen in 450 µl FACS-Puffer wurden direkt vor der Messung im FACS-Calibur mit
2,5 µg/ml Propidiumjodid versetzt. In tote Zellen kann dieser Farbstoff sehr schnell eindrin-
gen und sich in die DNA einlagern. Dies kann durch erhöhte Fluoreszenz im Kanal 3 de-
tektiert werden.
2.2.3.3.2. Einfache Antikörperfärbung
Pro Ansatz wurden 1 x 106 Zellen in 50 µl FACS-Puffer mit dem Primärantikörper in der
angegebenen Konzentration für 30 min bei 4°C inkubiert.
Sofern dieser nicht direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff (FITC für Kanal 1, R-PE für Kanal
2) gekoppelt war, wurde danach zweimal mit einem Überschuß FACS-Puffer gewaschen und
ein weiterer Inkubationsschritt für 30 min bei 4°C im Dunklen mit einem fluoreszenzfarb-
stoffgekoppelten Sekundärantikörper angeschlossen.
Danach wurden die Zellen nochmals gewaschen und in 350 µl PBS für die Messung am
FACS-Calibur aufgenommen.
2.2.3.3.3. Antikörperdoppelfärbung
Sofern keine Kreuzreaktion zu erwarten war, wurden die beiden FITC- und PE- gekoppelten
Antikörper gleichzeitig mit den Zellen inkubiert. Bei der Auswertung von solchen Doppel-
färbungen ist darauf zu achten, daß durch Überlappung der Emissionsspektren der beiden
Farbstoffe falsch-positive Resultate entstehen können, sofern diese nicht durch Adaption der
Geräteeinstellungen über eine vorausgehende Testfärbung durch Kompensation unterdrückt
werden.
2.2.3.3.4. AnnexinV-FLUOS/ PI-Doppelfärbung mit dem AnnexinV-FLUOS Stain-
ing Kit der Firma Roche Diagnostics (Mannheim)
In frühen Phasen der Apoptose zeigen sich Membranveränderungen wie die Translokation
von Phosphatidylserin-Resten an die Membranaußenseite. AnnexinV ist ein Ca2+-abhängiges
Material und Methoden
58
Phospholipid-bindendes Protein mit einer hohen Affinität zu Phosphatidylserin. Jedoch ist die
Membran in der frühen Phase der Apoptose noch so „dicht“, daß kein PI eindringen kann.
Schreiten die Zellen in der Apoptose jedoch voran, wird auch die Membran undicht, so daß
eine PI-Färbung der Zell-DNA stattfinden kann. Nekrotische Zellen sind PI-anfärbbar, und
exponieren ebenfalls Phosphatidylserin. Daß in dieser Arbeit AnnexinV/PI-positive Zellen als
„spätapoptotisch“ bezeichnet werden, beruht auf time-course-Experimenten, die zeigen, daß
die Zellen eine AnnexinV-positive Phase durchlaufen, bevor sie doppelt positiv werden.
Apoptotische Zellen wurden im Rahmen dieser Arbeit mit dem AnnexinV-FLUOS-Staining-
Kit der Firma Roche Diagnostics (Mannheim) nach deren Protokoll gefärbt und im FACS-
Calibur detektiert.
1 x 106 Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 200 g für 5 min zentrifugiert. Der Über-
stand wurde verworfen und das Pellet in 100 µl staining solution resuspendiert. Die Zellen
wurden für 15 min im Dunkeln bei RT inkubiert, anschließend wurden 400 µl binding puffer
zugefügt und die Zellen mittels des FACS-Calibur analysiert.
staining solution 20 µl AnnexinV-Fluorescein-Reagenz
20 µl PI-Reagenz
in 1 ml binding puffer
2.2.3.3.5. Messung und Auswertung am FACS-Calibur
Da sich lebende von toten Zellen im FACS-Calibur anhand ihrer Größe (FSC) und Granulari-
tät (SSC) unterscheiden, wurde in der Regel im FSC/SSC-dotplot eine Region definiert, wel-
che nur die lebenden Zellen enthielt. Dies wurde durch PI-Färbung mehrerer Zellaliquots
überprüft. Es erfolgte dann die Messung von 20.000 Zellen jeder Probe im Lebendgate. Dabei
wurden die toten Zellen mit aufgenommen, jedoch nicht mitgezählt.
Die Daten wurden in den Software-Programmen CellQuest, FCSPress oder winMDI in Form
von dotplots und Histogrammen statistisch ausgewertet.
2.2.3.4. Immunhistochemie/ Immunzytochemie
2.2.3.4.1. Herstellung von Zytospins
Pro Objektträger wurden je nach Größe der zu untersuchenden Zellen zwischen 2 x 104 und 5
x 105 Zellen geerntet, gewaschen und in 100 µl PBS aufgenommen. Objekträger, Filterpapier
und Trichter wurden in die Einsätze der Zytospinzentrifuge eingespannt. In den Trichter wur-
den 50 µl 20 % BSA in PBS vorgelegt und mit 100 µl Zellsuspension vorsichtig überschich-
Material und Methoden
59
tet. Dies bewirkt, daß die Zellen bei der Zentrifugation durch dieses Kissen aus dichterem
Medium abgebremst werden und beim Aufprall auf dem Objektträger nicht kaputt gehen. Die
Zentrifugation wurde bei 800 rpm für 10 min bei RT durchgeführt.
Die Objektträger wurden ün getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbe-
wahrt.
2.2.3.4.2. Fixierung von Zytospins
Die Zytospins wurden vor der immunhistochemischen Färbeprozedur in einer frisch angesetz-
ten 2 %igen Paraformaldehyd-Lösung fixiert.
2.2.3.4.3. Fixierung für Immunfluoreszenzfärbungen
Für Immunfluoreszenzfärbungen wurden die Zytospins für 10 min in eiskaltem Aceton fixiert,
da die Fixierung mit Paraformaldehyd zu einer erhöhten unspezifischen Eigenfluoreszenz der
Zellen führen kann.
2.2.3.4.4. Färbung mit der DAB-Methode
Zur Färbung mit DAB wurde die sog. StreptABC-Methode von Dako verwendet. Diese Me-
thode ist aufgrund der Verstärkung des Signals über einen Brückenantikörper und Streptavi-
din-Biotin besonders sensitiv.
Die Objektträger mit den fixierten Zellen wurden in einer Küvette zunächst in PBS rehydriert.
Hierauf wurden mit Methanol/2 % H2O2 für 15 min bei RT endogene Peroxidasen inaktiviert.
Nach dreimaligem Waschen der Objektträger in PBS wurden die Objektträger in eine feuchte
Kammer überführt und die Zytospins mit PBS/3 % TM (100 µl pro Objektträger) überschich-
tet. Nach 30 min bei RT wurde die Lösung abgeklopft und durch den Primärantikörper in
PBS/3 % TM ersetzt. Dieser wurde auf den Zellen entweder für 30 min bei 37°C, 2 h bei RT
oder ün bei 4°C belassen. Danach wurden die Zellen dreimal mit PBS in einer Küvette gewa-
schen, wieder in die feuchte Kammer gebracht und für eine Stunde bei 37°C mit einer Lösung
des biotinylierten Sekundärantikörpers (für Primärantikörper aus der Maus: Reagenz C des
StreptABC-Kit, biotinylierter Ziegen-anti-Maus/Hasen-Ig; Dako;) in PBS/3 % TM bedeckt.
Nach erneutem Waschen folgte ein weiterer einstündiger Inkubationsschritt bei 37°C mit je
einer 1: 100-Verdünnung der Reagenzien A und B des StreptABC-Kits in PBS/3 % TM.
Die Enzymaktivität der nun an die Zellen gebundenen Peroxidase wurde über das Substrat
DAB (2 Tabletten in 40 ml PBS und 0,006 % H2O2) detektiert. Hierbei entsteht eine braune
Material und Methoden
60
Färbung, deren Entwicklung nach 5 min Inkubation durch Spülen mit Leitungswasser abge-
stoppt wurde.
Das DAB-Endprodukt ist sowohl in organischen als auch in wäßrigen Lösungsmitteln unlös-
lich. Daher können Gegenfärbungen in organischem oder löslichem Medium durchgeführt
werden und die Präparate in organischem oder löslichem Einbettmedium eingebettet werden.
Zur besseren Orientierung auf den Präparaten wurde eine Zellkern-Färbung durch kurzes
Eintauchen der Objektträger in Hämalaun-Lösung durchgeführt. Diese ergibt nach gründli-
chem Wässern mit Leitungswasser eine blau-violette Färbung.
2.2.3.4.5. Immunfluoreszenzfärbung (Dreifachmarkierung)
Für die Immunfluoreszenzfärbung von CD137 und B-Zellen im Zytospin wurden diese nach
Fixierung mit eiskaltem Aceton in PBS rehydriert und wie folgt inkubiert: In einem ersten
Schritt wurden die Zytospins in PBS/2 % BSA für 30 min bei RT in einer feuchten Kammer
blockiert. Nach dem Entfernen der Blockierlösung wurden die Zellen mit einer Mischung aus
2 µg/ml anti-CD137-bio (Klon 4B4-1, Ancell) und 1: 1.000 anti-CD19-FITC (Klon HD37,
Dako) in PBS/2 % BSA für 1 h bei 37°C im Dunklen inkubiert. Nach sorgfältigem dreimali-
gen Waschen in PBS schloß sich eine einstündige Inkubation bei 37°C im Dunkeln mit einem
Strep-Cy3-Konjugat an. Die Präparate wurden gewaschen und anschließend mit 4 µg/ml
Hoechst 33342 in PBS für 30 min bei 37°C in Dunkeln gegengefärbt. Dieser Farbstoff inter-
kaliert in die DNA und färbt so die Zellkerne an.
Es wurden gegen menschliche Proteine adsorbierte Sekundärantikörper verwendet und durch
Kontrollfärbungen mit Isotypantikörpern die Spezifität der Färbung überprüft.
2.2.3.4.6. Einbettung der Präparate
Die Schnitte und Zytospins, die mit der DAB-Methode gefärbt wurden, wurden anschließend
in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und mit dem organischen Einbettmedium En-
tellan eingedeckt.
Dieses hat gegenüber wäßrigen Einbettmedien den Vorteil, daß die Präparate dauerhaft auf-
gehoben werden können, da keine Austrocknungsgefahr besteht.
Immunfluoreszenzfärbungen wurden mit dem wäßrigen Einbettmedium Vectashield einge-
deckt und mit Nagellack umrandet. Alternativ wurden Immunfluoreszenzfärbungen mit
MoBiGlow eingedeckt, das zwar ebenfalls zu den wäßrigen Einbettmedien zählt, aber – ähn-
lich Entellan – aushärtet.
Material und Methoden
61
Fluoreszenzpräparate sind aufgrund der Instabilität der Fluoreszenzfarbstoffe nur sehr be-
grenzt haltbar und sollten stets im Dunkeln aufbewahrt werden, da sie bei Lichteinwirkung
sehr schnell ausbleichen.
2.2.3.4.7. Photografie
Die Immunfluoreszenzaufnahmen wurden an einem Bildanalysesystem mit dem Mikroskop
Zeiss Axiovert S100 und dem Objektiv Plan-Neofluar 40x/0,75 Ph2 über eine elektrisch ge-
kühlte CCD-Kamera aufgenommen.
Die Auswertung und Überlagerung der Bild-files erfolgte über die Software MetaMorph
(Universal Imaging Corp.).
Fotos von Agarosegelen (PCR) wurden mit Hilfe des über einem UV-Transilluminator instal-
lierten Geldokumentationssystems 2000i aufgenommen.
Ergebnisse
62
3. Ergebnisse
Ausgangspunkt dieser Untersuchung über die Rolle von CD137 in der Tumorantwort waren
die Untersuchungen von M. FURTNERS, in denen er nachweist, daß CLL-Patienten erhöhte Se-
rumspiegel an sCD137 aufweisen und die Konzentration an CD137 mit der Leukozytenzahl
der Patienten korreliert (FURTNER M., 2001). Weitere Vorarbeiten von S. POLEY vom Klinikum
Großhadern der Ludwig-Maximilians-Universität München beinhalten FACS-Analysen, die
die Synthese der membrangebundenen Form von CD137 auf Leukozyten von Patienten mit
verschiedenen Leukämieerkrankungen belegen. Dies weist zusammen mit der Tatsache, daß
immobili-siertes CD137 Apoptose in aktivierten T-Lymphozyten induzieren kann (SCHWARZ H.
et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999), darauf hin, daß die Expression von CD137 Tumorzellen einen
Vorteil bietet.
Darauf aufbauend untersuchte ich in dieser Arbeit zuerst die Expression von löslichem
CD137 in den Seren von B-CLL-Patienten und den Kulturüberständen von Patientenzellen
sowie die Expression von mCD137 auf den Lymphozyten von CLL-Patienten. Weitere Ziele
dieser Dissertation stellten die Charakterisierung der durch CD137 vermittelten Effekte und
die Aufklärung der Funktionsmechanismen von CD137 als Neoantigen auf den malignen
Lymphozyten dar.
3.1. Screening des CLL-Patienten-Materials
3.1.1. Das verwendete Patientenmaterial
Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Patientenmaterial handelte es sich um kryokonservierte
Lymphozytenaliquots von B-CLL-Patienten aus einer Studie, die an der Medizinischen Poly-
klinik der Universität Würzburg von M. GOLLER durchgeführt wurde. Außerdem standen von
einem Teil dieses Patientenkollektivs Serumproben zur Verfügung. In Kapitel 2.1.1.2. (Tab.
2.-1.) sind die in Würzburg erhobenen Daten, die im Rahmen meiner Arbeit von Interesse
sind, zusammengefaßt. Auf Grund der Begrenztheit des Materials wurden nicht alle Versuche
mit den Zellen aller Patienten durchgeführt.
3.1.2. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen
3.1.2.1. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen auf RNA-Ebene
Die Vorarbeiten von Dr. S. POLEY zeigten, daß die Leukozyten von Patienten mit Leukämie-
erkrankungen mCD137 exprimieren. Die uns zur Verfügung stehenden CLL-Zellen wurden
Ergebnisse
63
mit 10 ng/ml PMA und 1 µM A23187 (Kalziumionophor) oder 5 ng/ ml PHA stimuliert, um
das durch die Kryokonservierung veränderte Expressionsmuster an Zelloberflächenproteinen
(GOLLER, M., persönliche Mitteilung) zu rekonstruieren. Aus den kultivierten Zellen unterschiedli-
cher CLL-Patienten wurde die Gesamt-RNA isoliert. Die RNA wurde revers transkribiert und
die so gewonnene cDNA in einer PCR mit den CD137-spezifischen Primern G-ILA-sen und
G-ILA-AS eingesetzt. Es ergab sich folgendes Bild (Abb. 3.-1.):
mCD137
G3PDH
Abb. 3.-1.: Aktivierte Lymphozyten von CLL-Patienten exprimieren die mRNA für CD137. 2%iges
Agarosegel der PCR mit den mCD137-spezifischen Primern G-ILA-sen und G-ILA-AS; je-
weils rechts aufgetragen: Probennahme nach 48 h mit 10 ng/ml PMA, 1 µM A23187; links
aufgetragen: nicht aktivierte Proben; Als Kontrollen sind aufgetragen: - PCR ohne DNA-Matri-
ze, + mit 10 ng/ml PMA, 1 µM A23187 aktivierte Lymphozyten eines gesunden Spenders. Im
unteren Teil der Abbildung ist eine parallel angefertigte PCR mit Primern gegen das durch die
Aktivierung unbeeinflußte Haushaltsgen G3PDH mit den Primern G3PDH-sen und G3PDH-
AS gezeigt, um zu demonstrieren, daß gleiche cDNA-Mengen in der PCR eingesetzt wurden.
Nach Stimulation transkribieren die Zellen aller untersuchten Patienten CD137. Jedoch kann
die Expression der CD137-mRNA durch B-Lymphozyten gesunder Spender nach Stimulation
ebenfalls gezeigt werden (SCHWARZ H. et al., 1995), nicht aber die Proteinexpression (KIENZLE G.
und VON KEMPIS J., 2000; KIENZLE G. et al., 1997; MICHEL J., unveröffentlichte Daten).
3.1.2.2. Expression von mCD137 durch B-CLL-Zellen auf Protein-Ebene
Aus diesem Grund wurden von den stimulierten CLL-Zellen FACS-Färbungen gegen CD137
angefertigt. Der Gehalt an B-Lymphozyten dieser Zellaliquots ist in Tab. 2.-1. (Kap. 2.1.1.2.)
aufgeführt.
- + 1 5 6 17 20 25
- akt - akt - akt - akt - akt - akt
Ergebnisse
64
Abb. 3.-2.: Die Lymphozyten von CLL-Patienten exprimieren mCD137. FACS-Analyse der Lympho-
zyten von 13 CLL-Patienten.
Abb. 3.-2. zeigt die mCD137-Expression (durchgezogene Linien) gegenüber einer Färbung
mit einem Isotypantikörper (getüpfelte Linien). Dabei wird deutlich, daß auf den Lympho-
zyten aller untersuchten Patienten (13/13) mCD137 nachzuweisen ist. Der Anteil CD137-po-
sitiver Zellen lag zwischen 2,68 und 52,31 %. Zusammen mit Tab. 2.-1., die über den B-Zell-
Patient 1 Patient 5 Patient 6
Patient 9 Patient 101 Patient 102
Patient 13 Patient 14 Patient 15
Patient 17 Patient 20 Patient 22
Patient 24 Patient 25
Ergebnisse
65
Anteil in den Proben Auskunft gibt, ergab sich, daß in mindestens 10 der 13 untersuchten Pro-
ben mCD137 auf den entarteten B-Lymphozyten als Neoantigen exprimiert wird. Bei diesen
Patienten wird mCD137 auf einem deutlich höheren Anteil an Zellen exprimiert, als T-Zellen
in den Aliquots enthalten sind. Dieser Bezug ist notwendig, da T-Lymphozyten nach Stimu-
lation mCD137 exprimieren und so das Ergebnis verfälschen können (SCHWARZ H. et al., 1995;
VON KEMPIS J. et al., 1997; MICHEL J., 1998).
Um sicherzustellen, daß wirklich die B-CLL-Zellen mCD137 exprimieren, und das nachge-
wiesene Protein nicht von aktivierten T-Zellen stammt, wurden zusätzlich Immunfluores-
zenz-Doppelfärbungen durchgeführt
Abb. 3.-3. zeigt die Koexpression von CD19 und CD137 auf einer Patientenzelle.
Abb. 3.-3.: Aktivierte CLL-Zellen koexprimieren CD137 und den B-Zell-Marker CD19. Immunfluo-
reszenzfärbung eines Cytospins der Lymphozyten eines CLL-Patienten, die 12 h mit 5 ng/ml
PHA aktiviert wurden; blau: Kernfärbung mit Hoechst 33342, grün: antiCD19-FITC, rot: anti-
CD137-RPE; oben ist die Überlagerung der Färbung dargestellt, die kleinen Bilder unten zei-
gen die Färbungen einzeln.
Ergebnisse
66
Es ist deutlich zu erkennen, daß der B-Zell-Marker CD19 (grün) und CD137 (rot) auf dersel-
ben Zelle kolokalisieren. Die Überlagerung der Lichtemission grünen und roten Lichts in un-
mittelbarer Nähe ergibt den Mischton gelb-orange. Die Zellkerne sind mit Hoechst 33342 ge-
gengefärbt und erscheinen nach Anregung blau.
Bei acht von 10 untersuchten Patienten läßt sich die Koexpression beider Marker nachweisen.
Bemerkenswert ist, daß sich die rote Färbung auf sehr eng begrenzte „Punkte“ konzentriert.
Dies kann als Hinweis gewertet werden, daß CD137 auf der Membran in sog. clustern, raft-
Strukturen oder Mikrodomänen angeordnet und aktiv an der Signalübertragung beteiligt ist.
3.1.3. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen
Außer der membranständigen Form konnten von der CD137-mRNA mehrere splice-Varian-
ten nachgewiesen werden, darunter welche, die für lösliche Formen des Proteins codieren (MI-
CHEL J. et al., 1998, MICHEL J., 1998). Bei gesunden Probanden können nur geringe Konzentratio-
nen der löslichen Form des Proteins im Serum detektiert werden. M. FURTNER weist in seiner
Dissertation nach, daß in den Seren von CLL-Patientendie Spiegel an stark erhöhte sCD137-
Spiegel zu finden sind (FURTNER M., 2001). Dies konnte auch für das Würzburger Patientenkol-
lektiv gezeigt werden.
3.1.3.1. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen auf RNA-Ebene
Um zu nachzuweisen, daß das sCD137 in den Patientenseren von den CLL-Lymphozyten her-
rührt, wurde die CD137-Expression zuerst auf Transkriptionsebene untersucht.
CLL-Zellen wurden 48 h mit 10 ng/ml PMA und 1 µM A32187 stimuliert. Aus diesen Zellen
wurde die Gesamt-RNA isoliert. Über RT-PCR mit den Primern ILA-241-sen und ILA-
3’UTR-AS konnte zwischen der löslichen und der membranständigen Form von CD137 un-
terschieden werden.
Die PCR ist in Abb. 3.-4. dargestellt: Die Lymphozyten von 10 der 12 untersuchten Patienten
exprimieren nach Stimulation die lösliche Form von CD137 auf RNA-Ebene.
Ergebnisse
67
Abb. 3.-4.: Aktivierte Lymphozyten von CLL-Patienten exprimieren sowohl membranständiges
CD137 als auch die lösliche Form. 2%iges Agarosegel der PCR mit den Primern ILA-241-
sen und ILA-3’UTR-AS; jeweils rechts aufgetragen: Probennahme 48 h nach Aktivierung
durch PMA/ A23187, jeweils links aufgetragen: nicht aktivierte Proben. Als Kontrollen: - PCR
ohne DNA-Matrize, + mit 1 µM A23187, 10 ng/ml PMA aktivierte Lymphozyten eines
gesunden Spenders. Im unteren Teil der Abbildung ist eine parallel angefertigte PCR mit
Primern gegen das durch Aktivierung unbeeinflußte Haushaltsgen G3PDH mit den Primern
G3PDH-sen und G3PDH-antisen gezeigt, um zu demonstrieren, daß gleiche cDNA-Mengen in
der PCR eingesetzt wurden. Die sCD137-Banden sind sehr schwach. Bei Patient E ist keine
Expression von sCD137 zu erkennen.
3.1.3.2. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen auf Protein-Ebene
3.1.3.2.1. Expression von sCD137 durch B-CLL-Zellen in Zellkulturüberständen
Es wurde untersucht, in wieweit CLL-Zellen sCD137 in Kulturüberstände abgeben.
1,0 x 106 Zellen wurden mit 10 ng/ml PMA und 1 µM A23187 oder 5 µg/ml PHA stimuliert
und zwei Tage kultiviert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert, die Überstände abge-
nommen und im ELISA analysiert.
Bei 14 von 17 daraufhin untersuchten Patienten konnte sCD137 in Konzentrationen zwischen
0,1 und 1,2 ng/ml nach Stimulation der Zellen in den Überständen detektiert werden.
3.1.3.2.2. Nachweis von sCD137 in Patientenseren
Von 10 der Patienten standen Serumaliquots zur Verfügung, so daß die Konzentration an
sCD137 im Serum dieser Patienten bestimmt werden konnte. M. FURTNER konnte in seiner
Dissertation zeigen, daß bei CLL-Patienten sCD137 im Serum signifikant erhöht ist und dies
mit der Leukozytenanzahl korreliert (FURTNER M., 2001). In allen getesteten Patientenseren war
sCD137 nachweisbar. Die Konzentrationen lagen zwischen 0,08 und 1,1 ng/ml. Von den 10
in Rahmen dieser Arbeit untersuchten Seren wiesen fünf einen signifikant erhöhten sCD137-
Spiegel auf, d.h. die CD137-Konzentration in diesen Proben war größer als der durchschnitt-
- + 5 6 13 17 20
- akt - akt - akt - akt - akt
mCD137
sCD137
G3PDH
Ergebnisse
68
liche Spiegel an sCD137 in den Seren 100 gesunder Probanden zzgl. der doppelten Standard-
abweichung. Dieser Wert beträgt 0,512 ng/ml.
A B
Leukozytenzahl - sCD137
R2 = 0,87320
20
40
60
80
100
120
140
0 0,2 0,4 0,6 0,8
ng/ ml sCD137
Leu
kozy
tenz
ahl
CD5+ B-Zellen - sCD137
R2 = 0,21510
20
40
60
80
100
120
140
0 0,2 0,4 0,6 0,8
ng/ ml sCD137C
D5+
B-Z
elle
n
C D
aktivierte T-Zellen - sCD137
R2 = 0,6655
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8
ng/ ml sCD137
T-L
ymph
ozyt
en
ß2-Mikroglobulin - sCD137
R2 = 0,58050
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8
ng/ ml sCD137
µg/
ml ß
2-M
ikro
glou
lin
Abb. 3.-5.: Korrelation verschiedener klinischer Parameter mit der Menge an sCD137 im Serum von
CLL-Patienten; A Leukozytenanzahl, B Zahl der CD5-postiven B-Zellen, C Zahl der T-
Lym-phozyten, D Serumkonzentration an ß2-Mikroglobulin. A – C: Die Zellzahlen sind in
103/µl angegeben; dargestellt sind jeweils die Einzelwerte der Patienten, sowie eine
Trendlinie.
Die Korrelation mit der Anzahl an Leukozyten konnte bestätigt werden. Außerdem können
aus Abb. 3.-5. folgende Aussagen getroffen werden: (i) Der Level an sCD137 korreliert we-
der mit dem Anteil noch mit der Anzahl an CD5+-B-Zellen. (ii) Der sCD137-Spiegel korre-
liert weder mit dem Anteil noch mit der Anzahl an T-Zellen. Er korreliert jedoch negativ mit
dem Anteil und der Anzahl an aktivierten, HLA-DR-positiven T-Lymphozyten. (iii) Zwischen
dem Serumspiegel an sCD137 und ß2-Mikroglobulin kann eine Korrelation gefunden werden.
Bei ß2-Mikroglobulin handelt es sich um einen der wenigen zuverlässigen diagnostischen
Ergebnisse
69
Marker, die den klinischen Verlauf der CLL abbilden (ZWIEBEL J. A. und CHESON B. D., 1998).
Beim Erstellen der Korrelationen wurden zwei Patienten ausgeschlossen, die Autoimmun-
erkrankungen entwickelt hatten (GOLLER M., persönliche Mitteilung).
3.1.3.2.2. Herkunft von sCD137 in Patientenseren
Es war von Interesse herauszufinden, welcher Zelltyp für die Produktion von sCD137 verant-
wortlich ist, da dies aus den Korrelationen nicht hervorgeht. Obwohl die Konzentration an
sCD137 mit der Leukozytenzahl eine gute Korrelation aufweist, nimmt diese Übereinstim-
mung ab, wenn man sich die Korrelation zwischen sCD137 und der Anzahl an CD5-positiven
B-CLL-Zellen ansieht. Zudem zeigt sich eine negative Korrelation zwischen der Anzahl an
aktivierten T-Zellen und der sCD137-Konzentration. Um zu untersuchen, von welchen Zellen
das lösliche CD137 sekretiert wird, wurden die T-Lymphozyten aus CLL-Zell-Aliquots mit
magnetischen anti-CD3-beads abgetrennt. Sowohl diese depletierten B-Zellen als auch un-
depletierte Zellen des gleichen Spenders wurden zwei Tage mit PMA/A23187 stimuliert. An-
schließend wurde mittels ELISA die Konzentration an sCD137 bestimmt. Dabei ergab sich
folgendes (s. Abb. 3.-6.):
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Serum undepletiert B-Zellen
ng/ m
l CD
137
Abb. 3.-6.: Das im Serum von CLL-Patienten gefundene sCD137 stammt nicht von den B-Lympho-
zyten. Bestimmung der Konzentration an löslichem CD137 im Serum eines CLL-Patienten so-
wie im Zellkulturüberstand nicht depletierter Lymphozyten oder aufgereinigter B-Lymphozy-
ten desselben Patienten nach 48 h Kultur unter PMA/ Ca2+-Ionophor-Stimulation durch einen
ELISA gegen CD137; dargestellt ist der Mittelwert einer Dreifachbestimmung ± Standardab-
weichung. Exemplarisch ist eines von drei Experimenten mit den Zellen verschiedener Patien-
ten gezeigt.
Dies wies darauf hin, daß das im Serum beobachtete sCD137 nicht – wie es die Korrelation
mit der Leukozytenanzahl nahelegte – von den leukämischen B-Zellen stammt.
Ergebnisse
70
Von zwei weiteren Patienten konnten sowohl B- als auch T-Lymphozyten betrachtet werden.
Dabei ergab sich eindeutig, daß das gefundene sCD137 von den T-Lymphozyten stammt (vgl.
Abb. 3.-7.). Dies stimmt mit den Beobachtungen von J. MICHEL überein, daß sCD137 in
erster Linie von (CD8-positiven) T-Zellen exprimiert wird (MICHEL J. et al., 1998).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
undepletiert B-Zellen T-Zellen
ng C
D13
7/ m
l
Abb. 3.-7.: Das im Patientenserum und in den Überständen kultivierter B-CLL-Zellen gefundene
sCD137 wird von T-Lymphozyten produziert. ELISA gegen sCD137 von Zellkulturüber-
ständen nicht depletierter Lymphozyten, aufgereinigter B- und T-Lymphozyten desselben Pa-
tienten nach 48 h PMA/ Ca2+-Ionophor-Stimulation; gezeigt ist der Mittelwert einer Dreifach-
bestimmung ± Standardabweichung.
3.2. Funktion von mCD137 in der CLL
3.2.1. Die Rolle von mCD137 bezüglich des Überlebens von CLL-Zellen
Um die Rolle von mCD137 in vitro untersuchen zu können, wurden Polystyrol-Zellkultur-
platten mit einem CD137-Fc-Fusionsprotein beschichtet, das aus dem extrazellulären Teil von
CD137 und einen IgG-Fc-Teil besteht. Diese Moleküle lagern sich über den Fc-Teil zu Ho-
modimeren zusammen. Die CLL-Zellen wurden in CD137-Fc-, Kontrollprotein- oder unbe-
schichteten Platten kultiviert. Im Abstand von einigen Tagen wurde die Anzahl der lebenden
Zellen mittels Trypanblau-Ausschluß bestimmt.
Dabei ergab sich für sechs von sechs untersuchten Patienten, daß die Zellen auf CD137-Fc
signifikant länger überlebten als in Platten, die mit einer äquimolaren Menge an Fc-Kontroll-
protein beschichtet worden waren.
Tab. 3.-1. zeigt das prozentuale Überleben der CLL-Zellen am Tag 8. Der Anteil überleben-
der Zellen schwankt sehr stark zwischen den Patienten. Es ist für CLL-Lymphozyten bekannt,
daß die Zellen verschiedener Probanden große Unterschiede hinsichtlich ihres Überlebens so-
Ergebnisse
71
wie des Ansprechens auf Zytokine und Mitogene aufweisen (PFEFFER K. et al., 1987; KARRAY S. et
al., 1987; ALVAREZ-MON M. et al., 1993).
5 µg/ml Fc 10 µg/ml CD137-Fc p-Wert
2 45,1 ± 1,2 71,7 ± 2,3 0,000
102 16,0 ± 1,8 34,0 ± 9,2 0,030
14 12,4 ± 1,0 18,8 ± 3,5 0,040
15 73,1 ± 6,9 84,8 ± 0,9 0,043
16 26,4 ± 3,4 36,5 ± 1,0 0,008
22 32,9 ± 5,6 71,0 ± 5,1 0,001
Tab. 3.-2.: An Tag 8 überleben signifikant mehr Lymphozyten von CLL-Patienten auf immobilisier-
tem CD137-Fc als auf Fc-Kontrollprotein. Die Platten wurden mit den angegebenen äqui-
molaren Mengen an CD137-Fc-Fusionsprotein bzw. Fc-Kontrollprotein beschichtet. Angege-
ben ist der Anteil der überlebenden Zellen von den im Experiment eingesetzten lebenden Zel-
len in Prozent als Mittelwert aus einer Vierfachbestimmungen ± Standardabweichung, sowie
die Signifikanz (p-Wert).
In Abb. 3.-8. ist für den Patienten 22 exemplarisch eine Absterbekurve der CLL-Zellen über
mehrere Wochen Kultur gezeigt.
0
20
40
60
80
100
120
0 3 6 9 12 15 18
Tag
Proz
ent ü
berl
eben
de Z
elle
n
---FcCD137-Fc
Abb. 3.-8.: CLL-Zellen, die auf immobilisierten CD137-Fc kultiviert wurden, sterben langsamer ab,
als Zellen, die auf unbeschichteten Platten oder Kontrollprotein-beschichteten Platten
kultiviert wurden. Bestimmung der lebenden Zellen über Trypanblau-Ausschluß über einen
Zeitraum von 18 Tagen; betrachtet wurden Zellen, die in unbeschichteten 24-well-Polystyrol-
platten, mit CD137-Fc-Fusionsprotein (10 µg/ml in 300 µl PBS) oder der äquimolaren Menge
an Fc-Kontrollprotein (5 µg/ml in 300 µl PBS) beschichteten kultiviert wurden; gezeigt sind
Vierfachbestimmungen ± Standardabweichung.
Ergebnisse
72
Auf immobilisiertem CD137-Fc überleben nicht nur mehr Zellen, sondern die B-CLL-Lym-
phozyten überleben auch über einen längeren Zeitraum.
sCD137 oder lösliches Fc im Medium hat keinen überlebensverlängernden Effekt, es scheint
im Gegenteil zu einem geringfügig schnelleren Absterben zu führen. Auch hier ist exempla-
risch Patient 22 betrachtet (s. Abb. 3.-9.). Bei den anderen fünf betrachteten Patienten hat
CD137-Fc ebenfalls einen geringfügig negativen oder keinen Effekt auf das Überleben der
CLL-Zellen.
0
20
40
60
80
100
120
0 3 6 9 12 15 18
Tage
Proz
ent Ü
berl
eben
de
---FcCD137-Fc
Abb. 3.-9.: Die Zugabe von löslichem CD137 zu CLL-Zellen hat keinen Einfluß auf deren Überleben
in Kultur. Zugegeben wurden entweder 10 µg/ml CD137-Fc-Fusionsprotein oder die äquimo-
lare Menge von 5 µg/ml Fc-Protein zu Zellen, die in FCS-blockierten 24-well-Polystyrolplatten
kultiviert wurden; gezeigt sind Vierfachbestimmungen ± Standardabweichung.
3.2.2. Ursache der höheren Anzahl überlebender B-CLL-Zellen auf
CD137-Fc
Für die deutlich erhöhte Überlebenrate der CLL-Zellen an Tag 8 auf immobilisiertem CD137-
Fc-Protein kann es zwei Gründe geben: Erstens, daß die Zellen durch das immobilisierte
CD137-Fc nicht absterben. Zweitens, daß einige Zellen zwar absterben, andere aber prolife-
rieren und so die Zahl an lebenden Zellen auf CD137-Fc langsamer abnimmt, als auf mit dem
Kontrollprotein beschichteten Platten.
Um die Ursache des verlängerten Überlebens aufzuklären, wurden Proliferationsassays durch-
geführt: 2,5 x 105 Zellen wurden in einer Konzentration von 1,25 x 106 Zellen/ml in den Lö-
chern einer 96-well-Platte für zwei Tage kultiviert. Dann wurde über Nacht 50 µCi 3H-Thymi-
din zugegeben, welches im Falle der Zellteilung in die neu synthetisierte DNA eingebaut
Ergebnisse
73
wird. Am nächsten Tag wurden die Zellen auf einer Filtermembran lysiert und die Menge an
Radioaktivität auf dieser Membran in einem Szintilisationszähler bestimmt.
Dabei ergab sich, daß immobilisiertes CD137-Fc in den Zellen aller fünf untersuchten Patien-
ten keine Proliferation zu induzieren vermag. In Abb. 3.-10. sind zwei der Experimente ge-
zeigt.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Fc CD137-Fc
Fc CD137-Fc
Cou
nts
Patient 8 Patient 14
Abb. 3.-10.: Immobilisiertes CD137 hat keinen Einfluß auf die Proliferation von CLL-Zellen. Prolife-
rationsassay mit CLL-Zellen zweier Patienten auf unbeschichteten Platten bzw. Polystyrolplat-
ten, die mit äquimolaren Mengen an CD137-Fc- bzw. Fc-Protein beschichtet waren; gezeigt
sind Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung.
Wie aus Abb. 3.-10. zu entnehmen ist, ist kaum Radioaktivität meßbar; das bedeutet, daß das
verlängerte Überleben der CLL-Zellen auf immobilisiertem CD137-Fc nicht auf Proliferation
zurückzuführen ist. Die etwas höheren Strahlungswerte der CD137-Fc-Bedingung sind darauf
zurückzuführen, daß auf immobilisiertem CD137-Fc mehr Zellen überleben. Dies wurde in
Kapitel 3.2.1. gezeigt.
3.3. Die Rolle von mCD137 in der LAK-Antwort
Die bisherigen Untersuchungen beschäftigen sich lediglich mit der Wirkung von CD137 auf
die leukämischen Zellen an sich. Um einen Einblick in die Interaktion der entarteten Zellen
mit dem Immunsystem zu bekommen, ist es jedoch notwendig, beide Seiten – die der Tumor-
zellen und die der interagierenden Immunzellen – zu betrachten.
Da – wie oben bereits erwähnt – die CLL-Zellen in vitro sehr rasch absterben (PFEFFER K. et al.,
1987; KARRAY S. et al., 1987; ALVAREZ-MON M. et al., 1993; KIPPS T. J., 1998; MEINHARDT G. et al., 1998;
Ergebnisse
74
SÖDERBERG O., 1998), wurden für die folgenden Untersuchungen verschiedene (Tumor-)Zelli-
nien statt der CLL-Zellen verwendet.
3.3.1. Der Effekt von mCD137 in der LAK-Antwort
Um herauszufinden, ob mCD137 einen für die Tumorzellen positiven Effekt bzgl. der LAK-
Antwort bewirkt, wurden ausgewählte Zellinien (COS, Jurkat, K562, Raji) mit dem Vektor
CMV-ILA-sense transient transfiziert, der auf dem Expressionsvektors pcDNA3.1. basiert.
Dieser trägt unter der Kontrolle des CMV-Promotors eine Kopie des vollständigen Tran-
skripts von mCD137. Alternativ wurde der Vektor RSV-ILA-sense verwendet. Dieser Vektor
beruht auf Expressionsvektor pRc/RSV und besitzt die codierende Region für CD137 hinter
dem RSV-Promotor. Der Zeitpunkt der maximalen Expression dieser Konstrukte wurde über
die Transfektion der analogen Vektoren mit der codierenden Region von gfp (green fluores-
cent protein) getestet. Ein Expressionsmaximum dieses Membranproteins ist nach ca. 48 h er-
reicht. Alle Experimente mit transfizierten Zellen wurden daher zwei Tage nach der Trans-
fektion der Zellen durchgeführt.
Die in dieser Arbeit verwendeten Zellinien wurden aus folgenden Gründen ausgewählt:
COS-Zellen lassen sich sehr effizient transfizieren. Sie sind adhärent und stammen aus dem
Nierenepithel von grünen Meerkatzen.
K562 sind stark undifferenzierte humane myelotische Suspensionszellen, die aus einem Pa-
tienten mit akuter myelotischer Leukämie (AML) kultiviert wurden. Diese Zellinie dient bei
Studien mit LAK-Zellen häufig als Zielzellinie. Bei meinen Untersuchungen war zudem von
Interesse, daß diese Zellen nicht nur – wie CLL-Zellen – hämatopoetischer Abstammung,
sondern auch gut transfizierbar sind.
Jurkats sind T-Lymphozyten einer akuten T-Zell-Leukämie. Sie wachsen ebenfalls in Lösung
und lassen sich gut transfizieren. Sie sind der lymphatischen Reihe zuzuordnen.
Rajis stammen von den Lymphozyten eines Patienten mit einem Burkitt-Lymphom ab. Diese
Suspensionszellen sind B-Lymphozyten, wie auch die CLL-Zellen. Leider lassen sich Rajis
nichtviral wenig effizient transfizieren.
Für COS-, Jurkat-, K562- und Raji-Zellen ist in Abb. 3.-11. die Modulation der mCD137-
Expression durch die Transfektion gezeigt.
Ergebnisse
75
Abb. 3.-11.: 48 h nach Transfektion mit einem CD137-sense-Expressionsvektor synthetisieren die an-
gegebenen Zellinien deutlich mehr mCD137 als nach der Transfektion mit einem Kon-
trollvektor. FACS-Analysen der angegebenen Zellinien mit einem anti-CD137-RPE-Anti-
körper (durchgezogene Linie); zur Kontrolle ist die Färbung mit einem RPE-gekoppelten Iso-
typantikörper gezeigt (getüpfelte Linie); Transfektionskonstrukte: pcDNA: pcDNA 3.1., CIS:
CMV-ILA-sen, RSV: RSV, RIS: RSV-ILA-sen; angegeben ist der Anteil CD137-positiver Zel-
len bezogen auf die Isotypkontrolle in Prozent.
COS
K562
Jurkat
Raji
Ergebnisse
76
Die transfizierten Zellen wurden als Zielzellen im LAK-Assay eingesetzt. LAK-Zellen sind
PBMCs, die für drei Tage hohen IL-2-Konzentrationen (100 ng/ml) ausgesetzt waren. Bei
diesen Zellen handelt es sich hauptsächlich um unspezifische zytotoxische T-Zellen.
Für alle untersuchten Zellinien ergab sich, daß Zellen, die mCD137 auf ihrer Oberfläche ex-
primieren, gegenüber Zellen, die mit dem Kontrollvektor transfiziert wurden, eine verminder-
te Lyserate aufwiesen (vgl. Abb. 3.-12.).
COS K562
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1: 2,5 1: 10 1:25 1: 50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
pcDNACMV-ILA-sen
05
10152025
3035404550
1: 2,5 1:10 1: 25 1: 50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
RSVRSV-ILA-sen
Jurkat Raji
05
10152025
3035404550
1: 2,5 1: 10 1: 25 1: 50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
pcDNACMV-ILA-sen
02468
10
1214161820
1: 2,5 1: 10 1: 25 1: 50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
RSVRSV-ILA-sen
Abb. 3.-12.: Die Expression von mCD137 durch verschiedene Zellinien schützt diese vor LAK-vermit-
telter Zytolyse. LAK-Assays mit den angegebenen Konstrukten transfizierter Zellinien. Ge-
zeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist
eines von je drei unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse
77
3.3.2. Verifizierung der durch mCD137 vermittelten Verminderung
der zytotoxischen Lyse
Die Verminderung der zytotoxischen Lyse durch mCD137 wurde mit zwei weiteren Ver-
suchsansätzen bestätigt: Zum einen wurden Transfektionen mit einem antisense-Konstrukt
auf der Basis des Vektors pcDNA3.1. durchgeführt, um die CD137-Expression der Zellen
spezifisch zu inhibieren, zum anderen wurde das von den transfizierten Zellen gebildete
mCD137 mit einem Antikörper gegen CD137 blockiert.
3.3.2.1. Nachweis der Spezifität des mCD137-Effekts durch die Transfektion mit
einem antisense-Vektor
Um eine Veränderung der Zytolyse über die Regulation von mCD137 an COS-Zellen nach-
weisen zu können, wurden Transfektionsexperimente mit sense- und antisense-Vektoren
durchgeführt.
Das Blockieren der Translation durch antisense-RNAs beruht zum einen darauf, daß sich der
Translationsapparat der Zelle an die dsRNAs, die durch die Hybridisierung der sense- und an-
tisense-RNA entstehen, nicht anlagern kann. Zum anderen werden dsRNAs in der Zelle von
spezifischen RNasen abgebaut, da in der gesunden Zelle dsRNAs vorwiegend als Folge vira-
ler Infektion vorkommen.
COS-Zellen, die selbst kein endogenes mCD137 exprimieren, wurden mit 0,3 µg RSV-ILA-
sen/2,7 µg RSV, mit 0,3 µg RSV/2,7 µg RSV-ILA-antisen, mit 0,3 µg RSV-ILA-sen/2,7 µg
RSV-ILA-antisen und zur Kontrolle mit 3,0 µg RSV alleine transfiziert. Das hier verwendete
Verhältnis von 1:10 sense-:antisense-Vektor wurde in Vorversuchen als optimal ermittelt. Ein
Überschuß an antisense-RNA ist notwendig, wenn mit full-length-Transkripten die Trans-
lation einer mRNA verhindert werden soll. Die transfizierten Zellen wurden nach zwei Tagen
im LAK-Assay eingesetzt. Dabei zeigte sich, wie erwartet, daß eine Transfektion mit dem
antisense-Vektor alleine keinen Einfluß hat, da die COS-Zellen CD137 nicht konstitutiv ex-
primieren. Eine Transfektion mit RSV-ILA-sen vermindert die gemessene Zytolyse deutlich,
während die mit RSV-ILA-sen und RSV-ILA-antisen kotransfizierten Zellen deutlich stärker
lysiert werden (vgl. Abb. 3.-13.).
Die verminderte zytotoxische Lyse ist folglich auf die Anwesendheit von CD137 in der
Membran der Zielzellen zurückzuführen.
Ergebnisse
78
0
5
10
15
20
25
2,5 10 25 50
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
RSVRSV/ RISRIA/ RSVRIA/ RIS
Abb. 3.-13.: Kotransfektion mit einem CD137-antisense-Vektor hebt die durch mCD137-vermittelte
Verminderung der Empfindlichkeit gegenüber zytotoxischer Lyse teilweise auf. LAK-
Assay mit COS-Zellen, die 48 h vor dem Experiment mit den angegebenen Konstrukten trans-
fiziert wurden; RSV: pcDNA-Expressionsvektor mit RSV-Promotor, RSV/ RIS: 2,7 µg RSV /
0,3 µg RSV-ILA-cis, RIA/ RSV: 2,7 µg RSV-ILA-antisense / 0,3 µg RSV, RIA/ RIS: 2,7 µg
RSV-ILA-antisense/ 0,3 µg RSV-ILA-cis. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestim-
mungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist eines von drei unabhängigen Experimenten.
In Abb. 3.-14. ist die Rekonstitution der Empfindlichkeit antisense-transfizierter Zielzellen
gegenüber der LAK-Lyse für Zellinien dargestellt, die konstitutiv mCD137 exprimieren. Die
konstitutive Expression von mCD137 in K562 und Rajizellen, sowie die Modulation der Ex-
pression nach Transfektion dieser Zellinien zeigen Abb. 3.-11. und 3.-15..
K562 Raji
05
10152025
303540
4550
1: 1 1: 10 1: 50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
RSV
RIS
RIA
0
5
10
15
20
25
30
1: 1 1: 10 1:50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
RSV
RIS
RIA
Abb. 3.-14.: Korrelation der CD137-Expression mit der Sensibilität verschiedener Zellinien gegen-
über LAK-Lyse. LAK-Assay der mit den angegebenen Vektoren transfizierten Zellen. Trans-
fektionskonstrukte: RSV: RSV, RIS: RSV-ILA-sense, RIA: RSV-ILA-antisense. Gezeigt sind
die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist eines von
je drei unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse
79
K562 Raji
Abb. 3.-15.: Durch die Transfektion mit einem CD137-antisense-Konstrukten kann die mCD137-Ex-
pression verschiedener Zellinien moduliert werden. FACS-Analysen mit CD137-sense- und
-antisense Vektoren transfizierter Zellinien; dargestellt ist die Färbung mit einem anti-CD137-
RPE-Antikörper (durchgezogene Linien) gegenüber der Färbung mit einem Isotypkontrollanti-
körper (getüpfelte Linie); angegeben ist der Anteil an CD137-positiven Zellen in Prozent ge-
genüber der Kontrollfärbung; dargestellt ist eines von je drei unabhängigen Experimenten.
Da K562 und Rajis mCD137 endogen exprimieren, bewirkt die Transfektion mit RSV-ILA-
sen eine Erhöhung der konstitutiven Expression, wie sie nach der Transfektion mit dem Leer-
vektor RSV detektiert werden kann. Die Transfektion mit RSV-ILA-antisen verringert die Ex-
pression an CD137-Protein auf der Zelloberfläche der transfizierten Zellen. In Einklang mit
der veränderten Dichte an mCD137 werden Raji- und K562-Zellen, die mit RSV-ILA-sen
transfiziert wurden, weniger stark lysiert. Dieser Schutz wird durch die Transfektion des anti-
sense-Vektors jedoch aufgehoben: antisense-transfizierte Zellen werden stärker lysiert als
kontroll-transfizierte.
Ergebnisse
80
3.3.2.2. Nachweis der Spezifität des mCD137-Effekts durch die Vorinkubation der
Zielzellen mit dem anti-CD137-Antikörper bbk-2
Für transfizierte COS- sowie für Raji-Zellen wurden Neutralisierungsexperimente durchge-
führt. Dabei wurden CD137-exprimierende Zellen mit einem Antikörper gegen CD137 inku-
biert. Dadurch kann keine Interaktion zwischen CD137 und seinem Liganden mehr stattfin-
den, da der Antikörper an CD137-Moleküle auf der Zelloberfläche bindet und so die Bin-
dung von CD137 an seinen Liganden verhindert.
Wieder dienten die gut transfizierbaren COS-Zellen dazu, das Prinzip zu belegen. Mit der Zu-
gabe des Serums nach der Transfektion erfolgte die Gabe von 5 µg/ml des blockierenden anti-
CD137-Antikörpers bbk-2 (LEE U.-H. et al., 2002) bzw. seiner Isotypkontrolle MOP-C21. Die so
behandelten Zellen wurden zwei Tage nach der Transfektion im LAK-Assay eingesetzt.
Die mit dem Antikörper inkubierten und pcDNA-ILA-sen-transfizierten Zellen zeigen eine
deutlich höhere Empfindlichkeit gegenüber der Lyse als Zellen, die mit einem Isotypkontroll-
Antikörper behandelt wurden, wenngleich sie nicht so empfindlich wie die kontrolltransfizier-
ten Zellen reagieren. Auf die kontrolltransfizierten Zellen hat die Zugabe der Antikörper er-
wartungsgemäß keinen Einfluß (vgl. Abb. 3.-16.).
Abb. 3.-16.: Die Neutralisierung von mCD137 erhöht die Empfindlichkeit von CD137-transfizierten
COS-Zellen gegenüber der LAK-Lyse. LAK-Assay von COS-Zellen, die mit den angegebe-
nen Konstrukten transfiziert und mit je 5 µg/ml der angegebenen Antikörper ün inkubiert wur-
den; CIS: CMV-ILA-sense; bbk-2: Maus-IgG1 anti-CD137-Antikörper, MOP-C21 Maus-
IgG1. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dar-
gestellt ist eines von drei unabhängigen Experimenten.
0
5
10
15
20
25
1: 5 1: 10 1: 50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
pcDNA3---
pcDNA3 MOP-C21
pcDNA3 bbk-2
CIS ---
CIS MOP-C21
CIS bbk-2
Ergebnisse
81
Daß CD137-transfizierte COS-Zellen trotz der Antikörperbehandlung nicht so sensitiv auf die
LAK-Lyse reagieren wie pcDNA-transfizierte COS kann zwei Gründe haben: Zum einen muß
damit gerechnet werden, daß es zu einer Überexpression von CD137 in der Membran kommt,
da CD137 vom verwendeten Expressionskonstrukt über den sehr starken viralen CMV-Pro-
motor exprimiert wird. Es ist daher möglich, daß die eingesetzte bbk-2-Konzentration nicht
ausreicht, um sämtliche CD137-Molekülkomplexe in der Membran zu blockieren. Ein weite-
rer Grund für die eingeschränkte Sensibilität der bbk-2-behandelten, CD137-transfizierten
COS-Zellen kann darin bestehen, daß eine Signalübertragung durch CD137 selbst für einen
Teil des Effekts verantwortlich ist. In diesem Fall könnte der Antikörper eine Oligomeri-
sierung von mCD137 und damit ein Signal in die Zelle verhindern.
Um auf Transfektionen und die damit verbundene Überexpression verzichten zu können, wur-
den Neutralisierungsexperimente mit untransfizierten Raji-Zellen durchgeführt.
Rajis exprimieren CD137 konstitutiv auf ihrer Oberfläche (vgl. Abb. 3.-14.). Sie wurden ohne
vorherige Transfektion über Nacht mit bbk-2 vorinkubiert und anschließend im LAK-Assay
eingesetzt. Die Empfindlichkeit gegenüber der zytotoxischen Lyse der LAK-Zellen erhöht
sich mit ansteigenden Antikörperkonzentrationen, wie durch dose-response-Experimente mit
bbk-2-Konzentrationen von 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml und 5,0 µg/ml gezeigt werden konnte (Abb.
3.-17.).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1: 5 1: 10 1: 50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
---MOP-C21bbk-2 [0,5]bbk-2 [1,0]bbk-2 [5,0]
Abb. 3.-17.: Mit steigender Konzentration erhöht der anti-CD137-Antikörper bbk-2 die Empfindlich-
keit der Raji-Zellen gegenüber der Lyse durch LAK-Zellen. LAK-Assay der über Nacht
mit den angegebenen Antikörperkonzentrationen vorinkubierten Raji-Zellen; bbk-2: Maus-
IgG1 anti-CD137-Antikörper, MOP-C21 Maus-IgG1. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechs-
fachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist eines von drei unabhängigen Experi-
menten.
Ergebnisse
82
Aus den obigen Experimenten folgt, daß die Reduktion der zytotoxischen Lyse von CD137-
exprimierenden Zellen spezifisch durch mCD137 vermittelt wird. Die Neutralisation von
membrangebundenem CD137 hebt die durch mCD137 vermittelte verminderte Empfindlich-
keit gegenüber der LAK-Lyse zumindest teilweise auf. Das läßt darauf schließen, daß der
Effekt nicht zuletzt auf reverser Signalübertragung durch den CD137-Liganden beruht.
3.3.3. Mechanismus der Verminderung der LAK-Antwort durch
mCD137
Für die Reduzierung der LAK-vermittelten Zytolyse kommen mehrere Mechanismen in Fra-
ge: So können zum einen direkte Effekte durch mCD137 eine Rolle spielen, wie z.B. die In-
duktion von Apoptose in LAKs. Dieser Effekt von mCD137 bzw. immobilisiertem CD137
auf aktivierte T-Zellen ist bei SCHWARZ H. et al., 1996 und MICHEL J. et al., 1999 beschrie-
ben. Zum anderen sind indirekte Effekte, beispielsweise die Induktion von Zytokinen denk-
bar, die die LAK-Lyse hemmen.
3.3.3.1. Verminderung der Lyserate mCD137-tragender Zellen durch Apoptosein-
duktion in LAK-Zellen
Aufgrund der Arbeiten von H. SCHWARZ und J. MICHEL (SCHWARZ H. et al., 1996, MICHEL J. et al.,
1999), wurde vermutet, daß auf den Zielzellen exprimiertes mCD137 in den LAK-Zellen Apo-
ptose induziert, so daß diese weniger Zielzellen lysieren können. Um diese Hypothese zu
überprüfen, wurden folgende Versuche durchgeführt:
pcDNA- oder CMV-ILA-sen-transfizierte Tumorzellinien wurden zwei Tage nach der Trans-
fektion zusammen mit unterschiedlichen Verhältnissen an LAK-Zellen für 5 bzw. 20 h inku-
biert. Die Zellen wurden gewaschen und mit AnnexinV-Fluorescin, sowie PI gefärbt. In der
FSC/SSC-Darstellung am Durchflußzytometer (FACS) konnten die LAK-Zellen und die
transfizierten Tumorzellen auf Grund ihrer Größe und Granularität unterschieden und so
einzeln analysiert werden (vgl. Abb. 3.-19.).
Die LAK-Zellen wurden hinsichtlich der Verteilung lebender, apoptotischer und nekrotischer
Zellen betrachtet. Dabei zeigte sich, daß die Inkubation der Effektorzellen mit mCD137-ex-
primierenden Zielzellen die Menge an apoptotischen LAK-Zellen innerhalb von 6 bis 20 h
allenfalls leicht erhöht (vgl. Tab. 3.-3.).
Ergebnisse
83
COS K562 Raji
Abb. 3.-18.: FSC/SSC-FACS-Diagramm der Gemische aus den transfizierten Zellinien (R3) und den
LAK-Zellen (R1 und R2), um zu zeigen, daß man beide Populationen anhand der Unter-
schiede in der Größe (FSC) und der Granularität (SSC) der Zellen auseinanderhalten
und so einzeln analysieren kann. R1: sterbende Lymphozyten (apopototische, spätapoptoti-
sche und nekrotische Zellen), R2: lebende Lymphozyten, R3: eingesetzte Zellinie. Dargestellt
ist eines von je drei repräsentativen Experimenten.
Zielzellen
transfiziert
mit
t:e-
Verhältnis
AnnexinV-
PI-
(vitale Zellen)
AnnexinV-
PI+
(nekrotische
Zellen)
AnnexinV+
PI-
(frühapoptoti-
sche Zellen)
AnnexinV+
PI+
(spätapoptoti-
sche Zellen)
ohne 76,45 2,42 5,30 15,83
1: 1 70,71 2,64 9,50 17,15
pcDNA 1:2,5 76,97 2,09 5,83 15,11
1: 10 78,31 2,07 5,08 14,53
1: 1 71,29 2,94 6,27 19,51
CMV-ILA-sen 1:2,5 72,05 3,17 6,00 18,78
1: 10 74,83 2,92 5,57 16,68
Tab. 3.-3.: Durch mCD137 vermittelte Apoptose von LAK-Zellen hat nur einen geringen Einfluß auf
den Zytolyse-vermindernden Effekt, der im LAK-Assay beobachtet wurde. Angegeben
sind die prozentualen Anteile an LAK-Zellen im jeweiligen Quadranten aus einem von drei
FACS-Experimenten. Transfizierte COS-Zellen wurden ün mit LAK-Zellen inkubiert, die da-
nach über AnnexinV-Fluorescin/ PI-Färbung im FACS analysiert wurden.
Auch für K562 und Rajis konnte gezeigt werden, daß mCD137-Expression der Zielzellen die
Apoptose der LAK-Zellen nur geringfügig erhöht (vgl. Abb. 3.-20.).
Ergebnisse
84
K562
CMV-ILA-sen
K562
pcDNA
Lymphozyten
alleine
Ergebnisse
85
Abb. 3.-19.: LAK-Zellen, die mit mCD137-exprimierenden Tumorzellen kultiviert wurden, zeigen nur
geringfügig mehr Apoptose als LAKs, die mit Kontrollzellen inkubiert wurden. FACS der
Lymphozyten eines Zellgemisches aus LAK- und transfizierten Tumorzellen in verschiedenen
e:t-Verhältnissen; Färbung: AnnexinV-Fluorescin(FL1-H)/PI(FL3-H)-Doppelfärbung; unter
den dotplots sind die prozentualen Anteile der in den jeweiligen Quadranten enthaltenen Ereig-
nisse angegeben. Gezeigt ist jeweils eines von drei unabhängigen Experimenten.
Raji
pcDNA
Raji
CMV-ILA-sen
Ergebnisse
86
Der lediglich leichte Anstieg an apoptotischen LAK-Zellen innerhalb von 20 h kann die signi-
fikanten Unterschiede in den Lyseraten zwischen pcDNA- und CMV-ILA-sen-transfizierten
Zellen in den LAK-Assays, bei denen die Ziel- und Effektorzellen nur 4 h miteinander inku-
biert werden, nicht erschöpfend erklären.
Um auszuschließen, daß es sich um eine Form der Apoptose handelt, bei der die Apoptose-
kennzeichen an der Membran verzögert auftreten, wurden Caspase3-Aktivitätsassays durch-
geführt. Caspase3 ist eine Effektorcaspase am Ende der Caspase-Kaskade und verbindet zu-
sammen mit Caspase7 den mitochondrialen Weg der Apoptoseinduktion mit dem rezeptorver-
mittelten Weg. Für die Caspase3-Assays wurden Zellextrakte von LAK-Zellen, die für 20 h
auf immobilisierten CD137-Fc bzw. Fc-Protein kultiviert worden waren, verwendet.
Aber auch hier zeigten sich nur geringe Unterschiede zwischen der Caspaseaktivität von
LAK-Zellextrakten nach Kultur auf immobilisierten CD137-Fc und solchen nach Inkubation
mit Fc-Kontrollprotein. Untersucht man Zellextrakte von LAKs, die für 20 h auf Glutaralde-
hyd-fixierten, mit CMV-ILA-sen bzw. pcDNA3-transfizierten COS-Zellen kultiviert wurden,
erhält man vergleichbare Ergebnisse (vgl. Abb. 3.-20.).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Casp3gereinigt(30 U)
--- Fc CD137-Fc
COSpcDNA
COSCIS
OD
405
nm
Abb. 3.-20.: LAK-Zellen zeigen nach Inkubation mit mCD137-tragenden Zellen bzw. immobilisiertem
CD137-Fc-Protein nur geringfügig höhere Caspase3-Aktivität als LAKs, die auf
Kontroll-zellen oder Kontrollprotein kultiviert wurden. Caspase3-Aktivitätsassay mit
Zellextrakten von Zellen die 20 h auf Fc- bzw. CD137-Fc beschichteten Platten kultiviert
wurden bzw. mit Glutharaldehyd-fixierten, pcDNA- oder CMV-ILA-cis (CIS)-transfizierten
COS-Zellen (Fixierung 48h nach der Transfektion); eingesetzt wurden jeweils 10 µg Gesamt-
protein. Da es sich bei den Balken im Diagramm um den Mittelwert von Doppelbestimmungen
handelt, sind keine Standardabweichungen angegeben. Gezeigt ist eines von drei unabhängigen
Experimenten.
Ergebnisse
87
3.3.3.2. Die Rolle von Zytokinen in der mCD137-vermittelten Reduktion der
LAK-Lyse
Da kein signifikanter direkter Effekt über die Induktion von Apoptose in den Effektorzellen
nachzuweisen war, wurde untersucht, ob Effektor- oder Zielzellen durch mCD137 angeregt
werden, Zytokine zu sekretieren, die den Tumorzellen einen Überlebensvorteil bzw. ein Ent-
kommen aus der Immunüberwachung verschaffen können.
IL-10 ist ein wichtiges antiinflammatorisches Zytokin. Es fungiert als starker Inhibitor der
Th1-Zytokine, einschließlich IL-2 und IFNg und kann von B-Zellen sekretiert werden (OPAL
M. S. und DEPALO V. A., 2000). IL-10 gehört zu den Zytokinen, die von Tumoren sezerniert wer-
den, um der Immunabwehr zu entkommen (SALAZAR-ONFRAY F., 1999). Die Rolle von IL-10 in
der CLL wird kontrovers diskutiert: MEINHARDT G. et al. (1999) sprechen von „überzeugen-
den Hinweisen“ darauf, daß IL-10 das Überleben und die Proliferation aktivierter CLL-Zel-
len fördert und diese vor programmiertem Zelltod schützt (KITABAYASHI A., 1995). Andere
Autoren beschreiben, daß IL-10 die in vitro-Proliferation aktivierter B-CLL-Zellen hemmt
(TANGYE S. G. et al., 1998) und Apoptose induziert (FLUCKINGER A. C. et al., 1994). IL-10 kann im
Serum von CLL-Patienten detektiert werden und korreliert revers mit dem Krankheitsverlauf
(AGUILAR-SANTELISES M. et al., 1999; SJÖBERG J. et al., 1995; 1996).
TGFß ist ein weiteres antiinflammatorisches Zytokin, das während der Tumorentstehung und
-progression eine nicht unbedeutende Rolle spielt. So reguliert dieses Zytokin normalerweise
das Zellwachstum. Viele Zelltypen werden jedoch während der Entartung unempfindlich
gegen die inhibitorischen Wirkungen von TGFß. Aktiv von Tumorzellen sezerniertes TGFß
kann zu Tumorwachstum, -metastasierung und Angiogenese beitragen (HATA A., 2001; PASCHE
B., 2001; WIESER R., 2001). TGFß wird von B-Zellen und Zellen myeloiden Ursprungs sekretiert
(BECK C. et al., 2001), so auch von B-CLL-Zellen (SCHULER M. et al., 1998). Die Effekte von TGFß
auf CLL-Zellen scheinen nicht eindeutig zu sein: Im erwähnten Artikel beschreibt M. SCHU-
LER die antiproliferative Wirkung von endogenem und von exogenem TGFß. L. LANGNEAUX
et al. hingegen zeigen in einer Studie, daß die Lymphozyten von sechs von 21 CLL-Patienten
keinerlei Proliferationsinhibition durch TGFß erfahren (LANGNEAUX L. et al., 1997). G. MEIN-
HARDT führt TGFß unter „Faktoren mit vermischten oder widersprüchlichen Effekten“ an:
Zum einen inhibiert TGFß die Proliferation von B-CLL-Zellen, wenn auch in geringerem
Maße als die nativer B-Zellen, andererseits spricht er von einem proliferativen Vorteil für den
malignen B-Zell-Klon durch die verminderte Sensitivität der CLL-Zellen gegenüber dem Zy-
tokin, so daß eine verstärkte TGFß-Sekretion von leukämischen und Stroma-Zellen in der
CLL zwar normale Knochenmarkszellen hemmt, der leukämische B-Zellen aber expandieren
Ergebnisse
88
kann. Zudem sind B-CLL-Zellen resistent gegenüber TGFß-vermittelter Apoptose (DOUGLAS R.
S. et al., 1989).
3.3.3.2.1. Die Rolle von IL-10 in der mCD137-vermittelten Reduktion der LAK-
Lyse
Um Aufschluß über sezernierte Zytokine zu erhalten, wurden die LAK-Zellen auf mit im-
mobilisierten CD137-Fc-Fusionsprotein bzw. Fc-Kontrollprotein beschichteten Polystyrol-
platten kultiviert. Nach 48 h wurden zellfreie Überstände präpariert und deren Konzentration
an IL-10 im ELISA analysiert.
0
20
40
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100
120
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180
200
--- Fc CD137-Fc
pg/ m
l IL
-10
Abb. 3.-21.: Immobilisiertes CD137 hat keinen Einfluß auf die IL-10-Sekretion von LAK-Zellen.
ELISA gegen IL-10 mit Überständen von LAK-Zellen, die 48 h auf immobilisierten CD137-Fc
bzw. Fc-Kontrollprotein kultiviert wurden. Die Zellkulturplatten wurden mit 10 µg/ml CD137-
Fc oder der äquimolaren Menge von 5 µg/ml Fc-Kontrollprotein beschichtet. Eingesetzt wur-
den 5 x 106 Zellen/ml. Gezeigt sind die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardab-
weichung. Dargestellt ist eines von drei unabhängigen Experimenten.
Wie Abb. 3.-21. zeigt, gibt es keine Unterschiede in der IL-10-Produktion der LAK-Zellen in
Abhängigkeit von der Anwesendheit von immobilisiertem CD137.
Da ein im LAK-Assay wirksames Zytokin nicht notwendig von den LAK-Zellen selbst gebil-
det werden muß, untersuchte ich Überstände der transfizierten Tumorzellinien auf CD137-
vermittelte IL-10-Freisetzung. Hierbei zeigte sich, daß K562-Zellen keinerlei nachweisbares
IL-10 sezernieren. Raji-Zellen produzieren zwar IL-10, die Konzentration dieses Zytokins im
Überstand steht jedoch nicht in Zusammenhang mit der Menge an mCD137, die auf der Ober-
fläche exprimiert wird (s. Abb. 3.-22.). Offensichtlich ist IL-10 für die mCD137-vermittelte
Inhibition der Lyse im LAK-Assay nicht verantwortlich.
Ergebnisse
89
0
500
1000
1500
2000
2500
RSV RIS RIA
pg/m
l IL
-10
Abb. 3.-22.: Die Höhe der Expression von mCD137 durch Raji-Zellen beeinflußt deren IL-10-Produk-
tion nicht. IL-10-ELISA von zellfreien Überständen transfizierter Rajis, die 48 h nach der
Transfektion gewonnen wurden. Transfektionskonstrukte: RSV: RSV, RIS: RSV-ILA-sense,
RIA: RSV-ILA-antisense. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen ± Standard-
abweichung. Dargestellt ist eines von fünf unabhängigen Experimenten.
3.3.3.2.2. Die Rolle von TGFß1 in der mCD137-vermittelten Reduktion der LAK-
Lyse
Wir betrachteten daher TGFß, ein weiteres als nicht nur als immunsuppressiv (OPAL S. M. und
DEPALO V. A., 2000), sondern auch als Überlebensfaktor für Tumore bekanntes Zytokin (WIESER
R., 2001). Analog zu den obigen Versuchen wurden zellfreie Überstände von LAK-Zellen prä-
pariert, die 48 h auf immobilisiertem CD137 bzw. Fc-Kontrollprotein kultiviert worden wa-
ren. Diese wurden mittels ELISA auf ihren Gehalt an TGFß1 untersucht.
0
200
400
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800
1000
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1400
1600
--- Fc CD137-Fc
pg/ m
l TG
Fß1
Abb. 3.-23.: Die Kultur auf immobilisiertem CD137-Fc hat keinen Einfluß auf die TGFß1-Sekretion
von LAK-Zellen. TGFß1-ELISA mit Überständen von 5 x 106 LAK-Zellen/ ml, die 48 h auf
mit 5 µg/ml Fc-Protein bzw. 10 µg/ml CD137-Fc beschichteten Polystyrolplatten kultiviert
wurden. Die Überstände stammen aus dem gleichen Experiment wie die für Abb. 3-22.. Ge-
zeigt sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist
eines von fünf unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse
90
Abb. 3.-23. zeigt, daß die durch LAK-Zellen sekretierte TGFß-Konzentration auf immobili-
siertem CD137 nicht ansteigt, sondern im Gegenteil eher leicht abnimmt.
Auch hier untersuchte ic, in wieweit die transfizierten Zellen selbst in der Lage sind, auf die
Anwesendheit von mCD137 mit der Produktion von TGFß zu reagieren. Zellfreie Überstän-
de, die 48 h nach Transfektion präpariert wurden, zeigen für alle untersuchten Zellinien einen
Anstieg von TGFß, wenn mCD137 auf den Zellen vorhanden ist (Abb. 3.-24.).
K562
0
200
400
600
800
1000
1200
RSV RIS RIA
pg/m
l TG
Fb
Raji
0
200
400
600
800
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1400
1600
1800
2000
RSV RIS RIA
pg/m
l TG
Fß1
Abb. 3.-24.: Die Menge an membrangebundenen CD137 transfizierter Zellen hat deutlichen Einfluß
auf die TGFß1-Sekretion der Zellen: Je mehr CD137 auf der Membran exprimiert wird,
um so höher ist die TGFß1-Sekretion der Zellen. TGFß1-ELISA der Überstände transfizi-
erter Zellen 48 h nach der Transfektion; Transfektionskonstrukte: RSV: RSV, RIS: RSV-ILA-
sense, RIA: RSV-ILA-antisense; die Rajis-Überstände stammen aus dem gleichen Experiment,
das für Abb. 3.-22. verwendet wurde. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen
± Standardabweichung. Dargestellt ist eines von je fünf unabhängigen Experimenten.
Ein Anstieg der in den Zellkulturüberständen vorhandenen TGFß1-Konzentration konnte so-
wohl für K562 als auch für Rajis gezeigt werden. Wird auf der Zelle vorhandenes mCD137
Ergebnisse
91
durch Transfektion mit einem antisense-Vektor herabreguliert, sinkt auch die TGFß1-Kon-
zentration. Die TGFß1-Freisetzung durch die transfizierten Zellen erfolgt in Abhängigkeit
von der mCD137-Expression der Zellen. Da TGFß1 ein durch verschiedene Tierarten hoch
kon-serviertes Molekül ist, konnte der Anstieg von TGFß nach Transfektion mit mCD137
auch für COS-Zellen belegt werden (nicht gezeigt).
3.3.3.3. Spezifität der Zytokinwirkung
Um nachzuweisen, daß das sezernierte TGFß1 für die Reduktion der LAK-Lyse verantwort-
lich ist, fertigten wir LAK-Assays an, zu denen in den Assay-Ansatz 5 µg/ml neutralisieren-
de TGFß1- bzw. Isotypkontrollantikörper gegeben wurden.
K562
0
5
10
15
20
25
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1:5 1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
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izit
ät
RSV/ IgGRSV/ antiTGFßRIS/ IgGRIS/ antiTGFßRIA/ IgGRIA/ antiTGFß
Raji
0
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1:5 1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
RSV/ IgGRSV/ antiTGFßRIS/ IgGRIS/ antiTGFßRIA/ IgGRIA/ antiTGFß
Abb. 3.-25.: Die Zugabe neutralisierender anti-TGFß1-Antikörper direkt zum LAK-Assay hat kaum
Einfluß auf die Lyserate von K562- und Raji-Zellen. LAK-Assays mit transfizierten Zellen
unter Zugabe von 5 µg/ml neutralisierenden Antikörpern gegen TGFß1 direkt in das LAK-
Assay; Transfektionskonstrukte: RSV: RSV, RIS: RSV-ILA-sense, RIA: RSV-ILA-antisense.
Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt
ist eines von drei unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse
92
Dabei zeigte sich, daß die direkte Zugabe neutralisierender anti-TGFß1-Antikörper in das
LAK-Assay kaum Einfluß auf die Lyserate hat (Abb. 3.-25.).
Da alle Zellen, bevor sie im LAK-Assay eingesetzt wurden, gewaschen wurden, sind die lösli-
chen Zytokine im Assay selbst nicht mehr vorhanden. Eine Neusynthese ist bei der Assay-
dauer von vier Stunden vernachlässigbar. Um auszuschließen, daß bereits während der Inku-
bation nach der Transfektion der Zielzellen die Sensitivität dieser Zellen gegenüber der spä-
teren Lyse durch Zytokine beeinflußt wurde, wurde mit der Zugabe des Serums nach der
Transfektion den transfizierten Zellen 5 µg/ml neutralisierender anti-IL-10- bzw. anti-TGFß1-
Antikörpers oder der jeweiligen Isotypkontrolle zugefügt.
Diese Versuchsanordnung zeigte, daß die Inkubation der Zielzellen mit einem neutralisieren-
den anti-IL-10-Antikörper deren Empfindlichkeit gegenüber zytotoxischer Lyse etwas erhöht,
ohne jedoch das Verhältnis der Lysekurven für CD137-sense-, -antisense- und kontrollvektor-
transfizierte Zellen zu verändern (s. Abb. 3.-26.).
0
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1:5 1:10 1:50
e:t-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
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ät
RSV/ IgGRIS/ IgGRIA/ IgGRSV/ antiIL-10RIS/ antiIL-10RIA/ antiIL-10
0
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RSV RIS RIA
Pro
zent
Zyt
otox
iozi
tät
Abb. 3-26.: Vorinkubation mit neutralisierenden anti-IL-10-Antikörpern hebt die Empfindlichkeit
der Targetzellen gegenüber der LAK-Lyse an, unabhängig von der Expression von
mCD137. LAK-Assay mit transfizierten Raji-Zellen, die 5 µg/ml der angegebenen Antikörper
zusammen mit dem Serum nach der Transfektion erhielten; Transfektionskonstrukte: RSV:
RSV, RIS: RSV-ILA-sense, RIA: RSV-ILA-antisense. Die Abb. rechts zeigt zur Verdeutli-
chung ein Balkendiagramm der 1:10-Bedingung; die jeweils dunkleren Balken eines Balken-
paares zeigen die Isotypkontrolle der jeweiligen Bedingung, die helleren Balken die Lyserate
nach Vorinkubation der Zellen mit neutralisierenden anti-IL-10-Antikörpern. Die Abb. zeigt
ein Experiment mit Raji-Zellen. Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ±
Standardabweichung. Dargestellt ist eines von drei unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse
93
Der Einfluß neutralisierender IL-10-Antikörper auf die CD137-vermittelte Reduktion der
LAK-Lyse paßt gut zu den Ergebnissen aus den ELISAs, nach denen IL-10 in Raji-Kulturen
unabhängig vom Vorhandensein von mCD37 auf den Zellen in ähnlichen Konzentrationen
freigesetzt wird. IL-10 hemmt die Zytolyse unabhängig von mCD137.
Neutralisierende anti-TGFß1-Antikörper heben die Zytolyserate ebenfalls an. Daher liegen
die Lysekurven der RSV-, RIS- und RIA-transfizierten Zellen auf etwa demselben Niveau
und der deutliche, durch mCD137 bewirkte Schutz der Targetzellen vor der LAK-Lyse unter
dem Einfluß des anti-TGFß1-Antikörpers verschwindet (vgl. Abb. 3-27.).
Neutralisierende anti-TGFß1-Antikörper bewirken erst nach der Vorinkubation mit den Ziel-
zellen eine Aufhebung des mCD137-vermittelten Schutzes vor Lyse. Das ist ein deutlicher
Hinweis darauf, daß die Hemmung der Zytolyse über die Targetzellen vermittelt wird. Das
dafür verantwortliche Molekül ist TGFß1.
Ergebnisse
94
K562
0
5
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15
20
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1:5 1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
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ätRSV/ IgGRIS/ IgGRIA/ IgGRSV/ antiTGFßRIS/ antiTGFßRIA/ antiTGFß
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RSV RIS RIA
Pro
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Raji
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1:5 1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
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Zyt
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RSV/ IgGRIS/ IgGRIA/ IgGRSV/ antiTGFßRIS/ antiTGFßRIA/ antiTGFß
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RSV RIS RIA
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
Abb. 3-27.: Vorinkubation mit neutralisierenden anti-TGFß1-Antikörpern hebt die Empfindlichkeit
der Targetzellen gegenüber der LAK-Lyse abhängig von der mCD137-Expression an.
LAK-Assay mit transfizierten Zellen, die 5 µg/ml der angegebenen Antikörper zusammen mit
dem Serum nach der Transfektion erhielten; Transfektionskonstrukte: RSV: RSV, RIS: RSV-
ILA-sense, RIA: RSV-ILA-antisense; Die Abb. rechts zeigen zur Verdeutlichung ein Balken-
diagramm der 1:10-Bedingungen. Die jeweils dunkleren Balken eines Balkenpaares zeigen die
Isotypkontrolle der jeweiligen Bedingung, die helleren Balken die Lyserate nach Vorinkuba-
tion der Zellen mit neutralisierenden anti-TGFß1-Antikörpern. Gezeigt sind die Mittelwerte
aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist eines von drei unabhän-
gigen Experimenten.
3.3.3.4. Induktion der TGFß-Freisetzung durch mCD137 oder den CD137-Ligand
Bisher wurde die Frage, durch welchen Mechanismus die TGFß-Induktion und die Reduktion
der Lyserate bewirkt wird, nur am Rand behandelt: Über mCD137 oder seinen Liganden?
Weder die Ergebnisse, der Zytolyse-Experimente mit den antisense-Konstrukten noch die
Versuche, die CD137-CD137-Ligand-Wechselwirkung durch anti-CD137-Antikörper zu blo-
ckieren, enthalten keine eindeutige Antwort auf die Frage, ob der zytolysesenkende Effekt des
Ergebnisse
95
membrangebundenen CD137 auf einem mCD137-Signal oder einem Signal durch den Li-
ganden beruht.
Um zu klären, auf welchem Molekül die Senkung der Zytolyse CD137-tragender Zellen be-
ruht, konstruierte ich einen Expressionsvektor auf der Basis des Vektors pcDNA3.1. In diesen
wurde ein über PCR amplifiziertes Fragment von CD137 kloniert, das dem full-length-Tran-
skript ohne die zytoplasmatische Domäne entspricht. Ein von diesem Vektor exprimiertes
CD137-Molekül besitzt die extrazelluläre Domäne, die Signalsequenz zum Membrandurch-
tritt und die Transmembrandomäne von CD137, die es in der Zellmembran verankert. Ihm
fehlt aber der gesamte intrazelluläre Anteil, der für die Signalübertragung notwendig ist.
Eine mit diesem Vektor transfizierte Zelle präsentiert mCD137 seinem Liganden und ver-
netzt diesen. Ein Signal durch mCD137 ins Zellinnere ist jedoch aufgrund der fehlenden intra-
zellulären Domänen des Proteins nicht mehr möglich. Im Gegenteil, trimerisiert solch ein
trunkiertes CD137-Molekül im Zuge der Multimerisierung mit intakten CD137-Molekülen in
der Zelloberfläche CD137-tragender Zellen, wie Rajis oder K562, so kann es aufgrund des
dominant-negativen Effekts die Signaltransduktion reduzieren oder völlig ausschalten.
Mit pcDNA-ILA-trunc transfizierte Zellen wurden zum einen im LAK-Assay eingesetzt, um
zu prüfen, ob ohne Signal durch mCD137 der zytolysesenkende Effekt weiterhin beobachtet
werden kann. Zum anderen wurden ELISAs gegen TGFß1 anfertigt, um den Einfluß eines
Signals durch mCD137 auf den TGFß1-Spiegel zu bestimmen. Zur Kontrolle wurde auch IL-
10 betrachtet.
Abb. 3.-28. zeigt das Ergebnis: pcDNA-ILA-trunc-transfizierte Zellen sind nicht gegen die
zytotoxische Lyse durch LAKs geschützt. Dies ist ein Hinweis darauf, daß der Schutz der
transfizierten Zellen vor der Zytolyse durch ein Signal über CD137 und nicht ein Signal durch
den Liganden vermittelt wird.
Ergebnisse
96
COS
0
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t:e-Ratio
Pro
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pcDNACIS/ pcDNApcDNA/ truncCIS/ trunc
K562
0
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1:5 1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
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otox
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pcDNACIStrunc
Raji
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1:5 1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
pcDNACIStrunc
Abb. 3-28.: Die Expression eines CD137-Konstruktes ohne die intrazelluläre Domäne des Proteins
schützt Tumorzellen nicht vor Zytolyse. LAK-Assays mit transfizierten Zellinien; Transfek-
tionskonstrukte: pcDNA: pcDNA 3.1., CIS: CMV-ILA-sense, trunc: CMV-ILA-trunc. Gezeigt
sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt ist je-
weils eines von drei unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse
97
Die Intrazellulärsequenz von CD137 ist für die Vermittlung der Reduktion der LAK-Lyse es-
sentiell. Es stellte sich daher die Frage, ob die intrazelluläre Domäne von CD137 auch für die
Freisetzung von TGFß verantwortlich ist. Die TGFß-Wirkung ist – wie oben gezeigt – (Kap.
3.3.3.2. und 3.3.3.3.) ebenfalls eine Vorraussetzung für die Herabsetzung der Empfindlich-
keit der Targetzellen gegenüber der Zytolyse.
K562
0
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150
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pcDNA CIS trunc
pg/ m
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Fß1
Raji
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1000
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pcDNA CIS trunc
pg/ m
l TG
Fß1
Abb. 3.-29.: Für die Erhöhung der TGFß1-Sekretion durch mCD137 ist die intrazelluläre Domäne
von CD137 nicht notwendig. TGFß1-ELISA mit Transfektionsüberständen der angegebenen
Zellinien, die 48 h nach der Transfektion gewonnen wurden. Transfektionskonstrukte: pcDNA:
pcDNA3.1., CIS: CMV-ILA-sense, trunc: CMV-ILAtrunc. Dargestellt sind die Mittelwerte aus
Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung. Gezeigt ist eines von je drei un-abhängigen
Experimenten. Die Überstände stammen aus dem in Abb. 3.-28. gezeigten Experiment.
Wie in Abb 3.-29. dargestellt, wird das Signal, TGFß1 zu sezernieren, nicht über mCD137
vermittelt. Die Signalübertragung zur TGF-Freisetzung erfolgt vielmehr über den Liganden,
der auf B-Lymphozyten (Raji), sowie auf myelotischen Zellen (K562) konstitutiv exprimiert
Ergebnisse
98
wird (KIENZLE G. und VON KEMPIS J., 2000). CD137trunc-Moleküle unterscheiden sich auf der
Zellaußenseite nicht von intakten CD137-Molekülen und sollten über ihre plad-Domänen, die
im Molekül extrazelluär liegen, ihre Fähigkeit zur Oligomerisierung – auch mit intakten
CD137-Proteinen – beibehalten haben. Somit wären diese Moleküle durchaus in der Lage,
den CD137-Liganden zu vernetzen und damit die CD137-Ligand-tragenden Zellen zu stimu-
lieren.
Zur Kontrolle wurden IL-10-ELISAs angefertigt, da die IL-10-Produktion von Rajis in allen
vorherigen Experimenten unabhängig von der mCD137-Expression war. Abb. 3.-30. zeigt,
daß auch ein trunkiertes CD137 keinen Einfluß auf die IL-10-Sekretion besitzt.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
pcDNA CIS trunc
pg/ m
l IL
-10
Abb. 3.-30.: Die Fähigkeit von mCD137 zur Signaltransduktion beeinflußt die IL-10-Sekretion nicht.
IL-10-ELISA mit den Überständen transfizierter Raji-Zellen, die 48 h nach der Transfektion
gewonnen wurden; Transfektionskonstrukte: pcDNA: pcDNA3.1., CIS: CMV-ILA-sense,
trunc: CMV-ILAtrunc. Dargestellt sind die Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen ± Standard-
abweichung. Gezeigt ist eines von drei unabhängigen Experimenten. Die in diesem Experiment
verwendeten Überstände stammen aus demselben Versuch wie die Zellen und Überstände der
Abb. 3.-28. und 3.-29..
Zusammenfassend läßt sich sagen: Trunkiertes CD137 übt im LAK-Assay fast keinen zytoly-
sesenkenden Effekt aus. Das läßt vermuten, daß ein Signal durch mCD137 selbst für die
Reduktion der Lyse verantwortlich ist. Da eine Neutralisierung von TGFß1 ebenfalls den zy-
totoxizitätssenkenden Effekt aufhebt (vgl. Abb. 3.-27.), liegt die Vermutung nahe, daß die
Freisetzung von TGFß1 ebenfalls durch ein mCD137-Signal erreicht wird. Erstaunlicherweise
wird die TGFß-Sekretion durch das trunkierte CD137 jedoch nicht beeinflußt. Dies ist ein
Hinweis darauf, daß die Modulation von TGFß1 über CD137-Ligand vermittelt wird. Die IL-
Ergebnisse
99
10-Sekretion wird weder durch die Modulation der Expression von mCD137 noch durch die
Funktionsfähigkeit des CD137-Moleküls beeinflußt, wie Abb. 3-30. belegt.
3.4. Die Rolle von sCD137 während der LAK-Antwort
Wie in den Kapiteln 3.1.3.2.1. und 3.1.3.2.2. dieser Arbeit gezeigt wurde, wird in der CLL
sCD137 von T-Lymphozyten ins Serum der Patienten abgegeben. Während sich die B-CLL-
Zellen als entartete Zellen gegen die Immunabwehr zu schützen versuchen, ist es Aufgabe der
T-Lymphozyten, die leukämischen Zellen zu bekämpfen. Welche Rolle sCD137 dabei
zukommt, wird in diesem Abschnitt genauer untersucht.
3.4.1. Die Wirkung von sCD137 auf die LAK-Zellen
Um die Wirkung von sCD137 in der Interaktion zwischen Tumor- und LAK-Zellen zu
charakterisieren, wurden LAK-Zellen über Nacht mit 5 µg/ml CD137-Fc-Fusionsprotein oder
10 µg/ml Fc-Protein vorinkubiert und am nächsten Tag im LAK-Assay eingesetzt. Abb. 3.-
31. zeigt das Resultat:
0
5
10
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1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
---FcCD137-Fc
Abb. 3.-31.: Die Vorinkubation von LAK-Zellen mit löslichem CD137-Fc-Protein erhöht deren Fä-
higkeit Zielzellen zu lysieren. LAK-Assay mit LAK-Zellen, die über Nacht mit 10 µg/ml
CD137-Fc bzw. der äquimolaren Menge von 5 µg/ml Fc-Kontrollprotein in FKS-blockierten
wells vorinkubiert wurden. Im dargestellten Assay wurden K562 als Zielzellen verwendet.
Gezeigt sind die Mittelwerte aus Sechsfachbestimmungen ± Standardabweichung. Dargestellt
ist eines von drei unabhängigen Experimenten.
Mit löslichem CD137-Fc vorbehandelte LAK-Zellen zeigen eine bis zu fünffach höhere Lyse-
rate als mit Kontrollprotein vorinkubierte oder unbehandelte LAK-Zellen. Dieses Ergebnis ist
unabhängig von den eingesetzten Targetzellen: LAK-Assays mit COS- oder Jurkatzellen zei-
Ergebnisse
100
gen eine vergleichbare Steigerung der Lyserate nach Vorinkubation der Effektorzellen mit
löslichem CD137-Fc-Fusionsprotein (nicht gezeigt).
3.4.2. Die Wirkung von sCD137 auf die Target-Zellen
Target-Zellen wurden über Nacht mit 10 µg/ml CD137-Fc-Fusionsprotein oder der äquimo-
laren Menge von 5 µg/ml Fc-Protein vorinkubiert. Am Tag darauf wurden diese Zellen im
LAK-Assay eingesetzt.
In Abb. 3.-32. ist das Ergebnis dargestellt.
COS K562
0
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1: 10 1: 50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
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---FcCD137-Fc
0
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1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät---FcCD137-Fc
Jurkat
0
5
10
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25
1: 10 1: 50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
FcCD137-Fc
Abb. 3.-32.: Vorinkubation mit löslichem CD137-Fc-Protein erhöht die Anfälligkeit verschiedener
Zielzellen gegenüber der LAK-Lyse im Vergleich zu Zellen, die mit Fc-Kontrollprotein
behandelt wurden. LAK-Assay nach Vorinkubation der angegebenen Zellen mit 10 µg/ml
CD137-Fc bzw. 5 µg/ml Fc-Protein über Nacht; dargestellt sind die Mittelwerte aus Sechsfach-
bestimmungen ± Standardabweichung. Gezeigt ist je eines von drei unabhängigen Experi-
menten.
Ergebnisse
101
Die Sensitivität der Zielzellen gegenüber der zytotoxischen Lyse erhöht sich durch die Inku-
bation mit löslichem CD137-Fc. Dies kann nicht auf die Steigerung der Lyseaktivität der
LAK-Zellen durch CD137 zurückzuführen sein, da sowohl die eingesetzten Target- als auch
die LAK-Zellen vor dem Assay mehrmals gewaschen werden, so daß kein CD137-Fc im
Assay selbst vorhanden ist. Es muß sich hierbei um einen Effekt von löslichem CD137 auf die
Targetzellen handeln.
Die Verwendung des Fusionsproteins wirft das Problem auf, daß – durch die Zusammenlage-
rung der Fc-Teile zweier Moleküle – die beiden CD137-Anteile zwei Ligandmoleküle vernet-
zen könnten. Daher, und um lösliches CD137 zur Verfügung zu haben, das endogenem
sCD137 entspricht, wurde der Expressionsvektor pcDNA-ILA-w/otm auf der Basis von
pcDNA 3.1. konstruiert. Dieser enthält nach dem CMV-Promotor die cDNA für CD137 ohne
den intrazellulären Anteil und die Transmembrandomäne.
In Abb. 3.-33. ist das Ergebnis der LAK-Assays mit CMV-ILA-w/otm transfizierten Zellinien
dargestellt. Die Expression löslichen CD137s durch transfizierte Zellen wurde im ELISA
nachgewiesen und lag bei COS-Zellen bei etwa 4 ng/ml, bei K562- und Raji-Zellen zwischen
1 und 2 ng/ml. Die Experimente mit den transfizierten Targetzellen bestätigen die Ergebnisse
der Versuche, in denen die Zielzellen mit löslichem CD137-Fc vorinkubiert wurden: Lös-
liches CD137 steigert die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber zytotoxischer Lyse durch
LAK-Zellen.
Ergebnisse
102
COS K562
0
5
10
15
20
25
1:5 1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
pcDNACIS/ pcDNApcDNA/ w/otmCIS/ w/otm
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
1:5 1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
pcDNACISw/otm
Raji
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1:5 1:10 1:50
t:e-Ratio
Pro
zent
Zyt
otox
izit
ät
pcDNACISw/otm
Abb. 3-33.: Zellen, die nach der Transfektion lösliches CD137 produzieren und diesem für zwei Tage
ausgesetzt sind, zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit gegen zytotoxische Lyse durch LAK-
Zellen. LAK-Assay mit transfizierten Zellinien; Transfektionskonstrukte: pcDNA: pcDNA
3.1., CIS: CMV-ILA-sense, w/otm: CMV-ILA-w/otm; Kotransfektionen: pcDNA: pcDNA 3.1.
3,0 µg, pcDNA/ CIS: 2,7 µg pcDNA 3.1./ 0,3 µg CMV-ILA-sense, w/otm/ pcDNA: 2,7 µg
CMV-ILA-w/otm/ 0,3 µg pcDNA 3.1., w/otm/ CIS: 2,7 µg CMV-ILA-w/otm/ 0,3 µg CMV-
ILA-sense; dargestellt sind die Mittelwerte von Sechsfachbestimmungen ± Standardabwei-
chung. Gezeigt ist je eines von drei unabhängigen Experimenten.
Lösliches CD137 kann zweierlei Funktion ausüben: Zum einen kann es durch Interaktion mit
mCD137-Molekülen verhindern, daß ein funktioneller trimerer Komplex zur Signaltransduk-
tion in die mCD137-tragende Zelle entsteht. Dieser Mechanismus ist für andere Mitglieder
der TNF-Rezeptorfamilie gezeigt, wie Fas oder TNFR1 und 2 (PAPOFF G. et al., 1999; SIEGEL M. R.
et al., 2000). Das Prinzip beruht darauf, daß die plad-Domäne im Extrazellulärbereich der Mo-
leküle für die Oligomerisierung ausreicht, so daß lösliche Moleküle über diese Domäne mit
membranständigen interagieren können. Da es jedoch zur Ausbildung eines funktionellen
Ergebnisse
103
Komplexes notwendig ist, daß alle Moleküle des Komplexes intakte Intrazellulärdomänen be-
sitzen, kann bei solch einem gemischten Komplex kein Signal in die Zelle übertragen werden.
Lösliche Rezeptoren wirken daher dominant-negativ.
Die zweite Wirkung, die lösliche CD137-Moleküle im System der reversen Signalübertra-
gung spielen können, besteht darin, daß einzelne lösliche Moleküle an Ligandtrimere, die in
der Membran schwimmen, binden und so die Multimerisierung des Liganden verhindern.
Dieser zweite Mechanismus hemmt die Signalübertragung durch den Liganden, während der
erste die Signaltransduktion durch den CD137-Rezeptor inhibiert.
Um einen Hinweis darauf zu erhalten, ob lösliches CD137 den Liganden blockiert, wurden
ELISAs gegen TGFß1 angefertigt, da in Kapitel 3.3.3.4. (Abb. 3.-29.) gezeigt werden konnte,
daß die Induktion der TGFß-Sekretion über ein durch den CD137-Liganden vermitteltes Sig-
nal erfolgt. In diesen ELISAs wurden Überständen von ün mit löslichem CD137-Fc inkubier-
ten Zellen verschiedener Zelllinien, sowie zellfreien Transfektionüberständen derselben Zell-
linien getestet. Das Ergebnis ist in Abb. 3.-34. gezeigt.
Diese Experimente belegen einen inhibitorischen Einfluß von löslichem CD137 auf die Sig-
naltransduktion durch den CD137-Ligand. Die TGFß1-Sekretion ist deutlich vermindert,
wenn die Zellen mit löslichem, rekombinantem CD137-Fc-Protein oder mit von den Zellen
endogen synthetisiertem sCD137 inkubiert werden. Die Steigerung der Empfindlichkeit ge-
genüber der LAK-Lyse durch sCD137 ist somit – zumindest teilweise – auf die Blockierung
der Signaltransduktion durch CD137-Ligand zurückzuführen.
Ergebnisse
104
A B
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
--- Fc CD137-Fc
pg/ m
l TG
Fß1
600
620
640
660
680
700
720
740
760
780
--- Fc CD137-Fc
pg/ m
l TG
Fß1
C D
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
pcDNA CIS w/otm
pg/ m
l TG
Fß1
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
pcDNA CIS w/otm
pg/ m
l TG
Fß1
Abb. 3.-34.: Inkubation mit löslichem CD137-Fc-Fusionsprotein senkt die TGFß1-Sekretion bei ver-
schiedenen Tumorzellinien (A, B). Sind transfizierte Zellinien endogenem löslichem
CD137 ausgesetzt, so verringert sich ihre TGFß1-Sekretion gegenüber kontrolltransfi-
zierten Zellen (C, D). ELISAs gegen TGFß1 mit zellfreien Überständen von für 48 h mit 10
µg/ ml CD137-Fc bzw. 5 µg/ ml Fc-Kontrollprotein kultivierten Zellen (A, B), sowie mit
zellfreien Transfektionsüberständen von Zellinien, die 48 h nach der Transfektion gewonnen
wurden (C, D); Transfektionskonstrukte: pcDNA: pcDNA 3.1., CIS: CMV-ILA-sense, w/otm:
CMV-ILA-w/otm; A, C: K562; B, D: Raji; dargestellt sind die Mittelwerte von Dreifachbe-
stimmungen ± Standardabweichung. Gezeigt ist jeweils eines von drei unabhängigen Experi-
menten. Die in Teilabbildung C und D dargestellten Versuche sind mit Überständen aus den in
Abb. 3.-33. gezeigten Experimenten durchgeführt.
Als zusätzliche Kontrolle zeigt Abb. 3.-35., daß die IL-10-Sekretion der Raji-Zellen nach
Inkubation mit löslichem CD137-Fc oder einer Transfektion mit CMV-ILA-w/otm
unbeeinflußt bleibt.
Ergebnisse
105
A B
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
--- Fc CD137-Fc
pg/ m
l IL
-10
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
pcDNA CIS w/otm
pg/ m
l IL
-10
Abb. 3-35.: Inkubation mit löslichem CD137-Fc-Fusionsprotein läßt die IL-10-Sekretion von Raji-
Zellen unbeeinflußt (A). Sind transfizierte Raji-Zellen endogenem löslichem CD137
ausgesetzt, so verändert sich ihre IL-10-Produktion gegenüber kontrolltransfizierten
Zellen nicht (B). ELISAs gegen IL-10 mit zellfreien Überständen von für 48 h mit 10 µg/ ml
CD137-Fc bzw. 5 µg/ ml Fc-Kontrollprotein kultivierten Zellen (A), sowie mit zellfreien
Transfektionsüberständen von Zellinien, die 48 h nach der Transfektion gewonnen wurden (B);
Transfektionskonstrukte: pcDNA: pcDNA 3.1., CIS: CMV-ILA-sense, w/otm: CMV-ILA-
w/otm; dargestellt sind die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen ± Standardabweichung.
Gezeigt ist jeweils eines von drei unabhängigen Experimenten. Die Überstände, die in Teil-
abbildung B verwendet wurden, sind die aus den in Abb. 3.-33. und 3.-34. gezeigten Experi-
menten.
Diskussion
106
4. Diskussion
4.1. Screening des CLL-Patientenmaterials hinsichtlich der
Expression von CD137
Das in dieser Studie betrachtete Kollektiv von B-CLL-Patienten umfaßte 25 Personen. Sechs
davon waren weiblich, 13 männlich, vom Rest war die Geschlechtszugehörigkeit nicht be-
kannt. Das entspricht einem Verhältnis von etwa 2:1 männlichen zu weiblichen Patienten;
dieses Geschlechterverhältnis ist für die CLL charakteristisch (BERGER D. P. et al., 1997). Das
durchschnittliche Alter der Patienten betrug 65,6 Jahre. Auch das ist typisch für CLL-Patien-
ten. Bei der CLL handelt es sich um eine Erkrankung des höheren Lebensalters, die im Mittel
in einem Lebensalter von 65 Jahren auftritt (BERGER D. P. et al., 1997). Das betrachtete Kollektiv
spiegelt folglich die Epidemiologie der CLL gut wieder.
CLL-Patienten haben eine stark erhöhte Anzahl an weißen Blutkörperchen im peripheren
Blut, die vorwiegend aus CD5-positiven B-Zellen besteht (vgl. Kap. 2.1.1.2., Tab. 2.-1.). Der
Anteil an B-Lymphozyten ist in den untersuchten CLL-Patientenproben auf 65 bis 97,5 % der
Blutleukozyten erhöht. Durchschnittlich steigt der B-Zell-Anteil der Lymphozytenaliquots auf
87,5 %. Beim gesunden Probanden beträgt der B-Zell-Anteil 20 bis 30 % (PSCHYREMBEL, 1998).
Für das Würzburger Patientenkollektiv konnte gezeigt werden, daß für alle untersuchten Pro-
ben nach Stimulation durch PMA/Kalziumionophor die mRNA für die membrangebundene
Form von CD137 nachweisbar war (Kap. 3.1.2.1., Abb. 3.-1.). Dies entspricht früheren Beob-
achtungen, nach denen die CD137-mRNA auf gesunden, EBV-transformierten B-Zellen und
B-Zellinien nach Stimulation nachgewiesen werden kann (SCHWARZ H. et al., 1995; KIENZLE G. et
al., 1997).
Bisher konnte die Expression von CD137-Protein auf humanen B-Lymphozyten selbst nach
Stimulation nicht detektiert werden (KIENZLE G. et al., 1997; KIENZLE G. und VON KEMPIS J., 2000; MI-
CHEL J.: unveröffentlichte Daten). Die PBMCs aller untersuchten CLL-Patienten exprimieren nach
Stimulation mCD137, wie über die FACS-Analyse mit anti-CD137-Antikörpern nachgewie-
sen werden konnte (Kap. 3.1.2.1., Abb. 3.-2.). Dieses Ergebnis hielt auch einer Überprüfung
durch Immunfluoreszenzdoppelfärbung stand: 8 von 10 untersuchten Proben zeigten Koex-
pression des B-Zell-Markers CD19 mit CD137 auf denselben Zellen (Kap. 3.1.2.1., Abb. 3.-
3.). Damit konnte erstmalig gezeigt werden, daß mCD137 auf Proteinebene von humanen B-
Zellen exprimiert werden kann. Dabei muß berücksichtigt werden, daß B-CLL-Lymphozyten
Diskussion
107
entartete Zellen sind, die ein gegenüber gesunden B-Zellen verändertes Expressionsmuster an
zellulären Proteinen aufweisen (KIPPS T. J., 1998; JURLANDER J., 1989).
Die diskrete, eng begrenzte Expression von mCD137 auf der Zelloberfläche, die in der Im-
munfluoreszenzfärbung sichtbar wird, kann dahingehend gedeutet werden, daß CD137 in der
Membran in clustern vorliegt. Mitglieder der TNFR-Familie aggregieren und bilden für die
Signalübertragung Multimere aus (BANNER D. W. et al., 1993; JONES E. Y. et al., 1990; ECK J. M. und
SPRANG S. R., 1989). Daher kann diese Beobachtung als erster Hinweis auf die Teilnahme von
raft-Strukturen an der aktiven Signaltransduktion durch CD137 gewertet werden. Hierfür
sprechen auch die Daten mit pcDNA-ILA-trunc- und pcDNA-ILA-w/otm-transfizierten Zel-
len (Kap. 3.3.3.4. und 3.4.2.). Das trunkierte bzw. das lösliche Protein kann in Zellinien, die
endogen mCD137 exprimieren, den zytolysesenkenden Effekt aufheben, der durch das konsti-
tutiv exprimierte CD137 vermittelt wird (Kap. 3.3.3.4., Abb. 3.-28. und Kap. 3.4.2., Abb. 3.-
33.). Die dominant-negativ Inhibition Signalübertragung durch sCD137 oder CD137trunc der
ist nur möglich, wenn das native mCD137 zusammen mit dem trunkierten oder löslichen Pro-
tein Oligo- oder Multimere ausbilden kann. Für einen endgültigen Beweis sind jedoch weitere
Studien nötig.
Die Ergebnisse aus Kapitel 3.1.2.1. zeigen, daß B-CLL-Lymphozyten CD137 als Neoantigen
synthetisieren, da bislang für native B-Zellen eine Proteinexpression nicht nachgewiesen wer-
den konnte. Die Expression von Neoantigenen – Molekülen, die auf der Ursprungszellpopula-
tion von entarteten Zellen nicht exprimiert werden – ist bei Tumoren, auch der CLL, ein
bekanntes Phänomen (KIPPS T. J., 1998; JURLANDER J., 1989).
In der Regel verschafft die Neusynthese bestimmter Moleküle auf entarteten Zellen diesen
einen Überlebens- oder Wachstumsvorteil. Auch Mitglieder der TNFR- und der TNF-Familie
werden von Tumoren als Neoantigene synthetisiert. Ein bekanntes Beispiel stellen die
Mitglieder der TNF-Familie TNF und FasL dar, die durch Tumorzellen verstärkt exprimiert
werden und in infiltrierenden T-Zellen über den TNFR1 bzw. Fas Apoptose induzieren
können (JURLANDER J., 1989; SUDA T. et al., 1997; VILLUNGER A. et al., 1997; OSORIO L. M. und AGUILAR-
SANTELISES M., 1998; BUZYN A. et al., 1999; O’CONNELL J. et al., 1999; HOLTZMANN M. J. et al., 2000;
RESTIFO N. P., 2000). Dieser Mechanismus ist auch für die CLL beschrieben (TINHOFER I. et al.,
1998).
M. FURTER konnte in seiner Dissertation in den Seren von CLL-Patienten die lösliche Form
von CD137 nachweisen und fand, daß die Konzentration des vorhandenen sCD137 mit der
Leukozytenzahl korreliert (FURTNER M., 2001).
Diskussion
108
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die PBMCs von 10 von 12 CLL-Patienten in der
RT-PCR ein positives Signal für sCD137 geben – sie synthetisieren die mRNA für sCD137
(Kap. 3.1.3.1., Abb. 3.-4.). sCD137-Protein konnte in den Überständen von 14 von 17 unter-
suchten Patientenzellaliquots detektiert werden (Kap. 3.1.3.2.1.). In allen untersuchten Seren
konnte sCD137 nachgewiesen werden, bei fünf von 10 Patienten lag die Konzentration an
sCD137 über der Grenze von 0,512 ng/ml. Dieser Wert entspricht dem Mittelwert an sCD137
im Serum von 100 gesunden Probanden zzgl. der doppelten Standardabweichung (Kap.
3.1.3.2.2.).
Die Konzentration an sCD137 in den Patientenseren korreliert mit der Anzahl an Leukozyten
im Blut (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-5.A). Dies bestätigt die frühere Aussage von M. FURTNER
(FURTNER M., 2001).
Es besteht außerdem eine Korrelation zwischen den Konzentrationen an sCD137 und ß2-
Mikroglobulin im Serum (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-2.D). ß2-Mikroglobulin dient als einer der
wenigen zuverlässigen Marker für den klinischen Verlauf der CLL. Ist der Spiegel an ß2-Mi-
kroglobulin im Serum erhöht, stellt dies einen Hinweis auf einen progressiven Krankheitsver-
lauf dar (KEATING M. J., 1999; KIPPS T. J., 1998; ZWIEBEL J. A. und CHESON B. D., 1998; JURLANDER J.,
1989). Die sCD137-Konzentration im Serum von CLL-Patienten könnte daher in der Zukunft
für die Prognose der CLL an Bedeutung gewinnen.
Die im Blut der CLL-Patienten zirkulierenden Leukozyten sind im wesentlichen CD5-posi-
tive, maligne B-Lymphozyten. Daher liegt die Vermutung nahe, eine Korrelation des Serum-
CD137 mit der Leukozytenzahl könnte mit einer Korrelation zwischen Serum-CD137 und
malignen B-Zellen einhergehen (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-5.B). Diese Annahme konnte jedoch
nicht bestätigt werden.
Auch eine Korrelation zwischen der Konzentration an sCD137 im Serum und dem Anteil
bzw. der Anzahl an T-Zellen konnte nicht hergestellt werden. Allerdings besteht eine negative
Korrelation zwischen der Serumkonzentration an sCD137 und dem Anteil und der Anzahl an
HLA-DR-positiven, aktivierten T-Lymphozyten (Kap. 3.1.3.2.1., Abb. 3.-5.C). Je mehr akti-
vierte T-Zellen in den Patientenproben enthalten waren, desto weniger sCD137 konnte im Se-
rum nachgewiesen werden.
Das nach Stimulation in Kulturüberstände sekretierte sCD137 stammt von den T-Zellen der
Patienten (Kap. 3.1.3.2.2., Abb. 3.-6. und Abb. 3.-7.). In den Überständen reiner B-CLL-Zel-
len ohne T-Lymphozyten konnte sCD137 nur knapp oberhalb der Nachweisgrenze detektiert
werden. Dies deutet darauf hin, daß auch das in den Seren gefundene sCD137 von T-Lym-
Diskussion
109
phozyten synthetisiert wurde. Dieser Befund deckt sich mit den Daten von J. MICHEL, der hu-
manes sCD137 in den Überständen aktivierter PBMCs und aufgereinigter, aktivierter CD4-
und CD8-positiver T-Zellen nachweisen konnte, nicht aber in B-Zell-Überständen (MICHEL J.,
1998).
J. MICHEL weißt in seiner Dissertation nach, daß sCD137 durch aktivierte PBMCs bei Aktiva-
torkonzentrationen exprimiert wird, die bereits eine Hemmung der Proliferation nach sich zie-
hen. Zudem konnte er eine starke Korrelation zwischen sCD137-Freisetzung und AICD fest-
stellen (MICHEL J., 1998). Dies kann erklären, warum in den späten Stadien der CLL mehr
CD137, sowie weniger aktivierte T-Lymphozyten vorhanden sind. Die „überaktivierten“ T-
Zellen begehen demnach aktivierungsabhängig Apoptose, die mit einer erhöhten sCD137-
Freisetzung einhergeht. Diese Sekretion von sCD137 durch stark aktivierte T-Zellen kann
durch dominant-negative Interaktionen mit dem mCD137 der T-Lymphozyten eine weitere
Aktivierung der Zellen durch CD137 unterbinden. Im Falle der anti-Tumor-Immunantwort
könnten so spezifische anti-Tumor-T-Zellen vor dem AICD bewahrt werden.
4.2. Die Funktion von mCD137 in der CLL
Werden CLL-Zellen auf immobilisiertem CD137-Fc-Fusionsprotein kultiviert, so leben nach
einem definierten Zeitraum signifikant mehr Zellen als auf einem Kontrollprotein. Zellen in
den CD137-Fc-beschichteten wells einer Kulturplatte überleben länger als Kontrollzellen
(Kap. 3.1.2., Tab. 3.-2. und Abb. 3.-8.). Die höhere Anzahl an lebenden Zellen geht nicht auf
eine gesteigerte Proliferation zurück (Kap. 3.2.1., Abb. 3.-10.).
Die CLL ist eine Erkrankung, bei der die Zellakkumulation in vivo nicht in erster Linie auf
eine Fehlregulation der Proliferation zurückzuführen ist, sondern auf eine Anreicherung der
B-Lymphozyten in die Folge einer gestörten Apoptoseregulation. Diese läßt sich zurückfüh-
ren auf ein verschobenes Gleichgewicht von Bcl-2 und Bcl-xL zu Bax. Die apoptose-inhibie-
renden Moleküle Bcl-2 und Bcl-xL werden in der CLL überexprimiert und die Apoptose der
entarteten B-Zellen unterdrückt (MEINHARDT G. et al., 1999; KIPPS T. J., 1998; OSORIO L. M. und
AGUILAR-SANTELISES M., 1998; OSORIO L. M. et al., 1998; REED J. C., 1998; SÖDERBERG O., 1998; ZWIEBEL J.
A. und CHESON B. D., 1998; JURLANDER J., 1989). Die Vernetzung von CD137-Ligand führt zur
Induktion des Transkriptionsfaktors NF-kB (SÖLLNER L., 2001). In B-CLL-Zellen ist die NF-
kB-Aktivität gegenüber normalen B-Lymphozyten konstitutiv erhöht und schützt diese Zellen
vor Apoptose (FURMAN R. R. et al., 2000; OSORIO L. M. und AGUILAR-SANTELISES M., 1998) Über NF-
kB wird u.a. die Transkription der Gene bcl-2 und bcl-x reguliert (BUI N. T. et al., 2001; SEVILLA
L. et al., 2001; KHOSHNAN A. et al., 2000; ROTHSTEIN T. L., 2000). Über diesen Weg wäre eine Verlän-
Diskussion
110
gerung des Überlebens der CLL-Zellen in vitro möglich: Das immobilisiertes CD137 vernetzt
auf den entarteten B-Zellen deren konstitutiv exprimierten CD137-Ligand (PAULY S., 2000; AL-
DERSON M. R. et al., 1994). Durch diesen werden NF-kB-vermittelt Bcl-2 und Bcl-xL induziert.
Dies wiederum führt zu einer verminderten Apoptoserate und einem erhöhten Überleben der
CLL-Zellen. Dafür spricht auch die Beobachtung, daß in vivo direkter Zell-Zell-Kontakt für
das Überleben von B-CLL-Zellen essentiell ist (LAGNEAUX L. et al., 1999; SÖDERBERG O., 1998).
Die Synthese von mCD137 bietet CLL-Zellen so die Möglichkeit, sich gegenseitig Überle-
benssignale zu übermitteln. Das bedeutet für die entarteten Zellen einen Vorteil.
Bei Zugabe des löslichen CD137-Fc-Proteins zu kultivierten CLL-Zellen kann dieser überle-
bensfördernde Effekt von CD137 nicht beobachtet werden. Dies ist darauf zurückzuführen,
daß für eine Signalübertragung durch CD137-Ligand nicht nur die Bindung des Rezeptor-
moleküls sondern auch die Vernetzung durch CD137-Rezeptormultimere essentiell ist. Ein-
zelne Fusionsproteine in Lösung binden zwar den Liganden, verhindern jedoch die Vernet-
zung und so die Übertragung des überlebensfördernden Signals in die Zelle.
Daß sCD137 keinen überlebensfördernden Effekt auf die B-CLL-Zellen besitzt (Kap. 3.2.1.,
Abb. 3.-9.), paßt zu den Daten, die zeigen, daß das in den Überständen von Patientenzellen
detektierte sCD137 nicht von den CLL- sondern von den T-Lymphozyten herrührt. Für den
Organismus würde es einen Nachteil darstellen, wenn die zellvermittelte anti-Tumor-Antwort
des Körpers einen Tumor durch Überlebensfaktoren unterstützte (Kap. 3.2.1., Abb. 3.-9.).
4.3. Die Rolle von mCD137 in der LAK-Antwort
4.3.1. Der Effekt von mCD137 in der LAK-Antwort
Um Aufschluß über das Zusammenspiel zwischen anti-Tumor-Immunzellen und Tumorzellen
sowie der Funktion von mCD137 in diesem Kontext zu erhalten, wurden LAK-Assays ange-
fertigt. So war es möglich, die Expression von mCD137 durch die eingesetzten Tumorzellen
mittels Transfektion zu modulieren und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die zyto-
toxische Lyse durch die LAK-Zellen zu betrachten.
Daß die Modulation der CD137-Expression verschiedener Zellinien durch die Transfektion
mit CD137-sense- und/oder -antisense-codierenden Vektoren möglich ist, konnte in Kapitel
3.3.1., Abb. 3.11. für COS-, K562-, Jurkat- und Raji-Zellen gezeigt werden.
Exprimieren Tumorzellen CD137 auf ihrer Oberfläche, werden sie im LAK-Assay weniger
stark lysiert (Kap. 3.3.1., Abb 3.12.). Die Reduktion der Lyse ist – wie die Experimente zei-
gen – nur zum Teil von der Dichte der mCD137-Expression abhängig: mCD137-transfizierte
Diskussion
111
Raji-Zellen exprimieren weniger mCD137 als mCD137-transfizierte COS-Zellen. Trotzdem
erfahren auch diese Zellen einen wirksamen Schutz vor der LAK-Lyse.
Um die Spezifität des zytolysesenkenden Effekt durch mCD137 zu verfizieren, wurden zwei
verschiedene Strategien angewandt:
Zum einen wurde die mCD137-Expression auf den Zielzellen durch Transfektion mit einem
sense- oder einem antisense-Konstrukt moduliert. Die Modulation von mCD137 konnte über
Antikörperfärbung per FACS gezeigt werden (Kap. 3.3.1., Abb. 3.-11. und Kap. 3.3.2.1., 3.-
15.). Die so transfizierten K562- bzw. Raji-Zellen wurden in LAK-Assays eingesetzt. Es ließ
sich nachweisen, daß die Lysehemmung durch mCD137 auf den Targetzellen der Dichte des
Rezeptors auf der Oberfläche dieser Zellen abhängig ist (Kap. 3.3.2.1., Abb. 3.-14.).
mCD137 ist ein Membranprotein. Starke Expression von Membranproteinen kann zu Verän-
derungen der Zellmembran führen. Membranveränderungen können das Verhalten der trans-
fizierten Zellen im LAK-Assay unspezifisch beeinflussen, da CTL- und LAK-Lyse auf Zell-
Zell-Interaktionen beruhen. LAKs und CTLs induzieren im direkten Kontakt zu ihrer Ziel-
zelle Poren in deren Membran durch Porine, wie Perforin. Dies führt zum raschen Absterben
der Targetzelle durch Wasser- und Salzverlust. Daher mußte die verminderte Lyserate der
mCD137-transfizierten Zellen durch eine weitere Methode verifiziert werden, die keinen Ein-
fluß auf die Höhe der Expression des membrangebundenen Proteins hat.
Dafür wurden mCD137- sowie kontrolltransfizierte COS-Zellen nach der Transfektion mit
dem blockierenden anti-CD137-Antikörper bbk-2 (LEE U. H. et al., 2002) inkubiert. bbk-2 bindet
an mCD137 auf der Zelloberfläche und verhindert dadurch die Interaktion mit CD137-Li-
gand-Molekülen auf den Nachbarzellen. Außerdem unterbindet der gebundene Antikörper im
LAK-Assay die Wechselwirkung zwischen dem mCD137 auf den Zielzellen und CD137-Li-
gand-Molekülen auf den LAK-Zellen. Im Falle transfizierter COS-Zellen hebt der anti-
CD137-Antikörper bbk-2 die Zytolyseminderung durch mCD137 teilweise auf. Dies wird aus
einem Vergleich zwischen der Lyserate CD137-transfizierter, Antikörper-behandelter Zellen
mit der kontrolltransfizierter, bbk-2-behandelter Zellen ersichtlich (Kap. 3.3.2.2., Abb. 3.-
16.).
Daß die CD137-transfizierten Zellen nach Antikörperbehandlung nicht so empfindlich auf die
LAK-Lyse reagieren wie kontrolltransfizierte Zellen, kann daran liegen, daß auf den COS-
Zellen die mCD137-Expression durch die starken viralen Promotoren der Expressionsvekto-
ren so hoch ist, daß die eingesetzte bbk-2-Konzentration nicht sättigend ist, d.h. nicht alle
mCD137-Moleküle neutralisiert werden können. Deshalb wurden diese Experimente mit Raji-
Diskussion
112
Zellen wiederholt, die konstitutiv geringe Mengen an CD137 in der Membran tragen. So
konnte auf die Transfektion und die damit verbundene Überexpression von CD137 verzichtet
werden. Zudem war es eher möglich, sättigende Antikörperkonzentrationen zu erreichen. Um
die Spezifität der Blockierung durch bbk-2 mit zu überprüfen, wurden Antikörperkonzentra-
tionen von 0,5 bis 5,0 µg/ml eingesetzt. Steigende Konzentrationen an bbk-2 führen zu einer
steigenden Empfindlichkeit der Raji-Zellen gegenüber der LAK-Lyse (Kap. 3.3.2.2., Abb. 3.-
17.). Die Blockierung der Wechselwirkung zwischen CD137 und seinem Liganden hebt den
schützenden Effekt der mCD137-Expression vor zytotoxischer Lyse auf.
Für einige Moleküle ist bekannt, daß ihre Expression auf der Zelloberfläche Zielzellen vor
LAK-Lyse schützen kann. Zu diesen zählen MHC II- (LOBO P. I. und PATEL H. C., 1994), MHC I-
(PALUCKA K. A. et al., 1998) und nichtklassische MHC-Moleküle (CHANG C. S. et al., 1999; CHIANG E.
Y. et al., 2002), sowie HSP70 (DRESSEL R. et al., 2000) und ICAM-1 (TRIOZZI P. L. et al., 1992). Für
Mitglieder der TNFR-Familie gab es hierfür jedoch bisher keine Hinweise. Das von den
Tumorzellen exprimierte mCD137 könnte insofern auf die LAKs wirken, als die Ligation des
Liganden auf aktivierten T-Zellen zur Anergie bzw. Apoptose führt (SCHWARZ H. et al., 1996; MI-
CHEL J. et al., 1999).
Im Falle der CLL könnte die ektopische Neoexpression von mCD137 den entarteten Zellen
durch den vermittelten Schutz vor tumorreaktiven T-Zellen einen weiteren Vorteil bieten,
zusätzlich zu dem überlebensfördernden Effekt, der durch den CD137-Liganden in die CLL-
Zellen übertragen werden kann (vgl. Kap. 3.2.1.).
4.3.2. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der
LAK-Lyse – direkte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts
Weder für CD137 noch für andere Mitglieder der TNFR-Familie war bisher bekannt, daß sie
in ihrer membrangebundenen Form Schutz vor zytotoxischer Lyse vermitteln können. Daher
versuchten wir Aufschluß über den Mechanismus gewinnen, über den die LAK-Lyse redu-
ziert wird.
Das CD137-/CD137-Ligand-System kann seinen zytolysesenkenden Effekt entweder direkt
oder indirekt vermitteln: Eine direkte Vermittlung wäre gegeben, wenn das durch CD137 oder
CD137-Ligand übertragene Signal unmittelbar zu einer Reaktion der Zelle führt, z.B. NF-kB-
Aktivierung und erhöhte Expression von Bcl-xL nach der Ligation von CD137 (DEBENDETTE M.
A. et al., 1997; LEE H. W. et al., 2002; BUKZYNSKI J. et al., 2003) oder Apoptoseinduktion nach der
Vernetzung des CD137-Liganden auf LAK-Zellen (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999).
Diskussion
113
Eine indirekte Zytolyseminderung bestünde darin, daß durch das CD137 bzw. CD137-Li-
gand-vermittelte Signal weitere Moleküle induziert werden, die ihrerseits die LAK-Lyse hem-
men. Dies kann beispielsweise durch die Freisetzung antiinflammatorischer Zytokine gesche-
hen.
In dieser Arbeit wurden zuerst die direkten Effekte betrachtet, da bekannt war, daß immobili-
siertes bzw. membrangebundenes CD137 in ruhenden und aktivierten T-Lymphozyten Apo-
ptose induzieren kann (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999).
Apoptoseinduktion in anti-Tumor-T-Zellen durch Tumorzellen ist ein Mechanismus für das
Entkommen eines Tumors aus der Immunüberwachung. In Leukämien und anderen Krebsar-
ten ist die Expression apoptoseinduzierender Moleküle wie FasL beschrieben (VILLUNGER A. et
al., 1997; BUZYN A. et al., 1999; O’CONNELL J. et al., 1999). Dieses Mitglied der TNF-Familie ist in
der Lage, Fas auf aktivierten T-Lymphozyten zu binden und diese dadurch in die Apoptose zu
treiben (SUDA T. et al., 1997; HOLTZMANN M. J. et al., 2000; RESTIFO N. P., 2000). Dies ist auch für die
CLL beschrieben (OSORIO L. M. und AGUILAR-SANTELISES M., 1998; TINHOFER I. et al., 1998): Das
pathologische Zusammenspiel zwischen Fas und FasL besitzt klinische Relevanz: Eine hohe
Fas-Expression auf T-Lymphozyten korreliert mit einem niedrigerem Überleben der CLL-
Patienten GRONEBERG C. et al., 2003).
Apoptose, der programmierte Zelltod, ist ein energieabhängiger, definierter Prozeß der Zelle,
der im gesunden Organismus bei der Differenzierung und Beibehaltung der Integrität von Ge-
weben von Bedeutung ist. Gegenüber der Nekrose ist Apoptose dadurch gekennzeichnet, daß
die Kern-DNA durch endogene Nukleasen fragmentiert wird und der Zellkern kondensiert.
Die Zellproteine werden durch Proteasen abgebaut und die Zelle schrumpft, indem sie mem-
branumgebene Vesikel abgibt, die von phagozytischen Zellen aufgenommen und abgebaut
werden. In der frühen Apoptose erscheinen Phosphatidylserinreste auf der Zellaußenseite. An
diese bindet AnnexinV. In dieser frühen Phase der Apoptose ist die Zellemembran normaler-
weise noch „dicht“: Ein DNA-Farbstoff, wie PI, kann nicht in die Zelle eindringen. Dies
konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Im Laufe der Zeit wurden die Zellmembranen
der verwendeten apoptotischen Zellen jedoch undicht. Die in dieser Arbeit betrachteten Zellen
treten nach einer AnnexinV-positiven, PI-negativen frühen Apoptosephase, in eine späte ein,
in der beide Färbungen positiv werden.
Die LAK-Zellen, die mit mCD137-exprimierenden Zielzellen kultiviert worden waren, wur-
den mittels AnnexinV-/PI-Färbung im FACS analysiert. LAK-Zellen, die mit CD137-sense-
transfizierten Zielzellen inkubiert wurden, zeigten nur wenig mehr Apoptose, als solche, die
mit kontrolltransfizierten Zellen kokultiviert wurden (Kap. 3.3.3.1., Tab. 3.-3. und Abb. 3.-
Diskussion
114
20.). Die Färbungen wurden nach 6 bzw. 20 h Kokultur durchgeführt. Die Bedingungen der
LAK-Assays wurden – bis auf die verlängerten Inkubationszeiten – beibehalten. Parallel
durchgeführte LAK-Assays zeigten das gewohnte Ergebnis einer starken Lyseminderung,
wenn mCD137-transfizierte Zellen als Targetzellen eingesetzt wurden (nicht gezeigt).
Zusätzlich angefertigte Caspase3-Aktivitätsassays ergaben ein ähnliches Bild (Kap. 3.3.3.1.,
Abb. 3.-20.): LAK-Zellen, die immobilisiertem oder membrangebundenem CD137 ausgesetzt
waren, zeigen eine geringfügig höhere Caspase3-Aktivität als Kontrollzellen. Caspase3 ist
eine der Effektorcaspasen, die während der Induktion der Apoptose aktiviert wird. Caspase3
integriert zusammen mit Caspase7 den rezeptorvermittelten und den mitochondrialen Weg der
Apoptoseinduktion und wird in beiden Fällen aktiviert.
Interessant ist die Tatsache, daß K562- und Rajizellen in der FACS-Analyse bei Effek-
tor:Target-Verhältnissen von 1:2,5 und 1:5 in einem höheren Anteil an LAK-Zellen Apoptose
zu induzieren vermögen als COS-Zellen, die nach der Transfektion weitaus höhere Mengen
an CD137 exprimieren. Da man davon ausgehen muß, daß die LAK-Zellen in allen Experi-
menten vergleichbar viel CD137-Ligand exprimieren, muß der Unterschied zelltypspezifisch
zu erklären sein. Möglicherweise verfügen diese Zellen über Oberflächenmoleküle oder se-
kretieren Zytokine, die eine Apoptoseinduktion durch mCD137 in CTLs supplementieren
können. Da K562 und Rajis in Suspension wachsen, konnten für Kokulturen aus LAK-Zellen
und diesen Zellen keine Caspase3-Aktivitätstests durchgeführt werden. Die ebenfalls lösli-
chen LAK-Zellen konnten nicht mehr abgetrennt und einzelnen analysiert werden.
Die stärkere Apoptoseinduktion durch K562- und Raji-Zellen in den LAKs kann als Hinweis
gelten, daß in vivo dieser Weg bei der Lysehemmung durch entartete Zellen eine größere Rol-
le spielt, als dies in vitro der Fall ist. In der CLL spielen die Mikroumgebung und akzes-
sorische Zellen für das Überleben und Wachstum des malignen B-Zell-Klons eine entschei-
dende Rolle (DECKER T. et al.,1995; OSORIO L. M. und AGUILAR-SANTELISES M., 1998; SÖDERBERG O.,
1998; LAGNEAUX L. et al., 1999). Die Mikroumgebung des LAK-Assays ist gegenüber der in vivo-
Situation sehr reduziert: So wird als Medium PBS mit 5 % FKS eingesetzt und es interagieren
lediglich zwei Zelltypen. Unterstützende Zytokine oder Zellen werden in den LAK-Assays
nicht berücksichtigt.
Es bleibt auch ein weiterer Punkt unberücksichtigt: Durch den Zell-Zell-Kontakt mit den
transfizierten Tumorzellen können LAK-Zellen möglicherweise in eine Anergie treten, die
dem endgültigen Eintritt der Apoptose vorangeht. Der Eintritt der Apoptose kann teilweise
erst Tage nach der Induktion erfolgen (BOSSU P. et al., 1993; MIXTER P. F. et al., 1994; SUDA T. et al.,
1997; DAS S. et al., 2000). So wäre die Fähigkeit der LAK-Zellen zur Lyse im Assay vermindert,
Diskussion
115
ohne daß nach 6 bis 20 h Apoptosekennzeichen nachweisbar wären. Zytotoxische T-Zellen in
der CLL weisen häufig Dysfunktionen bis hin zur Anergie auf. Die Gründe hierfür sind
bislang unklar (ZAKNOEN S. L. und KAY N. E., 1990; BARTIK M. M. et al., 1998; GOOLSBY C. L. et al.,
2000).
Ein weiterer direkter Effekt zum Schutz der Zielzellen kann die Induktion überlebensver-
längernder Moleküle, wie Bcl-xL, nach der Ligation von mCD137 sein (DEBENDETTE M. A. et al.,
1997; LEE H. W. et al., 2002; BUKZYNSKI J. et al., 2003). Bcl-xL ist ein Mitglied der zur Bcl-2-
Proteinfamilie. Diese Klasse von Proteinen ist an der Apoptoseregulation und der Regulation
der Permeabilität der Mitochondrienmembran beteiligt. Die antiapoptotischen Proteine Bcl-xL
und Bcl-2 können sich in die äußere Mitochondrienmembran einlagern und die Veränderun-
gen der Mitochondrienmembran, die zur Apoptose führen, verhindern (FUKUDA K. und YAMAMO-
TO M., 1999; HARRIS M. H. und THOMPSON C. B., 2000). Ob CD137-sense-transfizierte Zellen eine
höhere Bcl-xL-Expression zeigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht analysiert. Die
Zytolyse, die im LAK-Assay gemessen wird, geht nicht auf den Anteil an Tumorzellen ein,
die durch die LAK-Zellen in Apoptose getrieben wird. Sie mißt den Anteil an Zellen, die über
Perforine und GranzymB getötet wird. Diese Proteine bilden in der Membran der Targetzellen
Poren, über die das Zytosol – und damit das Farbreagenz mit dem die Zielzellen beladen
wur-den – ausläuft. Der Schutz, den Zielzellen vor CTL-vermittelter Apoptose erfahren, läßt
sich über die LAK-Assays nicht bestimmen.
4.3.2. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der
LAK-Lyse – indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Ef-
fekts
Die in vitro beobachtete CD137-vermittelte Senkung der Zytolyse wird vermutlich nur zu
einem Teil durch die Induktion von Apoptose bzw. Anergie in den T-Zellen bewirkt. Der nur
geringfügig höhere Anteil an apoptotischen LAK-Zellen nach Kontakt mit mCD137-trans-
fizierten Zielzellen läßt eine derart hohe Reduktion der Lyse innerhalb der LAK-Assay-Dauer
von 4 h unwahrscheinlich erscheinen. Wir untersuchten daher, ob der Schutz vor Zytotoxizität
durch ein mCD137- oder CD137-Ligand-induziertes Zytokin vermittelt wird.
Diskussion
116
4.3.2.1. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –
indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts durch IL-10
IL-10 ist ein wichtiges, antiinflammatorisches Zytokin, das im gesunden Organismus die Ak-
tivierung, Proliferation, Effektorfunktion und die Zytokinantworten von T-Zellen hemmt (AK-
DIS C. A. und BLASER K., 2001; AKDIS C. A. et al., 2001; MOORE K. W. et al., 2001). Es wird vorwiegend
von CD4-positiven Th2-, sowie B-Lymphozyten synthetisiert (OPAL S. M. und DE-PALO V. A.,
1999). IL-10 vermindert die Expression von Molekülen der TNF-Rezeptor-Familie auf Zellen
und fördert das shedding dieser Rezeptoren (OPAL S. M. und DEPALO V. A., 1999).
Tumoren verwenden IL-10, um durch Suppression des Immunsystems der Immunüberwa-
chung zu entkommen (SALAZAR-ONFRAY F., 1999). Die Funktion von IL-10 in der CLL wird kon-
trovers diskutiert: So soll es die Proliferation und das Überleben der B-CLL-Zellen unterstüt-
zen (JURLANDER J. et al., 1997) und sie vor Apoptose schützen (KITABAYASHI A. et al., 1995). Andere
Autoren finden in vitro eine Inhibition der Proliferation und die Induktion von Apoptose
durch IL-10 (SJÖBERG J. et al., 1995; TANGYE S. G. et al., 1998; MAINOU-FOWLER T. et al., 2001). Klinisch
korreliert die IL-10-Konzentration im Serum von CLL-Patienten negativ mit dem Krank-
heitsverlauf; d.h. eine hohe IL-10-Konzentration im Serum kommt nur in frühen Krankheits-
stadien vor. Schreitet die CLL voran ist kaum noch IL-10 detektierbar (SJÖBERG J. et al., 1995).
Für die mCD137-vermittelte Inhibition der Zytolyse spielt IL-10 keine Rolle.
LAK-Zellen sekretieren auf immobilisiertem CD137-Fc ebenso viel IL-10 wie auf Fc-Kon-
trollprotein bzw. auf unbeschichteten Platten (Kap. 3.3.3.2.1., Abb. 3.-21.). Die Freisetzung
von IL-10 durch die LAK-Zellen ist folglich unabhängig von der Gegenwart immobilisierten
CD137s.
Ein Zytokin, daß im LAK-Assay wirksam ist, muß nicht zwangsläufig von den LAK-Zellen
selbst synthetisiert werden. Daher wurde die IL-10-Konzentration in den Transfektions-
überständen der eingesetzten transfizierten Zielzellen untersucht: K562-Zellen produzieren –
gemäß ihrer Abstammung als myelotische Zellen – kein IL-10, unabhängig von der mCD137-
Dichte auf ihrer Oberfläche. Bei Raji-Zellen ist die IL-10-Sekretion unabhängig von der
mCD137-Expression (Kap. 3.3.3.2.1., Abb. 3.-22.).
CD137-sense, -antisense und kontrolltransfizierte Raji-Zellen wurden mit neutralisierenden
anti-IL-10-Antikörpern inkubiert und im LAK-Assay eingesetzt. Die Zellen zeigten eine er-
höhte Sensitivität gegenüber Zytolyse. Die Empfindlichkeit ist jedoch in allen Transfektions-
bedingungenleicht erhöht (Kap. 3.3.3.3., Abb. 3.-26.), unabhängig von der mCD137-Expres-
sion der Zellen. Das weist darauf hin, daß durch die Neutralisation von IL-10 ein durch dieses
Diskussion
117
Zytokin vermittelter Lyseschutz für die Targetzellen reduziert wird. Da aber die Freisetzung
unabhängig von der mCD137-Expression der Zellen erfolgt, hat auch die Neutralisa-tion nur
einen allgemeinen Effekt, und keinen Einfluß auf die durch mCD137-vermittelte Herabset-
zung der Lyse.
4.3.2.1. Untersuchungen zum Mechanismus der Verminderung der LAK-Lyse –
indirekte Vermittlung des zytolysesenkenden Effekts durch TGFß
TGFß ist ein weiteres potentes, immunsuppressives Molekül. TGFß supprimiert die Prolifera-
tion und Differenzierung von T- und B-Lymphozyten und ist in der Lage in lympoiden Zellen
Apoptose und Toleranz zu induzieren. Zudem hemmt es die IL-2-, IFN-g- und TNF-Produk-
tion (LETTERIO J. J. und ROBERTS A. B., 1997; OPAL S. M. und DEPALO M. D., 2000; CHEN W. et al., 2001;
KOLI K. et al., 2001; TOTTH A. et al., 2001).
Im gesunden Menschen wird TGFß1 von myelotischen Zellen, T-, und B-Lymphozyten expri-
miert (PASCHE B., 2001). LAK-Zellen, die auf immobilisiertem CD137-Fc-Fusionsprotein kulti-
viert wurden, sekretieren ebensoviel TGFß1 wie LAK-Lymphozyten, die auf Kontrollprotein
oder in unbeschichteten Platten inkubiert wurden. Die TGFß-Freisetzung liegt demnach nicht
auf der Seite der LAK-Zellen und ist unabhängig von der Vernetzung des CD137-Liganden
auf der Oberfläche dieser Zellen (Kap. 3.3.3.2., Abb. 3.-23.).
Während der Tumorentstehung und -progression spielt TGFß eine bedeutende Rolle. Von
Tumorzellen sezerniertes TGFß kann zu Tumorwachstum, -metastasierung und der Angioge-
nese beitragen; dazu kommt, daß viele Zellen während ihrer Entartung gegen die inhibitori-
schen Wirkungen von TGFß unempfindlich werden (DE VISSER K. E. und KAST W. M., 1999; HATA
A., 2001; WIESER R., 2001). Durch die immunsuppressive Wirkung bietet TGFß den Tumorzellen
darüber hinaus Schutz vor der Zerstörung durch CTLs und NK-Zellen (LETTERIO J. J. und RO-
BERTS A. B., 1997; BECK C. et al., 2001; PASCHE B., 2001; WIESER R., 2001).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Überstände CD137-sense-, -antisense- und kontroll-
transfizierter Tumorzellen auf ihre TGFß1-Freisetzung hin untersucht. Sowohl K562 als auch
Raji-Zellen sekretieren TGFß1. Nach der Transfektion mit dem CD137-sense-Expressions-
vektor steigt die freigesetzte TGFß1-Menge gegenüber der kontrolltransfizierter Zellen an.
Nach Transfektion mit dem antisense-Vektor fällt sie ab (Kap. 3.3.3.2., Abb. 3.-24.). Das be-
deutet, daß mit steigender Dichte an mCD137 auf der Oberfläche eine zunehmende Menge an
TGFß durch die entsprechenden Zellen sekretiert wird.
Die Funktionalität des von den Tumorzellen sekretierten TGFß wurde über Neutralisierungs-
experimente geprüft. Eine direkte Zugabe von neutralisierenden anti-TGFß1-Antikörpern zu
Diskussion
118
LAK-Assays mit transfizierten K562- und Raji-Zellen zeigte keine Wirkung auf die
Zytolyserate nach CD137-sense-Transfektion (Kap. 3.3.3.3., Abb. 3.-25.). Dies beruht ver-
mutlich darauf, daß in den LAK-Assays gewaschene Zellen eingesetzt werden; für die Frei-
setzung von löslichen Mediatoren, deren Bindung und die Induktion von Effekten stellt die
Assaydauer von 4 h eine zu kurze Zeitspanne dar.
Durch die mCD137-Expression transfizierter Zellen wird die TGFß1-Freisetzung verändert.
Deren Auswirkungen sind die transfizierten Tumorzellen bereits während der Inkubationspha-
se nach der Transfektion ausgesetzt. Daher wurden CD137-sense-, -antisense- und kontroll-
transfizierte Zellen mit neutralisierendem anti-TGFß1-Antikörper vorinkubiert. Die Antikör-
per bzw. ihre Isotypkontrolle wurde nach der Transfektion zusammen mit dem Serum den
Ansätzen zugefügt. Diese Versuche ergaben, daß die Vorbehandlung mit neutralisierenden
TGFß1-Antikörpern die CD137-vermittelte Lysesenkung aufhebt (Kap. 3.3.3.3., Abb. 3.-27.).
Die Lyseraten CD137-sense- und kontrolltransfizierter Zellen wurden auf das Niveau antisen-
se-transfizierter Zellen gesteigert. Der durch die mCD137-Expression vermittelte Schutz vor
zytotoxischer Lyse wurde also aufgehoben. Offensichtlich wird die in vitro beobachtete Inhi-
bition der zellvermittelten Lyse von Tumorzellen durch mCD137 mittels TGFß1 bewirkt.
In welcher Hinsicht TGFß den mCD137-tranfizierten Zellen ein Signal zum Schutz vor Lyse
vermittelt, ist in dieser Arbeit nicht näher untersucht. Doch gibt es in der Literatur Hinweise,
daß TGFß Tumorzellen mit hoher MHC I- und ICAM-1 Expression dahingehend verändert,
daß diese keine Entwicklung zytotoxischer T-Zellen zulassen (NAKY N. und VANKY F., 1998).
MHC I-Moleküle und ICAM-1 werden auch als schützend gegen die zytotoxische Lyse disku-
tiert (TRIOZZI P. L. et al., 1992; PALUCKA K. A. et al., 1998).
Auf den immunsuppressiven Anteil der TGFß-Wirkung gegen zytotoxische T- und NK-Zellen
geht diese Arbeit nicht näher ein, da sich dieser Teil der TGFß-Wirkung nur charakterisieren
ließe, wenn in den Überständen der LAK-Assays Unterschiede in der TGFß-Freisetzung
durch die eingesetzten Tumorzellen nachweisbar wären. Die TGFß1-Konzentrationen in den
Assay-Überständen der LAK-Assays lagen jedoch unterhalb der Nachweisgrenze (nicht ge-
zeigt).
TGFß selbst und Fehlsteuerungen des TGFß-Signalweges vermittelten Tumorgenese sowie
eine erhöhte Malignizität von Tumoren (JIRTLE R. L. und MEYER S. A., 1991; JACHIMCZAK P. et al.,
1996; MORINGA Y. et al., 1997; SIESE A. et al., 1999; STANDER M. et al., 1999; HATA A., 2001; PASCHE B.,
2001). So konnte u.a. eine enge Verzahnung des Smad2-, JNK- und Ras-pathways und die
nachfolgende NF-kB-Aktivierung nach TGFß1-induzierten Signalen nachgewiesen werden
(PARK J. I. et al., 2003). Über NF-kB werden eine Vielzahl aktivierender und überlebensför-
Diskussion
119
dernder Signale in Zellen übermittelt (KARIN M. et al., 2002; LI Q. und VERMA I. M., 2002). Auch
Synergismen mit der NF-kB-Aktivierung durch mCD137 und membrangebundenen CD137-
Ligand und den dadurch vermittelten physiologischen Funktionen (siehe Kap. 1.1.2.1.4. und
1.1.2.1.5.) sind denkbar.
Auch B-CLL-Zellen exprimieren hohe Mengen an TGFß (KREMER J. P. et al. 1992; SCHULER M. et
al., 1998). Die Effekte von TGFß auf CLL-Zellen sind jedoch nicht eindeutig: Einige Autoren
beschreiben eine antiproliferative Wirkung von endo- und exogenem TGFß auf CLL-Zellen.
Diese ist jedoch geringer als die Wirkung auf native B-Zellen (JURLANDER J., 1997; LAGNEAUX L.
et al., 1997; 1998; SCHULER M. et al., 1998). Dagegen finden L. LAGNEAUX et al. in einer Studie
keinerlei Proliferationsinhbition der CLL-Zellen bei sechs von 21 Patienten (LAGNEAUX L. et al.,
1997; 1998). In einem Artikel von G. MEINHARDT wird TGFß hinsichtlich seiner Funktion
während der CLL unter „Faktoren mit vermischten oder widersprüchlichen Effekten“ ange-
führt: Zum einen inhibiert TGFß die Proliferation der entarteten B-Lymphozyten, wenn auch
in geringerem Maße als die Zellteilung gesunder B-Zellen. Der maligne Klon erhält jedoch
einen proliferativen Vorteil durch seine verminderte Sensitivität gegenüber TGFß. So hemmt
die verstärkte Zytokinsekretion durch leukämische und Stromazellen während der CLL nor-
male Knochenmarkszellen, aber der entartete B-Zell-Klon kann expandieren (MEINHARDT G. et
al., 1999). Die gestörte Empfindlichkeit gegenüber der TGFß-Wirkung ist meist auf Mutatio-
nen der TGFß-Rezeptoren oder der Herabregulation ihrer Expression auf den CLL-Zellen zu-
rückzuführen (LAGNEAUX L. et al., 1998). B-CLL-Zellen zeigen sich resistent gegen TGFß-indu-
zierte Apoptose (DOUGLAS R. S. et al., 1989; LAGNEAUX L. et al., 1998).
Die Induktion von TGFß durch die mCD137-Expression kann so zusätzlichen Vorteil für das
Wachstum und Überleben der CLL-Zellen bedeuten, neben den überlebensfördernden und zy-
tolysesenkenden Wirkungen von mCD137 und einer möglichen Suppression der anti-Tumor-
Immunantwort durch TGFß.
4.3.2.3. Vermittlung der TGFß-Freisetzung durch CD137 oder CD137-Ligand
Bisher blieb die Frage unbeantwortet, ob die reduzierte Empfindlichkeit gegenüber der Zyto-
lyse von einem Signal durch CD137 oder durch CD137-Ligand vermittelt wird.
Die meisten LAK-Assays wurden mit transfizierten Zellen durchgeführt. In transfizierten Zel-
len wird das transfizierte Gen häufig sehr stark exprimiert, wenn es über einen viralen Promo-
tor, wie den CMV- oder RSV-Promotor in unserem System, transkripiert wird. Eine hohe Ex-
pression von Membranproteinen kann zur Folge haben, daß sich diese ohne weitere Stimula-
tion in der Membran zu Multimeren zusammenlagern und auf diese Weise entweder selbst
Diskussion
120
konstitutiv ein Signal in die sie tragende Zelle transduzieren oder auf einer Nachbarzelle vor-
kommende Liganden vernetzen und so ein Signal durch den Liganden in die Nachbarzelle
senden (FENG X. H. und DERYNCK R., 1996; LEONI C. und VALTORTA F., 2002; HUR E. M. et al., 2003).
Dies könnte zu einer Assoziation der CD137-Proteine in der Membran und u.U. der Trans-
duktion von Signalen in die transfizierten Zellen geführt haben. Die Ligation von CD137
kann zur NF-kB-Aktivierung und der Induktion der überlebensfördernden Proteine Bcl-xL
und Bfl-1 in den Tumorzellen führen (ARCH R. H. und THOMPSEN C. B., 1998; JANG I. K. et al., 1998;
LEE H. W. et al., 2002). Denkbar ist auch die Transkription und Freisetzung weiterer Moleküle
nach mCD137-Vernetzung, die das Überleben der Tumorzellen bzw. die Aktivität der LAK-
Zellen beeinflussen. Die durch mCD137 vermittelten physiologischen Funktionen in Zellen
außerhalb des Immunsystems sind kaum bekannt. Geht man von den Signalwegen aus, die
nach mCD137-Stimulation im Immunsystem beschritten werden, so sollte CD137-Ligation
eine eher aktivierende, überlebensfördernde Wirkung besitzen und entsprechende Oberflä-
chenmoleküle und Zytokine induzieren.
Zudem oder alternativ ist eine Wirkung des CD137-Moleküls über die Ligation von CD137-
Ligand-Molekülen auf den Tumorzellen möglich. Sowohl myeloide Zellen (K562), als auch
Lymphozyten (Jurkat, Raji) exprimieren CD137-Ligand (ALDERSON M. R. et al., 1994; PAULY S.,
2000; SALIH H. R. et al., 2001; SÖLLNER L., 2001). Die Vernetzung des CD137-Liganden auf ver-
schiedenen Karzinomzellinien führt zu einer deutlichen Steigerung der IL-8-Expression dieser
Zellen. IL-8 ist ein proinflammatorisches Zytokin (SALIH H. R. et al., 2000). Die Ligation von
CD137-Ligand auf Monozyten/Makrophagen hat ebenfalls aktivierende Wirkung (LANGSTEIN J.
et al., 1998; LANGSTEIN J., 1999; LANGSTEIN J. und SCHWARZ H., 1999; LANGSTEIN et al., 2000; SÖLLNER L.,
2001). Zudem hemmt eine Quervernetzung des CD137-Ligand-Proteins aktivierte T-Zellen
durch die Induktion von Apoptose (SCHWARZ H. et al., 1996; MICHEL J. et al., 1999).
Auch aus den antisense- und Blockierungsexperimenten kann nicht rückgeschlossen werden,
ob der CD137-Rezeptor oder der CD137-Ligand das Signal überträgt:
Steigt die Lyserate nach der Transfektion des CD137-antisense-Vektors an, kann dies darauf
zurückzuführen sein, daß durch die Herabregulation von CD137 in der Membran weniger
CD137-Ligand quervernetzt werden kann. Das führt zu einer Abschwächung der Lyseminde-
rung, wenn die Hemmung der Zytolyse durch ein CD137-Ligand-Signal vermittelt wird. Das
gleiche ist zu erwarten, wenn der Effekt über CD137 transduziert wird: Weniger CD137 in
der Membran entspricht weniger Signaltransduktion über dieses Molekül und damit einem ge-
ringeren „funktionellen“ Effekt (vgl. Abb. 3.-13., 3.-14. und 3.-15.).
Diskussion
121
Das Blockieren der CD137-CD137-Ligand-Wechselwirkung durch neutralisierende Antikör-
per verändert das Verhältnis der CD137-Rezeptor- zu den Ligand-Molekülen in den Mem-
branen der beteiligten Zellen nicht nicht. An CD137 gebundener Antikörper verhindert je-
doch, daß dieses Protein seinen Ligand binden und vernetzen kann. Dadurch kann weder ein
Signal durch CD137 noch eines durch CD137-Ligand übertragen werden. Im Falle der Trans-
fektion bzw. weniger CD137-Moleküle ist es darüber hinaus denkbar, daß blockierende anti-
CD137-Antikörper an eben synthetisierte oder einzeln in der Membran schwimmende
CD137-Moleküle binden, und dadurch eine Zusammenlagerung von CD137 zu Multimeren
verhindert. Ohne Multimerisierung ist jedoch die Signaltransduktion durch CD137, wie sie als
Artefakt in CD137-sense transfizierten Zellen auftreten könnte, ebenfalls nicht möglich.
Um nachweisen zu können, über welches Molekül – CD137 oder CD137-Ligand – die Lyse-
inhibition durch mCD137 vermittelt wird, wurde der Vektor pcDNA-ILA-trunc konstruiert
und in der Transfektion eingesetzt. Dieses Konstrukt verfügt nur über die Extrazellulär- und
Transmembransequenz der codierenden Region von CD137. Dadurch ist ein von diesem Vek-
tor exprimiertes trunkiertes membranständiges Protein in der Lage, über den Extrazellulärbe-
reich zu multimerisieren und den CD137-Liganden zu vernetzen, nicht aber Signale in die
Zelle zu transduzieren. Durch Oligomerisierung mit intakten CD137-Proteinen entstehen do-
minant-negative Effekte, da eine effiziente Signalübertragung davon abhängt, daß alle kom-
plexierten CD137-Moleküle über Intrazellulärregionen verfügen.
Tumorzellen, die mit dem Vektor pcDNA-ILA-trunc transfiziert wurden, sind nicht mehr im-
stande sich gegen die LAK-Lyse zu schützen (Kap. 3.3.3.4., Abb. 3.-28.). Ein Signal über
CD137 ist für die Reduktion der Lyse folglich ebenso essentiell wie das Vorhandensein von
TGFß1.
Dennoch wird TGFß1 – wie weitere Versuche mit pcDNA-ILA-trunc ergaben – unabhängig
von der Anwesendheit einer intakten Intrazellulärsequenz von mCD137 freigesetzt (Kap.
3.3.3.4., Abb. 3.-29.). Die Experimente legen nahe, daß die Induktion der TGFß-Sekretion
durch den CD137-Liganden vermittelt wird, dessen Signalübertragung durch CD137trunc
nicht gestört ist. CD137-Ligand wird sowohl auf B-Lymphozyten (Raji), wie auch auf mye-
lotischen Zellen (K562) exprimiert (ALDERSON M. R. et al., 1994;; PAULY S., 2000; SALIH H. R. et al.,
2001; SÖLLNER L., 2001).
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß für den CD137-vermittelten Schutz vor LAK-Lyse so-
wohl ein Signal durch CD137 als auch ein Signal durch CD137-Ligand essentiell ist. TGFß
wird auf das Signal durch CD137-Ligand hin freigesetzt. Um einen höchstmöglichen Schutz
Diskussion
122
vor zytotoxischer Lyse zu erreichen, müssen Tumorzellen sowohl CD137-Rezeptor als auch
CD137-Ligand exprimieren und die Fähigkeit zur TGFß-Sekretion besitzen. Um den Körper
bei der Tumorbekämpfung zu unterstützen, muß dieser parakrine Kreislauf unterbrochen wer-
den.
4.4. Die Rolle von sCD137 in der LAK-Antwort
Die Frage, warum sCD137 in den Seren von CLL-Patienten auftaucht, wurde bislang nicht
ausreichend betrachtet. Wie in Kapitel 3.1.3. nachgewiesen werden konnte, wird sCD137 in
der CLL von den T-Lymphozyten der Patienten sekretiert. Hier sind die wichtigsten Ergebnis-
se aus Kapitel 3.1.3. noch einmal zusammengefaßt:
(i) Je aggressiver die CLL verläuft und je weiter sie fortgeschritten ist, desto mehr
sCD137 ist im Serum der Patienten nachweisbar.
(ii) Je mehr aktivierte T-Lymphozyten im Blut der CLL-Patienten vorhanden sind, desto
weniger sCD137 kann im Serum Erkrankter detektiert werden.
(iii) Auf das Überleben der CLL-Zellen hat sCD137 keine positive Wirkung.
Das erscheint widersprüchlich: Die B-CLL-Zellen scheinen keinen Vorteil vom Vorhanden-
sein des löslichen CD137 zu haben, ebensowenig die aktivierten T-Lymphozyten. Dennoch
ist sCD137 ein Kennzeichen fortgeschrittener CLL.
Um die Wirkung von sCD137 auf die anti-Tumor-Immunreaktion zu charakterisieren, wurde
die Wirkung von löslichem CD137-Fc auf LAK-Zellen untersucht. Mit CD137-Fc-Fusions-
protein vorinkubierte LAK-Zellen vermögen fünffach effizienter Lyse zu induzieren als LAK-
Zellen, die mit Fc-Kontrollprotein vorinkubiert wurden, unabhängig von der Art der Ziel-
zellen (Kap. 3.4.1., Abb. 3.-31., bzw. nicht gezeigt).
Behandelt man dagegen die Zielzellen mit löslichem CD137-Fc vor, so ergibt sich eine Stei-
gerung der Lyseempfindlichkeit der Zellen abhängig von der eingesetzten Tumorzellinie
(Kap. 3.4.1., Abb. 3.-32.). Da die Inkubation der Zellen vor dem Einsatz im Assay erfolgte,
kann hierfür die Erhöhung der Lysekapazität der LAK-Zellen ausgeschlossen werden. Es muß
sich also um einen Effekt des löslichen CD137-Proteins auf die Targetzellen handeln.
Ein Problem bei der Verwendung von CD137-Fc-Fusionsprotein kann darin bestehen, daß
über den Fc-Teil des Proteins zwei CD137-Moleküle vernetzt sind, die u.U. die Ligation von
zwei Ligandmolekülen erlauben. Das kann eine Signalübertragung durch den CD137-Ligand
bewirken. Zudem sind durch den Fc-Anteil weitere Probleme bei der Interaktion zwischen
CD137-Fc, CD137, sowie CD137-Ligand denkbar.
Diskussion
123
Um lösliches CD137 zur Verfügung zu haben, das endogenem sCD137 entspricht aber den
CD137-Liganden nicht vernetzen kann, wurde der Vektor pcDNA-ILA-w/otm entwickelt, der
für sCD137 codiert. In mCD137-exprimierenden Zellinien, wie K562 und Jurkats, konnte die
Lyse gegenüber den CD137-negativen COS-Zellen durch lösliches CD137-Fc stärker gestei-
gert werden (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-32.); daher wurden die Auswirkungen des endogen von
pcDNA-ILA-w/otm exprimierten sCD137 an mCD137-tragenden Zellen untersucht.
Kotransfektionen von CD137-sense- und sCD137-codierenden Vektoren in COS-Zellen re-
sultierten in einer vollständigen Rekonstitution der Lyseempfindlichkeit gegenüber CD137-
sense-transfizierten Zellen. pcDNA-ILA-w/otm-transfizierte K562 oder Raji-Zellen zeigten
eine gegenüber kontrolltransfizierten Zellen deutlich gesteigerte Sensibilität für die LAK-Ly-
se (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-33.).
Lösliche Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie können durch folgenden Mechanismus wir-
ken: In der Extrazellulärdomäne tragen die TNFR-Moleküle die sog. plad-Domäne, die die
Oligomerisierung der Moleküle vermittelt. Diese Domäne ist bei löslichen Molekülen erhal-
ten, so daß diese mit membranständigen Isoformen Komplexe bilden können. Dies bewirkt
dominant-negatives Verhalten bzgl. der Signaltransduktion: Durch die gemischten Komplexe
kann wegen der fehlenden Intrazellulärbereiche der löslichen Proteine kein Signal in die Zelle
transduziert werden. Dies ist für die Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie TNFR1 und Fas
nachgewiesen (ORLINICK J. R. et al., 1997; PAPOFF G. et al., 1999; CHAN F. K.-M. et al., 2000; SIEGEL R. M.
et al., 2000). Auch für CD137 erscheint dieser Mechanismus wahrscheinlich.
Darüber hinaus können lösliche Moleküle der TNF-Rezeptorfamilie ihre membranständigen
Liganden blockieren, indem einzelne lösliche Rezeptormoleküle an Liganden(trimere) binden,
die in der Membran schwimmen. So kann eine Multimerisierung der Liganden und dadurch
eine Signalübertragung in die Ligand-tragende Zelle verhindert werden. Dies ist u.a. für Fas
beschrieben (OWEN-SCHAUB L. et al., 2000; KAMIHIRA S. und YAMADA Y., 2001). Das in Abb. 3.-33.
gezeigte LAK-Assay mit COS-Zellen steht jedoch in scheinbarem Widerspruch zu dieser
These, da die Anwesendheit von sCD137 auf kontrolltransfizierte Zellen keinen Einfluß hat.
Dies kann aber auch darauf zurückzuführen sein, daß die in diesem Assay verwendeten COS-
Zellen keine oder eine nur niedrige Konzentration an CD137-Ligand aufweisen.
Die Wirkung von sCD137 auf die Lyseempfindlichkeit der eingesetzten Tumorzellen kann
dadurch zum Teil erklärt werden, da in Kapitel 3.3. gefunden wurde, daß die schützende
TGFß-Induktion über ein CD137-Ligand-Signal vermittelt wird. Auch ist auf Zellen B-
lymphatischen und myelotischen Ursprungs, wie K562 und Raji-Zellen, eine deutlich höhere
konstitutive Expression an CD137-Ligand zu erwarten, als auf Nieren-Epithelzellen (COS).
Diskussion
124
Um zu überprüfen, ob sCD137 die Signaltransduktion durch den Liganden blockiert, wurden
die Überstände von K562- und Raji-Zellen auf ihre TGFß-Freisetzung hin untersucht. Die
Zellen wurden vorher mit löslichem CD137-Fc inkubiert. Im Vergleich zu Zellen, die mit Fc-
Kontrollprotein kultiviert wurden, nahm in CD137-Fc-behandelten Zellen die TGFß-Sekre-
tion ab (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-34. A und B). In pcDNA-ILA-w/otm- transfizierten Zellen zeig-
te sich die Reduktion der TGFß-Freisetzung gegenüber kontroll- und CD137-sense-transfi-
zierten Zellen noch deutlicher (Kap. 3.4.2., Abb. 3.-34. C und D).
sCD137 hat in den LAK-Assays eine doppelte Funktion: Es unterbricht die schützenden Sig-
nale durch mCD137 durch dominant-negative Interaktion. Die CD137-vermittelten Signale
werden zusätzlich zu der CD137-Ligand vermittelten TGFß-Induktion benötigt, um den
Schutz gegenüber der Zytolyse zu bewirken. Die CD137-Ligand vermittelte TGFß-Induktion
vermag sCD137 durch die Blockierung des Liganden ebenfalls zu hemmen. Dies macht
sCD137 zu einem potenten Molekül, um die tumorschützenden Effekte des CD137-/CD137-
Ligand-Systems zu unterbrechen.
Dem sCD137 im Serum der CLL-Patienen scheint daher eine eher T-Zell-unterstützende Wir-
kung zu zuzukommen, da es den Schutzmechanismus durch den parakrinen loop zwischen
CD137- und CD137-Ligand-Signalen durchbricht, die zum Schutz der entarteten Zellen vor
Zytolyse führen. sCD137 greift jedoch auch auf der Seite der CTL-Zellen in die Regulation
der anti-Tumor-Antwort ein, da eine mCD137-vermittelte Stimulation in T-Zellen die Pro-
duktion proinflammatorischer Zytokine, die Entwicklung zytolytischer Immunantworten und
die anti-Tumor-Immunität erhöht (DEBENEDETTE M. A.. et al., 1995; HURTADO J. C. et al., 1995; DEBE-
NEDETTE M. A. et al., 1997; MELERO I. et al., 1997; 1998i; SHUFORD W. W. et al., 1997; MOGI S. et al., 2000;
KIM J. A. et al., 2001; DIEHL L. et al., 2002; MILLER R. E. et al., 2002; TARABAN V. Y. et al., 2002; WILCOX
R.A. et al., 2002ii; 2002iii; YOSHIDA H. et al., 2003).
Zusammengefaßt ergibt sich für B-Zell-Tumoren oder Leukämien myelotischen Ursprungs
folgende Situation:
Myelotische oder B-lymphatische Zellen exprimieren CD137-Ligand. Durch diesen kann die
betreffende Zelle mit mCD137 – beispielsweise auf einer aktivierten T-Zelle – interagieren.
Durch dieses Signal wird die Tumorzelle zur Sekretion von TGFß angeregt. TGFß wirkt auf
die anti-Tumor-Immunzellen supprimierend. Aktivierte anti-Tumor-T-Zellen tragen CD137
und CD137-Ligand auf ihrer Membran. Signale durch die Vernetzung von CD137 durch den
CD137-Ligand auf B- oder myelotischen Zellen, wie DCs oder Monozyten, führen zu einer
starken Aktivierung der T-Lymphozyten. Dies resultiert in einer gesteigerten Proliferation, er-
höhten zytotoxischen Effektorfunktionen und der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine,
Diskussion
125
wie IL-2 oder TNF. Außerdem beginnen die aktivierten T-Zellen CD137-Ligand zu exprimie-
ren (Abb. 4.-1.). In dieser Phase der Tumorantwort liegen die Vorteile auf der Seite der anti-
Tumor-T-Zellen. Eine Vernichtung der entarteten Zellen scheint möglich.
Abb. 4.-1.: Potentielle Wirkung der CD137-Ligand-Expression durch die Tumorzelle auf die anti-
Tumor-Antwort. Die Vernetzung von CD137-Ligand auf Tumorzellen führt zur TGFß-Se-
kretion. TGFß supprimiert die anti-Tumor-Antwort. Anti-Tumor-T-Lymphozyten erhalten je-
doch durch den CD137-Ligand auf der Tumorzelle über CD137 ein starkes aktivierendes Sig-
nal. Dies führt zum Überleben, der Proliferation, einer Steigerung der Gedächtnisfunktion und
der Freisetzung proinflammatorischer Zytokine durch die T-Zellen. Dadurch werden diese pa-
rakrin stimuliert und exprimieren infolge ihrer starken Aktivierung CD137-Ligand. In dieser
Phase der Tumorentwicklung überwiegt das CTL-stimulierende Signal durch CD137 gegen-
über dem supprimierenden TGFß-Signal. In diesem Stadium ist eine Vernichtung der Tumor-
zellen noch möglich.
Stimulation durch den CD137-Ligand^ TGFß-Freisetzung, die aber ohne zusätzliches Signal durch CD137 ohne für die Tumorzelle von nur geringer Wirkung bleibt
CD137
CD137-Ligand
TumorzelleaktivierteT-Zelle
Aktivierung durch Stimulation von mCD137^ Steigerung der CTL-Funktion^ gesteigertes Überleben^ Steigerung der Gedächtnisfunktion
^
TGFß
TGFß
Wirkung von TGFß auf Tumorzellen^ eventuell Steigerung der Proliferation^ eventuell Verringerung der Apoptose-
rate (z. B. in der CLL)^ eventuell Induktion von Apoptose
Wirkung von TGFß auf aktivierte T-Lym-phozyten^ Suppression^ Induktion von Apoptose und Anergie
Diskussion
126
Die Tumorzelle exprimiert im Verlauf der weiteren Tumorentwicklung – z.B. durch ein Mu-
tationsereignis ausgelöst – mCD137 als Neoantigen. Via CD137-vermittelte Signaltransduk-
tion durch den mCD137-Ligand von Nachbartumorzellen erhält die entartete Zelle überle-
bensfördernde Signale, z.B. durch NF-kB-Aktivierung oder die Induktion von apoptosehem-
mender Proteine, wie Bcl-xL oder Bfl-1. mCD137 schützt die malignen Zellen zudem vor der
Zytolyse durch die anti-Tumor-T-Zellen. Außerdem ist die Tumorzelle in der Lage parakrin
die CD137-Liganden auf Nachbarzellen zu vernetzen und dadurch deren TGFß-Freisetzung
zu steigern. Das sekretierte TGFß wirkt einerseits – zusammen mit den mCD137-vermittelten
Signalen – überlebensfördernd auf die Tumorzellen, andererseits supprimiert es die anti-Tu-
mor-T-Zellen und treibt sie in Apoptose und Anergie. Durch mCD137 sind die entarteten
Zellen in der Lage über die Ligation des CD137-Liganden ein weiteres apoptoseinduzie-
rendes Signal in die T-Lymphozyten zu übermitteln. Durch ihren CD137-Rezeptor erhalten
die T-Zellen weiterhin stimulierende Signale, die aber bereits der Regulation durch die gleich-
zeitige Expression von CD137-Ligand unterliegen – die Zelle bekommt mehr Signale in Rich-
tung Apoptose und Anergie (Abb. 4.-2.).
In diesem Stadium zeigen sich deutliche Vorteile für die Tumorzellen: Sie sind vor der
Zytolyse durch die CTLs geschützt. Zusätzlich erhalten sie überlebensfördernde Signale.
Gleichzeitig supprimieren die Tumorzellen die Tumorabwehr durch die Induktion von
Anergie und Apoptose.
Diskussion
127
Abb. 4.-2.: Potentielle Wirkung der gleichzeitigen Expression von CD137 und CD137-Ligand
Expression durch Tumorzellen auf die anti-Tumor-Antwort. Die zusätzliche Expression
von CD137 durch die Tumorzelle schützt diese – zusammen mit dem nach CD137-Ligand-
Vernetzung induzierten TGFß – vor der Zytolyse durch tumorreaktive T-Zellen und fördert
das Überleben und die weitere TGFß-Produktion der entarteten Zellen. Die T-Lymphozyten
sind nicht nur vermehrt dem immunsuppressiv wirkenden TGFß ausgesetzt, sondern erhalten
durch die Ligation des CD137-Liganden Apoptosesignale. Die Vorteile hinsichtlich des
Überlebens liegen nun auf der Seite der Tumorzellen.
Um der Anergie und dem CD137-Ligand vermittelten AICD zu entgehen, exprimieren die T-
Lymphozyten sCD137. sCD137 blockiert zum einen die aktivierenden Signale durch CD137
in die T-Zellen durch dominant-negative Interaktion mit mCD137-Molekülen auf der T-Zell-
Oberfläche. Zum anderen hemmt es die Transduktion apoptosefördernder Signale durch
CD137-Ligand in die T-Zellen. Auf der Seite der Tumorzelle inhibiert das freigesetzte
sCD137 ebenfalls die Signaltransduktion durch das CD137-/CD137-Ligand-System: Der pa-
Stimulation durch den CD137-Ligand^ TGFß-Freisetzung
CD137
CD137-Ligand
TumorzelleaktivierteT-Zelle
Aktivierung durch Stimulation von mCD137^ Steigerung der CTL-Funktion^ gesteigertes Überleben^ Steigerung der Gedächtnisfunktion
TGFß
TGFß
Wirkung von TGFß auf Tumorzellen^ Zusammen mit dem CD137-Signal: Schutz vor Zytolyse
Wirkung von TGFß auf aktivierte T-Zellen^ Suppression^ Induktion von Apoptose und Anergie
Stimulation von CD137-Ligand^ Induktion von Anergie und Apoptose
Stimulation durch CD137^ Überleben^ Zusammen mit TGFß: Schutz vor Zytolyse
Diskussion
128
rakrine loop aus CD137-vermittelten Überlebenssignalen und tumorfördernden Wirkungen
von CD137-Ligand-induzierten TGFß wird unterbrochen (Abb. 4.-3).
Abb. 4.-3.: Potentielle Wirkung der sCD137-Expression durch die anti-Tumor-T-Lymphozyten auf
die Interaktion zwischen Tumor- und T-Zellen. Sowohl die Signaltransduktion durch
CD137 als auch durch CD137-Ligand wird unterbrochen. Dies hebt sowohl die tumorfördern-
den Signale durch CD137 und die CD137-Ligand vermit-telte TGFß-Freisetzung auf. Zum
anderen schützt es die T-Lymphozyten vor Apoptose. Jedoch ist eine Aktivierung der T-Zellen
durch mCD137 durch sCD137 gehemmt.
Aus den zusammenfassenden Schemata geht hervor, daß es sich bei der Tumorkontrolle durch
CD137/-CD137-Ligand-Signale um ein fein abgestimmtes Netzwerk handelt. In einer Viel-
zahl von Tumoren sind Signaltransduktionswege mutiert und die Empfindlichkeit gegenüber
regulatorischen Molekülen daher modifiziert. CD137 stellt einen Immunregulator dar. Seine
Neoexpression auf Tumorzellen vermittelt zusammen mit der TGFß-Induktion durch CD137-
Ligand einen starken Schutz vor CTL-Lyse.
Stimulation durch den CD137-Ligand^ durch sCD137 aufgehoben
CD137
CD137-Ligand
TumorzelleaktivierteT-Zelle
Aktivierung durch Stimulation von mCD137^ durch sCD137 aufgehoben
Wirkung von sCD137 auf aktivierte T-Lymphozyten^ hebt die Effekte von CD137- und CD137-Ligand auf
Stimulation von CD137-Ligand^ durch sCD137 aufgehoben Stimulation durch den CD137
^ durch sCD137 aufgehoben
sCD137
Wirkung von sCD137 auf Tumorzellen^ hebt die Effekte von CD137- und CD137-Ligand auf
Diskussion
129
4.5. Ausblick
Ein wichtiges Ziel bei der Aufklärung der Bedeutung des CD137-/CD137-Ligand-Systems
bei der Tumorantwort ist es, die Relevanz dieses Systems in vivo zu bestimmen. Denkbar sind
für diese Fragestellung Experimente mit Mäusen, denen syngene Tumoren injiziert werden,
die sich in ihrer mCD137-Expression unterscheiden. Solche Versuche sollten eine klare
Aussage darüber erlauben, ob die Expression von mCD137 auch in der in vivo-Situation das
Überleben und den Schutz des Tumors vor der Zytolyse durch Immunzellen vermitteln kann.
Die deutliche Rekonstitution der Zytolyseempfindlichkeit der Tumorzellen gegenüber den
zytotoxischen Immunzellen durch sCD137 läßt die Inhibition der CD137-/CD137-Ligand-
Wechselwirkung als einen Ansatzpunkt für eine Tumortherapie erscheinen. sCD137 stellt ein
potentes Molekül dar, um den Lyseschutz zu verhindern, da es die Signaltranduktion durch
CD137 sowie die durch den CD137-Ligand zu unterbrechen vermag. Inwieweit eine Thera-
pie mit sCD137 die Regulation der anti-Tumor-Antwort auf der Seite der zytotoxischen
Zellen stört, bedarf weiterer Forschung. Die mCD137-Stimulation in T-Zellen vermittelt nicht
nur die Produktion proinflammatorischer Zytokine sondern auch die Entwicklung der
zytolytischen und tumordestruktiven Immunantworten (DEBENEDETTE M. A.. et al., 1995; 1997; ME-
LERO I. et al., 1997; 1998i; SHUFORD W. W. et al., 1997; CANNONS J. L. et al., 2001; KIM J. A. et al., 2001;
DIEHL L. et al., 2002; MILLER R. E. et al., 2002; TARABAN V. Y. et al., 2002; W ILCOX R.A. et al., 2002iii;
YOSHIDA H. et al., 2003).
Zusammenfassung
130
5. Zusammenfassung
Das CD137-/CD137-Ligand-System spielt in der Regulation von anti-Tumor-Immunantwor-
ten eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurden zu ersten Mal die Auswirkungen der Expres-
sion von mCD137 auf Tumorzellen untersucht.
Das Screening von Lymphozyten-Proben eines CLL-Patientenkollektivs ergab, daß die RNA
für mCD137 in den stimulierten Zellen aller daraufhin untersuchten Patienten exprimiert
wurde. Zudem konnte die Expression des membranständigen Proteins über FACS-Analysen
und Immunfluoreszenzdoppelfärbungen bei 16 von 21 Patienten nachgewiesen werden. Dabei
handelt es sich um den ersten Nachweis von mCD137-Expression auf Proteinebene in B-Zel-
len. Auf stimulierten B-Lymphozyten gesunder Spender ist mCD137 nicht detektierbar (MI-
CHEL J., 1998). mCD137 wird auf den CLL-Zellen demnach als Neoantigen exprimiert.
In den Seren der aller getesteten Patienten wurde die lösliche Form von CD137 in Konzen-
trationen zwischen 0,08 und 1,1 ng/ml gefunden. In den Überständen stimulierter B-CLL-
Zellen konnte bei 14 von 17 Proben zwischen 0,1 und 1,2 ng/ml sCD137 detektiert werden.
RT-PCRs ergaben, daß die Zellen der überwiegenden Mehrheit der untersuchten Patienten
(10/12) die mRNA für sCD137 exprimieren. Durch Depletionsexperimenten konnte nachge-
wiesen werden, daß sCD137 – im Gegensatz zu mCD137 – während der CLL nicht von den
entarteten B-Lymphozyten, sondern von T-Zellen freigesetzt wird. Die von M. FURTNER ge-
fundene Korrelation (FURTNER M., 2001) zwischen der Leukozytenzahl und der sCD137-Kon-
zentration in den Seren von CLL-Patienten konnte bestätigt werden. Darüber hinaus konnte
gezeigt werden, daß eine positive Korrelation mit dem Prognosemarker ß2-Mikroglobulin
besteht, sowie eine inverse Korrelation mit der Anzahl an aktivierten T-Lymphozyten der
Patienten.
mCD137 wirkt auf B-CLL-Zellen überlebensverlängernd ohne Proliferation zu initiiren.
mCD137-transfizierte Tumorzellen schützt die Expression von mCD137 vor LAK-Lyse. Die-
ser Effekt wird spezifisch durch mCD137 vermittelt: Sowohl die Transfektion mit einem
CD137-antisense-Vektor als auch die Neutralisation der CD137-/CD137-Ligand-Interaktion
durch Antikörper heben den Schutz vor der zytotoxischen Lyse durch die LAK-Zellen auf.
Für den schützenden Effekt durch die mCD137-Expression der Tumorzellen konnten
folgende Mechanismen ermittelt werden:
mCD137-tragende Zellen können in LAK-Zellen geringfügig mehr Apoptose induzieren als
Kontrollzellen. Dieser Mechanismus spielt zumindest in vitro jedoch eine eher untergeordnete
Rolle. Darüber hinaus sekretieren Raji- und K562-Zellen nach Transfektion mit einem
Zusammenfassung
131
CD137-sense-Vektor TGFß. IL-10 spielt im Zusammenhang mit der mCD137-spezifischen
Reduktion der Lyse keine Rolle. Der im LAK-Assay analysierte Schutz durch TGFß wird in
erster Linie parakrin zwischen den Tumorzellen vermittelt, wie durch Neutralisierungsexperi-
mente gezeigt werden konnte. Die Freisetzung dieses Zytokins erfolgt durch reverse Signal-
transduktion via CD137-Ligand. Dies konnte durch Experimente mit transfizierten Zellen
nachgewiesen werden, die ein trunkiertes CD137-Protein exprimieren. Diese CD137-trunc-
Moleküle können weiterhin den Liganden vernetzen, sind aber selbst nicht mehr zur Signal-
transduktion befähigt. Darüber hinaus supprimieren sie die Signalübertragung von endogenem
CD137 dominant-negativ.
sCD137 hebt den die mCD137-vermittelte Reduktion der Zytolyse vollständig auf. So hemmt
es dominant-negativ die Signalübertragung durch mCD137. Zum anderen blockiert es die
TGFß-Freisetzung durch CD137-Ligand.
Insgesamt bietet die Koexpression von CD137 und CD137-Ligand myelotischen und B-
lymphatischen Leukämiezellen Vorteile: Durch ein Signal durch mCD137 und die CD137-
Ligand-induzierte TGFß-Freisetzung wird ein starker Schutz gegen Zytolyse durch anti-
Tumor-Immunzellen vermittelt. Dieser Schutz kann durch die Bereitsstellung von sCD137-
Molekülen, die beide Signalwege hemmen, aufgehoben werden.
Literaturverzeichnis
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Abkürzungsverzeichnis
167
7. Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
A260 Absorption bei 260 nm
A280 Absorption bei 280 nm
aa amino acid(s)
Ab antibody
Abb. Abbildung
abs. absolut
ABTS 2,2’-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolin-sulfonat(6)]diammonium
ADAM a disintegrin and metalloproteinase
AICD activation induced cell death
ALPS autoimmune lymphoproliferative syndrome
AML akute myelotische Leukämie
Ap Ampicillin
AP Alkalische Phosphatase
AP(-1) activating protein
APC antigen presenting cell
ASK apoptosis signal regulating kinase
ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosin-5’-triphosphat
Bcl B cell lymphoma
bFGF basic fibroblast growth factor
Brca breast cancer
ß-Gal ß-Galaktosidase
bidest. doppelt destilliertes
bp Basenpaar(e)
BSA bovine serum albumine
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
C Cytidin
ca. Circa
CalceinAM Calcein-Acetomethylester
CD cluster of differentiation
Abkürzungsverzeichnis
168
cDNA complementary DNA
Ci Curie (Einheit des radioaktiven Zerfalls)
CLL chronisch lymphatische Leukämie
cm Zentimeter
cpm counts per minute (Maß für radioaktiven Zerfall)
CRD cystein rich domain
CTP Cytidin-5’-triphosphat
CTL cytotoxic T-lymphocyte
d Tage
d Desoxy-
Da Dalton
DAB 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
DC dendritische Zelle
DD death domain
ddH2O doppelt destilliertes Wasser
DED death effector domain
DEPC Diethylpyrocarbonat
d.h. das heißt
DMEM Dulbecco’s modified eagle medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinsäure
DNase Desoxyribonuclease
dNTP Desoxynukleotid(e)
ds doppelsträngig
DTT Dithiotreitol
EAE experimental autoimmune enzephalomyelitis
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraacetat
ELISA enzyme linked immunosorbend assay
Erk extracellular signal activated kinase
et al. et alteri (und andere)
EtBr Ethidiumbromid
EtOH Ethanol
FACS Fluorescence activated cell sorter
Abkürzungsverzeichnis
169
FADD Fas-associated death domain protein
FDC follicular dendritic cells
FITC Fluorescein-Isothiocyanat
FKS Fötales Kälberserum
FSC forward scatter
g Normalfallbeschleunigung
g Gramm
G Guanin
gfp green fluorescent protein
GITR glucocorticoid induced TNF receptor family related gene
GM-CSF granulocyte/ macrophage colony stimulating factor
G3PDH Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GTP Guanosin-5’-triphosphat
h Stunde
HGNC Human Genome Nomenclature Comitee
HLA human lymphocyte antigen
HRP horseradish peroxidase
IAA Isoamylalkohol
IAP inhibitor of apoptosis proteins
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
ILA induced by lymphocyte activation
ILK integrin linked kinase
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalaktisid
I.U. Internationale Einheiten
JNK c-jun-Kinase
jun japanisch für 17; Onkogen aus Avian Sarcoma Virus 17
kb Kilobasenpaare
kDa Kilodalton
KLH keyhole limpet hemocyanin
l Liter
L Ligand
LAK lymphokine activated killer
Abkürzungsverzeichnis
170
LB Luria broth (Luria Bertani)
LCMV lymphocytic choriomeningitis virus
L. monocytogenes Listeria monocytogenes
LRR leucin rich repeat protein
lpr lymphoproliferative
LT Lymphotoxin
m Milli
m membrangebunden
M Molar
m Mikro
mA Milliampere
MAPK mitogen activated protein kinase
max. Maximal
MCS multiple cloning site
MEK MAP kinase kinase/ Erk activating kinase
MHC major histocompatibility complex
min Minute
MLR mixed lymphocyte reaction
MOPS Morpholinopropansulfonsäure
mRNA messenger RNA
MS multiple Sklerose
MW Molekulargewicht
n Nano
NFkB nuclear factor kB
NIK NF-kB inducing kinase
NK natural killer
nm Nanometer
nt nucleotide(s)
ODx Optische Dichte bei einer Wellenlänge von x nm
ORF open reading frame
ori origin of replication
p pico
p.a. pro analysis
PBMC peripheral blood mononuclear cells
Abkürzungsverzeichnis
171
PBS phosphate buffered saline
PCR polymerase chain reaction
pers. persönlich
pH pondus hydrogenii,
negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
PHA Phytohämagglutinin-M
PI Propidiumjodid
PI3K phosphoinositid-3 kinase
plad pre-ligand assembly domaine
PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat
pNA p-Nitroanillin
pNPP pNitrophenylphosphat
RANK receptor activator of NFkB
RIP receptor interacting protein
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuclease
RPE R-Phycoerythrin
rpm Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
RT-PCR PCR nach reverser Transkription von mRNA in cDNA
S soluble
s. siehe
S. Seite
SAC Staphyllococcus aureus Cowan A
SAPK stress activated protein kinase
sec Sekunde
SDS Natriumdodecylsulfat
SLE spontaneous lupus erythematosus
sog. sogenannt
S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae
src-Kinasen Rous-Sarcoma-Virus kinase (virale Kinase; Namensgeber eine Gruppe
von Kinasen, zu der u. a. blk, csk, fyn, hck und lck gehören
ss einzelsträngig
SSC sideward scatter
Abkürzungsverzeichnis
172
T Thymidin
Tab. Tabelle
TACE TNF-alpha converting enzyme
TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TBE-Puffer Tris-Borat-EDTA-Puffer
TCR T cell receptor
TE-Puffer Tris-EDTA-Puffer
TGF tumor growth factor
THD TNF homology domain
TLR Toll-like receptor
TM Trockenmilch
TNF Tumor-Nekrose-Faktor
TNFR Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor
TNFRSF Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-Superfamilie
TNFSF Tumor-Nekrose-Faktor-Superfamilie
TP tumor protein
TRADD TNF-receptor associated death domain protein
TRAF TNF-receptor associated factor
Tris Tri-(hydroxymethyl)-aminomethan
Triton-X-100 Polyoxymethylenether
Tween-20 Polyoxyethylensorbitan-Monolaurat
TZ Technische Zentrale
U Unit (Einheit der Enzymaktivität)
u.a. unter anderem
ün über Nacht
ÜNK Übernachtkultur(en)
ÜTK Übertagkultur(en)
usw. und so weiter
UTP Uracil-5’-triphosphat
UTR untranslatierte Region
u.U. unter Umständen
UV Ultraviolett
V Volt
VE-Wasser vollentsalztes Wasser
Abkürzungsverzeichnis
173
Vol. Volumen
vs. versus
VSV vesicular stomatitis virus
(v/v) Volumen/Volumen
(w/v) Gewicht/Volumen
wt Wildtyp
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid
z.B. zum Beispiel
ZNS Zentralnervensystem
zzgl. zuzüglich
Die Aminosäuren sind nach dem international gebräuchlichen Ein- oder Dreibuchstabencode
abgekürzt.
Danksagung
174
8. Danksagung
Mein besonderer Dank gilt:
Herrn Prof. Dr. Ferdinand Hofstädter, der die Anfertigung dieser Arbeit und ihre Weiterfüh-rung nach dem Weggang von Dr. Herbert Schwarz ermöglichte, indem ich die Räumlichkei-ten und Laboreinrichtungen an seinem Institut benutzen durfte.
Dr. Herbert Schwarz, der mir das interessante Thema für diese Arbeit zur Verfügung stellteund die Arbeit in Regensburg und von Cambridge aus in Theorie und Praxis engagiert betreu-te und begleitete. Er stand jederzeit mit Rat zur Verfügung, ließ mir aber auch die Freiheit,eigene Ideen umzusetzen. Ohne sein Engagement, seine Anregungen, Diskussionen und daszur Verfügung gestellte Fachwissen wäre diese Arbeit nicht das, was sie ist.
Dr. Rainer Apfel, der die Betreuung des praktischen Teils meiner Arbeit übernahm, als Dr.Herbert Schwarz nach England wechselte. Er hatte immer ein offenes Ohr für auftretende La-borprobleme und das Wissen und die Bereitschaft, diese zu lösen.
Dr. Pjotr Jachimczak für seine hervorragende Einführung in die LAK-Assays.
Allen Mitgliedern der AG Schwarz für die gute Zusammenarbeit. Besonders erwähnt seienSusanne Pauly und Liane Söllner, meine Mitdoktorandinnen, Gitte Krause, die mich im Laboranlernte und die dieser Arbeit am Ende noch einmal richtig Schwung verlieh und DanielaDrenkard, die die vollen vier Laborjahre Labor, Computer, Kaffee, wissenschaftliche undprivate Sorgen und Nöte mit mir teilte.
Allen Mitgliedern der AGs Männel, Bosserhoff und Apfel sowie den Mitglieder des Institutsfür Pathologie für ihre freundliche Unterstützung und Zusammenarbeit, wann immer Ideen,Protokolle und Material benötigt wurden. Herzlichen Dank an Dr. Bernd Echtenacher für diewissenschaftlichen und privaten Diskussionen im Labor und „am Berg“.
Meinen „gesunden männlichen Probanden“ Nils Pollak, Thorsten Lieb, Peter Müller, Chri-stoph Scherübel und Dr. Michael Woenckhaus für das Sillhalten beim Blutspenden.
Dr. Hagen Blasczik, Dr. Georg Richter, Dr. Ellen Obermann, Dr. Thomas Schubert für dasBlutabnehmen für die Lymphozytenpräparationen trotz „Schnellschnitt“ und anderer Ver-pflichtungen.
Meinen Eltern, die mir durch ihre Unterstützung Studium und Promotion ermöglichten undmich nicht nur in schwierigen Phasen unterstützten.
Meiner Tochter Friederike, die immer wieder unter dieser Arbeit litt und trotzdem sonntägli-che Besuche im Labor ertrug .
Thorsten, dessen Liebe und Geduld mich durch diese Arbeit begleitete.