Die Stickstoff-Fixierung. Aktuelle chemische und biologische Aspekte

Stickstof-Fixierung

Joachim Erfkamp und Achim Muller

1888 entdeckten H. Hellriegel und H. Wil- farth die Bindung des freien Luftstickstoffs (Stickstoff-Fixierung) durch die Knoll- chenbakterien in den Wurzelknollchen von Leguminosen (Abbildung 1). Dies gilt als eine der bedeutenden fruhen Entdeckun- gen auf dem Gebiet der biologischen Stick- stoff-Fixierung, da mit ihr zurn ersten Ma1 die zentrale Rolle, die Bakterien bei der Re- duktion des Luftstickstoffs spielen, klar erkannt wurde. Seitdem hat wohl kein Enzymsystem wie die u.a. in den Knoll- chenbakterien fur die Stickstoff-Fixierung verantwortliche Nitrogenase so viele Wis- senschaftler aus verschiedenen naturwis- senschaftlichen Disziplinen, namlich Che- miker, Biochemiker, Biophysiker, Geneti- ker, Physiologen [l, 2, 31, beschaftigt (Ta- belle 1). Das hangt naturlich damit zusammen, dai3 die Stickstoff-Fixierung fur die Ernahrung der Menschen vergleichbare Bedeutung hat wie die Photosynthese. Ober den derzeitigen Stand der Nitrogena- se-Forschung wird hier berichtet.

Nitrogenasen katalysieren die Reduktion des reaktionstragen Luftstickstoffs zu Ammo- niak, NH,, bzw. zum Ammonium-Ion, NH:, eine Reaktion, fur die das ,,entspre- chende" grol3industriell angewendete Verfah- ren, der Haber-Bosch-ProzeB (Gleichung l), hohen Druck und-hohe Temperaturen benotigt. Der Natur gelingt fast die gleiche Reak- tion (Gleichung 2) bei Zimmertemperatur und Normaldruck. Es ist daher kein Wunder,

N, + 3H,

N, + 8 H+ + 16 MgATP + 8e-

' 2 NH, (1) 500 "C, 200 atm

Katalysator

+ 2 NH, + H, ( 2 ) humtemp.

Normaldruck, Nitrogenase + 16 MgADP + 16 Pi

(ATP = Adenosintriphosphat, ADP = Ade- nosindiphosphat, Pi = Phosphat, PO:-)

daB man die Nitrogenase uber einen so lan- gen Zeitraum intensiv untersucht hat, unter anderem auch mit dem Ziel, das kostspielige

Die Stickstoff-Fixierung Aktuelle chemische und biologische Aspekte

1

Abb. 1. Leguminosen als N,-Fixierer: typi- sche Leguminosen-Wurzel mit Knollchen.

Industrieverfahren durch einen der Natur nachempfundenen Prozea zu ersetzen. Un- sere Gesellschaft ist in besonderem Mage von gebundenem Stickstoff in Form von Ammo- niumsalzen und Nitraten abhangig, auch wenn dies auf den ersten Blick nicht so deutlich wird. Aber die intensiv betriebene Land- wirtschaft, wie sie zur Versorgung der Bevol- kerung in unseren Rallungsraumen notwen- dig ist, ware ohne kunstliche Dungung un- denkbar. Vor 200 Jahren ernahrte ein Bauer wenig mehr als nur seine Familie, heute er- nahrt er in der Bundesrepublik Deutschland im Durchschnitt rund 70 Menschen.

Ein anderer Verwendungstweck fur gebun- denen Stickstoff spielt heute im Atomzeital- ter eine geringere Rolle als friiher: Nitrat ist ein wesentlicher Bestandteil von Schwarzpul- ver. Nicht zuletzt aus diesem Grund war Sal- peter - also Nitrat - so wertvoll, dal3 sogar

Cbemie in unserer Zeit / 24. Jabrg. 1990 / Nr. 6 0 VCH VerIagsgesellscbafi mblf, M 9 4 0 Weinheim, 1990 000~28~1/90/0612-0001 $ 03.50 + .25/0

Kriege um die natiirlichen Lagerstatten aus- gefochten wurden (,,Salpeterkrieg'' 1879 bis 1882 zwischen Bolivien, Peru und Chile). Heute benotigt neben der Landwirtschaft hauptsachlich die chemische Industrie Am- moniak und Salpetersaure fur die Herstellung von Farben, Lacken und Kunststoffen, aber auch fur Sprengstoffe wie Trinitrotoluol (TNT), Nitroglycerin und Nitrocellulose.

Pflanzen benotigen, wie alle Lebewesen, in erster Linie zehn chemische Elemente als Grundbausteine, die in ausreichenden Men- gen und in verwertbarer Form zur Verfugung stehen mussen, und zwar die Metalle Kalium, Calcium, Magnesium und Eisen sowie die Nichtmetalle Kohlenstoff, Stickstoff, Sauer- stoff, Phosphor, Schwefel und Wasserstoff. Dariiber hinaus wird eine Reihe von Elemen- ten, hauptsachlich der 3d-Reihe, also der ersten zehn Ubergangsmetalle, in sehr geringen Mengen benotigt. Von den zehn ,,Hauptele- menten" begrenzt das Element, das - gemes- sen an dem Bedarf der Pflanze - in geringster Menge vorhanden ist, das Wachstum der

267

Stickstof-Fixierung

Pflanze. Diese wichtige Erkenntnis verdan- ken wir, wie iibrigens auch den ersten Kunst- diinger, Justus von Liebig, der bci seinen Un- tersuchungen in der Asche von Pflanzentei- len eine Reihe anorganischer Salze fand. Er schrieb in der Einleitung zu seinem Buch ,,Agriculturchemie" [Y]:

,,... Die Nahrungsmittel der Pflanzen sind un- organische Stoffe, Kohlensaure, Wasser, Am- moniak oder Salpetersaure einerseits; Kali, Kalk, Bittererde, Eisen, Phosphorsaure, Schwefelsaure, Kieselsaure andererseits ... Je- der dieser Nahrstoffe ist fur die Entwicklung der Pflanze unentbehrlich. Leben und Gedei- hen der Pflanze ist durch die Gegenwart aller dieser Nahrstoffe bedingt, fehlt ein einziger, so bleibt ein UberschuB der anderen wir- kungslos. Der Ertrag ist somit von der Menge desjenigen der Pflanzennahrstoffe abhangig, von dem am wenigsten vorhanden ist. Die Pflanze bezieht die Stoffe, die bei der Ver- brennung in der Asche zuriickbleiben, aus dem Boden; die Fruchtbarkeit des Bodens beruht auf seinem Gehalt an diesen Aschenbe- standteilen der Pflanze ..."

Es mutet seltsam an, daQ in vielen Fallen aus- gerechnet Stickstoff eines der Elemente sein SOH, die z.B. in der Landwirtschaft wachs- tumsbegrenzend wirken, wo doch die irdi- sche Atmosphare zu 78 Prozent aus Stickstoff besteht. Das Problem ist aber, dai3 der Stick- stoff in einer fur Pflanzen verwertbaren Form vorliegen mug, also in Form von Nitraten oder Ammoniumsalzen.

Der Stickstoff-Kreislauf und einige relevante mikrobiologische Aspekte Stickstoff findet sich in der Natur hauptsachlich in der Atmosphare (als N,) und im Boden (Ammoniumsalze, Nitrate). Wie alle biolo- gisch relevanten Elemente durchlauft auch der Stickstoff einen komplexen Kreislauf [lo]. Luftstickstoff wird von Bakterien reduziert, durch atmospharische Prozesse, z. B. Gewitter, oder durch industrielle Prozesse oxidiert. Auf diese Weise gelangt der Stick- stoff in den Boden und durchlauft den Stoff- kreislauf Pflanze -Tier -+ Mensch + Boden -+ Pflanze. Nitrat, NO;, kann auch (durch denitrifizierende Bakterien) zu N, reduziert werden. Abbildung 2 zeigt einen solchen Stickstoffkreislauf.

Nur bestimmte Bakterien und bestimmte Bakterien-Pflanzen-Assoziate konnen Luft-

Tabelle 1. Wichtige Entdeckungen auf dem Forschungsgebiet der N,-Fixierung (unter Verwendung von Angaben aus [3]).

ca. 2000 Y. Chr.

ca. 300 v. Chr.

1772 1834

1838

1883

1888

1888

1893

1908-1913

1930

1941

1960

1965 1966

1966

1971

1971-1977

1972

1975 1977

1978 1981

1982

1986/87

1988

1989 1990

. . AzollalAndbaena-Symbiose als naturliche ,,Diingung" auf siidostasiatischen Reisfeldern Fruchtwechsel mit Leguminosen bei den Rijmern zur Verbesserung der nachfolgenden Ernten Entdeckung von N, in der Atmosphare verlafiliche Methode zur Bestimmung von C, H, 0 und N in organischen Materialien Leguminosen crhohen ihren Stickstoffgehalt Boussingault durch N,-Fixierung aus der Luft Methode zur quantitativen Bestimmung Kjeldahl von Stickstoff N,-Fixierung durch Leguminosen beruht auf Bakterien in Wurzelknollchen Isolierung von Rhizobiurn leguminosarum Beijerinck Entdcckung der N,-Fixierung durch das freilebende Bakterium Clostridium pasteurianum Entwicklung des Haber-Bosch-Verfahrens zur industriellen N,-Fixierung biologische N,-Fixierung ist von Molybdan abhangig Einsatz des '5N-Isotops zur Untersuchung der N,-Fixierung N,-Fixierung in zellfreien Rohextrakten von Clostridium pasteurianum erstcr N,-Komplex Acetylen-Reduktion zur quantitativen Bestimmung der Nitrogenase-Aktivitat Indentifizierung des ,,MoFe-" und des Mortenson ,,Fe-Proteins" Genkartierung der +Gene in Klebsiellu Streicher, Dixon und pneumoniae Postgate Erster Thiometallato-Komplex/Relevanz Miiller et al. 14, 321 des MoS:-/Synthese von [Fe(WS4),l2- Klonierung der kompletten n$'Gene in E. coli Dixon und Postgate (Ubertragung der Fahigkeit zur N,-Fixierung) Reduktion cines N,-Liganden zu NH, Isolierung des FeMo-Co MoSi- als Hydrolyscprodukt der Nitrogenase Zumft [5] Kristallisation und rontgenographische Weiningcr und Charakterisierung dcr Dinitrogenase Mortenson [15] erster ,,Monocuban"-MoFe,S,-Cluster (S = 3/21 Holm et al. [48] Isolierung der Vanadium-Nitrogenase aus Eady et al. [6], Azotobacter Hales et al. [7]

Isolicrung einer ,,Eisen-Nitrogenase(( Chisnell et al. [S] Fe-(N,H,)-Fe-Komplex Sellmann et al. [4Y] l,-S-verbriickte Fe,S,-Cluster Coucouvanis [5 11

Rutherford/Scheele Dumas

Hellriegel und Wilfarth

Winogradsky

Haber und Bosch

Bortels

Burris und Miller

Carnahan

Allen und Senoff [42] Koch und Evans

Chatt und Richards [44]

Shah und Brill [14]

268 Chemie in unserer Zeit / 24. Jahrg. 1990 / Nr. 6

Stickstof-Fixierung

2

zwei Komponenten - dem Eisen-Protein (Fe-Protein) und dem Molybdan-Eisen-Pro- tein (MoFe-Protein) - bestehendes Enzym beschrieben. Seit ein paar Jahren ist man allerdings z. T. dazu ubergegangen, beide Proteine wie getrennte Enzyme zu behandeln. Das MoFe-Protein wird in dieser Nomenklatur als Dinitrogenase bezeichnet: Es stellt also die ,,eigentliche" Nitrogenase dar, wahrend das Fe-Protein als Dinitrogenase-Reduktase bezeichnet wird, entsprechend seiner Funk- tion als ,,Elektronencarrier" zum MoFe- Protein*. Der komplexe Aufbau der Nitroge- nase ist in Abbildung 3 schematisch darge- stellt. In der Literatur findet man haufig auch die Bezeichnungen ,,Komponente I'' fur die Dinitrogenase und ,,Komponente 2" fur die Dinitrogenase-Reduktase [l]. Diese histo- risch bedingte Nomenklatur (die Dinitroge- nase verlaf3t bei der sauien-chromatographi- schen Trennung an DEAE-Cellulose vor der Dinitrogenase-Reduktase die Saule) findet heute noch ihren Niederschlag in der Kurz- schreibweise fur Nitrogenasen aus verschiedenen Bakterien. Im allgemeinen wird dabei hinter die ,,Initialen" des Bakterienartenna- mens die ,,Nummer" der entsprechenden Ni- trogenase-Komponente angehangt. Die Dini- trogenase-Reduktase aus Azotobactw vinelandii heif3t demnach Av2 und die Dinitrogenase aus Klebsiella pneumoniae Kpl .

Stickstoff reduyieren, denn die Nitrogenase ist ein bakterielles Enzym. Interessanterweise ist die Fahigkeit zur Stickstoff-Fixierung unter den Bakterien ,,nicht systematisch" ver- breitet: Nitrogenasen kommen in Bakterien vor, die z.T. nur weitlaufig miteinander ver- wandt sind. Dies wird deutlich, wenn man in einem Bakterienstammbaum die N,-fixierenden Organismen betrachtet [I 11. Tabelle 2 gibt eine Ubersicht iiber die verschiedenen Gruppen von Stickstoff-Fixierern.

Die molybdanhaltige Nitrogenase ist ein komplexes Enzymsystem, das offenbar in allen Bakterien, die bisher als hT,-Fixierer erkannt wurden, nach allem, was wir heute wis- sen, analog aufgebaut ist (2, 31. Es gibt zwar von Bakterium zu Bakterium geringe Unter- schiede in den Molmassen und den Amino- sauresequenzen der entsprechenden Nitro- genasen, aber die Grundstruktur und die Zusammensetzung der anorganischen Kom- ponenten ist sehr wahrscheinlich bei alien

bekannten Molybdan-Nitrogenasen gleich. (Zusammensetzung und Struktur ,,alternati- ver Nitrogenasen" werden in einem spateren Abschnitt diskutiert.) Nicht bei allen Enzy- men, beispielsweise bei Hydrogenasen, die auch bei der N,-Fixierung eine Rolle spielen konnen (zur Reoxidation des von der Nitro- genase gebildeten Wasserstoffs), ist dies der Fall. So haben die Nitrogenasen aus freile- benden Bakterien, z. B. Azotobacter vinelandii oder Clostridium pasteurianum, offensichtlich die gleiche Untereinheiten-Struktur wie die aus dem mit Leguminosen (Erbsen, Bohnen, Lupinen etc.) in Symbiose lebenden Rhizo- bium, dem in Wasserfarnen (Azolla) vorkom- menden Cyanobakterium Anabaena azollae oder den an den Wurzeln von verschiedenen Grasern wachsenden Azospirillum-Arten.

Die Dinitrogenase besteht aus vier Protein- Untereinheiten und hat eine Molmasse von ca. 220000. Die Subkomponenten - zwei identische a-Untereinheiten (Molmasse ca. 56 000) und zwei P-Untereinheiten (Mol- masse ca. 50 000 z. B. bei Klebsiella pneumoniae) - bilden einen a,P,-Komplex [12]. Es wurde analytisch bestimmt, daf3 der Gesamt- komplex der Dinitrogenase 32 * 3 Fe, ca. 30 S2- und 2 Mo enthalt. Diese zu den Kompo- nenten des ,,aktiven Zentrums" gehorenden Atome wurden durch spektroskopische Un- tersuchungen bestimmten Metall-Clustern zugeordnet [12, 131. Die unterschicdlichen Cluster (und ihre Zusammensetzung) sind in Tabelle 3 zusammengestellt und werden unten im Detail diskutiert.

Nitrogenase: Biochemie, Struktur- analyse und Spektroskopie Meistens wird die Nitrogenase als ein aus

* Diese Nomenklatur ist zwar anschaulich, wird sich allerdings wohl nicht durchsetzen, da das Fe-Protein noch eine andere Funktion haben kann.

Cbemie in unserer Zert / 24. Jabrg. 1990 / Nr, 6 269

Stickstoff-Fixierung

Aus der Dinitrogenase 1a13t sich als Cofaktor ein Fe-Mo-S-Cluster (FeMo-Co = Eisen- Molybdan-Cofaktor') isolieren 1141. Dieser Cofaktor ist allerdings nur einer von verschiedenen Metall-Clustern in der Dinitroge- nase; er reprasentiert also nur einen Teil des ,,aktiven Zentrums". Die Bestimmung seiner ,,exakten" Struktur durch Einkristall-Ront- genstrukturanalyse war bisher noch nicht moglich, wcil es noch nicht gelungen ist, ihn zu kristallisieren. Daher konnte der Fe- Mo-Co bisher nur mit spektroskopischen Methoden, z. B. Rontgen-Absorptionsspek- troskopie (EXAFS) und MoRbauer-Spektro- skopie, untersucht werden (vgl. unten).

Dreifach-Bindungen durch die Nitrogenase reduziert, z.B. das Azid-Ion, N;, und das Cyanid-Ion, C N - 121. Bemerkenswert ist auch die Fahigkeit der Nitrogenase, Protonen zu molekularem Wasserstoff zu reduzieren. Wie aus Gleichung 2 hervorgeht, ist die Re- duktion von einem N,-Molekiil mit der Frei- setzung von einem Wasserstoff-Molekiil ge- koppelt.

Mo-Co zu gewinnen. Im Kasten auf Seite 272, 273 wird ein unvollstandiger Uberblick iiber die angewandten physikalischen Methoden gegeben 112, 13, 171.

Uber EXAFS- und XANES-Spektroskopie an der Dinitrogenase und am FeMo-Co gibt es einige grundlegende Arbeiten [18, 19, 20, 211. EXAFS-Spektroskopie an der Mo-K- Kante (vgl. Kasten auf Seite 272, 273) spielt bei der Strukturaufklarung des FeMo-Co eine zentrale Rolle, da sich mit dieser Methode z. B. Aussagen iiber die Koordinationssphare des Molybdans machen lassen. Im Kasten auf Seite 272, 273 sind Ergebnisse von EXAFS-

Es gibt kaum eine spektroskopische Me- thode, mit der nicht versucht wurde, Auf- schliisse iiber Struktur und Funktion der verschiedenen anorganischen Bestandteile der Nitrogenase und vor allem iiber den Fe-

Vom Dinitrogenase-Protein selbst haben zuerst L. E. Mortenson et al. Kristalle geziich- tet (Abbildung 4a) und sie rontgenographisch charakterisiert (Bestimmung der Zelldimen- sionen, Raumgruppe usw.) 1151. Eine sowjeti- sche Arbeitsgruppe veroffentlichte eine Rontgenstrukturanalyse der Dinitrogenase- Kristalle (Auflosung 800 pm; Abbildung 4b) [16]. Leider lassen sich wegen der geringen Auflosung keine konkreten Aussagen iiber das ,,aktive Zentrum" machen. Die von den russischen Autoren postulierte lineare An- ordnung der Metall-Schwefel-Cluster, die ,,unmittelbar" benachbart sein sollen, scheint aufgrund einer neuen Strukturanalyse"" von L. E. Mortenson und Mitarbeitern [15c] zwei- felhaft (Ergebnis: 7000 pm voneinander ent- fernte FeMo-Co-Cluster mit zwei benachbar- ten ,,gr&eren" FeS-Clustern).

Organismen Art der N,-Fixierung Lebensweise der Bakterien

Symbiontische N,-Fixierung:

- endosymbiontische N,-Fixierung

in speziell von der Wirtspflanze ausgcbildeten Strukturen:

z. B. Leguminosed Knollchenbakterien Rbizobium meliloti

Anabaena azollae

Azospirillum lipoferum

AzollalCyanobakterien

- assoziative N,-Fixierung Bakterien leben auf oder in der Nahe von Wurzeln oder in engcr Gemeinschaft mit anderen Bakterien

Bei der Dinitrogenasc-Reduktase handelt es sich um ein Dimeres aus zwei identischen Untereinheiten mit einer Gesamtmolmasse von ca. 65 000 [2, 3, 121. Das Protein enthalt, soviel bisher bekannt ist, einen Fe4S4-CIuster, der die Untereinheiten ,,verbriickt" 11 5c].

N,-Fixierung durch freilebende Organismen:

obligat aerobe Bodenbakterien Azotobacter vinelandii

mikroaerophile Bodenbakterien Xanthobacter auto trophicus Interessant ist auch, da8 die Nitrogenase im

Gegensatz zu vielen anderen Enzymen nur geringe Substratspezifitat zeigt. So wird beispielsweise die Tatsache, daR Nitrogenase auch Acetylen zu Ethylen reduzieren kann, ausgenutzt, um die Aktivitat des Enzyms zu bestimmen. AuBer Acetylen wird auch noch eine Reihe von anderen, meist linear gebauten Molekiilen oder Ionen rnit Doppel- oder

fakultativ anaerobe Bakterien (N,-Fixierung nur anaerob)

Klebsiella pneumoniae

strikt anaerobe Bodenbakterien Clostridium pasteurianum

Cyanobakterien rnit Heterocysten (auf N,-Fixierung spezialisierte Zellen innerhalb der Filamente)

Anabaena variabilis

*vermutete Summenformel: MoFe,-8S,-, [12, 171. Cyanobakterien, die Photosyn-

these (0,-Produktion!) und N,-Fixierung zeitlich trennen

Nostoc .p

genauer: Untersuchung der anomalen "* Rontgenstreuung 11 5c].

270 Chemre in unserer Zeit / 24. Jahrg. 1990 / Nr. 6

Stickstof-Fixieuung

3 4

4

Messungen an der gereinigten Dinitrogenase von Clostridium pasteurianum wiedergege- ben. Aus der augenfalligen Ahnlichkeit der Resultate mit denen von MoFe,S,-Cuban- Clustern glaubten viele Autoren schliegen zu konnen, daR eine MoFe,S,-Cuban-Einheit ein wesentliches Strukturelement des Fe- Mo-Co sei. S. D. Conradson et al. stellten aber fest [20,21], dag sich in der Umgebung des Molybdans nicht nur, wie bis dahin immer vermutet, Schwefel- und Eisen-Atome befinden, sondern auch leichtere Atome (drei bis vier Schwefel-Atome in einer Entfernung von ca. 234 pm, zwei bis vier Eisen-Atome in einem Abstand von ca. 268 pm und zwei bis

Bezeichnung Anzahl Literatur

F e A ,,S"-Cluster ?* * * 1 ~ 2 , 131

Fe,_,Mo S6-9 ,,M"-CIuster 2 [12, 13, 171 ( A FeMo-Co)

*Vgl. auch Diskussion in [3j und [12] sowie im Text. +* oder zwei grogere Fe,&- bzw. p2-S-verknupfte Fe,S,-Cluster

***wahrscheinlich kein separater Cluster

drei Sauerstoff-, Stickstoff- oder Kohlenstoff- Atome in einer Entfernung von ca. 220 pni vom Molybdan [20,21]). Einkristall-EXAFS- Messungen von L. E. Mortenson, S. P. Cra- mer et al. zeigten [20], dai3 eine lineare L,FeS2- MoS,FeI,,-artige Struktur und trigonal-pla- nar angeordnete Eisen-Atome urn das Mo- lybdan ausgeschlossen werden konnen.

57Fe-Moi3bauer-Spektroskopie an der Dini- trogenase von Klebsiella pneumoniae fuhrten zu dem Ergebnis, dai3 in der gereinigten Dini- trogenase - entsprechend vier verschiedenen Isomerieverschiebungen - mindestens vier ,,Arten" von Eisen-Atomen vorliegen (vgl. Kasten auf Seite 272, 273 ausfuhrlich in [3, 131). Diese vier ,,Arten" von Eisen-Atomen wurden den drei Cluster-Typen in Tabelle 3 zugeordnet: Jeweils drei Eisen-Atome der ersten Kategorie bilden zusammen mit einem Eisen-Atom der zweiten Kategorie einen Fe,S,-Cluster, die ,,Komponente I"'. Die dritte Kategorie wird dem bereits erwahnten FeMo-Co, dem sogenannten ,,M"-Cluster, zugeordnet (M steht fur magnetisch). Die vierte Kategorie, deren Existenz sehr umstrit- ten ist, weil sich ihr Mogbauer-Spektrum unter dem der P-Komponenten ,,verbirgt", wurde einem ,,S"-Cluster zugeordnet, der aus einer Fe2S2-Einheit bestehen sol1 (vgl. Dis- kussion in [3, 12, 131). Nach den Ergebnissen der Rontgenstrukturanalyse von L. E. Mor- tenson sind Zweifel an der Cluster-Zuord- nung berechtigt (eventuell gibt es nur zwei, allerdings etwa doppelt so groge P-Cluster).

Cbemie in unserer Zeit / 24. Iabrg. 1990 / Nr. 6 27 1


5

Unserer Arbeitsgruppe ist die ,,Exzision" eines Fe,S,-Clusters (P-Cluster) aus dem Pro- tein nach der sogenannten Thiolat-Methode und seine rontgenographische Charakterisie- rung in eincm kristallinen Salz gelungen. Ab- bildung 5 zeigt die Struktur der zentralen Einheit. Dies beweist allerdings nicht unbedingt, dai3 die Metall-Cluster-Anordnung der genuinen Struktur im Protein entspricht. Wie bei fast allen Proteincn, die Fe-S-Cluster enthalten, kann man auch von der Nitroge- nase nur bei sehr tiefen Temperaturen (< 30 K) ESR-Spektren aufnehmen [22]. Die ESR- Untersuchungen haben meist mehr deskripti- ven Charakter, d.h. die Spektren werden meist nur als ,,finger prints" fur die Nitroge- nase-Komponenten verwendet (Nachweis des M-Clusters und auch des MoFe-Proteins im sog. semi-reduzierten Zustand, in dem es normalerweise isoliert wird, mit dem typi- schen Spinzustand S = 3/2; dieser entsteht durch Koppiung der Fe-Zentren (vgl. Spek- trum im Kasten nebenan). Konkrete Aussa- gen uber die Struktur des FeMo-Co lassen sich nur in Verbindung mit anderen Metho- den, z. B. mit der Mofibauer-Spcktroskopie, gewinnen. Sehr empfindliche in-vivo-untersuchungen zur Detektierung des MoFe- Proteins sind mit der sog. zeitaufgelosten y,y- Winkelkorrelationsspektroskopie moglich [24, 251 (vgl. Kasten nebenan).

Genetik der biologischen Stickstoff-Fixierung am Beispiel von Klebsiella pneamoniue Die genetischen Aspekte der N,-Fixierung sind nicht ganz einfach zu verstehen 13, 12, 261. Die fur die biologische N,-Fixierung notwendigen Grundvoraussetzungen sind das Vorhandensein der entsprechenderi Proteine (Dinitrogenase und Dinitrogenase-Reduk-

272 Cbernie in unsweT Zeit / 24. Jahrg. 1990 / Nr. 6

Stickstof-Fixierung

Cbernie in unserer Zeit / 24. Jabrg. 1990 I NT. 6 273

Stickstofff'Fixierung

tase) mit ihren anorganischen Cofaktoren, deren Einbindung in den Gesamtstoffwech- sel (Verfiigbarkeit von Elektronen und ATP) und eine effektive Regulation. Diese Grund- voraussetzungen miissen in den Genen veran- kert sein.

Die zur N,-Fixierung notwendigen Gene werden als nif-Gene (nitrogen fixation) bezeichnet. Es sind bei Klebsiellapneumoniae 20 auf dem Chromosom direkt hintereinander- liegende Gene, die in 7 bzw. 8 Operons orga- nisiert sind. (Ein Operon ist eine Gruppe von Genen, die gemeinsam abgelesen werden.) Die nif-Gene von Klebsiella pneurnoniae lassen sich zu verschiedenen funktionalen Gruppen zusammenfassen (Tabelle 4 und Genkarte der die nif-Gene umfassenden Re- gion des Chromosoms von Klebsiella pneurno- nia oben [26]).

Die zuerst entdeckten Gene waren die Struk- tur-Gene nifH, n i p und nifK, welche die Untereinheiten der Nitrogenase codieren. Diese Gene wurden 2.B. nur mit Hilfe von Deletionsmutanten (d. h. Mutanten, denen diese Gene fehlen) nachgewiesen. Das nijH- Gen stellt das Struktur-Gen (also das fur das cofaktor-freie Apoprotein verantwortliche Gen) fur die Dinitrogenase-Reduktase dar. Speziell bei Klebsiella pneumoniae ist es die Rolle des nzfh.i-Genprodukts, das inaktive Apoprotein in eine aktive Dinitrogenase- Reduktase zu uberfiihren [12]. Als Struktur- Gene fur die a- und P-Untereinheiten der Di- nitrogenase wurden ebenfalls mit Hilfe von Deletionsmutationen die Gene n i p und nifK identifiziert. Auch hier wirken moglicherweise mehrere Genprodukte als Hilfs- proteine, ahnlich wie bei nifM. Mutationen in den Genen n$Q, n i p , nifN, ni' und nifB fiihren zu defekten oder inaktiven Ni- trogenasen, bei denen man spektroskopisch nachweisen kann, daB durch diese Mutatio- nen kein oder nur ein unvollstandiger Fe- Mo-Co gebildet wird. Deshalb werden diese Gene im allgemeinen dem Syntheseprozei3 des Cofaktors und den damit zusammen- hangenden Vorgangen (z. B. Mo-,,processing"') zugerechnet.

Klebsiella pneurnoniae gehort als Enterobakte- rium zu den heterotrophen N,-Fixierern und

*Der Begriff ,,processing" umschreibt dabei den schrittweisen Einbau des Molybdans von im Kulturmedium vorliegendem MOO:- bis zum FeMo-Co.

- benutzt als Elektronenquelle Pyruvat, das beim Abbau verschiedener organischer Sub- strate wie Glucose, Lactose und Malat entsteht. Zur Elektronentransportkette vom Py- ruvat iiber ein Flavoprotein zur Dinitrogena- se-Reduktase gehiiren die Genprodukte von n$F und nifl. Die Genprodukte von nifA und nifL dienen der Transcriptionskontrolle, d. h. der Kontrolle daruber, ob die ubrigen nif-Gene abgelesen werden: Sie haben also rein regulatorische Funktion.

Der Dinitrogenase-Cofaktor (FeMo-Co): Versuche zur Synthese von Modellsubstanzen und weitere chemische Eigenschaften V. K. Shah und W. J. Brill [14] gelang die Iso- licrung des oben erwahnten Cofaktors aus

der Dinitrogenase. Uber dessen Eigenschaf- ten und Versuche zur Synthese von Modell- substanzen sol1 im folgenden Abschnitt berichtet werden [2, 3, 12, 17, 27, 28, 29, 301. Schon wit 1930 ist bekannt, dai3 die N,- Fixierung ein molybdan-abhangiger Vorgang ist [31]. Nachdem W. G. Zumft 1978 [5] an Hand der bekannten charakteristischen Elek- tronenspektren [27] entdeckt hatte, daB bei der Hydrolyse des in der Dinitrogenase vor- liegenden Eisen-Molybdan-Cofaktors Thio- molybdate (wie z. B. MoSi-) entstehen, ver- suchten weltweit verschiedene Arbeitsgrup- pen, den umgekehrten Weg zu gehen, namlich ausgehend von Thiomolybdaten Cluster zu synthetisieren, die bexiiglich ihrer spek- troskopi$chen Eigenschaften und in ihrer analytischen Zusammensetzung dem Fe- Mo-Co der Nitrogenase moglichst nahe kommen [28, 29, 301.

Genbe- Funktion des von zeich- nung

n;fK nifD

nifH

n;fQ n$B nzfN n i f E nifV

nifM n;fX n;fY nifS nifU"

n$A nifL

nifF 4 - J

diesem Gen codierten I'roteins

Dinitrogenase

Dinitrogenase-Reduktase

an der Synthese des Cofaktorc und am Mo-,,processing" beteiligt

Hilfsproteine bei der Aktivierung der Nitro- genase und des FeMo-Co

Regulation der nifGene

Elektronentransport

Ende der sechziger Jahre hatten wir mit der Darstellung einer Reihe von Thiowolfra- mato- und Thiomolybdato-Komplexen der Ubergangsmetalle begonnen [4, 271, wobei uns vor allem ihre spektroskopischen Eigen- schaften und Bindungsverhaltnisse interes- sicrten. Erst spater wurde klar [32], daB Sub- stanzen dieses Typs in gewissem Sinne Mo-

Farbe in der Gen- karte obcn dellcharakter haben.

Kurzlich beschrieben W. E. Newton et al., daR bei der Titration des FeMo-Co mit sauerstoff-gesattigten Losungsmitteln Thio-oxo- Molybdate entstehen [33]. Ziel dieser Unter- suchungen war es, weitere Hinweise fur eine aufgrund von EXAFS-Ergebnissen aufge- stellte These zu finden, daB sich an das Mo- lybdan mindestens ein sauerstoff- oder stickstoff-haltiger Ligand koordiniert (vgl. oben). Einen weiteren Hinweis auf Sauerstoff in der Koordinationssphare des Molybdans im Fe- Mo-Co liefert nach Ansicht dieser Autoren die Umsetzung mit [(Ph,P),Cu(NO,)] [34], bei welcher der in unserer Arbeitsgruppe synthetisierte Cluster [OMo(CuPPh,),S,X] (X = Halogen) [35] entsteht.

Abbildung 6 stellt einige Modelle vor. 1 und 2 wurden aufgrund erster EXAFS-Untersu- chungen als Partialstrukturen des Clusters angenornmen, wobei 1 nach entsprechenden Einkristall-EXAFS-Spektren heute kaum noch in Betracht kommt (vgl. oben). Dariiber hinaus zeigt sich eine groBe Ahnlichkeit der SDektren der Dinitroeenase mit den von h e -

Y

* Weitere Gene sind: nifW, n i f Z , und nif?'; fur einige Genprodukte ist die Funktion nicht eindeutig. des FeMo-Co sein kiinnte.

zies mit MoFe,S,-Einheiten. Dies IaBt den SchluB zu, daB eine MoFe,S,-Fragment Teil

274 Chemie in unserm Zeit / 24. Jahrg. 1990 / Nr. 6


6 Im allgemeinen wurde und wird angenommen, daR das Stickstoff-Molekul an das Mo- lybdan-Atom im FeMo-Co koordiniert wird. Neuere Uberlegungen zeigen [37, 381, daR sich der EinfluR des Molybdan-Atoms vor allem auf die Elektronenstruktur des ganzen Clusters auswirkt. Dadurch verlieren Mo- delle wie 3, bei denen der Stickstoff an das Molybdan koordiniert ist oder iiberhaupt Koordinationsstellen am Molybdan frei sind, an Wahrscheinlichkeit, da im Grunde genom- men die Reduktion ,,iiberall" am Cluster er- folgen kann. (Ein Hinweis auf ein koordina- tiv abgesattigtes Molybdan-Atom ergibt sich aus der Tatsache, daR CN- von der Nitroge- nase als Substrat reduziert wird, obwohl CN- ein starker und haufig destruktiver Komplex- ligand ist, der an freien Koordinationsstellen sofort entsprechend angreifen wurde.) Die Spezies 9 war im Zusammenhang mit der moglichen Existenz eines die beiden Fe- Mo-Co verbruckenden (Fe,S,)-Clusters interessant (vgl. die Diskussion oben). Insgesamt lai3t sich sagen, daR es heute noch kcine Mo- dellsubstanx gibt, welche die gestellten An- forderungen in bezug auf analytische und spektroskopische Daten vollkommen erfiillt.

Es mu13 aber nicht unbedingt als einziges Ziel der Synthese solcher Modellsysteme angese- hen werden, alle chemischen und physikalischen Eigenschaften der natiirlichen ,,Vorbii- der" zu imitieren. Es geht vielmehr auch darum, die Chemie von Fe-S- bzw. Fe-M-S- Clustern zu entwickeln, um den FeMo-Co synthetisieren zu konnen, wenn seine Struk- tur aufgekl5r-t ist. Die Herausforderung, die die Synthese von FeMo-Co-Modellen dar- stellt, hat auf jeden Fall zu einer Vielfalt von faszinierenden cubanartigen Fe-M-S-Clu- stern gefiihrt, die im wescntlichen von R. H. Holm et al. synthetisiert wurden [29].

Alternative Nitrogenasen und eine Hypothese uber deren Evolution Seit der Entdeckung der Molybdanabhangig- keit der N,-Fixierung durch H. Bortels 1930 1311 galt es als Dogma, dai3 die Nitrogenase generell ein Molybdan-Enzym-System ist. Neben dieser Molybdan-Nitrogenase ist aber spater auch eine wolfram-haltige Nitroge- nase nachgewiesen worden, die allerdings enzymatisch nicht aktiv ist [I, 31. Von dieser Nitrogenase wird angenommen, daR das Wolfram im ,,aktiven Zentrum" die Position des Molybdans einnimmt. Diese ,,Wolfram- Nitrogenase" kann ,,kunstlich" erzeugt wer-

den, wenn den Bakterien Wolfram im Uber- schuR zur Verfiigung gestellt wird. Sie entsteht, weil die Bakterienzelle zwischen Mo- lybdan und Wolfram nicht unterscheiden kann und so Wolfram isomorph in den dem FeMo-Co analogen Few-Co einbaut.

Beobachtungen, daR Vanadium das Wachs- tum unter stickstoff-fixierenden Bedingun- gen zu stimulieren vermag (,,V-Effekt"), wurden in den meisten fruheren Arbeiten mit einer verbesserten Aufnahme oder Nutzung des Molybdans erklart. 1986 konnte dann aber eine alternative Nitrogenase aus Azoto- bacter vinelandii und A. chroococcurn isoliert werden [b, 71, die statt Molybdan Vanadium enthalt. Inzwischen wird die Existenz einer Vanadium-Nitrogenase auch in Clostridiurn pasteurzanurn und dem Cyanobakteriumha- baem vdriabilis angenommen. *

SchlieRlich wurde 1988 eine dritte Nitroge- nase aus Azotobacter vinelandii vorgestellt, die anscheinend weder Molybdan noch Vana- dium enthalt, noch irgendein anderes Metall auner Eisen [8]. Diese ,,Eisen-Nitrogenase" ist bisher nur sehr wenig untersucht, und die Metallanalysen in den ersten Publikationen erfaken nur relativ wenige Elemente. AuRer- dem ist die ,,Eisen-Nitrogenase" offensichtlich sehr instabil, so daig nicht vollig ausgeschlossen werden kann, daR bei der Isolie- rung des Enzyms moglicherweise ein ,,Bruchstiick" des Cofaktors mit einem Me- tallatom verloren gegangen ist. Kiirzlich wurde in unserer Arbeitsgruppe auch in dem phototrophen Bakterium Rhodobacter capsulatus eine ,,Eisen-Nitrogenase" entdeckt [50].

*Wir konnten Hinweise finden, da13 auch das mikroaerophile (d. h. bei reduziertem 0,- Angebot wachscnde) Wasserstoffbakterium Xanthobacter autotrophicus eine ,,neuartige" Nitrogenase bildet [39].

Chemie in unserw Zeit / 24. Jabrg. 1990 / Nr. 6 275

Stickstof-Fixierung

7 DaE auch eine heterometallfreie Nitrogenase in der Lage sein wiirde, N, zu reduzieren, wurde bereits 1987 von uns an Hand von Mo- delluntersuchungen wahrscheinlich gemacht [37a]. Bemerkenswert ist, dai3 das Vanadium- System und das ,,Eisen-System" Acetylen nicht wie die Molybdan-Nitrogenase nur zurn Ethylen, sondern in einem Anteil von zwei bis drei Prozent bis zurn Ethan reduzieren.

Aufgrund der geringen Substratspezifitat und des verrnutlich sehr hohen Alters der Molyb- dan-Nitrogenase schlossen W. S. Silver und J. R. Postgate, daB die ursprungliche Bedeutung dieses Enzymsystems nicht die N,-Fixierung gewesen sein kann [40, 411. Die Begriindung der Autoren war, dai3 sich die Nitrogenase zu einer Zeit entwickelte, als die Erdatmosphare noch reduzierend war und geniigend Ammo- niak enthielr. (Der Sauerstoff gelangte erst wesentlich spater vermutlich vor allem durch die Photosynthese in die Atmosphare.) Nach Ansicht der Autoren war die urspriingliche Aufgabe der Nitrogenase die Entgiftung von Cyanid im Lebensraum der prakambrischen Bakterien.

Vor diesem Hintergrund gewinnt die Tatsa- che an Bedeutung, daR sich die Substratspezi- fitaten der drei Nitrogenase-Systerne deutlich unterscheiden [b, 7, 8, 12, 501. Die Aktivitat der ,,Eisen-Nitrogenase" lai3t sich allerdings nur schwer einordnen, weil die fur diescs En- zyrn optimalen Stabilitats- und Reaktionsbe- dingungen noch nicht bekannt sind. Mit der Annahme, daB ein Funktionswechsel von der Cyanid-Detoxifizierung zur Stickstoff-Ke- duktion stattgefunden hat, kann man daruber spekulieren, ob sich das ,,Eisen-System" unter Umstanden vor dem Vanadium-Systcm entwickelt hat, weil es moglicherweise fur die Cyanid-Reduktion besser geeignet war, und daB die Entwicklung dann iiber das Vana- dium-System zur Molybdan-Nitrogenase verlief, wed die Reduktion von N, gegeniiber der von CN- mehr und mehr an Bedeutung gewann.

8

Die drei Nitrogenasen basieren auf gene- tisch eigenstandigen Systemen, sind sich aber strukturell zumindest bezuglich der Existenz der beiden Proteinkompoiienten dennoch ahnlich. Besonders die Dinitrogenasen wei- sen Homologien auf und konnen sich (unter geringem Aktivitatsverlust) gegenseitig erset- Zen. Leider sind noch nicht von allen drei Sy- scemen die vollstandigen Nucleotid-Sequen- Zen der Gene bekannt, so daR man noch keine

276 Chemie in unserer Zeit / 24. Jahrg. 1990 / Nr. 6


sicheren Aussagen uber die denkbare Ent- wicklung aus einer gemeinsamen ,,Urform" oder ubcr die Evolution der Molybdan- Nitrogenase aus dem ,,Eisen-System" uber die Vanadium-Nitrogenase machen kann.

Interessant ist, dai3 diese drei Nitrogenase- Systeme in Abhangigkeit voneinander regu- liert werden. In Gegenwart ausreichender Molybdan-Mengen wird nur die Molybdan- Nitrogenase gebildet. Wenn aber die Molyb- dan-Konzentration unter einen Grenzwert sinkt, bildet de,. Organismus die Vanadium- Nitrogenase, wenn ihm Vanadium zur Ver- fugung gestellt wird." Erst wenn sowohl Molybdan- als auch Vanadium-Mange1 herr- schen, werden Molybdan- und Vanadium- Nitrogenase reprimiert und die ,,Eisen- Nitrogenase" wird gebildet. Dies gilt zumindest fur A. vinelandzi (Abbildung 7), dem bisher einzigen Organismus, in dem alle drei Nitrogenase-Typen nachgewiesen wurden.

Die oben angesprochene regulatorische Ver- knupfung lai3t sich einerseits sicherlich durch die unterschiedlichen Aktivitaten und Sub- stratspezifitaten erklaren; aber auch die denkbare Abfolge der drei Systeme im Lauf der Evolution konnte diese Art der Regulation erklaren (vgl. unten).

Auch eine Reihe anderer Hypothesen fiigt sich in diese Theorie sehr gut ein. So kann beispielsweise daruber nachgedacht werden, warum die Natur diese ,,Abfolge der Metalle" gewahlt hat: Eisen kann in den meisten Me- tallproteinen nur zwischen den Valenzzu- standen Fe(I1) und Fe(II1) wechseln, Vana- dium dagegen kommt in biologischen Syste- men in den Oxidationsstufen V(III), V(IV) und V(V) vor. Im Molybdan stehen fur bio- chemische Prozesse wahrscheinlich noch mehr Oxidationsstufen zur Verfugung: Mo(III), Mo(IV), Mo(V) und Mo(V1). Das mug nicht zwangslaufig bedeuten, dai3 sie alle am ProzeQ der N,-Fixierung beteiligt sind. Die groi3erc Variationsbreite der Oxida- tionsstufen macht aber plausibel, warum die Natur nach und nach dazu uberging, fur Mehrelektronen-Prozesse Elementen mit ho- herer Redox-Flexibilitat den Vorzug zu ge- ben.

*Die Hauptschwierigkeit dieser Experimente liegt in dem aui3erordentlich niedrigen Mo- lybdan-Bedarf der Bakterien ( t 0 , l pg/l) und der ubiquitaren Verbreitung des Molybdans.

Die Natur hat wahrscheinlich im Verlauf der Evolution xunachst die Elemente verwendet, die am haufigsten vorhanden waren (vgl. Ab- bildung 7). D a m gehorte Eisen. Vanadium ist weit wenigcr haufig, dafur aber im N,- reduzierenden Enzymsystem effektiver. Dies konnte ein Grund fur die oben erwahnte Ent- wicklung der Vanadium-Nitrogenase aus der ,,Eisen-Nitrogenase" sein. Entsprechendes gilt dann auch fur das in der Geosphare noch seltenere Molybdan und die nach dieser Hypothese noch spater entstandene Molyb- dan-Nitrogenase. Auch rnit Hilfe quanten- chemischer Berechnungen 1agt sich die hohere Effektivitat der Vanadium- und Mo- lybdan-Nitrogenasen gegeniiber der ,,Eisen- Nitrogenase" zumindest plausibel machen [37] (zur denkbaren Evolution vgl. Abbil- dung 7).

Ein Indiz dafur, dai3 auch andere Metall- Atome anstelle von Molybdan in den Fe- Mo-Co eingebaut werden konnten, ist die Tatsache, dai3 bereits isostrukturelle M-Fe-S- Cluster synthetisiert wurdcn, die als Metall- Atom M Vanadium, Molybdan, Wolfram und Rhenium (also Elemente, die Tetrathio-Anio- nen bilden [27a]) enthalten (vgl. z.B. die Synthese von [(FeCl,)(ReS,)(FeCl,)]*- sowie der isostrukturellen Spezies der genannten Metalle [37, 381).

N,-Komplexe

Nach der Isolierung des ersten N,-Komple- xes [RU(NH,),(N,)]~+ im Jahre 1965 [42] hat das Interesse an dieser Verbindungsklasse stark zugenommen. Inzwischen gibt es eine groi3e Zahl derartiger Spezies mit Metallen in niedrigen Oxidationsstufen. Besondere Be- deutung haben die Reaktivitat des Liganden und speziell die intramolekulare Umwand- lung in NH,, die J. J. Chatt und R. L. Ri- chards et al. entsprechend Gleichung (3) ge- Iang [43, 441.

oxidierter Metallkomplex + NH, + N,

Die Resonanz auf diese Entwicklung war so grog, daR Zeitschriften und selbst Tageszei- tungen wie die ,,Times" und der ,,Guardian" in England sofort mit Schlagzeilen reagierten (Abbildung 8). Aber die Hoffnung, den Ha- ber-Bosch-Prozei3 durch ein billigeres cycli- sches Verfahren zu ersetzen, wurde bisher nicht crfullt.

Es ist haufig postuliert worden, daQ die biologische Hydrierung von N, stufenweise ab- lauft [I, 12,441. In diesem Zusammenhang ist die Synthese des Komplexes 10 mit zwei uber

10

ein Diimin verbriickten Eisen-Atomen interessant, die D. Sellmann et al. vor kurzem gelang [49].

Zukunftsperspektiven

In den 130 Jahren seit der Entdeckung des Phanomens der N,-Fixierung hat dieses Ar- beitsgebiet nichts von seiner Attraktivitat und seiner Aktualitat verloren. Immer wieder eroffnen sich neue Perspektiven und neue Zielsetzungen. Fur den Chemiker ist die Su- che nach einem kostengiinstigen Ersatz fur das Haber-Bosch-Verfahren wohl einer der Hauptgriinde fur die Auseinandersetzung rnit dem Problem der biologischen N,- Fixierung. Daneben bietet die Beschaftigung mit der Nitrogenase aber auch eine Reihe von anderen interessanten Aspekten. So ist z. B. die im FeMo-Co enthaltene Molybdan- Schwefel-Bindung auch fur industrielle kata- lytische Prozesse wie die Entschwefelung und Entstickung von Erdiil von groi3er Be- deutung [45]. Dabei spielen die fur den intra- molekularen Elektronentransfer besonders geeigneten Mo-S-Bindungen eine wichtige Rolle [27, 46, 471.

Ein chemisch interessanter Aspekt ist die geringe Substratspezifitat der Nitrogenase. Die groi3e Substratpalette eroffnet grundsatzlich neue Moglichkeiten fur die organische Syn- these. Besonders erwahnt werden sollte auch die bei manchen Organismen besonders aus- gepragte Wasserstoffentwicklung (Gleichung 2). Verschiedene Arbeitsgruppen untersuch- ten speziell diese Phanomene mit dem Ziel einer zukunftigen Wasserstoff-Technologie. Wir versuchen beispielsweise, fur phototro- phe N,-Fixierer, die N, mit Hilfe von Licht- energie reduzieren und H, bilden, Bedingun- gen zu finden, unter denen die H,-Entwick- lung gegenuber der NH,-Bildung bevorzugt wird.

Cbemie in unserer Zeit ,f 24. Jabrg. 1990 ,f Nr. 6 277

Stickstof-Fixierung

Auch auf dem Gebiet der Fe-M-S-Cluster (M = V, Mo, W, Re) sind noch interessante Ent- deckungen zu erwarten. Die Untersuchungen von Elektronentransfer-Prozessen allgemein und die Synthese von reversibel oxidierbaren oder reduzierbaren Metall-Clustern mit (an- ti)ferromagnetisch gekoppelten Zentren wie im FeMo-Protein haben durchaus Praxis- Bezug.

Die mit der ii'berdungung verbundenen Pro- bleme (Nitrat im Trinkwasser, Eutrophierung der Gewasser, Versalzung der Ackerboden usw.) sind rnittlerweile ins Bewuiitsein der Offentlichkeit gedrungen. Daher wird intensiv daran gearbeitet, durch gentechnische Methoden Bakterien zu ,,erzeugen", die den Einsatz von Kunstdungern uberfliissig machen. Ein anderer Ansatz besteht darin, die bakteriellcn +Gene auf Pflanzen zu iiber- tragen, so dai3 diese selbst Stickstoff fixieren konnen. Ein dritter Weg ist die Konstruktion neuer Bakterien-Pflanzen-Symbiosen mit Hilfe der Gentechnik. Wenn es gelingt, die mit Leguminosen zusammenlebenden Rhizo- biurn-Arten zu einer Symbiose, beispielsweise mit Weizen, zu bewegen, ware eine Stick- stoff-Diingung uberfliissig. Interessant ist aber auch der Versuch, uber Ergebnisse der Genanalyse Antwort auf die Frage der Evolu- tion der drei Nitrogenase-Systeme zu erhal- ten.

Der vorliegende Artikel macht deutlich, wie schwierig die strukturelle Charakterisierung von Metall-Clustern in Proteinen selbst mit aufwendigstem Einsatz spektroskopischer Methoden i d . Dies wurde besonders evident durch die ,,neuesten" Rontgenstrukturdaten von L. E. Mortenson et al., so daB in Zukunft der Protein-Strukturanalyse auch unter Ein- satz von Synchrotron-Strahlung hohe Bedeu- tung zukommen wird.

"Daher wurden hier auch einige neuere Ar- beiten nicht erwahnt.

Literatur

[l] J. R. Postgate: ,,The fundamentals of nitrogen fixation". Cambridge University Press, Cambridge 1982. [2] A. Muller und W. E. Newton (Hrsg.): >,Ni- trogen fixation - the chemical-biochemical- genetic interface". Plenum Press, New York 1983. [3] J. R. Gallon und A. E. Chaplin: ,,An intro- duction to nitrogen fixation". Cassell Educatio- nal Limited, London 1987. [4] A. Miiller und E. Diemann: ,,The bis(tetra- thiotungstato)nickelate(II) ion, a novel complex with the WSi- ion as a ligand". J. Chern. SOC. Chem. Commun. 1971, 65. 151 W. G. Zumft: ,,Isolation of thiomolybdate compounds from the molybdenum-iron protein of clostridial nitrogenase". Eur. J. Biochem. 91, 345 (1978). [6] B. J. Hales, E. E. Case, J. E. Morningstar, M. F. Dzeda und L. A. Mauterer: ,,Isolation of a new vanadium-containing nitrogenase from Azotobucter vinelundii". Biochem. 25, 7251 (1986). [7] R. R. Eady, R. L. Robson,T. H. Richardson, R. W. Miller und M. Hawkins: ,,The vanadium nitrogenase of Azotobucter chroococcurn". Bio- chem. J. 244, 197 (1987). [8] J. R. Chisnell, R. Premakumar und P. E. Bishop: ,,Purification of a second alternative nitrogenase from a nif HDK deletion strain of Azotobacter vinelundii". J. Bacteriol. 170, 27 (1988). [9] Justus von Liebig: ,,Agriculturchemie" Braunschweig 1840 (xitiert nach: 0. P. Kratz und C. Priesner: ,,Liebigs Experimentalvorle- sung". Verlag Chemie, Weinheim 1983). [13] H. G. Schlegel: ,,Allgemeine Mikrobiolo- gie". 6. Auflage. Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1985. [l 13 E. Strasburger, F. Noll, H. Schenck und A. F. W. Schirnper: Jehrbuch der Botanik", 32. Auflage neubearbeitet von D. von Denffer, H. Ziegler, F. Ehrendorfer und A. Bresinsky. Gu- stav Fischer Verlag, Stuttgart 1983. [ 121 W. H. Orme-Johnson: ,,Molecular basis of biological nitrogen fixation". Ann. Rev. Bio- phys. Biophys. Chem. 14, 419 (1985). [13] K. Zimmermann und A. X. Trautwein: ,,MoBbauer investigation of nitrogenase" in [2]; E. Miinck, H. Rhodes, W. H. Orme-Johnson, L. C. Davis, W. J. Brill und V. K. Shah: ,,Nitroge- nase VIII. MoBbauer and EPR spectroscopy. The MoFe protein component from Azotobucter vinelundii OP". Biochim. Biophys. Acta 400, 32 (1975). [14] V. K. Shah und W. J. Brill: ,,Isolation of an iron-molybdenum cofactor from nitrogenase" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3249 (1977). [15a] M. S. Weininger und L. E. Mortenson: ,,Crystallographic properties of the MoFe proteins of nitrogenase from Clostridiurn pusteuriu- num and Azotobucter vinelundii". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 378 (1982).

[15b] T. Yamane, M. S. Weininger, L. E. Mor- tenson und M. G. Rossmann: ,,Molecular sym- metry of the MoFe protein of nitrogenase". J. Biol. Chem. 257, 1221 (1982). [15c] vgl. K. Schneider und A. Miiller: ,,New Erkenntnisse zum Enzymsystem der Nitroge- nase". Nachr. Chem. Tech. Lab. 38, 1076 (1 990). [16] N. I. Sosfenov, V. I. Andrianov, A. A. Va- gin, B. V. Strokopytov, B. K. Vainstein, A. E. Shilov, R. I. Gvozdev, G. I. Likhtenstein, I. 2. Mitsova und I. S. Blazhchuk: ,,X-ray diffraction study of the MoFe-protein of nitrogenase from Azotobucter vinelandii". Dokl. Akad. Nauk USSR 291, 1123 (1986). [17] C. L. Coyle und W. G. Zumft: ,,Transition metal-sulfur sites in nitrogenase", in: H. Matsu- bara, Y. Katsube und K. Wada (Hrsg.): ,,Iron- sulfur protein research". Japan Scientific Socie- ties Press, Tokyo, Springer-Verlag, Berlin 1986. 1181 S. P. Cramer, K. 0. Hodgson, W. 0. Gil- lum und L. E. Mortenson: ,,The molybdenum site of nitrogenase. Preliminary structural evi- dence from X-ray absorption spectroscopy". J. Am. Chem. SOC. 100, 3398 (1978). [19] S. P. Crarner, W. 0. Gillum, K. 0. Hodg- son, L. E. Mortenson, E. I. Stiefel, J. R. Chisnell, W. J. Brill und V. K. Shah: ,,The molybdenum site of nitrogenase. 2. A comparative study of Mo-Fe proteins and the iron-molybdenum cofactor by X-ray absorption spectroscopy". J. Am. Chem. SOC. 100, 3814 (1978). [20] A. M. Flank, M. Weininger, L. E. Morten- son und S. P. Cramer: ,,Single-crystal EXAFS of nitrogenase". J. Am. Chem. Soc. 108, 1049 (1986). [21] S. D. Conradson, B. K. Burgess, W. E. Newton, K. 0. Hodgson, J. W. McDonald, J. F. Rubinson, S. F. Gheller, L. E. Mortenson, M. W. W. Adams, P. K. Mascharak, W. A. Armstrong und R. H. Holm: ,,Structural insights from the Mo K-edge X-ray absorption near edge structure of the iron-molybdenum protein of nitrogenase and its iron-molybdenum cofactor by comparison with synthetic Fe-Mo-S clusters". J. Am. Chem. SOC. 107, 7935 (1985). [22] G. Palmer, J. S. Multani, W. C. Cretney, W. G. Zumft und L. E. Mortenson: ,,Electron paramagnetic resonance studies on nitrogenase: 1. The properties of molybdoferredoxin and azo- ferredoxin". Arch. Biochem. Biophys. 153, 325 (1972), sowie [3] S. 101. [23] M. K. Johnson, A. J. Thomson, A. E. Ro- binson und B. E. Smith: ,,Characterization of the paramagnetic centres of the molybdenum- iron protein of nitrogenase from Klebsiellapneu- moniue using low temperature magnetic circular dichroism spectroscopy". Biochim. Biophys. Acta 671, 61 (1981). [24] A. Lerf und T. Butz: ,,Kernquadrupol- Wechselwirkung und zeitaufgeloste Spektro- skopie der gestorten y-y-Winkelkorrelation: Anwendungen in Chemie, Materialforschung und biophysikalischer Chemie." Angew. Chem. 99, 113 (1987).

278 Chemie In unserer Zeit / 24. Jahrg. 1990 / Nr. 6

St ickstoff-Fixierung

[25] P. Mottner, A. Lerf, X. Ni, T. Butz, J. Erfkamp und A. Miiller: ,,In-vivo study of the nuclear quadrupole interaction of 99Mo(P-)99Tc in nitrogenase of Klebsiella pneumoniae". Hy- perfine Interaction 61, 1215 (1990). [26] W. Arnold, A. Rump, W. Klipp, U. B. Prie- fer und A. Piihler: ,,Nucleotide sequence of a 24206-base-pair DNA fragment carrying the entire nitrogen fixation gene cluster of Klebsiella pneumoniae". J. Mol. Biol. 203, 715 (1988). [27a] A. Miiller, E. Diemann, R. Jostes und H. Bogge: ,,Thioanionen der Ubergangsmetalle: Eigenschaften und Bedeutung fur Komplexche- mie und Bioanorganische Chemie". Angew. Chem. 93, 957 (1981). [27b] E. LXemann und A. Miiller: ,,Schwefel- und Selenverbindungen von Ubergangsmetallen mit do-Konfiguration". Coord. Chem. Rev. 10, 79 (1973). [28] B. A. Averill: ,,Fe-S and Mo-Fe-S clusters as models for the active site of nitrogenase". Struct. Bond. 53, 59 (1983). [29] R. H. Holm: ,,Metal clusters in biology: Qucst for a synthetic representation of the cata- lytic site o f nitrogenase". Chem. Soc. Rev. 10, 455 (1981). [30] D. Coucouvanis: ,,Fe-M-S complexes de- rived from MSi- anions (M = Mo,W) and their possible relevance as analogues for structural features in the Mo site of nitrogenase". Acc. Chem. Res. 14, 201 (1981). [31] H. Bortels: ,,Molybdan als Katalysator bei der biologischen Stickstoffbindung". Arch. Mi- krobiol. l , 333 (1930). [32a] E. Koniger-Ahlborn, A. Miiller, A. D. Cormier, J. D. Brown und K. Nakamoto: ,,Metal isotope shifts and normal-coordinate analysis of the [58Ni(92MoS,),]2~ ion and its 62Ni and looMo analogs". Inorg. Chem. 14, 2009 (1975). [32b] A. Muller und S. Sarkar: ,,Thio-Hete- roanionen - aunergewohnliche Metall-Ligan- den-Wechselwirkung und Reaktionen". Angew. Chem. 89, 748 (1977). [33] W. E. Newton, S. F. Gheller, B. Hedman, K. 0. Hodgson, S. M. Lough undJ. W. McDo- nald: ,,Elicitation of thiomolybdates from the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. Comparison with synthetic Fe-Mo-S complexes". Eur. J. Biochem. 159, 111 (1986). 1341 W. E. Newton, F. A. Schultz, S. F. Gheller, S. Lough, J. W. McDonald, S. D. Conradson, B. Hedman und K. 0. Hodgson: ,,Iron-molybdenum cofactor of Azotobacter winelandii nitrogenase: oxidation-reduction properties and structural insights". Polyhedron 5, 567 (1986). [35] A. Miiller, H. Bogge und U. Schimanski: "The preparation of different types of poly- nuclear transition metal-sulfur compounds by thiometallates, including cubane-like ones. Crystal structures of {Cu,WS,Cl}(PPh,),S, (Cu,WS,CI)(PPh,),O, {Cu,MoS,Cl}(PPh,),S,

CH,CI, and (PPh,),Ag,MoS, 0,8 CH,CI,". In- org. Chim. Acta 69, 5 (1983). [36a] S. Ciurli und R. H. Holm: ,,Insertion of pFe,S,]2' and [MoFe,S4I3+ cores into a semi-

{Cu,MoS,CI)(PPh,),O, (PPh,),Cu,WS, . O,8

rigid trithiolate cavitand ligand: Regiospecific reactions at a vanadium site similar to that in nitrogenase". Inorg. Chem. 28, 1685 (1989). [36b] D. Coucouvanis und M. G. Kanatzidis: ,,Synthesis and characterization of a new Fe/Mo/S cluster containing the [Fe6M02S6]'+ core. A precursor to a possible structural analo- gue for the FeMo site of nitrogenase". J. Am. Chem. SOC. 107, 5005 (1985). [36c] A. Miiller, A. Hildebrand, M. Penk, H. Bogge, E. Bill und A. Trautwein: ,,pe2S, (MoS,),I4- : The first complex with two MoS:- ions coordinated to a ferredoxin type central unit". Inorg. Chim. Acta 148, 11 (1988). [37a] A. Muller, R. Jostes, E. Krickemeyer und H. Bogge: ,,Zur Kolle des Heterometall-Atoms im N2-reduzierenden Protein der Nitrogenase". Naturwissenschaften 74, 388 (1987). [37b] A. Miiller und V. Wittneben: ,,X,-Elek- tronenstruktur von vFe,S,(SH)J4- und mogli- che Relevanz zum ,Nitrogenase Problem"'. J. Mol. Struct. (Theochem) 209, 223 (1990). 1381 A. Muller, R. Jostes, K. Schmitz, E. Kricke- meyer, H. Bogge, E. Bill und A. Trautwein: ,,(PPh4)2[C12Fe(ReS,)FeCl,]o,,[CI,Fe(MoS4)- FeCI,],,,: containing two isostructural complexes with different electronic populations, Mossbauer spectra and electronic structures". Inorg. Chim. Acta 149, 9 (1988). [39] K. Schneider und A. Miiller, unveroffent- licht; vgl. auch A. Miiller, K. Schneider, J. Erf- kamp, V. Wittneben, E. Diemann und A. N. Eaton: ,,Vanadium-Akkumulation beim Stick- stoff-fixierenden Wasserstoffbacterium Xuntbc- bacter autotropbicus". Naturwissenschaften 75, 625 (1988). [40] W. S. Silver und J. R. Postgate: ,,Evolution of asymbiotic nitrogen fixation". J. theor. Biol. 40, 1 (1973). 1411 J. R. Postgate: ,,Evolution within nitrogen- fixing systems", in: ,,Evolution in the microbial world. 24th Symposium of the Society for Gene- ral Microbiology", Cambridge University Press, Cambridge 1974. [42] A. D. Allen und C. V. Senoff: ,,Nitro- genopentammineruthenium(I1) complexes". J. Chem. SOC. Chem. Commun. 1965, 621. [43] R. L. Richards: ,,Dinitrogen complexes and their reactions", in [2]. [44] J. Chatt: ,,Chemistry related to the biological fixation of nitrogen", in A. Miiller und E. Diemann (Hrsg.): ,,Transition metal chemistry. Current problems of general, biological and ca- talytical relevance". Verlag Chemie, Weinheim 1981. [45] A. Miiller, E. Diemann und F. W. Bau- mann: ,,Katalysatoren fur die Erdol-Entschwe- felung". Nachr. Chem. Tech. Lab. 36,18 ( 1 988). [46] A. Miiller, K. Jostes, W. Eltzner, Ch.-Sh. Nie, E. Diemann, H. Bogge, M. Zimmermann, M. Dartmann, U. Reinsch-Vogell, Sh. Che, S. J. Cyvin und B. N. Cyvin: ,,Synthetic, spectro- scopic, X-ray structural, and quantum-chemical studies of cyanothiomolybdates with Mo,S, Mo,S,, Mo,S,, and Mo4S4 cores: A remarkable class of species existing with different electron

populations and having the same central units as the ferredoxins". Inorg. Chem. 24,2872 (1985). 1471 A. Miiller: ,,Coordination chemistry of Mo- and W-S compounds and some aspects of hydrodesulfurizacion catalysis". Polyhedron 5, 323 (1986). [48] W. H. Armstrong, P. K. Mascharak und R. H . Holm: ,,Demonstration of the existence of single cubane-type MoFe,S, clusters with S = 3/2 ground states: Preparation, structure, and properties". Inorg. Chem. 21,1699 (1982). 1491 D. Sellmann, W. Soglowek, F. Knoch und M. Moll: ,,Nitrogenase-Modellverbindungen: B-N2H,(Fe(,,NHS,'?),l, der Prototyp fur die Koordination von Diazen an Eisen-Schwefel- Zentren und seine Stabilisierung durch starke N-H ..S-Wasserstofmriicken". Angew. Chem. 101, 1244 (1989). [50] K. Schneider und A. Miiller: ,,Demonstra- tion of an alternative nitrogenase in Rbodobacter capsulatus". Eur. J. Biochem., im Druck. 1511 P. R. Challen, Sang-Man Koo, W. R. Dun- ham und D. Coucouvanis: ,,New p2-S2--cou- pled, Singly Bridged Double Cubane with the [(Fe,S,CI,)2S]4- Core. The Stepwise Syn- thesis and Structural Characterixation of (n-Bu,N),(Ph,P),[(Fe4S,CI3),S". J. Am. Chem. SOC. 112, 2455 (1990).

Prof. A. Muller, geb. 1938 in Detmold, pro- movierte 1965 (bei 0. Glemser) und habili- tierte sich 1967 an der Universitat Gottingen. Seine Arbeitsgebiete umfassen u. a. Molekul- physik, Schwingungsspektroskopie, Bioan- organische Chemie, heterogene Katalyse sowie molekulare Metalloxid- und Sulfid- Komplexe. 30 Ubersichtsartikel aus diesen Bereichen wurden von ihm publiziert. Seit 1977 ist er Professor fur Anorganische Che- mie an der Universitat Bielefeld.

J. Erfkamp. geb. 1962, studierte von 1982 bis 1987 Chemie und Biologie in Bielefeld. Seit 1987 arbeitet er bei Prof. Dr. A. Miiller auf dem Gebiet der biologischen Stickstoff- Fixierung.

Chemie in unserer Zeit / 24. Jahrg. 1990 / NY. 6 279

Documents

Die Stickstoff-Fixierung. Aktuelle chemische und biologische Aspekte