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Die Synthese der 1,4-Diketoadipinsaure und ihre biologische Bedeutung;

von Franz Wille. Mit 3 Figuren im Text.

[Aus dem Chem. Laboratorium der Bayer. Akad. der Wissenschaften zu Miinchen.]

(Eingelaufen am 28. MLrz 1939.)

Im Jahre 1930 veroffentlichten E. Toenn ies sen u. E. B r i n k m a n n I) eine Reihe yon Experimenten uber den Abbau von Brenztraubensaure in1 uberlebenden Saugetier- organismus. Sie zeigten durch Stromungsversuche, dab in- takte Kaninchenmuskulatur bei Gegenwart von Sauerstoff Brenztraubensaure abzubauen vermag. Als Reaktionsprodukte wurden geringe Mengen Bernsteinsanre und Ameisensaure isoliert. Anaerob fand ein Abbau von Brenztraubensaure nicht statt.

Nach den Vorstellungen der Verfasser lieben sich diese Befunde auf folgende Weise erkliiren:

2 Mol Brenztraubensaure unterliegen der Dehydrierung zu 1,4-l>iketoadipinsauxre.

- 2 H CH,-CO-COOH I 2CH,COCOOH ~ + I

CH2--CO-COOH

Dieses Zwischenprodukt ist nicht fabbar. E s zerfallt unter dem Einflub von Hydrolasen in 1 Rlol Bernsteinsaure und 2 Mol Ameisensanre.

11 I CH2-CO-COOH CH,- COOH

CH,-CO-COOH + 2H,O -+ 1 f 2 HCOOH .

Die Richtigkeit dieser Theorie mubte sich durch bio- logische Tersnche mit 174-Diketoadipinsiiure prufeii lassen, deren Synthese z u diesem Zwecke in Angriff genommen worden ist.

CH2- COOH

I) E. T o e n n i e s s e n nnd E. B r i n k m a n n , I€. 187, 137 (1930).

238 Wil l e ,

I. Chemischer Teil. Die 1,4-DiketoadipinsLure ist schon des oftereu Gegenstand syn-

thetischer Versuche gewesen. A18 erste haben sich E. B l a i s e und 11. G a n l t l) im Laufe ihrer systematischen Untersuchungen uber Keto- siiuren mit ihrer Darstellung befaMt. Spater versuchten H. S u t t e r 2,

nnd K. B e r n h a u e r und A. I g l a a e r d ) mit Hinblick auf die ver- mutete biologische Bedeutung ernent die Synthese. Ein Derivat der Saure wnrde in letzter Zeit von G. A. R. K o n und B. L. N a n d i 3 be- schrieben.

Auf Grnnd der vorliegenden negativen Befunde lied sich erkennen, dad in der 1,4-Uiketoadipinsaure eine Sub- stanz von auderordentlicher Reaktionsfahigkeit vorliegen mudte iind deshalb niir sehr subtile Xethoden ziim Erfolg fiihren wiirden.

Nach R. Cr i egee 5 , ist es moglich, gewisse Kohlenstoff- Xohlenstoff-Doppelbindungen mit atherischem WasserstofY- superoxyd unter Verwendung von Osmium-tetroxyd als Ka- talysator anfziispalten. Es entstehen die zugehorigen Alde- hyde und Ketone. Unter anderen Bedingnngen entstehen die entsprechenden IXoxyverbindungen. Hiernach erschien es wahrscheinlich, dad das Ringsystem des Cyclobuten-Z,2- dicarbonsuure-dimethylesters diesem dbbau zugangig ist. Diese Verbindung wurde auf folgendem Wege nach R. C. F u s o n und T s i P n Kao6) und W.H.Pe rk in jun.?) erhalten: 1,4-Dibromadipinsaure-ditith~;lester wird mit Kalinmcyanid in 1 - Cyan-cyclobntan - 1,2 - dicarbonsaure - diathylester iiber- gefiihrt. Das Nitril rnit Bariumhydroxyd verseift, die freie Tricarbonsaiire diirch thermische Spaltung in das Anhydrid der Cyclobntan-l,2-dicarbonsaure verwandelt. Bromierung iind dbspaltung des Broms rnit Natriiimjodid in alkoholischer Losung fiihrt zii dem gewiinschten Ester.

') C. r. 14?, 198 (1908); C. r. 118, 176 (1909). 2, A. 499, 47 (1932). ') Bio. Z. 249, 211 (1932). ') SOC. 1933, 2958; 1933, 1632.

A. 522, 76 (1936). 6, Am. SOC. 51, 1536 (1929). 5, SOC. G, 960 (1894).

Die Synthese cler 1,k-Diketoadipinsaure usw. 239

CIS /

CH,-CHBr-COOC,H, KcK ~ CH,-C-COOC,H,

CH,-C-COOC,H, CH,-CHBr-COOC,H, I 1 _ _ I

CHZ-C (COOH),

CHS-CH-COOH

CH,-CH-CO + I I ' 0 ~~

CH,-CH-CO/ -* I I

CH,-CBr-COOCH, SaJ CH,-C-COOCII,

CH,-CBr-COOCH, CH,-C-COOCH,

Tatsachlich reagiert der Cyclobnteii-1,2-dicarbonsaure- dimethylester mit Wasserstoffsuperoxyd in Qegenwart von Osmiumtetroxyd in der erwarteteii TVeise. LiiBt mail eine atherische Losung des Esters, Wasserstoffsuperoxyd und Osmiumtetroxyd im molekularen Verhiiltnis 1 : 2 : 0,02 bei Zimmertemperatur aufeinander einwirken, so stellt man fest, da8 nach 12-24 Stunden eine Umsetzung stattgefunden hat. Beim Konzeiitrieren der Ptherischen Losnng im Vakuuni scheidet sich der Dimethylester der DiketoadipinsPure in krystallisierter Form ab. Er wird nach mehrmaligem Um- krystallisieren aus Aceton in Ausbeuten von 50-60 Proc. d. Th. erhalten. Der Ester ist in organischen Losnngsmitteln leicht loslich, er ist auch loslich in kaltem Wasser.

Entsprechend seinen Ketofunktionen liefert der Ester ein krystallisiertes Bi.s-l,4-dinitro-phenyIhydi.azon nnd eiii Bis-pheny lhydrazon.

Der Diketoadipinsiiure- dimethylester schmilzt bei 98 bis 100'. Wenn der Ester rein ist, so beginnen sich uii- mittelbar nach dem Schmelzen prachtvolle Krystalle abzu- scheiden. Und nach einigen Minuten ist das Ganze wieder erstarrt. Erst bei 164-165 O setzt erneutes Schmelzen ein und langsame Zersetzung unter Gasentwicklung. Die aus- krystallisierte Verbindung ist mit diesem isomer. Xach den1 Umkrystallisieren aus Dioxaii ist der Schmelzp. 169-170 O .

Sie ist im Gegensatz zu dem Ketoester in organischen Losungs- mitteln vie1 weniger loslich und unloslich in kaltem Wasser. E s lag die Vermutung nahe, da8 es sich hier urn die Dienol- form des Diketo-adipinsaure-dimethylesters, den 1,4-Diozg-

--f I I --f I I1

240 Wil le ,

muconsdiure-dimethi/lester, handelt ; denn dessen Entstehen ist mit der Ausbildung eines konjugierten Systems verbunden.

CH800C-CO-CH2-CH2--CO-COOCH, -t CH,OOC-C=CH-CH=C-COOCH,

O H OH

I n nbereinstimmung mit dieser Annahme gibt dieser Ester in Dioxan eine intensive, aber nicht bestandige Eisenchlorid- Reaktion. Blit Diazomethan tritt Reaktion ein unter Bildung eines krystallisierten Dimethylderivats vom Schmelzp. 116 O, entsprechend den beiden enolischen OH-Gruppen. Dieses nimmt bei der katalytischen Hydrierung 2 Mole Wasser- stoff auf. Aus dem Diketoester vom Schmelzp. 98-100° entsteht mit atherischem Diazomethan keine krystallisierte Verbiudung. Und endlich zeigt der Enolester bei A = 325mp eine starke Absorptionsbande, wahrend der Diketoester im Gebiet von A = 240 my bis ins Sichtbare nicht absorbiert (vgl. Fig. 1).

In den beiden Verbindungen liegt der einfachste Fall von Keto-Enol-Tautomerie vor, in dem Keto- und Enolform rein isolierbar sind.

Von den drei sterisch moglichen Formen des Dienol- esters wurde nur eine gefunden, von der man wohl aus Symmetriegriinden und wegen ihrer Bestandigkeit bei er- hohter Temperatnr annehmen darf, daW Oxygruppe und Carboxygruppe in trans-Stellung zueinander stehen.

Der Enolester unterscheidet sich von dem Ketoester ferner noch dnrch seine reduzierenden Eigenschaften. F e + + + und Jodlosung werden zum Unterschied vom Diketoester in wiibrigem Dioxan sofort entfarbt: das Eisen, nachdem vor- her die Losnng einen Bugenblick rotbraun war.

AuWer nach der erwiihnten Methode erhalt man den 1,4-Dioxymncons~ure-dimethylester ails dern Ketoester nach knrzer Einwirknng von Soda durch Ansauern der Reaktions- l iking.

Die Siiuren. Wahrend der Diketoadipinsaure-dimethyl- ester in nentraler, wiiWriger Losung erst nach liingerem Stehen verseift wircl, tr i t t nnter dern EinflnW von Alkali

Die Synthese der 1,4-Diketoadipinsaure usw. 241

die Verseifung augenblicklich ein. Tropft man eine "llo-Na- tronlauge in eine farblose, wafirige Losung von Ketoester, so beobachtet man an der Eintropfstelle eine intensive Gelb- farbung, die nach dem Umschwenken sofort wieder ver- schwindet. Die Losung reagiert neutral. Ers t wenn mehr als zwei Aquivalente Alkali zugefiigt sind, ist die Reaktion alkalisch und die Losung intensiv gelb gefarbt. Diese Gelb- farbung beruht auf einer Verschiebung der Absorption der Dienolform der Saure zum Sichtbaren hin (vgl. Fig. 1). Beim Ansauern wird die Losung vollkommen farblos. Zur pra- parativen Darstellung der Saure wurde die Verseifung mit verdiinnter Barytlauge bei Zimmertemperatur ausgefiihrt.

Fig. 1 l). I 1,4-Dioxymuconsaure-dimethylester in Dioxan

I1 1,4-Diketoadipinsaure-dimethylester in 1 n-NaOH unter N,.

L)as so erhaltene, schwach gefiirbte Produkt ist ein Gemisch von Keto- und Enolsiiure. Man kann durch Ausziehen mit wenig kaltem Wasser die Enolform erhalten. Sie ist in Wasser in der Kiilte sehr schwer loslich und reagiert des- halb nur schwach sauer. Durch Umkrystallisieren aus reinem Uioxan erhiilt man sie rein weiW mit dem Zersetzungs-

') Fur die Aufnahme der Absorptionsspektren bin ich Frl. Dr. F. I 'rnckn e r von der Technischen Hochschulc Munchen zu goBern Dank verpflichtet.

242 WilZe,

punkt 225-226 O . Sie gibt in wiiibriger Suspension voriiber- gehende intensive Eisenchloridreaktion. Mit Diazomethan reagiert sie stiirmisch unter Bildung des schon am dem Dienolester erhaltenen 1,4-Dimethoxy-dimethylesters vom Schmelzp. 116O l). In Wasser suspendiert wirkt die Dienol- saure stark reduzierend. Aus Silbernitrat wird Silber aus- geschieden. Jodlosung und Nethylenblan werden rasch ent- farbt, Reaktionen wie sie von den 1,2-Dienolen, den Re- dnktonen, bekannt sin& Beim Stehen an der Luft farbt sich die Enolsaure oberflachlich gelblich. Auch in organischen Losnngsmitteln ist die 1,4-Dioxymucons%ure schwer loslich. In Wasser lost sie sich beim Erwarmen farblos auf, ohne wieder auszukrystallisieren. Sie ist in die Ketoform iiber- gegangen. Das Reduktionsvermogen gegeniiber Methylenblau, Jodlosung nnd auch die intensive braunrote Eisenchlorid- reaktion sind verschwunden. Beim Eindampfen im Vakuum- exsiccator erhiilt man aber wieder ein Gemisch von Enol- und Ketosaure.

Fig. 2. Fig. 3. 1,4-Diketo-adipinsLure, I, 4-Dioxy-muconsaure,

7-fach. 25-fach.

Die Ketosaure gewinnt man aus dem beim Eindampfen entstandenen Rohprodukt durch Ausziehen mit wenig reinem, hei5em Dioxan. Sie krystallisiert hieraus in gro5en Platten.

*) Die EnolsLure uud das Tetramethylderirat wurden, als diese Arbeit bereits im Gange war, von W. PI’. H a w o r t h , E. L. H i r s t u. J. K. PI’. J o n e s (Soc. 1935, 710) kurz beschrieben.

Die Synthese der 1, PDiketoadipinsaure usw. 243

Die Diketosaure ist in Wasser und Aceton spielend leicht loslich. Zum Unterschied von der Enolsaure beginnt die Diketosaure beim Erhitzen uber 110 O langsam Kohlendioxyd abzuspalten. Sie zerstaubt im Schmelzpunktsrohrchen una zersetzt sich unter Braunfarbung bei 234 O.

Aus der Diketosaure entsteht mit Perhydrol unter sturmischer Kohlendioxydentwicklung Bernsteinsaure (H 011 e- mannsche Reaktion). Cerisulfat oxydiert in der gleichen Weise. Die quantitative Untersuchung nach C. F romageo t und P. Desnuelle’), modifiziert von H. A.Krebs und W.A. Johnson2), ergab 2 Mol Kohlensaure pro Mol Diketosaure.

Als 1,kDiketon reagiert die Diketosaure mit Anilin unter Bildung von l-Phenyl-2,5-~yrrol-dicarbonsaure. Mit wenig Diazomethan erhalt man den Ausgangsester vom Schmelzp. 98-100 O, mit vie1 Diazomethan nicht krystalli- sierte Produkte.

Wahrend es leicht ist, die Enolform der Diketo-adipin- saure wegen ihrer Unloslichkeit in kal tem Wasser rein zu erhalten, gelang dies bei der Ketoform nicht. Stets war eine wenn auch geringe Menge von Enolsaure beigemischt, wie sich durch Zugabe eines Tropfens Wassers, in dem die Ketosaure sehr leicht loslich ist, erkennen lie& I n einem Versuch ergab sich, daS das Verhaltnis von Keto- zu Enol- same nach dem Eindampfen etwa 3:l war. Das deutet da- rauf hin, daS in der klaren waarigen Losung der Diketo- saure, wie man sie durch Auflosen derselben in der Warme erhalt, neben der Ketoform auch Enolform vorhanden sein mu& I n der Tat zeigt diese Losung eine geringe Entfarbungs- fahigkeit fur Methylenblau. Diese Reduktion kommt aber bald zum Stillstand. Erst beim Erwarmen vermag die Losung weitere Mengen von Methylenblau zu reduzieren. Wahrscheinlich stellt sich das Gleichgewicht zwischen Enol- und Ketoform nur bei hoherer Temperatur hinreichend rasch ein.

l) C. Fromageot u. P. Desnuelle, Bio. Z. 279, 174 (1935). 9 H. A. Krebs u. W. A. Johnson, Biochem. J. 31, 645 (1937).

Annalen der Chemie. 688.BSnd. 17

244 Wil l e ,

Wie aus dem Vorhergehenden hervorgeht, kommen die rbduzierenden Eigenschaften allein der Enolform zu. Die 1,4-Dioxy-mucons~ure hat in ihrer Konstitution eine nicht zu verkennende Ahnlichkeit mit den als starken Reduktions- mitteln bekannten Reduktonen, von denen das Glucoredukton, die Reduktinsaure und die Ascorbinsaure die bekanntesten Vertreter sind. Nur mit dem Unterschied, dab die beiden enolischen Hydroxyle in der fur Reduktone charakteristischen Gruppierung HOC = C(0H) - CO nicht wie dort an unmittel- bar benachbarten Kohlenstoffatomen stehen, sondern daD sie durch ein konjugiertes System voneinander getrennt sind. Demzufolge sind die intensiv gelb gefarbten, alkalischen Losungen der Same oder, was infolge der groden Verseifungs- geschwindigkeit dasselbe ist, des Esters sehr starke Re- duktionsmittel; denn in ihnen wird man, wie auch aus der Absorptionskurve hervorgeht, zum uberwiegenden Teil die Enolform annehmen mussen. So werden Dichlorindophenol und Methylenblau sehr rasch entfarbt unter Bildung der Leukoverbindungen. Sauerstoff wird begierig absorbiert, wohingegen die sauren Losungen bestandig sind.

Die quantitative Untersuchung ergab, daD pro Mol Saure ein halbes Mol Sauerstoff aufgenommen wird, bzw. 1 Mol Methylenblau, bzw. 1 Mol Dichlorindophenol reduziert werden. Die Einwirkung von Jod fuhrt, auch schon in bi- carbonatalkalischer Losung, zur Abscheidung von Jodoform.

Der Versuch, das Oxydationsprodukt, die Dehydrodiketo- adipinsaure zu isolieren, scheiterte an deren Unbestandigkeit. Es konnte in der W a r b u r g-Apparatur gezeigt werden, daD kurze Zeit nach der Sauerstoffaufnahme in etwa l/lo n-Baryt- lauge eine betrachtliche Kohlensaureabspaltung eingetreten war. Die Farbe der LGsung geht dabei von Gelb iiber Orange ins Farblose uber. In Ubereinstimmung damit stehen die optischen Untersuchungen. Nach erfolgter Oxydation mit Sanerstoff in alkalischem Medium beobachtet man keine aus- gepragte Absorptionsbande mehr. Die oxydative Zerstorung durch Spuren von Sauerstoff diirfte die geringere Hohe der Absorptionsbande in alkalischer Losung unter Stickstoff vielleicht eher erklaren, als die Annahme einer teilweisen

Die Synthese der 1,4-Diketoadipinsaure usw. 245

Enolisation (vgl. Fig. 1). Auch die Oxydation des Esters mit Sanerstoff in absolntem Methanol rnit Natrinmmethylat als enolisierendem Agens fuhrte zn keinem krystallisierten Prodnkt.

Versuohe. Dars te l lung

von 1,4-Diketoadipinsaure-dimethylester. 700 mg (4,12. Mol). Cyclobnten-1, S-dicarbonsanre-

dimethylester wnrden in 20 ccm peroxydfreiem Ather ge- lbst. Dazn wnrden 8,24. Mol atherisches Wasserstoff- snperoxyd gegeben. Dasselbe war durch mehrstundige Atherextraktion von Perhydrol erhalten nnd mit Natrinm- sulfat getrocknet worden. Die Gehaltsbestimmnng erfolgte jodometrisch. Zn der Reaktionslbsnng wnrden dann 20 mg Osminmtetroxyd, gelbst in 5,O ccm Ather, zngefugt. Dieser Ansatz blieb 12-24 Stnnden bei Zimmertemperatnr ver- schlossen stehen. Nach dieser Zeit hatte sich ein schwarzer Niederschlag von Osminmsiinre gebildet. Er wnrde ab- filtriert nnd der Ather i. V. entfernt. Nach dem Trocknen des Ruckstandes im Vakunmexsiccator uber Atzkali nnd Schwefelsanre wnrde das dnnkelgrane bis schwarze Prodnkt mit Ather, dem etwas atherisches Wasserstoffsnperoxyd zn- gegeben war, dnrchgeknetet nnd abgesangt. Man erhillt den Diketoester dann fast farblos. Ans 10 derartigen An- siitzen wnrden 5 g Diketoadipinsaure-dimethylester erhalten, entsprechend 60 Proc. d. Th.

Nach 3-maligem Umkrystallisieren ans Aceton unter Znsatz von etwas atherischem Wasserstoffsnperoxyd znm Entfernen der hartnackig anhaftenden Spnren von Osmium- saure ist der Ester rein. Schmelzp. 98-100°, bei 164-165O ernentes Schmelzen. Mit Eisenchlorid in Dioxan gibt der Ester keine Farbreaktion.

C,H,,O, (202) Ber. C 47,53 H 4,95 Gef. C 47,22 H 5,02.

Bi8-2,4-din~trophenylhydrazon. Reiner Ester wurde in kaltem Wasser gelSst und mit einer gesgttigten Usung von 2,4-Dinitro-phenyl- hydrazin-chlorhydrat in 1 n-Salzs&ure versetzt. Die entstehende gelbe

4,156 mg Subst.: 7,195 mg CO,, 1,863 mg H,O.

17 *

246 Wil l e ,

FIillung wurde aus Eisessig umkrystallisiert. Kleine Nadeln. Schmelz- punkt 242-243 O (Zers.). Loslich in Natronlauge mit dunkelroter Farbe.

3,131 mg Subst.: 0,561 ccm N, (22O, 729 mm). C,,H,,N,O,, (562) Ber. N 19,89 Gef. N 19,92,

Bis-phenylhydrazom. Die wil6rige Losung des Esters wird mit einer Liisung von Phenylhydrazin-chlorhydrat in Wasser versetzt. Das ausfallende 0 1 wird nach einigem Stehen fest. Aus Dioxan-Methanol 2-ma1 umkrystallisiert. Prismen. Schmelzp. 143-145 0 *).

3,530 mg Subst.: 8,090 mg CO,, 1,915 mg H,O. C,oH,,N,O, (382) Ber. C 62,83 H 6,76 Gef. C 62,60 H 6,07.

1,4-Dioxymuconsaure-dimethylester. 500 mg roher Ketoester werden 11/, Stunden zwischen

120-140 O gehalten. Die Schmelze ist dann erstarrt. Kocht man sie mit absolutem Alkohol aus, so hinterbleiben Krystalle vom Schmelzp. 164 O. Nach 2-maligem Umkrystallisieren aus Dioxan Schmelzp. 169-170°. I n Wasser unloslich, in Natron- lauge mit gelber Farbe loslich. Die Losung reduziert Methylenblau. In Dioxan gelost, gibt diese Verbindung mit Eisenchloridlosung in Dioxan eine intensive rotbraune, violett- stichige Farbung. Mit wafiriger Eisenchloridlosung tritt diese Farbung nur sehr kurz auf, dann erfolgt Reduktion des Eisens. Jod wird in Dioxan nicht entfarbt, sofort aber, sobald man etwas Wasser zugibt.

Man erhalt die Saure auch, wenn man Ketoester in 2 n-Natriumcarbonat lost und rasch in verdiinnte Salzsaure gibt. Sie fallt aus der sauren Losung Bus. Nach dem Um- krystallisieren Schmelzp. 168-169 '. Der Mischschmelzpunkt der beiden Substanzen gab keine Depression.

3,878, 3,431 mg Subst.: 6,738, 6,970 mg CO,, 1,740, 1,57 mg H,O. C,H,,O, (202) Ber. C 47,53 H 4,95

Gef. ,, 47,38, 47,46 ,, 5,02, 5,12.

Ve r s e i f u n g de s I)i ke t o e s t e r s. 500 mg roher Diketoester wurden in 20 ccm Wasser

in der K a t e gelost. Dann lieB man aus der Burette titrierte

l) Dm von C, A. R. Kon U. E. L. N a n d i a. a. 0. besehriebene F'rodukt hat den Schmelzp. 130-131 O.

Die Synthese &r 1,4-.Dihtoadipinstiure usw. 247

Barytlauge zutropfen unter dauerndem Durchleiten von Stickstoff bis zur bleibenden Trubung (42,O ccm Ba(OH), 0,103 n).

Nach Zugabe der entsprechenden Menge "/,,-Schwefel- saure wurde vom Bariumsulfat abzentrifugiert und die farb- lose Losung i. V. bei 40° eingedampft. Dann iiber Atzkali und Schwefelsaure getrocknet. Hellgelber Ruckstand.

Durch Ausziehen mit wenig heibem, uber Natrium ge- reinigtem, Dioxan erhalt man die Ketostiure krystallisiert in groben, farblosen Platten. Nach 2-maligem Umkrystallisieren aus Diokan ist sie analysenrein. Sie ist in Aceton und Wasser sehr leicht loslich. Im Schmelzpunktsrohrchen gibt die Saure beim Erhitzen uber l l O o CO, ab unter Zerstauben. Bei 234 O trat vollstandige Zersetzung ein. Methylenblau und Jod werden in wallriger Losung nicht entfarbt. Eisen- chlorid gibt intensiv gelbe Farbe. Mit wenig Diazomethan erhalt man das Ausgangsmaterial vom Schmelzp. 98-100 O

zuruck. 4,380, 4,292 mg Subst.: 6,700, 6,495 mg CO,, 1,38, 1,37 mg H,O.

C,H606 (174) Ber. C 41,38 H 3,45 Gef. ,, 41,72, 41,27 ,, 3,53, 3,57.

Enolsaure. Der beim Ausziehen mit wenig heibem Dioxan erhaltene Riickstand wird in einer groberen Menge dieses Losungsmittels in der Hitze gelost und filtriert. Aus dem Filtrat krystallisiert die Enolsaure in farblosen Kry- stallen. Schmelzp. 226-227 O (Zers.). Sie farbt sich schwach- gelb an der Luft. In Wasser in der K a t e schwer loslich. Entfarbt in wabriger Suspension Jodlosung und Methylen- blau und reduziert Silbernitrat. Gibt ferner intensiv rot- braune Eisenchloridreaktion, die nicht bestandig ist. Lost man aber die Saure in heiDem Wasser, so ist die Reduktions- wirkung gegen Methylenblau und Jod verschwunden. Die Eisenchloridreaktion ist jetzt rein gelb wie bei der Keto- saure. Beim Eindampfen i. V. erhalt man nach dem Um- krystallisieren wieder Diketosaure, die sich wie oben be- schrieben beim Erhitzen verhalt.

cc&O6 (174) Ber. C 41,38 H 3,45 Gef. C 41,63 H 3,66. 3,878 mg Subst.: 5,920 mg CO,, 1,27 mg H,O.

WilEe,

177 mg Stiure wurden in warmem Wamer gelost. Dann im Va- kuumexsiccator eingedampft. Beim Ausdehen mit kaltem Wasser gingen 127 mg in Losung. Daa entspricht etwa dem Verhiiltnis 1 : 3 fiir Enol und Ketoshre.

Eine waDrige Losung der Diketosaure wurde mit einigen Tropfen Perhydrol versetzt. Sturmische Kohlendioxyd- entwicklung. Das uberschussige Waaserstoffsuperoxyd wurde rnit Palladium zerstort. Beim Einengen Krystalle vom Schmelzp. 181-184O. Mischschmelzpunkt rnit reiner Bern- steinsaure gab keine Depression.

BiS-lt4-dinitrophenylhydrazon der fiketosawre. Eine warige Lo- sung der Diketoallure wurde mit 2,4-Dinitrophenylhydrain, in 1 n-Sah- siiure geliist, versetzt. Gelbe Ftillung. Nach dem UmkrysWiieren aus Eisessig Schmelzp. 245O (Zew.). Das Hydrazon ist in 2 n-Natron- lauge mit roter Farbe loslich, schlecht loslich in Sodalosung.

4,341, 4,268 mg Subst.: 6,505, 6,400 mg CO,, 0,88, 1,04 mg H,O. -- 3,469 mg Subat.: 0,662 ccm N, (22q 714 mm). C,,H,,N,O,, (534) Ber. C 40,45 H 2,62 N 20,97

Gef. ,, 4037, 40,90 ,, 2,27, 2,73 ,, 20,61.

Dimethoxymuconsaure-dimethylester. Enolsaure wurde rnit iitherischem Diazomethan iiber-

gossen. Sturmische Stickstoffentwicklung. Nach Abdampfen des Athers hinterbleiben Nadeln. Umkrystallisiert aus Dioxan-Wasser. Schmelzp. 116 O.

3,960, 3,486 mg Subst.: 7,575, 6,690 mg CO,, 2,14, 1,95 mg H,O. C,,,H,,O, (230) Ber. C 52,27 H 6,09

Gef. ,, 52,17, 52,34 ,, 6,05, 6,22.

0,01558 g des obigen Esters wurden in 7,O ccm absolutem Methanol

Wasserstoffaufnahme 3,30 ccm (18O, 720 mm) nach 41/z Stunden. gelost und mit Palladium katalytisch hydriert.

Ber. fiir 2 Doppelbindungen 1,32. lo-' Mol. Gef. ,, 2 9 , i , 3 i . 10-4 ~ o i .

Dioxymuconsaure-dimethylester wurde in Dioxan rnit iitherischem Diazomethan im UberschuS versetzt. Nach dem Abdampfen des Lbsungsmittels verbleiben Nadeln. Aus Dioxan-Wasger umkrystallisiert Schmelzp. 115-116 O. Misch- schmelzpunkt rnit Dimethoxy-dimethylester vom Schmelz- punkt 116 O gab keine Depression. Diketoadipinsaureester

D&e Synthese der 1,4-Da7celoadipinsaure usw. 249

gab unter analogen VerhUtnissen mit Diazomethan Stickstoff- entwicklnng, aber keine krystallisierten Produkte.

1 - P h y l - 2 , S-pyrrol-dicarbonsaure. Diketoadipinsiiure wurde in Wasser gelost und mit wenig friach-

destilliertem Anilin versetzt. Nach einigem Stehen schieden sich Kry- stall6 ab. Aus Waaser umkrystallisiert sintern sie ab 220O. Zersetzung unacharf unter Gaaentwicklung bei 256-259O. Die Stiure gibf wie auch A. P i c t e t und A. S te inmann ' ) gefunden haben, keine Fichten- spanreaktion. Aber nach dem Zersetzen lieS sich daa Phenylpyrrol durch seine blauviolette F'ichtenspanreaktion nachweisen.

4,304, 4,278 mg Subet.: 9,445, 9,410 mg COP, 1,78, 1,78mg -0. - 3,579 mg Subet.: 0,190 ccm N, (19O, 718 mm). C,,H,O,N + 'Is H,O (240) Ber. C 60,O H 4,58 N 5,83

Gef. ,, 59,85, 59,99 ,, 4,83, 4,66 ,, 5,80. Mit Diazomethan erhiilt man den Dimethylester. Aus Dioxan-

4,154 mg Subst.: 9,920 mg CO,, 1,79 mg H,O. Wasser umkrystallisiert Schmelzp. l l O o .

C,,H,,O,N (259) Ber. C 64,86 H 5,02 Gef. C 65J3 H 4,82.

D i e B e s t i m m u n g d e r D i k e t o a d i p i n s i i u r e m i t 2 ,4-Dichlor indophenol Es wurde die Entfiirbung von 2,4-Dichlorindophenollosung, die

gegen Ascorbinsiiure eingestellt worden 'war, durch cine alkaliiche Losung von Diketoadipinsiiure im Stufenphotometer gemessen. Ver- wendeka Filter S 61. Die Messung geschah in der von H. J. P i s t o r ? beschriebenen Kiivette. Wiihrend des Entflirbens wurde reiner Stick- stoff durchgeleitet. Die Diketosiiure wurde in Form ihres Esters zu- gegeben.

1,0 ccm NaOH (2 n) + 6,O ccm Dichlorindophenolliisung + 8,O ccm W w e r + 0,5 ccm Diketoesterlosung entspr. 4,43 mg Dimethylester. Nach 10 Minuten war die Entfiirbung beendet.

Diketoeater angew.: 2,21. 10-e Mol Dichlorindophenol verbr.: 1,95, lo-'' Mol.

D i e q u a n t i t a t i v e CO, - B ea t im m u n g b e i d e r O x y d a t i o n m i t Cer i su l fa t .

Die Messung geschah bei 3 8 O in der Warburgapparatur. Ein- wage: 19,O mg Diketosiiure + 1,3 ccm '/,,-Natronlauge a d 10,O ccrn aufgefullt. Die GeffiBe enthielten 0,5 bzw. 0,3 ccm Diketoeiiurelosung und 4,5 bzw. 4,7 ccm Wasser, die Kipper: 3,O ccm ges. Cerisulfat- liiwng in 10 n-Schwefelsiiure. Die betriichtliche Volumenkontraktion

1) B. 36, 2529 (1902). 7 H. 246, 248 (1937).

W i l l e ,

beim Einkippen der stark schwefelsauren Liisung wurde in Kontroll- versuchen ermittelt und in Rechnung gestellt. Die eingesetzte Diketo- siiure wurde auf die fruher beschriebene Weise manometrisch bestimmt.

Diketoshre . . . . . . 0,35 und 0,21. lowB Mol CO, . . . . . . . . . 0,82 und 0,40. Mol.

D i e C0, -Entb indung b e i d e r A u t o x y d a t i o n d e r D i k e t o s i i u r e i n a l k a l i s c h e r Losung.

Die BarcroftgefiiSe enthielten je 2,5. W5, 1,67. u. 3,33. Mol reinen Diketoester gelost in 6,0 ccm Wasser. Die Kipper waren mit 1,” ccm gesiittigter und filtrierter Barytlauge + 0,3 ccm Waaser gefullt. Fh wurde zunachst die Sauerstoffaufnahme gemessen und dann die enktandene Kohlcnsaure dureh Einkippen von 0,4 ccm SalzsHure (2 n) + 0,6 ccm Wasser. Jeder Ansatz wurde doppelt ausgefiihrt. T = 38”. Eingcs. Diketosfiure in M 0 l . l 0 - ~ 2,5 2,5 1,67 1,67 3,33 3,33 Verbr. Diketosliure man. gem. . . 1,76 1,83 1,25 1,21 2,36 2,33 CO, entwickelt . . . . . . . . 1,31 1,33 0,73 1,03 1,67 1,64

0,74 0,73 0,58 0,85 0,71 0,72 CO, entw. Ketos. verbr. * ’ ’ ’ * ’ * * .

Die Zeit, in der der Ester der alkalischen Reaktion unter Sauer- stoff ausgesetzt war, betrug etwa 60Minuten. Aus den Versuchen ist ersichtlich, daS eine vollkommene Oxydation nicht stattgefunden hatte. Es lief3 sich dementsprechend durch Reduktion einer alkalischen Me- thylenblaulosung zeigen, daS nach dem Versuch noch nicht umgesetzte Diketoverbindung vorhanden war. Dies erklfirt sich dadurch, daf3 in barytalkalischer Losung die Diketosfiure ein schwerlosliches Ba-Salz bildet, so daf3 der Zutritt von Sauerstoff beschrtinkt ist. Fcrner zeigte sich die eingetretenc Zersetzung an der cntwickelten Kohlenslure.

II. Biologische Versache. Piir die biologischen Versuche erschien es nun wesent-

lich, eine quantitative Bestimmung der Diketo-adipinsaure zur Hand zu haben, die moglichst spezifisch ist. Als geeig- net hierzu erwies sich die Sauerstoffaufnahme in schwach alkalischer Losung. Xan beobachtet hier zunachst eine sehr rasche Absorption des Sauerstoffs, die nach 10-16 Minuten beendet ist und dam abklingt. Infolge der Sekundarreaktionen ist die aufgenommene Menge Sauerstoff etwas groDer als der theoretischen entspricht. Auf Grund von sehr zahlreichen Versuchen lieS sich aber erkennen, daO dieser Mehrbetrag unter den gewaNten Bedingungen konstant ist. Er betragt etwa 10 Proc. der aufgenommenen Sauerstoffmenge.

Die Synhse der 1,4-Diketoadipinsaure usw. 251

2' 125 4' 184 6' 208 8' 222

1 0' 232 1T 235+ 14' 235 16' 1 240 18' 238

Zur quantitativen Bestimmung wurde die Sauerstoffaufnahme nach Zukippen von 0,4 ccm 2 n-Natronlauge + 1,6 ccm WBsser in Abstiinden von 2 Minuten notiert. Die Messung geschah bei 38O in der W a r b u r g - -4pparatur. Aus der Tabelle IiiSt sich der Endpunkt leicht erkennen (angekreuzte Werte). Korrigiert man diese Sauerstoffwerte um 10 Proc. und bereehnet dann die Menge der Diketostiure unter der Voraussetzung, daB einem Mol Diketoslure ein hnlbes Mol Sauerstoff enbpricht, so e rha t man die eingewogene Stiure auf & 10 Proe. genau. Der Messung wurde eine wtiSrige Losung von reinem Diketoester vom Schmelzp. 98 bie looo zugrunde gelegt, die jedesmnl frisch bercitet wurde. Im folgenden ist eine typisehe Versuehsreihe wiedergegeben.

Die Barcroft-GeffiBe enthielten: 3,86; 3,86; 2,14; 5,36; 3,86 mg Ester gelost in 6,O cem Wasser. Die Kipper enthielten 0,4 ccm NaOH(2n) und 1,6 ecm Wasser.

Gemessene 0,-Aufnahme in ccm.

. l_l_______ ~ _ _ _ _ _ _ _ _ .- - -

134 81 180 196 117 1 263 215 127 283 228 134 307 238 145+ 1 322 241+ 142 325+ 238 142 322 241 241

I

5

137 199 218 222 245 233 237 241+ 241

.I_- -__

~~~

Eingewogen. . . 1,91 1,91 1,06 2,65 1,91 Wiedergefunden. I 1,89 1 1,94 1 1,17 1 2,61 1 1,94

In der naehfolgenden Tabelle sind einige in analoger Weise er- haltene Ergebnisse zusmmengestellt:

Eingewogen 2,14 2,14 2,37 2,37 2,37 1 1,97 1,97 I 2,19 Wiedergef. 1 2,15 1 2,08 1 2,28 1 2,23 1 2,19 1 1,93 1 1,79 I 2,11

1. Das Verhalten de r Diketo-adipinsaure i m t i e r i s chen Gewebe.

I n den letzten Jahren ist von H. Weil-Malherbel) , H. A. K r e b s und W. A. J o h n s o n z ) und K. A. C. E l l i o t t

I) Biochem. J. 81, 299, 2202 (1937). 3 a a. 0.

262 W i l l e ,

und M. E. Greig') der Nachweis gefiihrt worden, dafl iso- lierte Gewebe aerob und anaerob aus Brenztraubensaure Bernsteinsaure im bilden vermogen. Wenn es sich bei diesem fibergang in Bernsteinsaure um den Hauptabbauweg der Brenztraubensaure handelt und wenn die 1,kDiketo-adipin- sLure im Sinne der eingangs skizzierten Theorie von E.Toenniessen und E.Brinkmannhier das erstezwischen- produkt ist, so ware zu erwarten, dafl die betreffenden Ge- webe diese Saure mit einer dem Brenztraubensaureumsatz entsprechenden Qeschwindigkeit abzubanen vermbgen; sei es hydrolytisch oder im Sinne einer Dehydrierung, wie es K. A. C. Elliott und E. F. S c h r o e d e r 3 und H. Weil-Mal- h e r b e s, in Betracht gezogen.

Um diese Frage zu entscheiden, wurden die folgenden Versuche mit Rattenniere, Rattenleber und Taubenbrust- muskel angestellt.

Die ffir die Versuche benotigte Diketosiiure war aus Dioxan um- krystallisiert worden, und die verwendete Liisung wurde fiir jeden Ver- such frisch hergestellt durch Aufloeen einer eingewogenen Menge Siiure in 0,9 proc. Kochsalzlosung. Dann wurden 60 Roc. der zur Neutrali- sation notwendigen n/,o-Lauge zugegeben. Die Losung war noch echwach sauer. Es war wegen der Empfindlichkeit der S(iure gegen Saueretofi' im Alkalischen rataam, diese geringe Aciditlit durch den Phosphatpder zu neutralisieren. Aue diesem Grunde auch wurde die Diketosfbe nicht durch Einwage, sondern durch die Sauersto5aufnahme in der vorhin be- schriebenen Weise im LeeNersuCh gemessen. In den Versuchen war die DiketosLure etwa 3 . molar und der Phoaphatpder PH 7,4 etwa %lo-* molar. Als biologisches Material wurden Rattennierenschnitte und Rattenleberschnitte verwendet, die aus frischgetoteten Tieren auf die iibliche Weise hergestellt worden waren. Fiir den Versuch mit Taubenbrustmuskel wurde dieeer in der Fleiechmaschine zerkleinert. Die Gewebemengen wurden eingewogen. Dae Trockengewicht bezieht sich auf dae Gewebe am Anfang des Versuchs. Die Versuche wurden bei 38O in der Barcroft-Warburg-Apparatur ausgefiihrt. Jeder Ver- such wurde doppelt angesetzt, und zwar nebeneinander : Diketoeiiure allein, Gewebe allein und Diketoahre + Gewebe. Nsch Beendigung wurde durch Einkippen von 0,3 ccm Natronlauge (2 n) und 1,7 ccm Wasser abgeetoppt und durch die einsetzende Sauerstoffaufnahme die

I) Biochem. J. 31, 1021, (1937). 9 Biochem. J. 28, 1920 (1934). 7 Biochem. J. 30, 665 (1935).

Die Synthse der 1,4-Dahtoadipinsaure usw.

Diketosaure gemessen. Die Sauerstoffaufnahme des Gewebes in dem alkalischen Medium wurde fiir die Diketosaurebestimmung in Abzug gebracht. Im folgenden sei ein typischer Versuch beschrieben.

a) Umsatz von Diketo-adipimaure mit Rattennkenschnitten. (aerob.)

21,6 mg Diketosaure in 0,g-proc. NaCl geliist mit 1,5 ccm n/,,-NaOH versetzt und mit physiologischer Kochsalzliisung auf 10,O ccm auf- gefiillt.

253

GefilSe 1 2 3 4 5 6

Nach 138'. . 978 10oO 8 10oO 7 900 Nach 297'. . 1 1480 1 1630 1 17 1 1670 I 18 I 1456

Nach 297 Minuten wurden zur Bestimmung der noch vorhandenen Ketostiure, 0,3 ccm 3 n-Natronlauge + 1,7 ccm Waseer in jedes Gef@ gekippt und die Sauerstoffaufnahme in Absthden von je 2 Minuten gemessen (Angabe in cmm 0,).

ccm Phospha uffer PH 7,4 (2,6815 mol.)

Diketosiiureliisung. . - - . . 1 0,O-proc. Kochsalzliisung .

8' 36 107 213 lo'

14'

I I 1,l 1,l 1,l 1,l 1,l 1,l - 2,o 2,o 2,o 2,o - 4,9 2,9 2,9 2,9 2,9 4,9

- I _ 50 113 71 168 85 194

106 204 117 218

mg Niere Trockengew. . 11 60 60 I -

6 -__ ____.

- 19 15 26 26 38" 50 42

60 1 - 60

Daraus ergibt sich: Eingesetzte Diketoahre in Mol. 1,92 1,89 Wiedergef. ,, 0,80 476 Umges. 1,12 im Mittel

In der nachstehenden Tabelle sind die Ergebnisse weiterer Versuche zusammengestellt.

-

Nie

re a

llein

. .

..

..

..

..

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iket

osiiu

re a

llein

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I Niere f D

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..

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re .

..

..

..

..

Mitt

el

47

46

1070

10

70

272'

.365

14

60

33

-430

15

30

275' 70

47

40

-

193

111

127

-

-

l,55

0,55

0,

67

0,94

-

-

-

-

20'

150

165

2,05

1,

84

0,96

5 1,

09 I

248

272

1,94

2,

07

1,58

1,

76

0,99

0,

33

-

..

..

..

..

..

..

38

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Dike

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882

1178

1288

*)

0

1475

294'

101

34

-

267

260

147

-

*.

2,14

2,

09

5 0,

91 -

131

Die Synthese der 1,i-Diketoadipinsauiure usw. 255

Leber allein . . . . 364 320 0,-Aufnahme . . Diketosiiure allein . 28 20

DiketosZiure + Leber 270 360 . . . . . . . . . . . . 250' Versuchsdaner

mg Leber Trgwt. . . . . . . . . . . . 72

{

{ Leber dlein . . . . 46 58 Diketosiiure allein . 262 257

Zugabe va Diketoshre + Leber 210 216 Einges. Diketosaure . . . . . . . . . 2,12 2,07 Wiedergef. Diketosiiure . . . . . . . . 1,27 1,32 Umges. Diketosaure . . . . . . . . . 0,80

cmm 0, nach

- - -- -

- -

288' 72

30 35 293 300 234 258

2,35 2,41 1,62 1,82

0,66

256 WilZe,

Rattenniere anaerob . . 1 ~

Rattenleber aerob . . . ' I

C. Umsatz von 1,4-Dikeloadipinsaure mit Taubenmuskel unter 0,.

Versuchsdauer 123 Minuten. Angew. Muskel 75 mg (trocken). Muskel allein . . 435 400

Diketos. + Muskel 321 315 Muskel allein . . 14 22

cmm 0, nach Zugabe v. Alkali Diketos. allein . . 298 303 227

Einges. Diketosiiure . . . . . . . . . . . . . . . 2,39 2,42 Wiedergef. Diketosiiurc . . . . . . . . . . . . . . 1,76 1,67

0,-Aufnahme . . . . . . . . Diketos. allein . . 21 19

{ Diketos. + Muskel 237

Umges. Diketosiiure . . . . . . . . . . . . . . . 0,69

I m folgenden sind die Ergebnisse zusammengefabt. Die nachfolgende Tabelle enthat die Umsatze von Diketoadipin- saure in Mol pro mg Gewebe und pro Stunde. Daneben finden sich die entsprechenden Umsiltze von Brenztrauben- saure, wie sie die betreffenden Autoren angeben.

Tab e l l e.

0,0333.10-6 0,361.10-6 1 Krebs 0,0383. 0,294. 1 u. MiliSb.') 0,0276.10-6 0,39 0,0191.10-8 0,428.10-8 i u. Mitarb.')

. - - - - -

Rattenniere aerob . . . I 0,0377.10-8 1,04 1 0,0293. loh8

' 0,0413. 1,16 . 0,180 1,25 0,0245. 1 u. Mitarb.2)

Taubenbrustmuskel aerob , 0,0447. 1

Es ist aus diesen Zahlen ersichtlich, da13 in allen unter- suchten Organen ein Verbrauch von Diketoadipinsilnre statt- findet. Diese Abnahme ist aber anaerob und aerob etwa gleich grob bei den verschiedenen Geweben und steht zu

I) a. a. 0. K.A. C. El l iot t , M.P. Benoy u. Z. Baker, Biochem. J. 29,

1937 (1935).

Die Synthe der la&Diketoadipimaure usw. 257

deren Abbauvermbgen fur Brenztraubensaure in keinem Verhiiltnis.

Betrachtet man die Umsatze fur Niere, so liegen diese aerob zwischen 0,0245. lo-" und 0,180.10-6 Mol, wenn man diesen letzten ausfallenden Wert als reel1 ansieht. Da 1 Mol Diketosaure &us 2 Mol Brenztraubensaure hypothetisch ent- stehen kann, so berechnet sich aus obigem ein Brenztrauben- saureumsatz von 0,049. lo-" bis 0,36. lo-". Demgegenuber steht ein experimentell gefundener Umsatz von Brenztrauben- saure von 1,04 bis 1,25.10-" Mol.

Bei Rattenleber liegen die Verhiiltnisse ahnlich. Dasselbe gilt fur die anaeroben Versuche mit Niere.

Unter der Annahme der Diketoadipinsaure als Zwischen- produkt beim biologischen Abbau von Brenztraubensaure lassen sich demnach nur maximal 30 Proc. (in den meisten FWen vie1 weniger) des experimentell gefundenen Brenz- traubensaureumsatzes erklaren. Es erscheint deshalb wenig wahrscheinlich, dab die 1,4-Diketoadipinsaure eine bedeutende Rolle im Brenztraubensaurestoffwechsel spielt. Die An- nahme, dab der Diketosaure im status nascendi eine er- hohte ReaktionsfAhigkeit zukommt, ist allerdings nicht aus- zuschlieben. Auch ware damit zu rechnen, dafi sie unter den Konzentrationsbedingungen der Versuche eine Hemmung des Enzymsystems hervorruft. Die Berucksichtigung solcher MBglichkeiten liegt um so naher, als Beziehungen der Diketo- adipinsaure zum Ornithin und Pyrrolidin auf Grund der neueren Ergebnisse iiber die Umaminierung von Ketosauren deutlich hervortreten.

2. Versuche mit Hefe. Zunachst wurde die Frage untersucht, ob die Diketo-

saure durch Hefe aerob abgebaut werden kann. Verwendung fand etwa 17 Stunden unter Sauerstoff vorgeschuttelte, so- genannte verarmte Lowenbrauhefe.

Die BarcroftgeftiBe enthielten: 2,O ccm Hefesuspension = 36 mg 'I'rockengewichthefe, 1,0 cem Phosphatpuffer pa 7,4 (2,65/15 molar), 2,0 ccm Wasser bzw. 2,O ccm Diketoadipinstiureloisung (wie iiblich neu- tralisiert). T = 309

258 Wil le ,

Hefe allein . . . . . . . 419 375 cmm 0, nach 160' . . Diketosaure allein . . . . 22 -

Hefe + Diketosaure . . . 439 - Hefe allein . . . . . . . 35 36 Diketosaure allein . . . . 255 240 Hefe + Diketosame 215 -

cmm 0, nach Zugabe v. Alkali . . . Einges. Diketosaure . . . . . . . . . . . . . . . 2,05 1,93 Wiedergef. Diketosaure . . . . . . . . . . . . . . 1,45 - Umges. Diketosaure . . . . . . . . . . . . . . . 0,54

Der Verbrauch an Diketosaure mit Bierhefe ist 0,056.10-6 Mol pro mg und Stunde, d. h. von derselben Grodenordnung wie fur tierisches Gewebe.

Wahrend nun intakte Hefe fur carboxylatische Versuche kein geeignetes Material darstellt, erhSilt man nach I?. Lynen') durch Frieren der Hefe mit fliissiger Luft ein Enzym- praparat, das Brenztraubensaure sehr gut zu decarboxylieren vermag. Derartige gefrorene und wieder aufgetaute Hefe wurde fur die folgenden Versuche benutzt.

Unter Stickstoff. Suspension aus 1,995 g Hefe + 10,O ccm Wasser. DiketosSlurelGsung: 24,O mg Diketosaure + 5,O ccm Phosphat + 1,66 ccm "/,,-Natronlauge auf 10,O ccm mit Wasser aufgefiillt. Inhalt der Bar- croftgefaBe 4,O ccm, davon 2,O ccm Saurelosung + 2 ccm Wasser bzw. Hefesuspension. Dauer des Versuchs 82 Minuten. Es wurde keine C0,-Entwicklung beobachtet.

Hefe allein . . . . . . . 46 41 Diketosame allein . . . . 287 273 cmm 0,

nach Zugabe v' Hefe + Diketosthe . . . 163 141 Einges. Diketosaure . . . . . . . . . . . . . . . 2,29 2,20

Umges. Diketoslure 194 Wiedergef. Diketoslure . . . . . . . . . . . . . . 0,94 0,76

Umsatz d. Diketosaure unter Stickstoff in Mol 1 . . . . . . . . . . . . 0,153

. . . . . . . . . . . . . . .

pro mg Trgwt. u. pro Std. I Die erhaltenen Ergebnisse lassen erkennen, daD dem

GefrierprozeB unterworfene, verarmte Hefe die Diketosaure bedeutend schneller umzusetzen vermag als die intakte Hefe und tierisches Gewebe. Aber dieser Verbrauch ist hier

l) F. Lynen, A. im Druck.

Die Synthese der 1,4-Diketoadipinsaure usw. 259

nicht rnit einer aquivalenten Kohlensaureentwicklung ver- bunden, was noch durch weitere Versuche belegt wird. Ein Abbau durch Carboxylase ist deshalb ausgeschlossen.

Dagegen entsteht dabei eine betrachtliche Menge von Saure, wie es aus folgendem Versuch rnit Natriumbicarbonat hervorgeht.

Suspension aus 2,105 g gefrorener, verarmter Hefe + 10,O ccrn Wasser. Diketosaurelosung: 23,s mg Diketosaure + 1,64 ccrn Natron- lauge n/10 auf 10,O ccrn mit Wasser aufgefiillt. Die BarcroftgefaBe enthielten je 0,s ccm Natriumbicarbonatlosung (1,3-proc.) + 2,O ccrn Hefe- suspension bzw. 2,O ccrn Hefesuspension + 2,O ccrn Diketosaurelosung bzw. 2,O ccm Diketosaurelosung und auSerdem Wasser. Gesamtvolumen 5,0 ccm. Die GefaBe wurden mit Stickstoff, dem 5 Proc. Kohlensiiure beigemischt war, gefiillt. Dauer 140 Minuten.

Einges, Diketosaure . . . . . . . . . . . . . . . 2,38 2,21 Wiedergef. Diketosaure . . . . . . . . . . . . . . 0,48 0,67 Umges. Diketosiiure . . . . . . . . . . . . . . . . 1,71

G O , . Hefesuspension allein . . . . . 0,616 0,538 . . . . . { Hefesuspension mit Diketosaure 1,61 1,53

Eine M6glichkeit, diese Saurebildung zu erklaren, ware die hydrolytische Spaltung der Diketoadipinsaure unter Bil- dung von Ameisensaure. Bei einem groderen Versuch lieO sieh aber nur eine geringe Menge fliichtiger Saure nach- weisen, die die fur Ameisensaure charakteristische Reaktion, die Reduktion von Sublimat, nicht zeigte.

Mol) Diketosaure + 30 ccrn Phosphatpuffer pa 7,4 2,6/15 molar + 13,s ccm NaOH n/10 + 76 ccm Wasser + 3,011 g ver- armte, gefrorene Hefe wurden unter Stickstoff 16l/, Stunden bei 23O geschiittelt. Nach dem Zentrifugieren angesauert und destilliert. Das Destillat verbrauchte 0,128. aquivalente Natronlauge. Die Diketo- s h r e war nicht vollstandig umgesetzt, wie sich durch das noch vor- handene ReduktionsvermGgen der alkalischen Losung gegeniiber Me- thylenblau aneeigte.

200 mg (- 1.

Es hat sich gezeigt, daO bei Zusatz von Hefekochsaft - aus vorher eingefrorener Hefe gewonnen - der Umsatz der Diketoadipinsaure durch gefrorene Hefe betrachtlich gesteigert wird. Dies wird durch die nachstehenden Ver- snche belegt. Ob man dabei in der Gasphase Stickstoff oder Sauerstoff hat, macht keinen Unterschied.

Annalen der Chemie. 688. Band. 18

260 Wi 1 l e , Die Synthese der l,4-Diketoadi.pinsaureiure.

Suspension aus 2,010 g Hefe + 10,O ccm Kochsaft. Diketosaure- liisung: 32,6 mg Diketosaure + 2,24 ccm NaOH n/10 + 5,O ccm Puffer PH 7,4 auf 10,O ccm aufgefullt mit Wasser. Die GefaBe waren in der gleichen Weise beschickt wie bei dem Versuch auf S. 258 und mit Stickstoff gefiillt. Nach 90 Minuten wurde abgebrochen durch Ein- kippen von 0,3 ccm 2 n-Schwefelsiiure + 1,7 ccm Wasser zur Bestimmung der gebundenen Kohlenshre. Dann wurde Sauerstoff durchgeleitet und nach Zugabe von 0,68 ccm 2 n-Natronlauge + 1,72 ccm Waaser die Diketosaure bestimmt.

freie CO, geb. CO, ges. CO, Hefe allein, . . . 4 22 26 Diketosaure allein . 10 12 32 Hefe +Diketosaure 56 35 17 23 73 58 Hefe allein. . . . 82 Diketoahre allein . 361 344 Hefe + Diketosaure 80 88

cmm 0, nach Zugabe v. Alkali

Umgesetzte Diketosaure: 2,90. lov5, 2,76. in Mol/ mg.Stde. = 2,82.10-6 ').

Die Diketostiure ist also vollstandig verbraucht. Nach welcher Zeit das Ende der Reaktion erreicht war, wurde nicht festgestellt. Ein zweiter, ganz gleichartiger Versuch fiihrte zu demselben Ergebnis, ebenso ein Ansatz unter Sauer- stoff. Die Entscheidung darnber, ob diese starke Steigerung des Umsatzes der Diketoadipinsaure durch den Co-Enzym- gehalt des Kochsaftes oder durch andere Inhaltsstoffe bedingt ist, wird sich erst aus weiteren Versnchen ergeben.

Der Koenigs-Baeyer-St i f tung danke ich fiir die Bewilligung von Mitteln zur Ausfuhrung der Arbeit.

l) Dabei ist das "rockengewicht zu 20 Proc. der feuchten Hefe angenommen.