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UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA!Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias!!
Departamento de Biología Celular y Molecular !!Laboratorio de Desarrollo y Regeneración Neural!!! !
! !! !“DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES DE
TEJIDO ADIPOSO DE RATA ADULTA HACIA FENOTIPO SCHWANN-LIKE in vitro” !!
TESIS DE LICENCIATURA!!!María Elena Zúñiga Anguiano !!!
DIRECTOR DE TESIS !Dra. en C. Nidia Jannette Carrillo González !!!
ASESOR!Dra. en C. Graciela Gudiño Cabrera!!!!
Las Agujas Zapopan, Jalisco Noviembre 2015!
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Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Desarrollo y Regeneración del Sistema Nervioso que pertenece al Departamento de Biología Celular y Molecular del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Guadalajara, bajo la dirección de la Dra en C. Nidia Jannette Carrillo González y la asesoría de la Dra. en C. Graciela Gudiño Cabrera.!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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DEDICATORIA!
!!
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AGRADECIMIENTOS !!
A mi Directora de tesis la Dra. Nidia Carrillo González, por ser la primera persona en mostrarme las células en microscopio, por su entrega en la realización de nuestro trabajo y quien
sin ella la realización de la presente no sería posible. !!A la Dra. Graciela Gudiño Cabrera por aceptarme en su laboratorio y apoyo. !
A la Dra. Marcela Rodríguez por siempre confiar en mi.!A la profesora Gabriela Escobar, por sus enseñanzas en cultivo, por su apoyo y cariño. !!
A mi sinodal el Dr. Arturo Orozco por sus revisiones, por su cariño y amistad. !A mi sinodal la Dra. Anne Santerre por su dedicación en la presente y valiosos consejos.!
A mi sinodal el Dr. Jorge Peregrina por sus revisiones y tiempo. !!A mis padres, Guillermo Zúñiga y Susana Anguiano por todo su amor, por su apoyo, no hay
tantas hojas para agradecerles tanto, a mis hermanos Susana, Pablo, Alejandro a quienes amo, por todo lo que hemos vivido juntos y por ser mis personas favoritas en el mundo. !!
A mis Jefes de Laboratorio: !La Dra. Nadia Torres por enseñarme a tomar decisiones de laboratorio por su cariño y
confianza que siempre tuvo en mí. !A la Dra. Lilia Nuño a quien admiro, quien me ha hecho crecer como bióloga por sus
consejos y aportaciones. !Al M. en C. Fernando Ulloa por hacerme crecer profesionalmente (me multiplicas), por su
amistad y razones innumerables. !!A mis amigos Ceyma, Antonio, Ale, Stefanie y Pedro, por su cariño, los quiero. !!
A mis abuelas por sus enseñanzas Glafira Velasco y Elena Álvarez.!!A mi amor M. en C. Isidro Zapata Hernández quien me ha apoyado desde que lo conozco,
por su amor, por inspirarme, por ser como es. Amor te dedico la estrofa siguiente que describe lo que siento ti.!!
“Por que se que te amo y sólo quiero devolver un poco de lo que me has dado. Tu, con tu ternura y tu luz iluminaste mi corazón, quien me da vida eres tu, no han nadie más sólo tu que
pueda darme la inspiración, sólo escuchando tu voz”.!Sólo tu de Carlos Rivera!!
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ÍNDICE !
ÍNDICE DE FIGURAS 9
ÍNDICE DE TABLAS 10
ABREVIATURAS 11
RESUMEN 13
1. INTRODUCCIÓN 14
1.1 Células de Schwann! 14!
1.2 Las células Schwann-like ! 14!
1.3 La glía envolvente del bulbo olfatorio ! 15!
1.3.1 Localización de la glía envolvente! 16!
1.3.2 Descubrimiento de la glía envolvente! 16!
1.3.3 Factores que influyen en la prolongación de los axones de neuronas receptoras olfatorias! 17!
1.3.4 Marcadores de la glía envolvente! 18!
1.3.5 Uso de la glía envolvente en modelos de lesión del SNC! 19!
1.3.6 Obtención de la glía envolvente! 20!
1.4 Terapia Celular ! 21!
1.5 Diferenciación celular! 22!
1.5.1 Potencialidad celular! 23!
1.6 Características de las células troncales ! 23!
1.6.1 Células troncales de adulto! 24!
1.7 Células troncales mesenquimales ! 26!
1.7.1 Capacidad imunoduladora de las células troncales mesenquimales! 27!
1.7.2 Pluripontecialidad de las células troncales mesenquimales ! 28!
1.7.3 Células troncales mesenquimales derivadas del tejido adiposo ! 29!
1.8 La fracción vascular estromal del tejido adiposo ! 32!
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 34
3. HIPÓTESIS 35
4. OBJETIVO GENERAL 35
5. OBJETIVOS PARTICULARES 35
6.1 Diagrama experimental ! 36!
6.2 Cultivos primarios ! 37!
6.2.1 Medio basal de cultivo celular ! 37!
6.3 Cultivo de glía envolvente! 37!
6.3.1 Inmunopurificación magnética! 38!
6.3.2 Recolección de medio condicionado de la glía envolvente ! 39!
6.4 Cultivo de células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo ! 39!
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6.4.1 Criopreservación celular! 41!
6.4.2 Conteo celular ! 42!
6.4.3 Diferenciación de las células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo! 42!
6.4.4 Inmunocitoquímica ! 43!
7. RESULTADOS 44
7.1 Cultivo de glía envolvente! 44!
7.1.1 Inmunopurificación magnética ! 44!
7.2 Cultivo de células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo ! 45!
7.2.1 Criopreservación celular! 46!
7.2.2 Diferenciación de las células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo! 46!
7.2.3 Análisis inmunocitoquímico ! 47!
7.2.3.1 Expresión de GFAP ! 50!
7.2.3.2 Expresión de p75! 51!
7.2.4.Caracterización morfológica de la diferenciación de las CTM-TA hacia fenotipo Schwann-like ! 51!
8. DISCUSIÓN 52
8.1 Cultivo de glía envolvente! 52!
8.1.1 Inmunopurificación magnética ! 52!
8.2 Morfología CTM-TA en estado indiferenciado! 53!
8.3 Proliferación de las CTM-TA en estado indiferenciado ! 53!
8.4 Análisis morfológico de las CTM-TA en estado indiferenciado! 53!
8.5 Diferenciación de las CTM-TA hacia fenotipo Schwann-like! 54!
8.6 Células de grupo control B27! 54!
8.7 Caracterización inmunocitoquímica de la diferenciación de las CTM-TA hacia fenotipo Schwann-like ! 55!
8.7.1 Expresión de vimentina! 55!
8.7.2 Expresión de GFAP! 56!
8.7.3 Expresión de p75! 57!
8.7.4 Expresión de NG2! 57!
9. CONCLUSIONES 59
10. PERSPECTIVAS 60
11. LITERATURA CITADA 61
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ÍNDICE DE FIGURAS
!!!!!!!!!!!!!!!!!
�9
Figura 1. Descripción de la glía olfatoria en humanos…………………………………….15!
Figura 2. Organización anatómica del bulbo olfatorio…………………………………….16!
Figura 3. Capacidad pluripotencial de CTM………………………………………………..28!
Figura 4. Esquema de la composición del tejido adiposo………………………………….33!
Figura 5. Metodología del cultivo de CTM-TA……………………………………………..40!
Figura 6. Técnica de obtención de las CTM-TA…………………………………………….41!
Figura 7. Células de GE de BO de rata a los 6 DIV…………………………………………44!
Figura 8. Confluencia celular de las CTM-TA in vitro……………………………..……….45!
Figura 9. CTM-TA de la zona inguinal de rata con tratamiento NH in vitro…………….47!
Figura 10. CTM-TA de la zona inguinal de rata con tratamiento DF10S in vitro………..48!
Figura 11. Expresión de GFAP de las CTM-TA de la zona inguinal de rata……………..50!
Figura 12. Expresión de p75 de las CTM-TA de la zona inguinal de rata………………..51 !
Figura 13. La GE purificada con perlas magnéticas positivas para p75…………………52!
!
ÍNDICE DE TABLAS
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Tabla 1. Cuadro comparativo de las células troncales..………………………………………………….. 25!
Tabla 2. Comparación de las células troncales de diversas fuentes……………………………………..32!
Tabla 3. Medios de cultivo utilizados………………………………………………………………………37!
Tabla 4. Diferenciación de las CTM-TA…………………………………………………………………… 42!
Tabla 5. Anticuerpos primarios y secundarios…………………………………………………………….43!
Tabla 6. Anticuerpos expresados por las CTM-TA tratadas en cultivo con NH………………………. 49!
Tabla 7. Anticuerpos expresados por las CTM-TA tratadas en cultivo con DF10S…………………… 49!
ABREVIATURAS
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BDNF !BO B27
Ca+2 CCG
CD CEP CFN
CG CIP cm2
CNTF CO2
CTM CTM-CU !
CTM-MO !CTM-TA !
DB DF
DF10S !DIV
DMEM !EDTA
Fig. FVE
g g
GDNF !GE
GFAP !!!!!
Factor neurotrófico derivado del cerebro (Brain-derived
neurotrophic factor) !Bulbo olfatorio !Medio definido DMEM suplementado con B27!Ión de calcio!Capa de células granulares!Antígenos de diferenciación (Cluster of differentiation) !Capa externa plexiforme!Capa de fibras nerviosas !Capa glomerular !Capa interna plexiforme !Centímetro cuadrado !Factor neurotrófico ciliar (Ciliary neurotrophic factor)!
Dióxido de carbono!Células troncales mesenquimales!Células troncales mesenquimales derivadas de cordón umbilical !Células troncales mesenquimales derivadas de médula ósea!Células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo !Dynabeads!Medio de base DMEM/DMEM-F12!Medio definido DMEM adicionado con 10% de Suero fetal bovino!Días in vitro !Modificación por Dulbecco del medio de cultivo Eagle (Dulbecco´s modified Eagle medium) !Ácido etildiaminotetraacético!Figura!Fracción vascular estromal!Fuerza gravitacional !Gramos!Factor neurotrófico derivado de células gliales (Glial
cell-derived neurotrophic factor)!Glía envolvente!Proteína glial fibrilar ácida (Glial fibrillary acidic protein)!!!
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h HLA IgG IgM
Mg+2
µg µm mg
MHC !min
ml m
NFG NG2 NH NK
PBS !PLL p75 rev.
rb SFB
SN SNC SNP sem.
VEFG !VIM !!!!!!
Horas!Histocompatibilidad leucocitario humano!Inmunoglobulina G!Inmunoglobulina M !Magnesio !Microgramo!Micrómetro!Miligramos!Complejo mayor de histocompatibilidad (Major
Histocompatibility Complex)!Minutos !Mililitros!Mouse!Factor de crecimiento nervioso (Nerve growth factor)!Proteoglicano condroitin sulfato!Medio de cultivo para células no hematopoyéticas!Asesino natural (Natural Killer)!
Solución amortiguadora de fosfatos (Phosphate-Buffered
Saline)!
Poli-L-lisina!Receptor de baja afinidad para neurotrofinas !Revisado!Rabbit!Suero fetal bovino!Sistema nervioso!Sistema nervioso central !Sistema nervioso periférico !Semanas!Factor de crecimiento endotelial vascular (Vascular
endotelial growth factor)!Vimentina!!!!!!!!
RESUMEN
La glía envolvente (GE), es un tipo de célula glial encargada de envolver los axones de las
neuronas olfatorias que se extienden desde la mucosa olfatoria del Sistema Nervioso
Periférico (SNP), hasta el bulbo olfatorio en el Sistema Nervioso Central (SNC). Estas células
tienen características parecidas a las células de Schawnn del SNP y por sus características
promotoras de regeneración en el SNC se han utilizado con resultados favorables en modelos
de lesión, principalmente en lesiones de médula espinal. El aislamiento de GE en humanos se
dificulta al obtener muy poca cantidad, además de no ser una extracción pura, por lo que se
han buscado fuentes alternas de células con este fenotipo. Las células troncales
mesenquimales derivadas de tejido adiposo (CTM-TA) tienen la capacidad de diferenciarse
hacia linaje neural bajo estímulos adecuados. En el presente trabajo se aislaron las CTM-TA de
la zona inguinal de rata adulta, las cuales se mantuvieron en proliferación en dos tratamientos
distintos: medio de cultivo para células no hematopoyéticas (NH) y medio de cultivo
suplementado con suero fetal bovino al 10% (DF10S), posteriormente se estimularon para su
diferenciación hacia el fenotipo de GE también conocido como Schwann-like.!
Con base en los resultados, se concluye que tanto el medio NH, como el medio DF10S son
adecuados para mantener a las CTM-TA proliferando y en estado indiferenciado y que
además son capaces mostrar morfología fenotipo Schwann-like al estar en contacto con el
medio condicionado por la GE.!
!!!!!!!!!!!!!!
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1. INTRODUCCIÓN
El sistema nervioso (SN), compuesto por neuronas y células gliales, se encarga de integrar el
funcionamiento de los componentes de un organismo, así como de coordinar y controlar sus
interacciones con el medio.!
El SN se divide en dos partes principales: SNC, que se compone de encéfalo y la médula
espinal, y el SNP que consta de los nervios craneales, espinales y sus ganglios asociados
(Snell, 2003).!
El SNC y el SNP presentan diferencias a nivel celular; mientras que la glía del SNC está
compuesta por astrocitos, oligodendrocitos, microglía (Haines, 2003) y células de aldainoglía
o Schwann-like (Gudiño-Cabrera y Nieto-Sampedro, 1999); el SNP presenta células de
Schwann (rev. Haines, 2003; López y Hurtado, 1993). No obstante, por el conjunto de
marcadores inmunológicos, propiedades de proliferación, promoción de crecimiento axonal y
su interacción con las neuronas, las Schwann-like presentan mayor similitud con las células de
Schwann (Nieto-Sampedro et al., 2002) de ahí su nombre.!
!1.1 Células de Schwann Las células de Schwann, descritas desde 1839 por Theodor Schwann constituyen la glía del
SNP, estas células cumplen múltiples funciones relacionadas con la protección y el soporte
metabólico axonal produciendo la vaina de mielina alrededor de estos axones, para los
procesos de neuroconducción (conducción nerviosa). Además participan en los procesos de
regeneración en lesiones del SNP, donde inician la autoproliferación para producir una guía
de regeneración del nervio periférico lesionado (López y Hurtado, 1993). Sin embargo existe
una célula llamada glía envolvente que presenta características fenotípicas y fisiológicas
parecidas a estas células de Schwann (Fairless y Barnett, 2005) conocidas como Schwann-like.!
!1.2 Las células Schwann-like Las células Schwann-like también conocidas como células de aldainoglía (del griego: aldainos
“hacer crecer”) son un grupo de células que incluye a la GE del bulbo olfatorio (BO), tanicitos
del hipotálamo, pituicitos de la pituitaria, glía de Müller, glía pineal y glía de Bergmann,
entre otras (Gudiño-Cabrera y Nieto-Sampedro, 1999), que se caracterizan por mostrar un
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fenotipo promotor del crecimiento y son similares a las células de Schwann; co-expresan
GFAP, p75, VIM, O4, receptor de estrógenos tipo α y S100 (Gudiño-Cabrera y Nieto-
Sampedro 1996; Nieto-Sampedro et al., 2002; Kocsis et al., 2009).!
!1.3 La glía envolvente del bulbo olfatorio La GE se deriva de células precursoras que residen en el epitelio olfatorio y durante el
desarrollo, migran del epitelio olfatorio y extienden sus prolongaciones que envuelven a los
axones de las neuronas olfatorias (Fig. 1), tal proceso es constante, ya que estas neuronas se
producen y se reemplazan continuamente a lo largo de la vida adulta (Mackay-Sim, 2004;
Fairless y Barnett, 2005; Romo et al., 2005; Gómez et al., 2007; Barraud et al., 2010). Estas
neuronas cruzan la placa cribosa que divide al SNP del SNC, para llegar al BO, donde
establecen sinapsis funcionales con las neuronas centrales en el glomérulo olfatorio (Gómez
et al., 2007; Barraud et al., 2010). !
La GE rodea los paquetes de axones recién formados de las neuronas receptoras olfatorias en
la parte periférica del epitelio olfatorio para proporcionar la guía necesaria y dirigir las
terminaciones del axón a sus posiciones correctas en el glomérulo (Raisman, 2001 en Zhu et
al., 2010; Nieto-Sampedro et al., 2002; Gómez et al., 2007 y Barraud et al., 2010).!
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(Modificada de Thuret et al., 2006).!
Figura 1. Descripción de la glía olfatoria en humanos. La vía olfatoria se caracteriza por tener la capacidad de regenerar continuamente a las neuronas receptoras olfatorias en la periferia de la mucosa olfatoria, los axones de estas neuronas se extienden e ingresan al sistema nervioso central ayudados por células de la GE olfatoria (Fairless y Barnett, 2005; Gómez et al., 2007).!
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1.3.1 Localización de la glía envolvente La organización básica laminar del bulbo olfatorio (BO) consiste en seis capas distintivas (Fig.
2) pobladas por diferentes tipos de células neurales: Capa de Fibras Nerviosas (CFN); Capa
Glomerular (CG); Capa Externa Plexiforme (CEP); Capa de Células Mitrales (CCM); Capa
Interna Plexiforme (CIP); Capa de Células Granulares (CCG) (Pollard, 2009). Se sabe que la
GE está distribuida en las dos capas más externas del BO (Ramon-Cueto y Avila, 1998;
Gómez et al., 2007; Barraud et al., 2010; Zhu et al., 2010) es decir en la CFN y CG. !
(Modificada de Pollard, 2009).!Figura 2. Organización anatómica del bulbo olfatorio. Capas del BO: Sección horizontal del BO de rata que muestra la organización laminar (tinción de hematoxilina y eosina) (Pollard, 2009). La GE se encuentra en las dos primeras capas CFN y CG (Barraud et al., 2010; Gómez et al., 2007).!
!1.3.2 Descubrimiento de la glía envolvente La GE del BO fue identificada por Golgi (1875) y Blanes (1898) (rev. en Higginson y Barnett,
2011). Inicialmente, consideraron que eran células de Schwann del sistema olfatorio debido a
su localización entre la mucosa olfatoria y el BO, sin embargo, pronto se demostró que eran
un distinto tipo de célula glial. Una de sus primeras indicaciones de sus inusuales
propiedades, proviene de un estudio imunohistoquímico de nervios olfatorios usando
anticuerpos de la proteína glial fibrilar ácida (GFAP), un marcador generalmente considerado
para definir astrocitos (rev. Higginson y Barnett, 2011).!
Subsecuentemente tres estudios seguidos reportaron que las células gliales del sistema
olfatorio expresaban el receptor de baja afinidad para neurotrofinas NGF/217c (Ran 1), ahora
conocido como p75 (Pixley, 1992; Ramón Cueto y Nieto-Sampedro, 1992; Barnett et al., 1993),
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GECFNCG
CCMCIP
CCG
CEP
típicamente un marcador para la no mielinización de células de Schwann (Jessen et al., 1990)
(rev. en Higginson y Barnett, 2011).!
Estos estudios comparten un recurrente tema, en el que describen a la GE como
antigénicamente y morfológicamente muy heterogéneas. En el estudio de Pixley y
colaboradores en 1992, obtuvieron las mucosas olfatorias de ratas recién nacidas, las cuales
fueron disociadas enzimáticamente e identificaron dos tipos de células gliales: células gliales
del nervio olfatorio parecidas a las células de Schwann y células gliales del nervio olfatorio
parecidas a astrocitos (Doncel-Pérez et al., 2009). Ambos tipos de células expresaron GFAP y
S100β pero con la diferencia que las células parecidas a células de Schwann expresaron p75
(Pixley, 1992; Franceschini y Barnett, 1996; Gudiño-Cabrera et al., 2007 rev. en Higginson y
Barnett, 2011).!
La GE se obtiene a partir de diversos métodos de cultivo, ya sea de BO, de la cavidad nasal,
de la mucosa o de la lámina propria (Raisman 2001, Gudiño-Cabrera et al., 2007; Muñoz,
2012). La GE olfatoria aisladas de la mucosa olfatoria y del BO de ratas fetales, neonatales y
adultas y las células de Schwann del mismo origen expresan uniformemente p75, S100β y
GFAP (Gómez et al., 2007), y las del BO, expresan además NPY y O4 (Su y He 2010). !
!1.3.3 Factores que influyen en la prolongación de los axones de neuronas receptoras olfatorias La GE se ha utilizado ampliamente en diversos modelos de lesión de la médula espinal y sus
beneficios se atribuyen a diversas moléculas que participan en el proceso de crecimiento
axonal (Gómez et al., 2007), entre las que se incluyen diversas moléculas de adhesión
promotoras de crecimiento axonal, como L1, E-NCAM, colageno tipo IV, fibronectina, nexina
y S100β (Gómez et al., 2007), factores tróficos como: Factor de crecimiento nervioso por sus
siglas en inglés Nerve growth factor (NFG); Factor neurotrófico derivado del cerebro, Brain-
derived neurotrophic factor (BDNF); Factor de neurotrófico derivado de células gliales, Glial cell-
derived neurotropic factor (GDNF); Factor neurotrófico ciliar, Ciliary neurtrophic factor (CNTF); y
Factor de crecimiento endotelial vascular, Vascular endotelial growth factor (VEFG), NT-3
(neurotrofina 3) NT-4 (neurotrofina 4); aunque la expresión de estos factores puede variar
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dependiendo de las condiciones del cultivo o el microambiente in vivo (Romo et al., 2005;
Kocsis et al., 2009; Gómez et al., 2007; Doncel-Pérez et al., 2009; Lo Furno et al., 2013). !
Estas células también secretan moléculas de matriz extracelular, como laminina, fibronectina
y colágeno tipo IV, que pueden actuar como sustratos favorables para el crecimiento axonal o
también pueden actuar en los axones ejerciendo un efecto quimiotrópico (Gómez et al., 2007;
Kocsis et al., 2009). La laminina también secretada por la GE, en particular, es un substrato
preferencial en la extensión de neuritas de los nervios olfatorios in vitro (Gómez et al., 2007). !
Se ha demostrado que BDNF y VEFG promueven la migración, proliferación y supervivencia
celular, además de la migración de las células neurales y actúan como factores neurotróficos y
neuroprotectores ayudando así a la supervivencia neuronal (Doncel-Pérez et al., 2009; Núñez,
2010). Además el BDNF se considera un poderoso modulador de la excitabilidad neuronal y
transmisión sináptica, aumenta el crecimiento axonal y participa en la plasticidad neuronal
(Gómez-Pinilla et al., 2007; Núñez, 2010). Como conclusión dentro de las moléculas
involucradas en la regeneración nerviosa se encuentran NGF, BDNF, GDNF, NT-3 y la
laminina (Willerth y Sakiyama-Elbert, 2008; Núñez, 2010).!
La presencia de L1 / Ng-CAM (Neuron-glia cell adhesión molecule) y N-CAM (Neural cell
adhesion molecule) en las membranas plasmáticas tanto de células GE y neuronas olfatorias
permite a los axones utilizar las superficies de las células gliales como un sustrato sobre el
cual crecer. Es cierto también que las células sintetizan y secretan laminina, proporcionando
así un sustrato adhesivo para los axones olfativos, así como el factor de crecimiento nervioso
derivado de glía y nexina, los cuales son agentes de promoción de neuritas (Douccette, 1990).!
!1.3.4 Marcadores de la glía envolvente En general, los estudios inmunocitoquímicos han revelado que la GE expresa diferentes
marcadores tales como GFAP, p75, Vimentina, proteína S100 y NCAM, O4, PSA-NCAM
(Polysialylate-neural cell adhesion molecule), GAD67 y Sox10 (Nieto-Sampedro et al., 2002; Lo
Forno et al., 2013; Raucci et al., 2013). !
!!
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1.3.5 Uso de la glía envolvente en modelos de lesión del SNC Cuando el SNP es lesionado, se activa el sistema inmune y se promueve la regeneración del
tejido por parte de las células troncales; una proporción de los brotes axonales son capaces de
volver a crecer y reconectarse con sus células diana, existiendo restauración después de la
lesión axonal, esto se debe al entorno permisivo que crean las células de Schwann alrededor
de los axones en crecimiento en respuesta a la lesión mediante la formación de la mielina, por
lo cual los axones pueden regenerarse (Raisman, 2001; Nieto-Sampedro, 2003; Bifari et al.,
2010). Por otra parte, sin ayuda externa, el SNC lesionado es incapaz de tener una
recuperación funcional completa, por lo que la intervención clínica es necesaria para frenar la
muerte neuronal secundaria y así reemplazar las neuronas muertas (Gudiño-Cabrera, 1998;
Romo et al., 2005). Los axones que sufren una agresión dentro del SNC de mamíferos son
incapaces de regenerarse, existiendo pérdida de la comunicación entre las redes neuronales,
causando un déficit a largo plazo, esto se debe a que las células de glía que rodean a los
axones lesionados crean un entorno no permisivo para su regeneración, ya que en el lugar de
la lesión se forma una cicatriz glial (Nieto-Sampedro, 2003; Ruitenberg et al., 2006). !
La cicatriz glial es una estructura que da soporte al tejido dañado, aislando las áreas
necróticas de las del parénquima sano y rellena el espacio resultante de la pérdida neuronal,
la cicatriz funciona entonces como una barrera en el SNC (Castellano et al., 2000; Nieto-
Sampedro, 2003). La formación de la cicatriz glial en el lugar de la lesión es el resultado de la
reacción astrocitaria, ésta cicatriz glial, está formada principalmente por astrocitos reactivos,
astrocitos fibrosos, también contiene prolongaciones microgliales, células de origen
sanguíneo y proteínas de la matriz extracelular como colágeno (Castellano et al., 2000; Nieto-
Sampedro, 2003; Ruitenberg et al., 2006); además que los fibroblastos del tejido conjuntivo
adyacentes se dividen y se disponen sobre la capa astrocitaria antes mencionada (Nieto-
Sampedro, 2003). !
Generalmente, se ha considerado que la cicatriz glial inhibe los procesos regenerativos
debido a las moléculas inhibidoras del crecimiento (Castellano et al., 2000; Ruitenberg et al.,
2006). Ahora bien, la GE tiene la habilidad de interactuar con los astrocitos quienes ya se dijo
son los principales constituyentes de la cicatriz glial en las lesiones de SNC, permitiendo que
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las prolongaciones de los astrocitos al encontrarse con la GE cambien su configuración
formando puentes que podrían ser el evento crucial para permitir el crecimiento de los
axones, tanto en el contexto de su ambiente natural en el sistema olfatorio, como en el
contexto de trasplantes en lesiones de médula espinal (Gómez et al., 2007).
Por sus propiedades promotoras del crecimiento axonal, la GE se ha utilizado
experimentalmente en diversos modelos de lesión del SNC, principalmente en médula
espinal (Nieto-Sampedro et al., 2002; Fairless y Barnett, 2005; Romo et al., 2005) además se
utiliza en otras enfermedades neurodegenerativas (Romo et al., 2005; Su y He, 2010), con
resultados favorables en la regeneración del SNC y SNP, donde ha mostrado una serie de
propiedades como producir factores neurotróficos in situ, promover la supervivencia
neuronal y la neuritogénesis, guíar el crecimiento axonal, restituir a los astrocitos reactivos
hipertróficos a su estado normal o de reposo, poseer la capacidad de sobrevivir y proliferar
en cultivo además de promover el crecimiento de neuritas. En los diferentes modelos de
lesión los transplantes de GE inducen en mayor o menor medida la reparación de fibras
nerviosas transectadas (Navarro et al., 1999 y Pascual et al., 2002, Gudiño-Cabrera et al., 2007;
Su y He, 2010). Al parecer estas células son las ideales para su utilización en medicina
regenerativa, sin embargo, su obtención en humanos mediante el raspado de la mucosa
olfatoria no es una extracción pura de GE, al menos que se obtenga de cadáveres
directamente de BO, en ambos casos, la cantidad de células que se obtiene es limitada, lo que
dificulta su expansión celular in vitro, por lo que se pretende utilizar fuentes alternas, tales
como células troncales para diferenciarlas hacia el fenotipo de células de GE, es decir, utilizar
terapia celular.!
!1.3.6 Obtención de la glía envolvente Los bulbos olfatorios proporcionan cultivos de GE puros, desprovistos de otras células
(Santos-Benito y Ramón-Cueto, 2003; Nieto-Sampedro, 1994), en contraste con cultivos de la
mucosa olfatoria, que contienen células de Schwann (Santos-Benito y Ramón-Cueto, 2003).
Pero a diferencia de la GE las células de Schwann no migran en el SNC (Santos-Benito y
Ramón-Cueto, 2003; Gudiño Cabrera et al., 2007; Kocsis et al., 2009), además, en cultivo las
células de Schwann y las células GE muestran propiedades fenotípicas similares tales como la
�20
expresión de p75 (Kocsis et al., 2009) y NG2 (Richarson et al., 2011); y debido a que los
marcadores expresados por las células de Schwann son similares a los de la GE, se dificulta
su aislamiento mediante inmunopurificación magnética (Rodríguez-Baeza, 2013).!
Por otra parte la obtención de GE en humanos derivada de la mucosa olfatoria es GE
periférica, se sabe que células de la GE de fuentes periféricas no se pueden integrar
adecuadamente después del injerto, es decir, las células gliales del SNP no se entremezclan
bien como la glía del SNC (Santos-Benito y Ramón-Cueto, 2003). Por lo que aislar la GE
directamente del BO parece ser la opción más adecuada; sin embargo, en humanos la
cantidad que se obtiene es poca, lo que dificulta la proliferación y expansión in vitro.!
!1.4 Terapia Celular La terapia celular se define como la introducción de células nuevas vivas en un organismo,
con el fin de tratar una enfermedad y restaurar o establecer la función (López, 2009; Mejía-
Toiber et al., 2009). En la terapia celular se buscan nuevas formas de restituir los procesos
biológicos que han resultado afectados, mediante el aporte de precursores celulares sanos, o
la aplicación de factores de crecimiento producidos normalmente por tales células (Pineda y
Londoño, 2009). Siguiendo la interacción con los injertos de células troncales, se ha observado
que algunos de los beneficios obtenidos con la terapia de células troncales no son debidos del
todo por el reemplazo de las células; más bien se deben al efecto protector de factores tróficos
y antiapoptóticos liberados en el tejido dañado, por las células troncales injertadas o por la
atracción de las células endógenas (Bifari et al., 2010). Por lo que el uso de las células troncales
representa una opción innovadora y prometedora para resolver diversos problemas clínicos
(Pineda y Londoño, 2009). !
Recientemente, la terapia celular ha sido propuesta como un método eficiente para la
regeneración de nervios lesionados. El trasplante de células troncales de varios orígenes, que
son diferenciados hacia células con fenotipo Schwann-like, estimula la reparación de nervios
periféricos (Lopatina, 2011). !
!!!
�21
1.5 Diferenciación celular Las células troncales poseen dos características importantes: la autorrenovación y la
capacidad de diferenciarse bajo estímulos específicos, para formar células especializadas que
constituyen a los diversos tejidos y órganos (Mayani, 2011a). En las células troncales de
adulto, para inducir la diferenciación in vitro es necesario imitar el microambiente de los
tejidos in vivo usando medios de cultivos con nutrientes, hormonas, citocinas, factores de
crecimiento y algunos compuestos sintéticos (Pérez-Serrano et al., 2011).!
La diferenciación celular involucra una especialización estructural y funcional paulatina de
las células de un organismo. Esta diferenciación ocurre mediante la activación diferencial de
genes, de manera que las proteínas que produce la nueva célula, difieren de las de su célula
progenitora, frecuentemente esta diferenciación inicia en el momento de la división celular
(Kalthoff, 1996; Karp, 2010).!
La diferenciación celular lleva a la generación y desarrollo de células fenotípicamente
distintas a las de su progenitora (Kalthoff, 1996; López y González, 2003). Esta diferenciación
involucra una respuesta a distintas señales bioquímicas que incluyen: 1) señales endógenas y
2) señales exógenas; la primera se refiere a la información genética de la propia célula, a las
proteínas promotoras e inhibidoras del ciclo celular, a la longitud de los telómeros y al
número de veces que debe dividirse la célula, la segunda se refiere al microambiente o
hábitat de la célula, así como su comunicación con otras células a través de secreción de
moléculas solubles, como factores de crecimiento, hormonas y citocinas (López y González,
2003). Conocer los mecanismos implicados en la diferenciación celular, ha abierto la
posibilidad de poder manipular células humanas y modificar la trayectoria para que
sustituyan la función de células afectadas por la enfermedad. Las células troncales son células
indiferenciadas con capacidad de proliferación prolongada para dar células en el mismo
estado de indiferenciación y con la potencialidad de formar otros tipos celulares
diferenciados (López y González, 2003). !
!!!!!
�22
1.5.1 Potencialidad celular Las células troncales se pueden clasificar según su potencialidad de diferenciación:!
El cigoto es la primera célula troncal totipotencial hasta el estadio de mórula (8 células), cada
célula es idéntica a las otras: es decir todas son células troncales totipotenciales y cada una de
ellas es capaz de producir tejido embrionario y estructuras extraembrionarias (placenta, saco
vitelino y cordón umbilical) (Prósper y Herreros, 2004; López y González, 2003; Mayani,
2011a); Conforme avanza el desarrollo, el embrión alcanza el estadio de blastocisto en el que
cada una de las células que forma parte de la masa celular interna es capaz de formar células
de cualquier tejido del organismo, es decir, tienen la habilidad de diferenciarse en tejidos
procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias: endodermo, mesodermo y
ectodermo y se les considera células troncales pluripotenciales, sin embargo estas células son
incapaces de dar origen a las estructuras extraembrionarias (Prósper y Herreros, 2004; López
y González, 2003; Mayani, 2011a); y por último, las células troncales multipotenciales que
antes se definían como células capaces de diferenciarse en distintos tipos celulares
procedentes de la misma capa embrionaria (López y González, 2003; Prósper y Herreros,
2004), sin embargo ahora se sabe que su potencial de diferenciación no se limita a su capa
embrionaria (Bianchi de di Risio et al., 2004; Liu et al., 2009; Rastegar et al., 2010; Merruane y
Rojas, 2010; Montesinos y Castro, 2011; Cawthorn et al., 2012; Jung et al., 2012; Lo Furno et al.,
2013; Alderman et al., 2013).!
!1.6 Características de las células troncales La definición de célula troncal debe hacerse de acuerdo a criterios funcionales, ya que estas
células no poseen características morfológicas que puedan distinguirlas del resto de las
células del tejido al que pertenecen (Mayani, 2011a). De acuerdo con esto, las células troncales
se han definido como células inmaduras, no diferenciadas, con una alta capacidad de
autorreplicación y que pueden diferenciarse en uno o más tipos de células especializadas con
funciones específicas en el organismo (Mayani, 2011a; Pineda y Londoño, 2009; García, 2003;
Mizuno, 2009; Arévalo et al, 2007). !
Las células troncales son una población que posee: 1) capacidad de auto-renovación 2)
viabilidad a largo plazo y 3) potencialidad de multilinaje (Zuk et al., 2002). Además las células
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troncales se clasifican en: 1) células troncales embrionarias totipotenciales, las cuales se
encuentran en pequeño número en el blastocito y pueden expandirse en forma indiferenciada
durante un corto tiempo y de acuerdo al sitio donde se alojan, ellas adquirirán fenotipos de
diferenciación (Bianchi de di Risio et al., 2004; García, 2003), 2) células troncales inducidas
(Mizuno, 2009) y 3) células troncales pluripontenciales de adulto, las cuales proliferan
extensamente y puede diferenciarse prácticamente en cualquier tipo celular del organismo,
dependiendo de los estímulos que reciba (Ramírez et al., 2010).!
En individuos adultos, existe una gran cantidad de células troncales con extraordinaria
plasticidad. Es por esto, que las células troncales pluripotenciales aisladas de tejidos adultos
pueden ser reprogramadas mediante factores de crecimiento y de diferenciación apropiados,
hacia fenotipos celulares deseados para restaurar un déficit funcional determinado (García,
2003). Los tejidos postnatales y adultos pueden ser renovados y regenerados exclusivamente
por tejidos específicos de células troncales (Crisan et al., 2011; Pérez-Serrano et al., 2011). !
!1.6.1 Células troncales de adulto Las células troncales adultas es un término que se utiliza para definir a las células troncales
que se obtienen después del nacimiento del organismo, también conocidas como células
troncales posnatales (Zuck, 2010; Stocchero y Stocchero, 2011).!
Las propiedades terapéuticas de las células troncales embrionarias y de las células troncales
pluripotenciales inducidas destacan por su auto-renovación y pluripotencialidad, sin
embargo, presentan limitaciones para su uso, tales como la regulación celular, así como
consideraciones éticas y manipulación genética, a diferencia, las células troncales de adulto
presentan la ventaja de ser inmunocompatibles (Mizuno, 2009; Prósper et al., 2006)(Tabla 1).!
Entre las mayores preocupaciones de la aplicación clínica de las células troncales
embrionarias es que éstas pueden ser rechazadas por el sistema inmune como una
consecuencia de histocompatibilidad y pueden interferir con las funciones normales de la
respuesta inmune del huésped (Bifari et al., 2010). Además, las células troncales embrionarias
tienen importantes limitaciones, por ejemplo, el hecho de que no existe ningún estudio
clínico abierto en pacientes y por otra parte, la misma capacidad proliferativa de estas células
�24
lleva a que en los distintos modelos animales en los que se han utilizado, se detecte de forma
invariable la producción de tumores (teratomas y teratocarcinomas) (Prósper et al., 2006). !
Por lo que se considera al tejido adulto como una buena opción para la obtención de células
troncales. Sin embargo, existen varios obstáculos que deben ser cuidadosamente dirigidos en
investigaciones de células troncales humanas pluripotenciales. Estos obstáculos son: 1)
proliferación celular, 2) diferenciación celular, 3) integridad genética, 4) alogenicidad y 5)
problemas éticos (Ramírez et al., 2010). Las células troncales pueden dividirse en células
troncales mesenquimales, las cuales dan origen a osteoblastos, condroblastos, mioblastos y
adipocitos; y en células troncales hematopoyéticas (CTH) que dan origen a células
sanguíneas (Stocchero y Stocchero, 2011).!
!Tabla 1. Cuadro comparativo de las células troncales: embrionarias, inducidas y de adulto.!
(Le Blank, 2003; Flores–Figueroa et al., 2006; Prósper et al., 2006; Mizuno, 2009; Bifari et al., 2010; Montesinos
y Castro, 2011; Stocchero y Stocchero, 2011).!
!!
Células troncales! embrionarias
Células troncales! inducidas
Células troncales de adulto
Consideraciones éticas
!Usualmente obtenidas de la
blástula de embriones de mamíferos por lo que presenta controversia
bioética.
!No se tienen
consideraciones bioéticas, debido a que
las células que se inducen son células troncales adultas.
!No presentan
problemas bioéticos. !
Consideraciones inmunológicas
!Rechazo debido a la histocompatibilidad. !
!Se puede evitar el
rechazo inmunológico usando como fuente las
células del propio paciente.
!Menor o nulo rechazo
debido a sus propiedades
inmunológicas únicas.
Consideraciones tumorales
Debido a su capacidad proliferativa mayor !
producción de tumores.
Presentan limitaciones para su uso debido a la
regulación celular. !
!Su capacidad
proliferativa y su potencial de
diferenciación son significativamente
menores.
�25
1.7 Células troncales mesenquimales Las células troncales mesenquimales (CTM) son un grupo de células troncales adultas no
hematopoyéticas que fueron caracterizadas por Friedenstein en 1987 (Flores-Figueroa et al.,
2006; Al-Saqi et al., 2014), quien las aisló de médula ósea y las describió como células
adherentes en cultivo, de morfología fibroblastoide, capaces de diferenciarse hacia células de
origen mesodérmico como osteocitos, condrocitos, adipocitos y miocitos (Arévalo et al., 2007;
Rastegar et al., 2010; Lo Furno et al., 2013). Las CTM son capaces de diferenciarse a
cardiomiocitos, hepatocitos, células endoteliales y células pancreáticas e incluso a células de
origen no mesodérmico, tales como las células de linaje neuronal (Rastegar et al., 2010; Lo
Furno et al., 2013). !
Además en modelos experimentales se ha demostrado que las CTM son capaces de regenerar
tejidos deteriorados o lesionados como hueso, cartílago, tejido hepático o miocardio; y
modular reacciones inmunes en colagenopatías, esclerosis múltiple y transplantes de médula
ósea (Arévalo et al., 2007).!
Las CTM se pueden aislar de médula ósea, sangre de cordón umbilical, tejido adiposo,
páncreas, hígado, músculo esquelético, epidermis, membrana sinovial, hueso trabecular,
tejido pulmonar, pulpa dental y ligamento periodontal, folículos pilosos, placenta, periostio
de cerebro, pericondrio, gelatina de Wharton y bazo; siendo los tres primeros mencionados
los más empleados (Wagner et al., 2005; Arévalo et al., 2007; Montesinos y Castro, 2011).!
Para la identificación de las CTM la Sociedad Internacional de Terapia Celular propuso varios
criterios: 1) tienen que ser plástico-adherentes, 2) deben ser capaces de diferenciarse in vitro
en osteoblastos, adipocitos y condrocitos bajo condiciones estándar de cultivo, 3) es necesario
que expresen CD73, CD90, CD105, CD29 y CD44, 4) es importante que no expresen
marcadores de linaje hematopoyético y de células endoteliales tales como CD14, CD11b,
CD45, CD19, CD79, CD34 y CD41 y 5) además de una baja expresión de HLA-DR (Wagner et
al., 2005; Rebelatto et al., 2008; Arévalo et al., 2007; Witkowska-Zimny y Walenco, 2011; Jung
et al., 2012; Menard et al., 2013).!
!!
�26
1.7.1 Capacidad imunoduladora de las células troncales mesenquimales Cuando las células que se trasplantan no provienen del propio paciente, sino que se obtienen
de otros individuos se le llama alotrasplante o trasplante alogénico, por lo que el sistema
inmune del huésped no reconoce las células como propias y el paciente debe de recibir
medicación inmunosupresora para evitar el rechazo del implante (Muñoz, 2012; Machado et
al., 2012). Sin embargo, si el donante de células y el receptor es del mismo individuo se le
conoce como terapia autóloga, entonces los órganos, tejidos o células trasplantados son
compatibles con el sistema inmune del huésped, y no se necesita la terapia inmunosupresora
(Muñoz, 2012).!
Por otra parte, las CTM no siguen las reglas de rechazo inmune. Además de no ser
reconocidas como aloantígenos, las CTM son capaces de suprimir la activación y
proliferación de diferentes células del sistema inmune del huésped (Ryan et al., 2005;
Machado et al., 2012). Así mismo, son consideradas inmunológicamente privilegiadas, ya que
no expresan moléculas coestimuladoras en su superficie, necesarias para la activación de las
células T y de las células Natural killer (NK); dicho de otra forma, al no estimular la
alorreactividad no se comportan como células alogénicas y escapan de la lisis celular (Le
Blank, 2003; Bianchi de di Risio et al., 2004; Ryan et al., 2005; Montesinos y Castro, 2011;
Machado et al., 2012; Macías-Abraham et al., 2014), este efecto inmunoregulador de las CTM
puede darse a través de contacto celular y/o mediante la secreción de diversos factores
(Montesinos y Castro, 2011). Además las CTM pueden ser trasplantables entre los individuos
con HLA diferente sin la necesidad recibir inmunosupresión, por lo que sus propiedades
inmunológicas únicas, las convierte en ideales para terapia celular (Le Blank, 2003; Machado
et al., 2013; Macías-Abraham et al., 2014), el uso de estas células en la clínica ha probado no
tener riesgos para los individuos, no son capaces de producir teratomas, por lo que sin duda
las CTM son de gran interés para la biomedicina, así como en terapia celular (Le Blank, 2003;
Bianchi de di Risio et al., 2004; Ryan et al., 2005; Flores–Figueroa et al., 2006; Machado et al.,
2012).!
!
�27
1.7.2 Pluripontecialidad de las células troncales mesenquimales El paradigma clásico de que la diferenciación de las células troncales está restringida a su
órgano específico, ha sido sustituido por la evidencia, basada en hallazgos experimentales de
que las células troncales adultas pueden cambiar hacia un fenotipo diferente del tejido en el
cual se encuentran, sugiriendo su capacidad de ser reprogramadas hacia un nuevo destino
(Bianchi de di Risio et al., 2004; Prósper y Herreros, 2004; Montesinos y Castro, 2011). !
Es importante destacar que para que una célula troncal pueda considerarse pluripotencial
debe cumplir las siguientes condiciones: en primer lugar, una única célula puede
diferenciarse en células especializadas procedente de cualquier capa embrionaria; en
segundo lugar, demostrar la funcionalidad in vitro e in vivo de las células en las que se han
diferenciado y, finalmente, que se produzca un asentamiento claro y persistente de estas
células en el tejido diana, tanto en presencia como en ausencia de daño en los tejidos en los
cuales se injerta, además, diversos trabajos indican de manera evidente la existencia de
células troncales adultas pluripotenciales (Prósper y Herreros, 2004) (Fig. 3).!
!!
! (Modificada de Liu et al., 2009).!
Figura 3. Capacidad pluripotencial de CTM. Las CTM pueden diferenciarse en linajes de células mesodérmicas y no mesodérmicas, incluyendo osteocitos, condrocitos, adipocitos, miocitos, fibroblastos, células epiteliales y las neuronas. Además, CTM son capaces de auto-renovación.!
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Neuronas
Fibroblastos
Células epiteliales
Osteocitos
Adipocitos Condrocitos Miocitos
CÉLULAS TRONCALES
MESENQUIMALES
1.7.3 Células troncales mesenquimales derivadas del tejido adiposo La primera demostración de la existencia de CTM en el estroma del tejido adiposo se produjo
en el año 2000. Un grupo de investigadores liderado por Gimble, describieron la capacidad in
vitro de estas células de diferenciarse a tejidos osteogénicos y mineralizar una matriz
extracelular, cuando se les exponía a diferentes factores de diferenciación, demostrando la
capacidad de multipotencialidad de estas células residentes en el tejido adiposo (García y
García, 2009).!
A pesar de estos estudios, la primera vez que se consideró la existencia de células troncales
mesenquimales en el tejido adiposo subcutáneo fue en el año 2001, cuando el grupo del Dr.
Hedrick describió una población celular multipontencial. Su descripción expresaba la
existencia de un grupo de células homogéneas con aspecto fibroblástico, obtenidas a partir de
la fracción vásculo-estromal de tejido adiposo y con capacidad de diferenciarse a osteocitos,
condrocitos y adipocitos (Arévalo et al., 2007; García y García, 2009; Rastegar et al., 2010; Lo
Furno et al., 2013). Además, analizaron el fenotipo de dichas células mediante sus marcadores
de membrana y analizaron su cinética de crecimiento; en ambos casos comprobaron que esta
población celular cumplía los criterios estipulados para ser consideradas CTM, siendo su
fenotipo muy similar a las células troncales mesenquimales de la médula ósea el de
morfología fibroblastoide (García y García 2009; Zuk et al., 2001; Grégoire et al., 1990). !
Las CTM-TA tienen el perfil de expresión: positivo para CD29, CD44, CD90, y CD105; y un
marcaje negativo para CD34, CD45 y CD133 (Ryan et al., 2005; García y García, 2009). !
En el 2003, Gimble propuso cinco criterios que determinan el tejido ideal para su aplicación
en la medicina regenerativa, que incluyen:!
1. Obtención celular en gran cantidad.!
2. Obtención con un procedimiento poco invasivo.!
3. Capacidad de diferenciarse a múltiples linajes celulares de forma regulada y
reproducible.!
4. Que se puedan trasplantar de forma efectiva y segura.!
5. Y que se realice mediante las Buenas Prácticas de Laboratorio.!
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A partir de estos criterios, se establece que las células troncales mesenquimales derivadas de
tejido adiposo (CTM-TA) muestran una opción bastante adecuada para su uso en terapia
celular (Gimble et al., 2007; Stocchero y Stocchero, 2011). El tejido adiposo es una de las
principales fuentes de células troncales que se pueden separar de la fracción vascular
estromal (Casteilla et al., 2011), de fácil obtención debido a que se pueden obtener de grandes
cantidades de células por medio de liposucción usando solo anestesia local (Casteilla et al.,
2011; Stocchero y Stocchero, 2011) y con alto potencial de diferenciación hacia distintos linajes
celulares especializados tales como adipogénico, condrogénico, osteogénico, miogénico y
neurogénico en respuesta a factores específicos (Pineda y Londoño, 2009; Rebelatto et al.,
2008). !
Añadido a esto en los últimos años se ha observado la expresión de marcadores de células
embrionarias en la superficie de las CTM-TA como lo son 0ct-4, Sox-2 y Rex-1 siendo los dos
primeros característicos de células pluripotenciales (García y García, 2009; Pelayo et al., 2011).
Además investigaciones han mostrado que las CTM-TA tienen la potencialidad de
diferenciarse hacia tejidos derivados de la capa del mesodérmico, ectodérmico y
endodérmico, tales como nervios y piel, lo que sugiere que son pluripotenciales en lugar de
solo exhibir capacidades multiponteciales (Liu et al., 2009; Merruane y Rojas, 2010;
Montesinos y Castro, 2011; Cawthorn et al., 2012; Jung et al., 2012; Alderman et al., 2013).!
Cuando comparamos a las CTM derivadas de médula ósea (CTM-MO) con las CTM-TA son
igualmente capaces de diferenciarse en células de origen mesodérmico. Sin embargo la
obtención de médula ósea es dolorosa para los pacientes y el número de células recolectadas
es bajo, a diferencia de éste, el tejido adiposo humano es ubicuo y se obtienen de manera fácil
grandes cantidades bajo anestesia local con poco malestar del paciente (Mizuno, 2009;
Casteilla y Dani, 2006; Witkowska-Zimny y Walenco, 2011).!
La proliferación de las CTM-TA es mayor en comparación con CTM-MO y células
mesenquimales de cartílago (CTM-C); además de soportar una mayor tolerancia a la
privación de suero que las dos tipos de células mencionadas (Peng et al., 2008).!
Aunque se propone que la médula ósea es la principal fuente de obtención de las CTM según
Beyer y Da Silva 2006, existen algunos aspectos que dificultan su uso como: limitada tasa de
�30
crecimiento, la capacidad de diferenciación de acuerdo a la edad del donante y el riesgo en la
toma de muestra (Arévalo et al., 2007) que puede ser mediante punción lumbar o mediante la
técnica llamada aféresis, que aunque son procedimientos seguros, implica algunos efectos
colaterales tales como dolor óseo, cefalea, mialgias y fiebre (Gutierrez et al., 2007; Mayani,
2011b). Sobre la obtención de CTM a partir de sangre de cordón umbilical (CTM-CU), se
requiere optimizar puntos críticos para lograr un cultivo exitoso, tales como el tiempo de
recolección y procesamiento, que debe ser inferior a 16 horas, así como el volumen de sangre
recolectado igual o superior a 30 ml (Arévalo et al., 2007). Respecto al aislamiento y cultivo a
partir de tejido adiposo, las células obtenidas de esta fuente tienen una morfología, fenotipo y
capacidad de diferenciación in vitro similar a las obtenidas de médula ósea, tienen una mayor
capacidad de proliferación y es posible acceder fácilmente a muestras de tejido adiposo a
través de procedimientos como liposucción o abdominoplastia usando solo anestesia local
(Arévalo et al., 2007; Mizuno, 2009; Gimble et al., 2010), y a partir de pequeñas cantidades de
tejido adiposo (100 a 200 ml) las cuales se pueden obtener bajo anestesia local, pudiendo
obtener hasta 500 veces más células que las obtenidas a partir de médula ósea (Mizuno, 2009;
Casteilla et al., 2011; Stocchero y Stocchero, 2011).!
!!!!!!!!!!!!!
�31
Tabla 2. Comparación de las células troncales de diversas fuentes. Células troncales mesenquimales de
médula ósea (CTM-MO), con las Células troncales mesenquimales de cordón umbilical (CTM-CU) y las
Células troncales mesenquimales de tejido adiposo (CTM-TA). !
!
(Adaptado de Kern et al., 2006 y Wangner et al., 2005).!
(Arévalo et al., 2007; Mizuno, 2009; Gimble et al., 2010; Casteilla et al., 2011; Stocchero y Stocchero, 2011).!
!1.8 La fracción vascular estromal del tejido adiposo El tejido adiposo se deriva de la capa embrionaria del mesodermo y consta de un soporte que
contiene a la fracción vascular estromal, así mismo ésta incluye una población celular
heterogénea que incluye células de músculo liso, fibroblastos, adipocitos, células endoteliales,
células epiteliales y las CTM además de otros tipos celulares como pericitos, células
CTM-MO CTM-CU CTM-TA
Proceso de obtención según
la fuente
-La obtención de médula ósea es dolorosa e invasiva
para el donador.!
Existen puntos críticos para la toma de la muestra:!-El tiempo de recolección debe ser igual o inferior a
16h.!!-El volumen de sangre
obtenido debe ser igual o superior a 30 ml.!!
-Es considerado un tejido de desecho posterior al
parto.
-Obtención poco invasiva por medio de anestesia local de 200 ml aprox.!!
- Obtención por liposucción o lipectomía considerado como tejido de desecho en cirugías
estéticas.!
Cantidad celular obtenida
-La cantidad que se obtiene es poca.
-Según el éxito del cultivo la cantidad de células
obtenidas.
-Mayor cantidad celular obtenida en comparación
con otras fuentes.
Formación de monocapa adherente
-De 4 a 5 días. -De 2 a 4 semanas. -De 4 a 5 días.
Capacidad de diferenciación
osteogénica 71.4% 100% 78.8%
Capacidad de diferenciación condrogénica
100% 100% 100%
Capacidad de diferenciación adipogénica
100% 0% 94%
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sanguíneas, macrófagos y linfocitos (Ouchi et al., 2001; Estrada y Venegas, 2007; Astori et al.,
2007; González et al., 2008; Alderman et al., 2011, Gir et al., 2012; Lo Furno et al., 2013)(Fig.4),
dicho de otra manera, el tejido adiposo contiene la fracción vascular estromal, y la fracción
vascular estromal contiene a las células troncales mesenquimales además de otras células.!! !!!!!!!!!!!Figura 4. Esquema de la composición del tejido adiposo: A) Adipocitos B) Matriz extracelular C) Pericitos encima de los vasos; importante en la angiogénesis D) Células troncales mesenquimales “CTM” E) Preadipocitos (Alderman et al., 2011).!
!!!!!!!!!!!
�33
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La regeneración neural en el SNC no es tan eficiente como en el SNP, no obstante, las células
Schwann-like (GE) se caracterizan por favorecer la regeneración de los axones, estas células se
han trasplantado en modelos de lesión en SNC (principalmente en médula espinal) con
resultados favorables. Sin embargo, la cantidad de GE que puede obtenerse en humanos es
muy poca, por lo que se dificulta su expansión in vitro restringiendo su uso en terapia celular
para los procesos de regeneración. Además, la extracción de GE no es pura, sino que va
acompañada de otras células, por lo que se propone utilizar células troncales derivadas de
tejido adiposo las cuales se destacan por su fácil obtención, alta tasa de proliferación,
capacidad de diferenciarse al linaje neural y modular la respuesta inmune, para diferenciarlas
hacia el fenotipo Schwann-like.!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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3. HIPÓTESIS
El medio condicionado por la glía envolvente inducirá la diferenciación de células troncales
mesenquimales derivadas de tejido adiposo hacia el fenotipo Schwann-like.!
4. OBJETIVO GENERAL
Diferenciar las células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo de rata adulta
hacia células con fenotipo Schwann-like.
5. OBJETIVOS PARTICULARES
I. Establecer las condiciones de medio de cultivo para mantener las células troncales
mesenquimales derivadas de tejido adiposo en proliferación y en estado indiferenciado.!
II. Diferenciar las células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo hacia
fenotipo de glía envolvente.!
III. Caracterizar la expresión de marcadores específicos de la glía envolvente durante la
diferenciación de las células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo.!
!!!!!!!!!!!!!!!
�35
MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Diagrama experimental
�36
Rata Wistar macho de 6 a 8 sem. de edad
n=5
GE Dif. 72 h
B27 (control)
DF10S Dif. 0 h
GE Dif. 72 h
B27 (control)
NH Dif. 0 h
Inmunocitoquímica con anticuerpos anti:
VIM NG2 GFAP
p75
Fijación de las CTM-TA a las 72 h
Obtención del medio condicionado por la
GE
Inmunopurificación magnética
Cultivo de GE de BO Cultivo de CTM-TA
NHDF10S
6.2 Cultivos primarios Los cultivos se realizaron a partir de tejido procedente de ratas (Rattus norvergicus) de la cepa
Wistar, criadas y mantenidas en el bioterio del Departamento de Biología Celular y
Molecular, con acceso libre al agua y alimento, a una temperatura constante de 22-25°C con
periodos de luz-oscuridad de 12-12 h. El sacrificio de los animales se realizó en una cámara
de CO2 y posteriormente se dislocaron cervicales.!
Las células se mantuvieron en incubación a 37°C, en una atmósfera de 5% de CO2, la
renovación del medio para los cultivos de GE y de CTM-TA se realizó cada tercer día.!
!6.2.1 Medio basal de cultivo celular Se utilizó una mezcla de DMEM y DMEM/F12 en proporción 1:1, suplementado con glucosa
(3 g/lt), glutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml) estreptomicina (0.1 mg/ml) y gentamicina
(40 μg/ml). Este medio basal (DF) se utilizó como base para preparar los medios de cultivo
utilizados, tanto los suplementados con suero fetal bovino, como el medio definido B27.!
!Tabla 3. Medios de cultivo utilizados.!
!6.3 Cultivo de glía envolvente Para el cultivo de GE se utilizaron ratas machos, de la cepa Wistar, de 8 a 10 semanas de
edad, se extrajeron los bulbos olfatorios en condiciones estériles, y se colocaron por separado
en solución de Hanks con Ca+2 y Mg+2, se retiraron las meninges y posteriormente se separó y
Medio de cultivo Descripción
Medio DF Es un medio de base DMEM/DMEM-F12 (Medio basal).
Medio DF10SEl medio DMEM/DMEM-F12 se suplementó con Suero Fetal Bovino al 10% v/v.
Medio suplementado B27Al medio basal de cultivo celular se le agregó el suplemento B27 en disolución 1:100.
Medio NH
Es un medio optimizado y estandarizado para la expansión reproducible y fiable de las células mesenquimales derivadas de médula ósea y no de células hematopoyéticas.
Medio condicionado de la GEMedio obtenido a partir de los cultivos de GE, los cuales a su vez se mantuvieron con medio suplementado B27.
�37
desechó la sustancia blanca (mielina). La capa de fibras nerviosas y glomerular disecada se
pasó a otra placa de petri con solución de Hanks sin Ca+2 ni Mg+2, y posteriormente se pasó a
un tubo cónico y se le agregó una solución de Hanks sin Ca+2 ni Mg+2 con 2.5 mg/ml de
tripsina, la disociación se facilitó con una pipeta Pasteur con la punta estrechada con la flama,
realizando disociación mecánica y química, posteriormente se resuspendió en medio DF10S,
y se realizaron dos lavados seguidos de centrifugación a 200 g durante 7 min, a 25°C cada
vez, después las células se pasaron a través de una malla estéril de 70 µm para retener el
tejido no disociado y se sembraron con medio DF10S en frascos de cultivo de plástico, de 25
cm2 o 75 cm2 a una densidad aproximada de 2 a 5x104 cél/cm2. Los frascos previamente
fueron tratados 1 h con PLL (Poli L-Lisina) a una concentración de 10 µg/ml; posteriormente
fueron tres veces enjuagados con H2O Milli Q.!
!6.3.1 Inmunopurificación magnética Los métodos de separación celular empleados se basan tanto en algunas características físicas
de las células, como su tamaño, así como sus características imunofenotípicas celulares
(Flores-Figueroa et al., 2006). De acuerdo con su inmunofenotipo las células pueden ser
seleccionadas por dos métodos denominadas selección positiva o selección negativa, ambos
métodos requieren del uso de un citómetro de flujo o de una columna inmunomagnética
(Gudiño-Cabrera y Nieto-Sampedro, 1996; Neurauter et al., 2007). La selección positiva se
basa en el reconocimiento por un anticuerpo de una molécula presente en la célula de interés.
Este método es muy útil cuando el anticuerpo utilizado para reconocer a la célula se expresa
únicamente en la célula de interés, puesto que, de lo contrario, se seleccionarían varios tipos
celulares (Gudiño-Cabrera y Nieto-Sampedro, 1996). La selección negativa, por otra parte, se
basa en la eliminación de células distintas a la población de interés celulares (Gudiño-Cabrera
y Nieto-Sampedro, 1996; Flores-Figueroa et al., 2006). Dicho lo anterior el método empleado
para la separación celular de los cultivos de GE utilizados en el presente trabajo es por medio
de una selección positiva para p75, mediante una columna inmunomagnética.!
Cuando el cultivo de GE alcanzó la confluencia celular, se realizó una tripsinización suave,
para la cual, la monocapa de células se lavó dos veces con solución de Hanks sin Ca+2 ni M+2,
fría (entre 4 y 8° C) y se incubó con tripsina/ EDTA (0.05%/ 0.02%) durante 2-3 min a
�38
temperatura ambiente, posteriormente se agitó suavemente para facilitar el desprendimiento
de las células. Una vez en suspensión las células se les agregó el medio DF10S 1:1 para
inactivar la tripsina y se lavaron por centrifugación (200 g por 7 min), repitiendose el lavado
con medio sin suero. Las células se incubaron con “dynabeads” (DB), microesferas de material
ferromagnético previamente recubiertas con IgG de cabra contra-ratón y monoclonal 192-
NGFR (Gudiño-Cabrera y Nieto-Sampedro, 1996). Las DB-NGFR se prepararon por
incubación de las DB por al menos 16 h, a 4° C, con anti-NGFR 192 en una relación de 1 µg de
anticuerpo por mg de DB en PBS con 1% de suero fetal bovino. Las DB se concentraron en la
pared del tubo con ayuda de un imán permanente de neoomidio-hierro-boro y se lavaron con
PBS, 3 veces, 5 min cada vez. !
La suspensión de células del cultivo primario se mezcló con DB-NGFR a una relación de 4:1
DB por célula (teniendo en cuenta que aproximadamente el 35% de las células del cultivo son
inmunoreactivas para NGFR y que una suspensión de DB M-450 de 30 mg/ml, equivale a 4 x
108 DB por ml), se incubaron por 40 min a 4° C, finalmente las células NGFR positivas se
resuspendieron en DF10S y fueron disgregadas mediante 6 a 8 pases suaves con una pipeta
Pasteur. Las células NGFR-positivas se sembraron en frascos con PLL a una densidad de 2 a
5x104 células /cm2.!
!6.3.2 Recolección de medio condicionado de la glía envolvente Una vez que los cultivos de GE fueron purificados y estos alcanzaron confluencia celular con
el medio DF10S se cambiaron al medio B27, y ya en este medio, se recolectaron los medios
condicionados tres veces por semana. Se tomó el medio condicionado del frasco de cultivo, se
filtró a través de una malla de 22 µm y se congeló a -20 °C hasta su uso.!
!6.4 Cultivo de células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo Para el cultivo de tejido adiposo se utilizaron ratas macho de 8 a 10 semanas de edad, se
extrajo por lipectomía una muestra de tejido adiposo de la zona inguinal (Fig. 5 a), se colocó
el tejido en una solución de Hanks sin Ca2+ ni Mg2+, ya en condiciones estériles, se pasó el
tejido a una caja de Petri a la cual se le añadieron 5 ml de solución de Hanks sin Ca2+ ni Mg2+
con colagenasa tipo I (10 mg/ml) y tripsina EDTA (10 mg/ml) en relación 1:1(Fig. 5 b), se
�39
cortó el tejido en trozos pequeños (Fig. 5 c), posteriormente se pasó a un tubo cónico de 15
ml, se facilitó la disociación con una pipeta Pasteur con la punta estrechada con la flama,
después se dejó en incubación a 36.5°C durante 30 min, pasado este tiempo en condiciones
estériles se le añadió medio DF10S en proporción 1:1 esto con el fin de inactivar la digestión
de la tripsina y la colagenasa, se centrifugó a 200 g durante 7 min a 25°C. Posteriormente se
decantó el medio, se le añadió medio DF y se resuspendió el precipitado celular, y se repitió
este proceso una vez más, pasando las células por una malla de 70 µm para retener el tejido
no disociado, finalmente se sembró la misma cantidad de células en dos tratamientos
diferentes: 1) medio con suero fetal bovino al 10% (DF10S), y 2) en medio químicamente
definido NH. Después de 48 h se realizó el primer cambio de medio y al alcanzar una
confluencia celular del 80%, se realizó un pase celular, el cual consiste en levantar las células
con una solución de Hanks sin Ca2+ ni Mg2+ con tripsina EDTA (10mg/ml) y colagenasa
(10mg/ml). Se centrifugaron a 200 g y se volvieron a sembrar las células en las mismas
condiciones de medio. !
Con fines comparativos, se tomó el tejido de cada rata para analizar la proliferación entre
ambos tratamientos (DF10S y NH).!
!Figura 5. Metodología del cultivo de CTM-TA. a) Tejido adiposo de rata subcutáneo de la zona inguinal de rata adulta (flecha), b) Tejido adiposo observado en esteroscopio al cual se le se retiró el tejido conectivo; c) El tejido adiposo se cortó en trozos pequeños en una solución de colagenasa I (10 mg /mL) y tripsina EDTA (10 mg/ ml). !
�40
b) c)a)
Se sabe que las CTM presentan la habilidad de adherencia al plástico lo cual permite
seleccionarlas de la población heterogénea de la que son aisladas y que carecen de esta
capacidad (Fig.6) (rev. Dominici et al., 2006; Arévalo et al., 2007).
Figura 6. Técnica de obtención de las CTM-TA. El tejido adiposo aspirado se compone de una FVE que es digerida y precipitada; en ella se encuentran células sanguíneas, fibroblastos, preadipocitos, adipoblastos, pericitos, células endoteliales, además de las CTM (Modificada de Rubin, 2009).!
!6.4.1 Criopreservación celular Una porción de las células obtenidas del cultivo primario se criopreservaron; estas células se
resuspendieron en medio DF10S con 10% de dimetilsulfóxido y 0.01% de metilcelulosa, a una
concentración de 1x106 hasta 10x106 células por ml, y se congelaron a -80° C hasta su uso.!
Para la descongelación celular, los criotubos fueron transferidos rápidamente a un baño
María a 37° C, durante 2 min y se añadieron 4 ml de medio DF10S. Las células en suspensión
se lavaron por centrifugación a 300 g 2 veces, para remover el medio de congelación, el
primer lavado con medio DF10S y el segundo con el medio correspondiente al cultivo. !
!!!!
�41
6.4.2 Conteo celular El conteo celular se realizó con la ayuda de la cámara de Neubauer (hemocitómetro) que
consiste en una rejilla graduada en las que se cuenta las células por cuadrantes. Cada
cuadrante de la cámara de Neubauer representa un volumen total de 0.01mm3. Por lo tanto,
la concentración celular por ml se calcula como: C: (cél/ml)= c x f x 104, donde c: promedio
de número de células por cuadrado, f: factor de dilución. !
!6.4.3 Diferenciación de las células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo Las CTM-TA que previamente se mantuvieron en proliferación en estado indiferenciado, se
sembraron en cajas de ocho pozos, previamente tratadas con PLL a 50 mg/ml a una densidad
aproximada de 2 a 4x104 y, posteriormente se pusieron en tres condiciones diferentes: 1) la
misma condición en la que mantuvieron en proliferación DF10S o NH, 2) medio
suplementado con B27 y 3) medio condicionado por la GE, el cual contiene factores de
crecimiento que fueron secretados por la GE en cultivo. !
Quedando entonces seis grupos experimentales: NH-B27, NH-GE, NH-NH, DF10S-B27,
DF10S-GE, DF10S-DF10S (Tabla 4). !
Tabla 4. Diferenciación de las CTM-TA.!
Las células se mantuvieron durante 72 h en incubación con 5% de CO2 a 36.5°C, con los
medios antes mencionados, posterior a esto las células se fijaron con paraformaldehído al 4%
tal como se describe en el proceso de inmunohistoquímica.!
!!!!
Células que se mantuvieron proliferando en estado
indiferenciado en medio:
NH DF10S
Medio de cultivo para la
diferenciación
NH DF10S
B27 B27
Cond. GE Cond. GE
�42
6.4.4 Inmunocitoquímica Los anticuerpos NG2, GFAP, p75 y VIM que se utilizaron para la realización de la
inmunocitoquímica se diluyeron en PBS con 0.1% de suero de cabra tal como se muestra en la
tabla 5.!
Para marcar las células que se cultivaron sobre las cajas de ocho pozos y se lavaron dos veces
con DF y se fijaron con paraformaldehído al 4%, por 8 min a temperatura ambiente, después
se realizaron 3 lavados con PBS. Los anticuerpos primarios se prepararon en las
concentraciones indicadas en la tabla 5, en PBS-1% de albúmina, y se adicionó con Tritón X
100 al 0.1% (PBS –TX100) en el caso de emplear anticuerpos contra antígenos intracelulares. A
excepción del anticuerpo contra p75 que se incubó durante al menos 16 h a 4°C, los demás
anticuerpos se incubaron por 1 h a temperatura ambiente y a continuación se incubaron con
sus respectivos anticuerpos secundarios diluidos 1:1000 durante 45 min, a T.A., después se
lavaron 3 veces 5 min cada vez, y finalmente un lavado rápido con agua bidestilada, e
inmediatamente después se les agregó glicerol diluido en PBS en proporción 1:1 para su
montaje y su posterior observación en un Microscopio de Fluorescencia.!
!Tabla 5. Anticuerpos primarios y secundarios. !
rb: rabbit, m: mouse !
!!!!!!
Anticuerpos primarios
Dilución en PBS con 0.1% suero de
cabra
Anticuerpos secundarios o
Alexas
Dilución en PBS con 0.1% suero de
cabra
NG2 rb 1:1,000 IgG rb 594 1:1,000
GFAP rb 1:1,000 IgG rb 594 1:1,000
p75 m 1:1,000 IgG m 488 1:1,000
VIM m 1:1,000 IgG m 488 1:1,000
�43
7. RESULTADOS
7.1 Cultivo de glía envolvente La GE de BO presentó tres tipos de fenotipos: bipolar, semi estrellado y estrellado (Fig. 7).!
!!! !!
!!!!!!!!!!Figura 7. Células de GE de BO de rata a los 6 DIV (días in vitro). a) Células de GE con fenotipo semiestrellado (flechas negras); b) célula de GE bipolar (flecha negra), microglía (círculo), fibroblasto (flecha blanca); c) células de GE con fenotipo estrellado (flecha negra) y d) células de GE con fenotipo bipolar (flecha negra), otros fenotipos de células tales como microglía (círculo). Barra 40 μm.!
!7.1.1 Inmunopurificación magnética Los medios condicionados por la GE deben obtenerse de cultivos de GE con una pureza
celular aproximada del 80%, cuando se observaba una proporción mayor al 20% de células
distintas, como fibroblastos (identificados como células de 70 a 100 μm aproximadamente,
con bordes irregulares no muy contrastados) y microglía (células de morfología poligonal,
con mayor contraste que la GE y numerosas vesículas en su interior), se realizaba entonces
una inmunopurifación magnética p75 positiva para la GE.!
�44
d
c
a
dc
b
7.2 Cultivo de células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo El análisis de los resultados de la proliferación de las CTM-TA en los medios NH y DF10S se
realizó de manera cualitativa, en donde se logró apreciar que las CTM-TA cultivadas en
medio NH proliferaban de 5 a 8 veces mayor en comparación a las cultivadas por DF10S a los
4 DIV (Fig. 8 a, b). A pesar de que las células en medio DF10S tardaban más en proliferar
respecto a las cultivadas en medio NH, al segundo pase celular (6-7 DIV), las células en
DF10S alcanzaban la confluencia celular que mantenían las cultivadas en NH. La morfología
mostrada en ambas condiciones (DF10S y NH), corresponde a la morfología fibroblastoide
característica de las células troncales (Fig. 8).!
!!
!
!!!!
!Figura 8. Confluencia celular de las CTM-TA in vitro. a) Células mantenidas en medio NH a los a) 4 DIV, c) 6
DIV, e) 7 DIV y células mantenidas en medio DF10S a los b) 4 DIV, d) 6 DIV y f) 7 DIV. Barra 70 μm.!
�45
a b
c d
NH DF10S
4 DIV
6 DIV
7 DIV
e f
!7.2.1 Criopreservación celular Las CTM-TA que se criopreservaron a -80º C mostraron una supervivencia del 80% después
del descongelamiento, se adhirieron a la superficie del frasco de cultivo y mostraron todas las
características observadas en las células que no fueron criopreservadas. !
!7.2.2 Diferenciación de las células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo Las CTM-TA cultivadas tanto en NH como en medio DF10S (Fig. 9 i, j, k, l y 10 i, j, k, l
respectivamente) en cajas de ocho pozos para su caracterización inmunocitoquímica,
mostraron sus características originales de morfología fibroblastoide y proliferación celular,
razón por la cual se sembraron a una densidad de 1x104 cél/cm2. Estas células resultaron
negativas para NG2 y positivas para p75, VIM y GFAP, aunque el marcaje de GFAP se
observó difuso cerca del núcleo, y no filamentoso en células con morfología aplanada (Fig. 9 j
y 10 j). !
Las CTM-TA que se mantuvieron en proliferación tanto en medio NH como en medio DF10S,
y que se pusieron posteriormente en medio suplementado con B27 (Fig. 9 a, b, c, d, y 11 a, b,
c, d), después de 72 h presentaron cambios morfológicos de fibroblastoide a pequeñas células
de aproximadamente 30 a 40 μm, con formas ovaladas y algunos pequeños procesos,
birrefringentes, sin embargo a pesar de ser sembradas a una mayor densidad de 4x104 cél/
cm2, no se observaron muestras de proliferación celular, el marcaje inmunocitoquímico reveló
que en estas condiciones las CTM-TA fueron negativas para NG2 y positivas para p75, VIM y
GFAP aunque el marcaje con GFAP fue también muy distinto sin formación de haces. !
Finalmente, las CTM-TA de ambas condiciones (DF10S y NH) que se pusieron en
diferenciación por 72 h en medio condicionado por la GE (Fig. 9 y 10), se sembraron a una
densidad de 4x104 cél/cm2, en éstas condiciones, las células adquirieron morfología bipolar, o
estrellada con bordes bien definidos, y birrefringentes, muy parecidos a los de la GE en
cultivo, estas células fueron negativas de igual manera a NG2 y positivas para GFAP, p75 y
VIM, y a diferencia de los tratamientos anteriores, en ésta condición tanto la VIM como GFAP
que se observa en las células bipolares, muestran la disposición en haces, característicos de la
GE (Fig. 9 f y 10 f).!
�46
!7.2.3 Análisis inmunocitoquímico
!!!!
!!
!!!!!
!!!!
!Figura 9. CTM-TA de la zona inguinal de rata con tratamiento NH in vitro. Durante la diferenciación en medio B27 (a, b, c, d), en medio condicionado por la GE (e, f, g, h) y en medio NH (i, j, k, l). Barra 100 μm.!
�47
____
p75
d
p75 p75
GFAP GFAP GFAP
VIM VIM VIM
NG2 NG2 NG2
a
b
c
h l
kg
f j
ie____
NH-B27 NH-GE NH-NH
!
!!
!!
!!!
!!
!
!Figura 10. CTM-TA de la zona inguinal de rata con tratamiento DF10S in vitro. Durante la diferenciación en medio B27 (a, b, c, d), en medio condicionado por la GE (e, f, g, h) y en medio DF10S (i, j, k, l). Barra 100 μm. !
!!!!
�48
DF10S-B27 DF10S-GE DF10S-DF10S
VIM
a
NG2 NG2NG2
p75p75p75
GFAPGFAPGFAP
VIMVIM
kgc
jfb
ie
d h l
___
Tabla 6. Anticuerpos expresados por las CTM-TA tratadas en cultivo con NH; después de 72 h de
diferenciación.
(+) Inmunorreactividad positiva; (-) Inmunorreactividad negativa.!
!Tabla 7. Anticuerpos expresados por las CTM-TA tratadas en cultivo con DF10S; después de 72 h de
diferenciación.!
!
(+) Inmunorreactividad positiva; (-) Inmunorreactividad negativa.!
!!!!!!!!!!!!!
Células en cultivo NH GFAP p75 NG2 VIM
Control B27 + + - +
GE + + - +
NH + + - +
Células en cultivo DF10S GFAP p75 NG2 VIM
Control B27 + + - +
GE + + - +
DF10S + + - +
�49
7.2.3.1 Expresión de GFAP !!
!
!Figura 11. Expresión de GFAP de las CTM-TA de la zona inguinal de rata. A), B), y C) células con tratamiento NH in vitro y durante las horas de diferenciación con condicionado de GE; D), E) y F) células con tratamiento DF10S in vitro y durante las horas de diferenciación con condicionado de GE. Barra 100 μm.
!!!!!
�50
A)
B)
C)
D)
F)
GFAP
GFAP
GFAP
GFAP
GFAP
GFAP
NH-GE DF10S-GE
E)
!7.2.3.2 Expresión de p75
!!Figura 12. Expresión de p75 de las CTM-TA de la zona inguinal de rata. A) y B), células con tratamiento NH in vitro y durante las horas de diferenciación con condicionado de GE; C) y D) células con tratamiento DF10S in vitro y durante las horas de diferenciación con condicionado de GE. Barra 100 μm.
!7.2.4.Caracterización morfológica de la diferenciación de las CTM-TA hacia fenotipo Schwann-like Ambos tratamientos presentaron la diferenciación morfológica hacia fenotipo Schwann-like al
exponerlas la medio condicionado de la GE, con somas mas pequeños, ovalados y con
prolongaciones largas y finas (Castellano et al., 2000). !
!!
�51
NH-GE DF10S-GE
A)
B)
C)
D)
p75
p75p75
p75
8. DISCUSIÓN
8.1 Cultivo de glía envolvente En cultivo la GE de BO presenta principalmente dos fenotipos morfológicos celulares: el
bipolar y el aplanado o semiestrellado y la transición morfológica entre ambos tipos se debe a
las condiciones del cultivo (Gudiño-Cabrera et al., 2007; Kocsis et al., 2009).!
Al primer día de cultivo de la GE, es necesario mantenerla en medio con suero fetal bovino
10% (DF10S) para que ésta reciba los factores de crecimiento necesarios que le permitan
adherirse al sustrato y estimular su proliferación y supervivencia celular (Hernández y
Juárez, 2009), en esta situación las células se disponen de forma paralela (Fig. 8 d).!
!8.1.1 Inmunopurificación magnética De los 10 a los 15 DIV se realizaba inmunopurificación magnética positiva para p75 (Fig. 14),
Al cultivo se le añadía medio DF10S que al estar en contacto en un cultivo puro en células de
GE, se recogía el medio como medio condicionado, el cual entonces contiene solo factores de
crecimiento producidos por la GE y no los de suero fetal bovino, por otra parte, el remplazar
el medio DF10S por el medio suplementado con B27 permite reducir la proliferación celular,
incluyendo la de otras células, como los fibroblastos y microglía y es cuando la GE adquiere
la morfología de GE semiestrellada. Aunque la heterogeneidad del cultivo puede atribuirse a
fuente del tejido, edad del donador, método de aislamiento y condiciones de cultivo, la
morfología de la GE también se sabe que es afectada por moléculas intra y extracelulares
tales como cAMP, dBcAMP endotelina 1 y Fibulina 3 (Su y He, 2010). !
Figura 13. La GE purificada con perlas magnéticas positivas para p75. La flecha marca las “dynabeads”.!
!
�52
8.2 Morfología CTM-TA en estado indiferenciado Los cultivos in vitro de las CTM constan de una población que morfológicamente presentan forma
espigada (denominada fibroblastoide), con un núcleo grande, alargado y céntrico con dos o tres
nucléolos (Flores-Figueroa et al., 2006). A pesar de que las CTM-TA en estado indiferenciado
presentaron la morfología fibroblastoide, algunas veces las células presentaron distintas
morfologías apreciadas durante el transcurso del cultivo las cuales corresponden a transiciones
celulares que dependen de la confluencia celular en donde influyen los contactos celulares y los
factores secretados por las células, esto concuerda con que las células en cultivo primario presentan
morfologías heterogéneas y a partir del tercer replaqueo, el cultivo se estabiliza y homogeneiza
(http://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/cultivo_celular.pdf).
!8.3 Proliferación de las CTM-TA en estado indiferenciado Los resultados obtenidos en el presente trabajo nos permitieron determinar que tanto el
medio suplementado con 10% SFB (DF10S), como el medio NH permiten la proliferación en
estado indiferenciado de las CTM-TA, aunque el medio NH estimulaba una rápida
proliferación, al poco después de poner a las células en cultivo, las células en el medio DF10S
alcanzaban una confluencia similar, sin embargo, cabe mencionar que el pase celular se
realizaba cuando las células en tratamiento DF10S presentaban una confluencia al 80%
mientras que las células NH presentaban una confluencia mayor. Ahora bien, se sabe que al
alcanzar una confluencia cercana a 100% el crecimiento celular se detiene por inhibición por
contacto y las células pueden comenzar a degenerararse, despegarse y morir (Studzinski,
2001), por lo que consideramos que si las células DF10S alcanzaron posteriormente una
confluencia similar a las células tratadas en NH, es debido a las diferentes confluencias en las
que fueron levantadas para el pase celular. !
!8.4 Análisis morfológico de las CTM-TA en estado indiferenciado Las CTM-TA que no fueron expuestas al medio de diferenciación en medio NH mostraron
una morfología de célula extendida, parecidas a fibroblasto; mientras las CTM-TA que no
fueron expuestas al medio de diferenciación en medio DF10S, algunas veces mostraron un
cambio morfológico notorio, con prolongaciones definidas, lo que nos indica que el medio
�53
NH mantiene durante todo el proceso una morfología de CTM, debido a que este medio
definido está estandarizado y optimizado para la expansión reproducible de las CTM
derivadas de médula ósea, mientras que en las células tratadas con suero no mantienen el
fenotipo de célula mesenquimal, así mismo, el suero en general es una indefinida mezcla de
aproximadamente 1,000 biomoléculas, que incluye hormonas, proteínas, factores
estimulantes e inhibidores de crecimiento además de una multitud de componentes todavía
desconocidos, todos estos pueden tener un efecto no deseado sobre las células en estudio
(Hernández y Juárez, 2009; Kinzebach y Bieback, 2013), por lo que consideramos que el
medio con suero (DF10S) induce tal cambio morfológico debido a la gran cantidad de factores
y biomoléculas antes ya mencionadas. !
!8.5 Diferenciación de las CTM-TA hacia fenotipo Schwann-like La GE secreta distintos factores de crecimiento, muchos reconocidos por sus propiedades
promotoras del crecimiento (Huang et al., 2011), sin embargo, existen otros que aún se
desconocen y esta combinación especial de factores, es la que se ha empleado en distintos
estudios de diferenciación de células troncales de distintas fuentes hacia el fenotipo Schwann-
like. Las células troncales son sensibles a percibir las señales del medio en que se mantienen,
en nuestro equipo de investigación se han diferenciado células troncales neurales, células
troncales de cordón umbilical, de médula ósea, entre otras, observando la capacidad de estas
células de diferenciarse hacia el fenotipo de interés. En este trabajo observamos la
diferenciación morfológica de las CTM-TA hacia el fenotipo Schwann-like (Fig. 9 e, f, g fig. 10
e, f, g), en medio condicionado por la GE, en donde se aprecian formas bipolares y
birrefringentes.!
!8.6 Células de grupo control B27 En teoría el uso de medio definido suplementado reduce la variabilidad de las condiciones de
cultivo (Chen et al., 2009), por lo que el medio suplementado y definido B27 es nuestro grupo
control, sin embargo, las CTM-TA previamente tratadas en NH (Fig. 9 a, b y c), como las
tratadas en DF10S (Fig. 10 a, b y c) presentaron cambios morfológicos no esperados al
�54
añadirseles el medio B27, mostrando somas celulares más pequeños, redondos u ovalados,
inclusive algunas células mostraron pequeñas prolongaciones marcadas con las flechas (Fig. 9
a y fig. 10 a). Ahora bien, se sabe que el medio suplementado B27 cuenta con 27 componentes
definidos (Chen et al., 2009) tales como biotina, DL alfa acetato de tocoferol, DL alfa-tocoferol,
ácido graso libre de BSA, catalasa, insulina humana recombinante, transferrina humana,
superoxido dismutasa, corticosterona, D-galactosa, etanolamina HCL, glutation (reducido),
L-carnitina HCL, ácido linoleico, ácido linolénico, progesterona, putrescina 2HCl, selenio de
sodio, entre otras, por lo que consideramos que si bien estos factores pudiesen ser los que
inducen dicho cambio morfológico, o bien pudiese ser el repentino cambio de medio de
cultivo es decir, del tratamiento al medio suplementado B27.!
!8.7 Caracterización inmunocitoquímica de la diferenciación de las CTM-TA hacia fenotipo Schwann-like Las células de glía envolvente de bulbo olfatorio expresan distintos tipos y variables
antigenos, incluyendo, p75NTR, S100b, GFAP, NPY and O4, mientras que la GE también
expresan una combinación de importantes proteínas, incluyendo CD 44, b1 integrina, P200,
Notch 3, NG2, VEGF, PACAP (Su y He, 2010; Castellano et al., 2000).!
!8.7.1 Expresión de vimentina Los filamentos intermedios son los elementos del citoesqueleto menos dinámicos del
citoesqueleto, formando generalmente una red que se extiende por toda la célula, brindando
soporte y estabilidad celular, además de regular la localización de proteínas y transmisión de
señales intracelulares (Paramio y Jorcano, 2002). Ahora bien, la vimentina (VIM) es un
filamento intermedio, que es expresado por células gliales, células de Schwann, células
epiteliales y algunas neuronas además de precursores neurales multiponteciales (Martínez y
Martínez, 2010). Se conoce que la VIM durante la mitosis juega un papel fundamental en el
tráfico y la distribución de las proteínas de filamentos intermedios y otros factores celulares
durante la división celular (Eng y Lee, 1995; Doetsch et al., 1997; Lo Furno et al., 2013).!
�55
En nuestros resultados, era de esperarse la expresión positiva de VIM en las CTM-TA
diferenciadas con medio condicionado por la GE, en medio NH (Fig. 9 e) y en medio DF10S
(Fig. 10 e); ya que como se dijo la VIM es expresada por células gliales, no obstante, Deng y
colaboradores en 2001 reportaron en las CTM la expresión positiva de ciertos marcadores de
fenotipo neural sin inducir ninguna diferenciación en condiciones estándar de los cultivos,
entre estos marcadores esta incluido VIM, Martínez y Martínez reportaron en 2010, la
expresión de VIM en células mesenquimáticas, lo que explica que nuestras CTM-TA en
estado indiferenciado, también expresaran VIM, tanto en medio NH (Fig. 9 i) como en medio
DF10S (Fig. 10 i).!
!8.7.2 Expresión de GFAP Además de la VIM la GFAP es un filamento intermedio, descrito en las células gliales,
proporciona estabilidad estructural, modula el movimiento y forma celular (Eng et al., 2000),
sin embargo, es una proteína que cuenta con al menos ocho isoformas y se ha descrito en
diversos tejidos no neurales (Carrillo-González, 2006). Ahora bien, mientras que en el 2000
Sanchéz-Ramos y su grupo de investigación reportaron bajos niveles de expresión de GFAP
con técnica de inmunocitoquímica en CTM, Deng y colaboradores en 2001 reportaron en las
CTM-MO la expresión de GFAP como positiva (Deng et al., 2006). En el presente estudio se
observó expresión de GFAP tanto en las CTM-TA en estado indiferenciado como en las
células diferenciadas hacia fenotipo Schwann-like. En las CTM-TA la expresión de GFAP se
observó de manera difusa distribuida por todo el citoplasma, sin formar haces, las cuales
aparecieron después de la diferenciación con el medio condicionado por la GE (Fig. 11) y
particularmente en las células con morfología Schwann-like, sin embargo, los filamentos
intermedios de la GE son abundantes y se encuentran de forma dispersa más que
organizadas en paquetes (Castellano et al., 2000).!
!!!
�56
8.7.3 Expresión de p75 El p75 es el receptor de baja afinidad para neurotrofinas el cual tiene múltiples funciones en
la célula, apoptosis, proliferación, diferenciación, regeneración, extensión axonal, crecimiento
de neuritas o colapso. La GE expresa este marcador, pero poco se sabes sobre su función en
estas células (Raucci et al., 2013). Mientras que la GE tiene una alta expresión de p75 en
cultivo, muestra una baja expresión de p75 en condiciones estables in vivo. Sin embargo, p75
es sobreexpresado después de lesiones axonales periféricas (Kocsis et al., 2009). !
En el análisis de los resultados esperábamos una expresión alta de p75 en cultivo de las CTM-
TA diferenciadas lo que indicaría que las células se están diferenciado hacia fenotipo de GE,
mostrandose una expresión positiva en ambos tratamientos tanto en NH, como en DF10S (Fig
12). Sin embargo, p75 también lo expresan células troncales adultas, embrionarias y de cáncer
(Tomellini et al., 2014), además en el 2007 Yamamoto y colaboradores demostraron que p75 es
un marcador útil para aislar células troncales derivadas de tejido adiposo (CTM-TA)
(Yamamoto et al., 2007); lo que explica claramente la expresión de p75 tanto en las CTM-TA
diferenciadas con condicionado de GE (Fig. 12 A) B) C) y D)), como en las CTM-TA sin
diferenciar (Fig 9k y 10k) para ambos tratamientos (NH y DF10S).!
!8.7.4 Expresión de NG2 El NG2 condroitin sulfato proteoglicano juega un papel fundamental en reparación de la
mielina (Richarson et al., 2011) y es expresado en el desarrollo del SNC, lo expresan las células
precursoras gliales y células implicadas en la plasticidad (Yang et al., 2006; Leoni y et al.,2014),
sin embargo, Gudino-Cabrera y Nieto-Sampedro en 1999 reportaron que NG2 es una de las
proteínas expresadas por la GE de la lamina propria además de que Su y He en el 2010 lo
reafirman, lo que claramente explica la nula expresión de NG2 debido a que nuestra fuente es
GE de bulbo olfatorio.!
En nuestros resultados las CTM-TA no fueron positivos para NG2, ni en las células
diferenciadas con medio condicionado por la GE, ni en las CTM-TA sin diferenciar (Fig. 9 h, l
y fig. 10 h, l). Cabe mencionar que un trabajo previo de nuestro laboratorio, NG2 se expresó
�57
en CTM-MO indiferenciadas, pero su expresión disminuyó al inducir la diferenciación a
fenotipo GE, aunque si se presentó morfología de células Schwann-like (Rodríguez-Vázquez,
2012).!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
�58
!9. CONCLUSIONES
I. No se puede concluir si el medio condicionado por la GE indujo la diferenciación de las
CTM-TA hacia el fenotipo Schwann-like debido a que los marcadores que considerábamos
control para marcar la GE, también fueron positivos para las CTM en estado
indiferenciado.!
II. En estado de proliferación e indiferenciado las CTM-TA tanto en medio NH como en
medio DF10S mostraron plástico adherencia y morfología fibroblastoide características de
las CTM.!
III. En ambas condiciones de cultivo (en medio NH y DF10S) las células mostraron cambios
morfológicos al exponerlas al medio condicionado por la GE, de apariencia fibroblastoide
hacia morfología bipolar.!
IV. Tanto las CTM-TA en estado indiferenciado como las CTM-TA diferenciadas en medio
condicionado por la GE mostraron la expresión de GFAP, p75 y VIM y la no expresión de
NG2.!
!!!!!!!!!!!!!
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10. PERSPECTIVAS
Es importante resaltar que los marcadores que considerabamos específicos para células de GE
como GFAP y p75 se han reportado que las CTM han expresado estos anticuerpos de
fenotipo neural in vitro en condiciones estándar del cultivo (es decir sin diferenciar) (Deng et
al., 2006), por lo que consideramos será necesario utilizar además de estos, otros marcadores
de GE que no expresaran las CTM tal como Nestina, S100β, O4, NCAM, NPY. Así como la
previa caracterización de células mesenquimales en donde se podrían realizar cinco pases
celulares para incrementar la pureza del cultivo observando un incremento en la expresión
de marcadores de origen mesenquimal reportado en Al-Saqi y colaboradores en 2009. La
expresión e inexpresión de marcadores, además de las características morfológicas
determinará la diferenciación de las células hacia fenotipo Schwann-like de GE. !
Por otra parte, para los cultivos celulares de humano y para trasplantes es necesario utilizar
medios sin suero provenientes de animal debido a las reacciones inmunológicas, peligro de
transmisión de priones o virus, mycoplasma, o polipéptidos, xenogénicos que se encuentran
en suero bovino (Felka et al., 2010; Jung et al., 2012). Por lo que es necesario encontrar medios
de cultivo grado clínico con suplementos que sustituyan al suero animal, o suplementado con
suero humano.!
Ya diferenciadas las CTM-TA de humanos hacia fenotipo Schwann-like, seria interesante
realizar transplantes alogénicos debido a la inmunoregulación que prestan las células
troncales, con la finalidad de observarlas en diversas patologías del SNC, incluidas las
lesiones de médula espinal. !
!!!!!!
�60
11. LITERATURA CITADA
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