LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

AUŠRINĖ SAKALAUSKAITĖ

DIHIDROKVERCETINO TIEKIMO Į ODĄ SISTEMŲ

BIOFARMACINIS VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Vitalis Briedis

KAUNAS, 2016

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

Data

DIHIDROKVERCETINO TIEKIMO Į ODĄ SISTEMŲ BIOFARMACINIS VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Vitalis Briedis

Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė

Aušrinė Sakalauskaitė

Data Data

KAUNAS, 2016

3

TURINYS SANTRAUKA ............................................................................................................................................... 5

SANTRUMPOS ............................................................................................................................................. 8

ĮVADAS ......................................................................................................................................................... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ......................................................................................................... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................................................................ 11

1.1. Odos pažeidimų priežastys ir jų prevencija ................................................................................... 11

1.2. Dihidrokvercetinas ......................................................................................................................... 12

1.2.1. Paplitimas ............................................................................................................................... 12

1.2.2. Struktūra ir antioksidacinis aktyvumas .................................................................................. 12

1.2.3. Dihidrokvercetino poveikis odoje .......................................................................................... 14

1.3. Veikliųjų medžiagų skvarba į odą ir skvarbą įtakojantys faktoriai ............................................... 15

1.4. Geliai ............................................................................................................................................. 17

1.5. Mikroemulsijos .............................................................................................................................. 17

1.6. Cheminių skvarbos skatintojų apžvalga ........................................................................................ 18

2. METODIKA ......................................................................................................................................... 22

2.1. Tyrimo objektas ............................................................................................................................. 22

2.2. Medžiagos ir įranga ....................................................................................................................... 22

2.2.1. Medžiagos .............................................................................................................................. 22

2.2.2. Įranga ...................................................................................................................................... 23

2.3. Dihidrokvercetino kiekybinio nustatymo metodika ...................................................................... 23

2.4. Dihidrokvercetino atskyrimas nuo papildomo produkto ............................................................... 23

2.5. Dihidrokvercetino ekstrakto grynumo vertinimas ......................................................................... 24

2.6. Dihidrokvercetino ekstrakto tirpumo vertinimas ........................................................................... 24

2.7. Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu gamyba ........................................................ 24

2.7.1. Gelių gamybos metodika ........................................................................................................ 24

4

2.7.2. Mikroemulsijų gamybos metodika ......................................................................................... 25

2.8. Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu kokybės vertinimas ...................................... 26

2.8.1. Eksperimentinių formuluočių fizikinių savybių nustatymas .................................................. 26

2.8.2. Eksperimentinių mikroemulsijų termodinaminio stabilumo vertinimas ................................ 27

2.8.3. Dihidrokvercetino atpalaidavimo iš eksperimentinių gelių in vitro tyrimai .......................... 27

2.9. Dihidrokvercetino skvarbos į žmogaus odą tyrimai ex vivo .......................................................... 27

2.10. Statistinė duomenų analizė ............................................................................................................ 28

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS .................................................................................................. 29

3.1. Dihidrokvercetino ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacija .................... 29

3.2. Dihidrokvercetino atskyrimas nuo papildomo produkto ............................................................... 31

3.3. Dihidrokvercetino ekstrakto grynumas ......................................................................................... 33

3.4. Dihidrokvercetino ekstrakto tirpumas ........................................................................................... 33

3.5. Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu kokybės vertinimas ...................................... 35

3.5.1. Gelių fizikinės savybės ........................................................................................................... 35

3.5.2. Mikroemulsijų fizikinės savybės ir termodinaminis stabilumas ............................................ 36

3.5.3. Dihidrokvercetino atpalaidavimas iš eksperimentinių gelių in vitro ..................................... 37

3.6. Dihidrokvercetino skvarba į žmogaus odą tyrimuose ex vivo ....................................................... 41

3.6.1. Dihidrokvercetino skvarba į odą iš eksperimentinio gelio ..................................................... 41

3.6.2. Cheminių skvarbos skatintojų ir raginio sluoksnio įtaka dihidrokvercetino skvarbai į odą .. 42

3.6.3. Dihidrokvercetino skvarba į odą iš mikroemulsijų ................................................................ 49

3.6.4. Dihidrokvercetino skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimų rezultatų apibendrinimas ........... 50

IŠVADOS ..................................................................................................................................................... 52

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ........................................................................................................... 53

LITERATŪROS SĄRAŠAS ........................................................................................................................ 54

TYRIMŲ REZULTATŲ SKLAIDA ........................................................................................................... 61

PRIEDAI ...................................................................................................................................................... 62

5

SANTRAUKA

DIHIDROKVERCETINO TIEKIMO Į ODĄ SISTEMŲ BIOFARMACINIS VERTINIMAS

A. Sakalauskaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. V. Briedis; Lietuvos

sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas - įvertinti dihidrokvercetino ir jo tiekimo į odą sistemų biofarmacines charakteristikas.

Darbo uždaviniai: pritaikyti ir įteisinti analitinį ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodą;

pagaminti eksperimentines dihidrokvercetino formuluotes – gelius ir mikroemulsijas – bei įvertinti jų

kokybę; ištirti dihidrokvercetino skvarbą iš eksperimentinių formuluočių į žmogaus odą ex vivo; įvertinti

skvarbos skatintojų įtaką dihidrokvercetino skvarbai į žmogaus odos sluoksnius.

Metodai. Dihidrokvercetino kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti naudotas validuotas ultra-efektyviosios

skysčių chromatografijos metodas. Dihidrokvercetino atpalaidavimo iš gelių tyrimai in vitro atlikti

naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes. Dihidrokvercetino skvarbos iš eksperimentinių

formuluočių į žmogaus odą ex vivo tyrimai atlikti naudojant modifikuotas Bronaugh tipo pratakias difuzines

celes.

Rezultatai. Atpalaiduotas dihidrokvercetino kiekis iš gelių formuluočių in vitro buvo nuo 0,75 mg/cm2

(26,62 proc.) iki 2,17 mg/cm2 (76,66 proc.). Dihidrokvercetino atpalaidavimui iš gelių įtakos turėjo

gelifikuojančios medžiagos karbomero 980 koncentracija bei skvarbą skatinančios medžiagos. Iš 1 proc.

karbomero gelių formuluočių į žmogaus odos epidermį įsiskverbė nuo 0,9882 ± 0,1854 µg/mg iki 3,2074 ±

0,2392 µg/mg, o į dermą – nuo 0,0028 ± 0,007 µg/mg iki 0,0242 ± 0,0066 µg/mg dihidrokvercetino. Pušies

ir eglės spyglių eteriniai aliejai statistiškai reikšmingai (p < 0,05) pagerino dihidrokvercetino skvarbą į odos

sluoksnius. Nustatyti eglės ir pušies spyglių eterinių aliejų skatinamieji santykiai į epidermį – 2,68 ir 1,86,

o į dermą – 7,49 ir 3,05. Dietilenglikolio monoetilo eteris bei PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai nepagerino

dihidrokvercetino skvarbos. Iš 5:1, 6:1 bei 7:1 surfaktanto ir kosurfaktanto (S:KoS) santykių mikroemulsijų

į epidermį įsiskverbė nuo 0,0762 ± 0,0087 µg/mg iki 0,0906 ± 0,0166 µg/mg dihidrokvercetino. Dermos

sluoksnyje bei akceptorinėje terpėje aptiktas dihidrokvercetinas buvo žemiau kiekybinio nustatymo ribos.

S:KoS santykis bei dinaminė klampa neturėjo reikšmingos įtakos dihidrokvercetino skvarbai iš

mikroemulsijų (p > 0,05).

Išvados. In vitro atpalaidavimo tyrimų rezultatai patvirtino sumodeliuotų gelių tinkamumą

dihidrokvercetino tiekimui į odą. Skvarbos ex vivo tyrimų rezultatai parodė, kad dihidrokvercetino skvarba

į žmogaus odą iš gelių buvo nuo 10 iki 35 kartų efektyvesnė nei iš mikroemulsijų (p < 0,05).

Veiksmingiausias skvarbos skatintojas buvo eglės spyglių eterinis aliejus (p < 0,05).

6

SUMMARY

BIOPHARMACEUTICAL EVALUATION OF DIHYDROQUERCETIN TOPICAL DELIVERY

SYSTEMS

A. Sakalauskaitė Master thesis/ scientific supervisor prof. dr. V. Briedis; Lithuanian University of Health

Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.

The aim: to evaluate biopharmaceutical characteristics of dihydroquercetin topical delivery systems.

Tasks: to develop and validate ultra-high performance liquid chromatography method; to prepare

experimental dihydroquercetin formulations – gels and microemulsions – and evaluate their quality; to

assess dihydroquercetin penetration from experimental formulations into human skin ex vivo; to evaluate

the influence of penetration enhancers on dihydroquercetin penetration into human skin layers.

Methods. Validated ultra-high performance liquid chromatography method was used for identification and

quantification of dihydroquercetin. In vitro release studies were performed using modified Franz type

diffusion cells. Dihydroquercetin skin penetration experiments ex vivo were carried out using full-thickness

human skin in modified Bronaugh type flow-through diffusion cells.

Results. Dihydroquercetin release from gel formulations in vitro ranged from 0.75 mg/cm2 (26.62 proc.) to

2.17 mg/cm2 (76.66 proc.). Dihydroquercetin release was influenced by the concentration of carbomer 980

and the presence of chemical penetration enhancers. Dihydroquercetin amounts penetrated from 1%

dihydroquercetin gels ranged from 0.9882 ± 0.1854 µg/mg to 3.2074 ± 0.2392 µg/mg in epidermis and from

0.0028 ± 0.007 µg/mg to 0.0242 ± 0.0066 µg/mg in dermis. Pine needle oil and spruce needle oil enhanced

dihydroquercetin penetration into skin layers at statistically significant level (p<0.05). Enhancing ratios for

spruce needle oil and pine needle oil were determined: epidermis – 2.68 and 1.86, dermis – 7.49 and 3.05,

respectively. Diethylene glycol monoethyl ether and PEG-8 caprylic/capric glycerides were not effective as

penetration enhancers. Dihydroquercetin amounts detected in epidermis from 5:1, 6:1 and 7:1 surfactant

and cosurfactant ratios (S:CoS) microemulsions (MEs) ranged from 0.0762 ± 0.0087 µg/mg to 0.0906 ±

0.0166 µg/mg. Dihydroquercetin was identified both in dermis and acceptor medium below the limit of

quantification. S:CoS ratios and dynamic viscosity did not demonstrated significant influence on

dihydroquercetin penetration from MEs.

Conclusions. In vitro release studies confirmed the suitability of gel formulations for topical delivery of

dihydroquercetin. Results demonstrated that dihydroquercetin penetration into human skin was more

effective from gels compared to microemulsions (p<0.05). Spruce needle oil was the most effective

penetration enhancer (p<0.05).

7

PADĖKA

Už suteiktas puikias darbo sąlygas, pagalbą ir patarimus rengiant mokslinį darbą nuoširdžiai dėkoju

darbo vadovui, Klinikinės farmacijos katedros vedėjui prof. dr. Vitaliui Briedžiui.

Už pagalbą bei patarimus atliekant mokslinius tyrimus nuoširdžiai dėkoju Klinikinės farmacijos

katedros doktorantui Vyčiui Čižinauskui, lekt. dr. Modestui Žiliui ir visam katedros kolektyvui.

8

SANTRUMPOS

A/V – aliejus vandenyje

ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas

DMPD – N,N-dimetil-p-fenilendiaminas

DHK – dihidrokvercetinas

DEGEE – dietilenglikolio monoetilo eteris

EA – eterinis aliejus

LOD – kokybinio nustatymo riba

LOQ – kiekybinio nustatymo riba

LogP – n-oktanolio-vandens pasiskirstymo koeficientas

SN – bazinės linijos triukšmas

S:KoS – surfaktanto ir kosurfaktanto santykis

ME – mikroemulsija

MeOH - metanolis

PDI – polidispersiškumo indeksas

PEG-8 KG – PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai

P6I – poligliceril-6-izostereatas

SS – skatinamasis santykis

UESC – ultra-efektyvioji skysčių chromatografija

UV – ultravioletinė spinduliuotė

VDD – vidutinis dalelių dydis

9

ĮVADAS

Žmogaus oda yra išorinis organas, saugantis organizmą nuo įvairių aplinkos faktorių. Vienas iš

pagrindinių faktorių, sukeliančių odos pažeidimus, yra saulės ultravioletinė (UV) spinduliuotė. Intensyvus

UV spinduliuotės poveikis skatina oksidacinio streso procesus odoje, todėl didina odos uždegimo,

pigmentacijos ar odos vėžio riziką [1]. Siekiant apsisaugoti nuo oksidacinio streso sukeltų odos pažeidimų,

aktuali veiksmingų apsauginių priemonių paieška. Tyrėjai didelį dėmesį skiria veiksmingų natūralių

antioksidantų paieškai [1,2].

Dihidrokvercetinas yra augalinės kilmės junginys, flavonoidas. In vitro bei in vivo mokslinių

tyrimų rezultatai patvirtina dihidrokvercetino antioksidacinį, priešuždegiminį, odos regeneraciją skatinantį,

odos pigmentaciją slopinantį poveikį [3–6]. Dihidrokvercetinas galėtų būti pritaikytas UV spinduliuotės

sukeltų odos pažeidimų prevencijai, todėl aktualu sumodeliuoti dihidrokvercetino tiekimo į odą sistemas.

Veikliųjų medžiagų, tarp jų ir dihidrokvercetino, skvarba į odą yra ribota dėl odos barjerinių

savybių. Odos paviršiuje esantis raginis sluoksnis (stratum corneum) yra pagrindinis barjeras, trukdantis

medžiagoms patekti į gilesnius odos audinius bei sisteminę kraujotaką. Raginio sluoksnio barjerines savybes

lemia sudėtinga korneocitų bei lipidų matricos struktūra. Veikliosios medžiagos skvarba į odą priklauso ne

tik nuo jos fizikinių-cheminių savybių, tačiau ir nuo formuluočių savybių [7], todėl yra svarbu tinkamai jas

sumodeliuoti. Siekiant pagerinti veikliosios medžiagos skvarbą pro raginį sluoksnį, kuriami įvairūs skvarbos

skatinimo metodai. Vienas iš plačiausiai taikomų skatinimo metodų yra cheminiai skvarbos skatintojai [8].

Šie junginiai, įterpti į formuluotes, gali padidinti veikliosios medžiagos tirpumą raginio sluoksnio lipiduose

ar keisti lipidų matricos struktūrą, taip pagerindami medžiagos skvarbą. Veiksmingų skvarbos skatintojų

paieška yra aktuali modeliuojant vietinio ar sisteminio poveikio preparatus.

Tyrimams atlikti pasirinktas skvarbos į žmogaus odą ex vivo biofarmacinis modelis. Remiantis

skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimų rezultatais, galima parinkti veikliajai medžiagai tinkamiausią

formuluotę ir jos sudėtį, įvertinti skvarbą skatinančių medžiagų poveikį bei prognozuoti suformuoto

preparato poveikį in vivo sąlygomis [9]. Publikuotų mokslinių tyrimų duomenų apie dihidrokvercetino

skvarbą į žmogaus odą ex vivo nebuvo aptikta. Šio darbo tikslas buvo įvertinti dihidrokvercetino ir jo

tiekimo į odą sistemų biofarmacines charakteristikas.

10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – įvertinti dihidrokvercetino ir jo tiekimo į odą sistemų biofarmacines charakteristikas.

Darbo uždaviniai:

1. Pritaikyti ir įteisinti analitinį ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodą;

2. Pagaminti eksperimentines dihidrokvercetino formuluotes – gelius ir mikroemulsijas – bei įvertinti

jų kokybę;

3. Ištirti dihidrokvercetino skvarbą iš eksperimentinių formuluočių į žmogaus odą ex vivo;

4. Įvertinti skvarbos skatintojų įtaką dihidrokvercetino skvarbai į žmogaus odos sluoksnius.

11

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Odos pažeidimų priežastys ir jų prevencija

Dėl didelio paviršiaus ploto ir lengvo prieinamumo oda gali būti pažeidžiama įvairių išorinių

faktorių. Vienas iš pagrindinių faktorių, sukeliančių odos pažeidimus, yra saulės ultravioletinė (UV)

spinduliuotė [2,10]. UV spinduliuotė, kuri pasiekia žemės paviršių, yra sudaryta iš maždaug 95 proc. UVA

(320–400 nm) ir 5 proc. UVB (290–320 nm) spindulių. Apie 70 proc. UVB spinduliuotės yra absorbuojama

raginiame sluoksnyje, 20 proc. gyvybingame epidermyje, o 10 proc. paveikia dermos sluoksnį [11]. Tuo

tarpu UVA efektyviau paveikia gilesnį odos dermos sluoksnį [11]. UV spinduliuotė gali pažeisti odą

tiesiogiai veikdama ląstelių DNR struktūrą, skatindama laisvųjų radikalų susidarymą ir uždegiminius

procesus odoje [2]. Laisvųjų radikalų susidarymą skatina ir kiti išoriniai faktoriai, tokie kaip karštis,

rūkymas, tarša [12,13].

Laisvieji radikalai - tai reaktyvūs cheminiai junginiai, turintys nesuporuotą vieną ar kelis elektronus

[14]. Laisvieji radikalai skirstomi į reaktyvias deguonies formas (superoksido anijono radikalas, hidroksilo

radikalas, vandenilio peroksidas, singletinis deguonis) bei reaktyvias azoto formas (azoto oksido radikalas,

azoto dioksido radikalas, peroksinitrito anijonas). Žmogaus oda turi endogeninę apsauginę sistemą, sudarytą

iš fermentinių ir nefermentinių antioksidantų [15]. Kai laisvųjų radikalų susidarymas tampa itin intensyvus,

endogeninė antioksidacinė sistema nepajėgia jų neutralizuoti ir pasireiškia oksidacinis stresas. Manoma,

kad oksidacinis stresas yra vienas iš odos ligų patogenezės faktorių. Oksidacinis stresas gali skatinti odos

senėjimo, pigmentacijos, eritemos bei vėžio vystymasį [1,15,16]. Odos antioksidacinės sistemos gebėjimas

apsisaugoti nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio mažėja senstant organizmui, todėl aktualu naudoti

papildomas apsaugines priemones [1].

Viena iš galimų strategijų siekiant užkirsti kelią odos pažeidimų vystymuisi yra antioksidantų

vartojimas. Antioksidantai – tai medžiagos, kurios neutralizuoja laisvuosius radikalus, sudarydamos

stabilius netoksiškus junginius. Padidėjęs tyrėjų susidomėjimas natūralios kilmės antioksidantais [1,2,17].

Plačiai išnagrinėtas resveratrolio, silimarino, propolio, kvercetino ar kitų natūralių antioksidantų poveikis

odos pažeidimų prevencijai [2,17,18]. Vykdoma naujų veiksmingų antioksidantų paieška. In vitro bei in

vivo mokslinių tyrimų rezultatai patvirtina augalinės kilmės junginio - flavonoido dihidrokvercetino

antioksidacines savybes bei priešuždegiminį, odos pigmentaciją slopinantį, odos regeneraciją skatinantį

poveikį [3,6,19].

12

1.2. Dihidrokvercetinas

1.2.1. Paplitimas

Dihidrokvercetinas (DHK), mokslinėje literatūroje dar vadinamas taksifolinu, yra flavonoidų grupei

priklausantis junginys, dihidroflavonolis. Augalai, kurių cheminėje sudėtyje aptinkamas DHK, yra šie:

pajūrinė pušis (Pinus pinaster), sibirinis maumedis (Larix sibirica), daūrinis maumedis (Larix gmelini),

didžioji pocūgė (Pseudotsuga menziesi) [19–21]. Nedideliais kiekiais DHK kaupiamas tikrąjame

margainyje (Silybum marianum) ir yra sudėtinė silimarino komplekso dalis [19]. Pastaraisiais metais šis

junginys nustatytas ir vynuogių, greipfrutų, apelsinų, svogūnų cheminėje sudėtyje [22].

1.2.2. Struktūra ir antioksidacinis aktyvumas

Dihidrokvercetino (DHK) molekulė turi flavonoidų cheminę struktūrą. Struktūra sudaryta iš

benzeno žiedo A, kondensuoto su šešianariu žiedu C, kuris 2-oje padėtyje turi prijungtą fenilo grupę B. 3,

5, 7, 3’, 4’ padėtyse yra prijungtos hidroksilo grupės, 4 padėtyje - keto grupė (1 paveikslas).

1 Pav. struktūrinė dihidrokvercetino formulė [23]

Flavonoidų antioksidacinis poveikis priklauso nuo molekulinės struktūros ir hidroksilo grupių

išsidėstymo [24]. Yra išskirti trys pagrindiniai struktūriniai kriterijai, kurie lemia antioksidacinį flavonoidų

poveikį [19,23,25,26]:

1. orto padėtyje esančios hidroksilo grupės B žiede;

13

2. 2,3-dvigubasis ryšys C žiede;

3. hidroksilo grupės 5-oje ir 7-oje padėtyse bei keto grupė 4-oje padėtyje.

DHK atitinka 1-ąjį ir 3-ąjį kriterijus. Tai patvirtina galimas DHK antioksidacines savybes [19,25–

27]. Svarbiausias struktūrinis fragmentas, lemiantis DHK antioksidacines savybes, yra B žiedas su 3‘ ir 4‘

hidroksilo grupėmis (katecholo grupė), tuo tarpu A žiede esančios 7 ir 5 hidroksilo grupės yra mažiau

reikšmingos [25,26,28]. Antioksidacinis poveikis pagrįstas vandenilio atomo perdavimo ar elektrono

perdavimo reakcijomis laisvąjam radikalui. Įvykus reakcijai, DHK neutralizuoja radikalą ir sudaromas

stabilus junginys [26,29].

DHK antioksidacinį aktyvumą pagrindžia in vitro tyrimų duomenys. 2015 m. atliktas DHK ir

standartinių antioksidantų antiradikalinio aktyvumo tyrimas [14]. Nustatyta, kad DHK sumažina lipidų

peroksidaciją efektyviau nei α-tokoferolis. DMPD•+, ABTS•+, O2•-, ir DPPH• radikalų inaktyvavimo

metodais nustatytos efektyvios DHK koncentracijos (EC50): 231,04µg/ml, 0,834 µg/ml, 9,91 µg/ml,

77µg/ml [14]. Tyrimai patvirtino, kad DHK suriša ABTS•+ ir O2•- radikalus efektyviau nei antioksidantai α-

tokoferolis, troloksas, butilhidroksianizolis, butilhidroksitoluenas. DPPH• inaktyvavimo metodu nustatyta,

kad DHK yra stipresnis antioksidantas nei butilhidroksianizolis ir butilhidroksitoluenas. 2013 m. atliktas

palyginamasis silimarino komplekso bei atskirų jo komponentų antiradikalinio poveikio tyrimas. Nustatyta,

kad DHK yra du kartus efektyvesnis antioksidantas nei pats silimarino kompleksas [30]. Įdomu tai, kad

silimarine aptinkama tik apie 3,5 proc. dihidrokvercetino, tačiau dėl stiprių antioksidacinių savybių jis gali

įtakoti didžiąją dalį silimarino antioksidacinio poveikio [30]. Janeiro ir kt. nustatė, kad DHK antioksidacinį

aktyvumą keičia aplinkos pH. Antioksidacinio poveikio maksimumas pasiekiamas neutralioje terpėje, o

rūgštinėje ir šarminėje aplinkoje sumažėja [23].

Vykdoma DHK farmakologinių poveikių paieška. Ištirtas DHK poveikis hemolizei bei trombocitų

agregacijai. In vitro AAPH• radikalo sukelta žmogaus eritrocitų hemolizė sumažėjo nuo 63,5±3,9 proc. iki

32,5±5,6 proc [31]. Kostyuk ir kt. atlikti tyrimai patvirtino, kad DHK slopina mažo tankio lipoproteinų

oksidaciją žmogaus kraujo serume in vitro [32]. 2015 m. atlikti tyrimai in vitro ir in vivo patvirtino, kad

DHK slopina angiotenzino-II kardiomiocitų hipertrofiją, sumažina oksidacinį stresą bei laisvųjų radikalų

susidarymą, todėl mažina širdies hipertrofijos riziką [33]. Sun ir kt. nustatė, kad in vivo ir in vitro DHK

sumažina diabetinės kardiomiopatijos riziką slopindamas oksidacinį stresą bei ląstelių apoptozę [34]. In

vitro ir in vivo tyrimai patvirtina, kad DHK mažina lipidų peroksidacijos procesus kepenų ląstelėse [35,36].

In vitro ir in vivo tyrimai prognozuoja DHK, kaip stipraus antioksidanto, pritaikymo galimybes.

14

1.2.3. Dihidrokvercetino poveikis odoje

Publikuoti tyrimai suteikia pirminius duomenis apie DHK taikymo perspektyvas odos ligų

gydyme. In vitro ląstelių kultūrose atlikti tyrimai patvirtino, kad DHK slopina α-melanocitus

stimuliuojančiojo hormono (α-MSH) veikimą, todėl slopina melanogenezės procesą ir veikia taip pat

efektyviai kaip antipigmentacinis preparatas arbutinas [4]. Atlikus tyrimus su B16F10 ląstelių linijomis,

nustatyta, kad DHK konkurenciškai didino tirozinazės koncentraciją ir tiesiogiai inhibavo tirozinazės

katalizuojamą l-dihidroksifenilalanino (L-DOPA) oksidacijos reakciją [4]. Nustatytas DHK

antiuždegiminis poveikis in vitro bei in vivo. Tyrimai su HaCaT ląstelių (imortalizuotų keratinocitų) linija

parodė, kad DHK mažina imunoglobulino ICAM-1 ekspresiją. ICAM-1 yra atsakingas už odos epidermio

sluoksnyje vykstančius uždegiminius procesus. Taip pat nustatyta, kad DHK slopina interferono-γ (IFN-γ)

sukeltą ICAM-1 ekspresiją žmogaus odos epidermio modelyje (EpiDerm®). Autoriai teigia, kad

priešuždegiminis poveikis pasireiškia dėl Jurkat T-ląstelių adhezijos slopinimo [5]. 2014 m. atliktas in vivo

tyrimas su NC/Nga pelėmis, kurioms buvo sukeltos atopinio dermatito žaizdos. Nustatyta, kad vietiškai

paskirtas DHK glikozidas slopino pagrindinius atopinio dermatito patogenezės faktorius: Th2-citokinus ir

imunoglobuliną E (IgE), taip pat nustatytas vizualinis žaizdų būklės pagerėjimas [6]. Tyrimai in vivo

patvirtina DHK odos regeneraciją skatinančias savybes. Shubina ir kt., Naumov ir kt. nustatė, kad

liposominiai DHK ar DHK-metalo (geležies, vario) komplekso preparatai skatina greitesnį cheminių ir

terminių odos pažeidimų gijimą [3,37–39]. Atlikus histologinius tyrimus, paaiškėjo, kad nudegusios žiurkių

odos srityje pilnai regeneravosi epitelinis sluoksnis, dermos srityje – plaukų folikulai ir riebalų liaukos, odos

morfologija buvo panaši į nepažeistos odos [3,37]. Nustatyta, kad liposominiai DHK preparatai stabilizuoja

endogeninę antioksidacinę sistemą, mažina uždegimą ir skatina proliferacinius procesus epidermyje [38,39].

Nustatyta, kad DHK mažina kologenazės MPP1 aktyvumą in vitro efektyviau nei retinoidinė

rūgštis, todėl galėtų būti taikomas UV spinduliuotės skatinamo odos senėjimo prevencijai [40]. Atlikus

tyrimus su B16F10 ląstelių linija, nustatyta, kad DHK sąveikavo su epiderminio augimo faktoriaus

receptoriais (EAFR) ir fosfoinozitido-3-kinazėmis (PI3K), mažino kinazinį aktyvumą, todėl slopino UV

sukeltą odos karcinogenezę [20].

DHK galėtų būti taikomas odos pažeidimų prevencijai ne tik dėl antioksidacinių, tačiau ir dėl

priešuždegiminių, odos pigmentaciją slopinančių, odos regeneraciją skatinančių savybių. Todėl aktualu tęsti

tyrimus, siekiant ištirti DHK poveikio odoje mechanizmus bei taikinius. Šiuo metu dar trūksta tyrimų

duomenų, kurie leistų spręsti apie DHK poveikį žmogaus odoje. Tačiau tam, kad DHK galėtų veikti odoje,

15 pirmiausiai turi pasiekti veikimo vietą. Veikliųjų medžiagų, tarp jų ir DHK, skvarba į odą yra ribota dėl

odos barjerinių savybių bei kitų fiziologinių ir fizikinių-cheminių faktorių.

1.3. Veikliųjų medžiagų skvarba į odą ir skvarbą įtakojantys faktoriai

Odos paviršiuje esantis raginis sluoksnis (stratum corneum) yra pagrindinis barjeras, ženkliai

ribojantis veikliųjų medžiagų patekimą į odą [41,42]. Siekiant suprasti veikliųjų medžiagų molekulių

skvarbą į odą, skvarbą skatinančių medžiagų poveikį bei teisingai interpretuoti DHK skvarbos tyrimų

rezultatus, yra svarbu išnagrinėti žmogaus odos raginio sluoksnio struktūrą.

Raginis sluoksnis yra plonas, 10 - 20 µm storio hidrofobinis audinys, sudarytas iš negyvųjų ląstelių

korneocitų bei lipidų ir baltymų. Korneocitai yra užpildyti vandeniu ir keratinu, o jų apvalkalas sudarytas iš

kryžmiškai sujungtų baltymų filagrino, lorikrino ir involukrino [43,44]. Kiekvienas korneocitas tarpusavyje

jungiasi baltyminėmis struktūromis – desmosomomis [45]. Lipidų matrica sudaryta iš ilgų grandinių

keramidų, cholesterolio, cholesterolio sulfato, laisvųjų riebalų rūgščių, sterolio ir vaško esterių [46,47].

Lipidai raginiame sluoksnyje yra išsidėstę bisluoksniais. Paprastai korneocitų ir lipidų išsidėstymas yra

apibūdinamas ,,plytų ir cemento“ modeliu. Remiantis šiuo modeliu, korneocitai yra sluoksniais

išsidėsčiusios plytos, o lipidai – tai cementas, apjungiantis korneocitus. Yra keletas teorijų, apibūdinančių

lipidų struktūrą raginiame sluoksnyje. Nustatyta, kad raginio sluoksnio lipidai gali egzistuoti trimis

skirtingomis fazėmis, priklausomai nuo temperatūros bei raginio sluoksnio gylio (2 paveikslas) [48].

2 pav. Raginio sluoksnio lipidų fazės tipai [48]

(pagal Marie-Alexandrine Bolzinger, Stéphanie Briançon, Jocelyne Pelletier, Yves Chevalier)

Eksperimentinių tyrimų metu nustatyta, kad didinant temperatūrą nuo 32 iki 90 °C, lipidai išsidėsto

sekančiai: orto-rombinė fazė (gelis) šešiakampė fazė (gelis) skystų lipidų fazė [49]. In vivo sąlygomis

žmogaus odos paviršiaus temperatūra yra 32 °C, todėl turėtų dominuoti orto-rombinė fazė. Tačiau

16 mokslininkai siūlo skirtingus struktūrinius modelius. Swartzenduber teigia, kad lipidai yra išsidėstę

,,sumuštinio“ principu, centre esant skystam kristaliniam sluoksniui, kuris apsuptas dviejų orto-rombinių

kristalinių gelio fazių. Tuo tarpu Norlen teorija nusako, kad lipidai yra išsidėstę vientisa šešiakampe gelio

faze [48]. Tačiau vieningos išvados dėl raginio sluoksnio lipidų struktūros šiuo metu nėra. Dėl sudėtingos

struktūros bei į gelį panašios konsistencijos, raginis sluoksnis skiriasi nuo kitų biologinių membranų ir riboja

visų medžiagų patekimą į odą. Po raginiu sluoksniu toliau yra išsidėstęs hidrofilinis gyvybingas epidermis,

o po šiuo sluoksniu – hidrofilinė derma [46]. Epidermis ir derma dėl savo sandaros ir savybių taip pat gali

riboti medžiagų skvarbą.

Galimi veikliosios medžiagos patekimo per raginį sluoksnį keliai: intraląstelinis, tarpląstelinis bei

odos intarpai (plaukų folikulai, prakaito liaukos) [47,48,50]. Manoma, kad hidrofilinės medžiagos

skverbiasi intraląsteliniu keliu (per raginio sluoksnio korneocitus), tuo tarpu hidrofobinės medžiagos –

tarpląsteliniu keliu (per lipidų matricą) [46]. Tačiau atsižvelgiant į raginio sluoksnio ,,plytų ir cemento“

struktūrą, hidrofilinės medžiagos, difunduodamos iš vieno korneocito į kitą, turi pereiti ir tarp korneocitų

išsidėsčiusią lipidų matricą. Dėl šios priežasties hidrofilinių medžiagų skvarba į odą yra labai ribota.

Lipofilinės medžiagos tirpsta raginio sluoksnio lipiduose, todėl turėtų efektyviau pereiti odos barjerą [51].

Tačiau lipofilinių medžiagų skvarba į gilesnius odos audinius (epidermį ir dermą) yra ribota dėl šių audinių

hidrofiliškumo [48,51]. Todėl galima teigti, kad ne tik raginis sluoksnis, bet ir gilesni odos audiniai sudaro

barjerą vaistinių medžiagų skvarbai. Šiuo metu manoma, kad pagrindinis veikliųjų medžiagų patekimo į

raginį sluoksnį kelias yra lipidų matrica [46].

Nors raginis sluoksnis yra heterogeninė, sudėtingos sandaros membrana, literatūroje pateikiami

supaprastinti matematiniai modeliai, apibūdinantys skvarbos į odą procesą [52,53]. Remiantis šiais

modeliais, medžiagos skvarba priklauso nuo [53]:

• koncentracijos (C);

• pasiskirstymo koeficiento (K);

• difuzijos koeficiento (D);

• difuzijos kelio/raginio sluoksnio storio (h).

Veikliosios medžiagos skvarba į odą priklauso nuo jos fizikinių-cheminių savybių. Teigiama, kad

skvarbai į odą ideali molekulė turi pasižymėti maža molekuline mase (<500 Da), vidutiniu lipofiliškumu

(logP = 1 – 3), pakankamu tirpumu riebaluose ir vandenyje, sąlyginai mažu tirpumu nešiklyje, žema

lydymosi temperatūra [43,52,54]. Molekulės, kurių logP reikšmė yra 1 – 3 intervale, yra tirpios lipidų

matricoje, tačiau tuo pačiu yra ir pakankamai hidrofiliškos, todėl gali difunduoti į raginio sluoksnio

korneocitus bei pereiti į gilesnius hidrofilinius odos audinius. Nuo molekulinės masės priklauso difuzijos

17 greitis, kuris lėtėja, didėjant molekulinei masei [52]. Tik maža dalis veikliųjų medžiagų molekulių atitinka

šiuos reikalavimus [51]. Labai svarbios ir odos savybės. Pavyzdžiui, odos pralaidumas medžiagoms ženkliai

padidėja, padidėjus vandens kiekiui odoje ar tam tikrų odos ligų atveju [52]. Taip pat svarbi odos

lokalizacija, amžius, temperatūra, paviršiaus plotas, kontakto su preparatu laikas, hidratacijos laipsnis

[43,47,55].

Šiuo metu nėra publikuotų DHK skvarbos į žmogaus odą tyrimų ex vivo rezultatų. Prognozuoti

apie DHK skvarbą galima pagal fizikines-chemines savybes. DHK pasiskirstymo vandenyje-oktanolyje

reikšmė logP yra 0,95, molekulinė masė - 304,25 Da, lydymosi temperatūra – 216 – 220 °C. Atsižvelgiant

į šias savybes, DHK turėtų difunduoti į raginį sluoksnį. Tačiau DHK skvarbai įtakos turės ir tiekimo į odą

sistemų savybės, todėl yra svarbu tinkamai jas sumodeliuoti.

1.4. Geliai

Europos farmakopėja gelį apibrėžia kaip puskietę vaisto formą, sudarytą iš skysčio, gelifikuoto tam

tikromis medžiagomis. Išskiriamos dvi gelių kategorijos: lipofiliniai ir hidrofiliniai geliai [56]. Hidrogeliai

– tai trimačiai hidrofiliniai polimerų tinklai, galintys absorbuoti didelius kiekius vandens [57]. Hidrogelių

gamyboje naudojami natūralios, pusiau sintetinės ar sintetinės kilmės polimerai: tragakantas, natrio

alginatas, celiuliozė ar jos dariniai, karbomerai, polivinilo alkoholis ir kiti. Paprastai geliai modeliuojami

siekiant paviršinio poveikio ar poveikio gilesniuose odos sluoksniuose, tačiau galima ir transderminė vaistų

pernaša į sisteminę kraujotaką [58]. Lyginant su tepalais arba kremais, geliai, kaip puskietė vaisto forma,

pasižymi šiais privalumais: dėl didelio vandens kiekio, būdingas efektyvesnis veikliosios medžiagos

atpalaidavimas; drėkina odą, todėl skatina vaisto skvarbą; paprasta gamybos technologija; stabilumas

[59,60]. Siekiant efektyvesnės veikliųjų medžiagų skvarbos, į gelių sudėtį gali būti įterptos skvarbą

skatinančios medžiagos [61,62]. Dėl šių savybių geliai yra patraukli dermatologinė vaisto forma.

1.5. Mikroemulsijos

Mikroemulsijos (ME) – tai skaidrios sistemos, sudarytos iš dviejų tarpusavyje nesimaišančių

skysčių, stabilizuotų paviršine surfaktanto ar jo mišinio su kosurfaktantu plėvele [63,64]. ME yra sudarytos

iš 3 – 5 komponentų: vandeninės fazės, aliejinės fazės, surfaktanto, kosurfaktanto, elektrolito [64]. ME gali

būti skirstomos į 3 kategorijas: aliejus vandenyje (A/V), vanduo aliejuje (V/A) ir biištisinės mikroemulsijos

[65]. Svarbu pabrėžti, kad emulsijos ir mikroemulsijos nėra ta pati sistema. Mikroemulsijas nuo emulsijų

skiria šie požymiai: termodinamiškai stabilios; skaidrios; nereikalinga didelė energija gamybos metu;

18 mažesnė klampa; dalelių dydis 10 – 200 nm. ME apibrėžiamos kaip sunkiai tirpių medžiagų tirpumą

gerinančios sistemos [66]. ME yra spontaniškai susidarančios sistemos, todėl jų gamybai nereikalinga

papildoma energija [67]. ME susiformuoja, kai surfaktantas ar jo mišinys su kosurfaktantu sumažina

paviršiaus įtempimą tarp aliejinės bei vandeninės fazių. Paviršiaus įtemptis sumažinama iki itin mažų

reikšmių (10-3mN/m-1) [64].

Mikroemulsijos, kaip vaisto forma, pasižymi šiais privalumais: termodinamiškai stabilios; gerina

tiek lipofilinių, tiek hidrofilinių medžiagų tirpumą; dispersinės fazės dalelės yra mažesnės nei 0,22 µm,

todėl gali būti sterilizuojamos filtracijos būdu; į tą pačią ME galima įterpti ir lipofilines, ir hidrofilines

medžiagas; paprasta gamybos technologija [65].

ME yra nagrinėjamos kaip medžiagų skvarbą į/pro odą skatinančios sistemos [8,68,69]. Manoma,

kad ME gerina veikliųjų medžiagų skvarbą dėl sudėtyje esančių surfaktantų ir kosurfaktantų, kurie gali

veikti kaip skvarbos skatintojai. ME taip pat pagerina veikliosios medžiagos tirpumą ir pasiskirstymą

raginiame sluoksnyje [68]. ME skvarbą skatinantį poveikį patvirtina atliekami ex vivo skvarbos tyrimai

[68,70,71].

1.6. Cheminių skvarbos skatintojų apžvalga

Siekiant pagerinti veikliųjų medžiagų skvarbą per raginio sluoksnio barjerą, kuriami įvairūs

skvarbos skatinimo metodai. Skvarbos skatinimo metodai gali būti išskirti į dvi pagrindines grupes [50,72]:

• Pasyvūs/cheminiai metodai: provaistai, nešiklių sistemos (vezikulės, mikroemulsijos, liposomos),

cheminiai skvarbos skatintojai;

• Aktyvūs/fizikiniai metodai: elektriniai metodai (jontoforezė, sonoforezė, elektroporacija),

mechaniniai metodai (mikroadatos, purkštuviniai injektoriai) bei kiti (ultragarsas, lazeris).

Vienas iš plačiausiai taikomų skvarbos skatinimo metodų yra cheminiai skvarbos skatintojai.

Cheminiai skvarbos skatintojai – tai medžiagos, kurios įterptos į nešiklius pagerina veikliosios medžiagos

difuziją, tirpumą bei sumažina odos rezistentiškumą, todėl veiklioji medžiaga gali efektyviau skverbtis į

odos sluoksnius [47]. Mokslinėse publikacijose yra nurodomi pagrindiniai kriterijai, kuriuos turi atitikti

idealus skvarbos skatintojas [72–74]: nedirgina odos; veikia greitai bei nuspėjamai; nesijungia su organizme

esančiais receptoriais ir nesukelia farmakologinio efekto; suderinamas su nešiklių sudėtinėmis dalimis;

bekvapis, beskonis, bespalvis, kosmetiškai priimtinas; pasižymi pakankamu tirpumu odoje.

19 Praktikoje naudojami skvarbos skatintojai nėra idealūs. Dažnai skvarbą skatinančios savybės

tiesiogiai koreliuoja su odą dirginančiu poveikiu [50].

Remiantis Shan ir kt. teorija, cheminiai skvarbos skatintojai gali veikti šiais mechanizmais: skatina

veikliosios medžiagos difuziją (D) į odą; tirpdo raginio sluoksnio lipidų matricą; didina vaisto

termodinaminį aktyvumą nešiklyje ir odoje; sukuria vaisto rezervuarą odoje; keičia vaisto pasiskirstymo

koeficientą [45]. Remiantis Barry lipidų - baltymų pasiskirstymo teorija, skatintojai veikia sąveikaudami su

tarpląsteliniais lipidais, korneocituose esančiu keratinu bei didindami veikliosios medžiagos pasiskirstymą

į raginį sluoksnį [75]. Skatintojai gali keisti raginio sluoksnio lipidų struktūrinį išsidėstymą, veikliosios

medžiagos tirpumą bei atverti intraląstelinį kelią, pavyzdžiui, keisdami korneocituose esančio keratino

konformaciją [52]. Paprastai skvarbos skatintojams būdingas daugiau nei vienas veikimo mechanizmas.

Cheminiai skvarbos skatintojai klasifikuojami į chemines grupes. 1 lentelėje pateiktos pagrindinės

grupės bei jų atstovai [8,45,62]:

1 lentelė. Skvarbos skatintojų cheminės grupės ir jų atstovai

Cheminė grupė Atstovai

Alkoholiai • Trumpos grandinės: etanolis, izopropilo alkoholis

• Ilgos grandinės: heksanolis, laurilalkoholis

Glikoliai Propilenglikolis, dipropilenglikolis, 1,2-butilenglikolis

Glikolių eteriai Dietilenglikolio monoetilo eteris Terpenai, terpenoidai ir eteriniai aliejai • Monoterpenai: eugenolis, limonenas,

mentolis • Seskviterpenai: farnesolis, neridolis • Įvairūs eteriniai aliejai (eukalipto,

baziliko, pipirmėtės) Riebalų rūgštys Oleino rūgštis, linoleno rūgštis, palmitino

rūgštis, stearino rūgštis Sulfoksidai Dimetilsulfoksidas, decilmetilsulfoksidas Pirolidonai N-metil-2-pirolidonas, 2-pirolidonas Amidai Azonas Surfaktantai • Anijoniniai: natrio laurilsulfatas

• Katijoniniai: alkildimetilbenzilamonio halogenidai, alkiltrimetilamonio halogenidai

• Nejoniniai: Tween-80, Brij 36-T, PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai

20 Aktualūs tyrimai su skvarbos skatintojais, kurie yra pripažinti kaip nesukeliantys toksinio, odą

dirginančio poveikio bei yra saugūs vartoti [46]. Žemiau pateikta tyrimams pasirinktų skvarbos skatintojų

grupių apžvalga.

Glikolių eteriai. Dietilenglikolio monoetilo eteris (DEGEE). DEGEE yra farmacijos pramonėje

naudojamas tirpiklis, pasižymintis tiek hidrofilinių, tiek lipofilinių medžiagų tirpumą gerinančiomis

savybėmis [76]. DEGEE naudojamas gelių, kremų, emulsijų, mikroemulsijų sudėtyje. DEGEE, kaip

skvarbą skatinančios medžiagos, veikimo mechanizmas yra pagrįstas veikliosios medžiagos tirpumo

raginiame sluoksnyje gerinimu, tačiau ne difuzijos skatinimu [8,51,77]. DEGEE gali absorbuoti vandenį iš

odos, padidinti vandens kiekį raginiame sluoksnyje ir brinkinti lipidų matricą, nepakeisdamas jų struktūros.

Tokiu būdu DEGEE sumažina raginio sluoksnio pasipriešinimą veikliųjų medžiagų difuzijai [61]. Skvarbą

skatinančias savybes pagrindžia atliekami tyrimai. Nustatyta, kad DEGEE efektyviai skatina flavonoido

kvercetino, kuris yra struktūrinis dihidrokvercetino analogas, skvarbą į kiaulės pilvo srities odą. Nustatyta,

kad DEGEE skatino transderminę kvercetino pernašą į akceptorinę terpę bei mažino kumuliaciją odos

sluoksniuose [70]. DEGEE efektyvumą patvirtina Osmalek ir kt. tyrimai, kurių metu nustatyta, kad

naprokseno skvarba iš karbomero gelio per žmogaus odos modelį į akceptorinę terpę buvo nuo 2,5 iki 4,5

karto didesnė nei iš gelio su kitu komerciniu skvarbos skatintoju, naudojant analogiškas koncentracijas [78].

DEGEE įterpimas į karbomero gelį lėmė padidėjusią klonazepamo skvarbą į triušio ausies odą.

Klonazepamo skvarba tiesiogiai priklausė nuo DEGEE koncentracijos gelyje [52]. 2016 m. Balazs ir kt.

ištyrė DEGEE poveikį ibuprofeno skvarbai per žmogaus odos epidermio sluoksnį. Nustatyta, kad 10 proc.

DEGEE įvedimas į gelį nepagerino skvarbos į akceptorinę terpę. Autoriai teigia, kad DEGEE kaip stiprus

tirpiklis sukelia raginio sluoksnio lipidų brinkimą, todėl ibuprofenas yra stipriau sulaikomas lipidų fazėje.

Todėl DEGEE nėra tinkamas transderminei ibuprofeno pernašai, o veikia sudarydamas veikliosios

medžiagos depą viršutiniuose odos sluoksniuose [79]. Šiuos rezultatus patvirtina ir 2011 m. atliktas

Czismazia ir kt. tyrimas, kurio metu taip pat tirta DEGEE įtaka ibuprofeno skvarbai iš gelio bei gautas

analogiškas rezultatas [61].

Surfaktantai. Surfaktantai dėl paviršinio aktyvumo naudojami tokių sistemų kaip emulsijos ar

mikroemulsijos stabilizavimui [63]. Surfaktantai savo struktūroje turi hidrofobines uodegėles ir hidrofilines

galvutes, todėl yra amfifiliniai. Skirstomi į anijoninius, katijoninius, nejoninius bei amfoterinius

surfaktantus. Nejoniniai surfaktantai yra mažiausiai toksiški ir dirginantys odą, todėl plačiausiai nagrinėjami

kaip skvarbą skatinančios medžiagos [51]. Nejoniniai surfaktantai veikia tirpdydami bei ekstrahuodami

raginio sluoksnio lipidus [80,81]. Surfaktantų poveikis priklauso ir nuo hidrofilinio-lipofilinio balanso

21 (HLB) bei anglies atomų grandinės ilgio [81]. Vienas iš nejoninių surfaktantų, plačiai naudojamas

mikroemulsijų gamyboje - PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai (PEG-8 KG). Nustatyta, kad PEG-8 KG skatina

tokių veikliųjų medžiagų kaip flukonazolo, fluoksetino skvarbą į odą [82,83].

Eteriniai aliejai. Eteriniai aliejai (EA) yra natūralūs, aliejinės konsistencijos, aromatingi skysčiai,

sudaryti iš terpenų, terpenoidų ir fenilpropanoidų mišinio [62]. EA plačiai tyrinėjami kaip skvarbos

skatintojai tiek hidrofilinėms, tiek lipofilinėms medžiagoms [84]. Skvarbą skatinantį poveikį lemia EA

sudėtyje esantys terpenai ir jų dariniai. Terpenai keičia raginio sluoksnio lipidų struktūrą, didindami

veikliųjų medžiagų difuziją bei pasiskirstymą į odą [85]. Vashisth ir kt. nustatė, kad terpenai veikia

ekstrahuodami raginio sluoksnio lipidus [86]. Skvarbą skatinantį poveikį įtakoja terpenų fizikocheminės

savybės: struktūra, lipofiliškumas, molekulės dydis bei virimo temperatūra [87]. Hidrofilinių molekulių

skvarbą labiau pagerina terpenai, kurie turi polines funkcines grupes, tuo tarpu lipofilinių –

angliavandeniliniai terpenai [87,88]. EA skvarbą skatinantis poveikis pragrįstas in vitro bei ex vivo

moksliniais tyrimais. Nustatyta, kad eukaliptų aliejus skatina chlorheksidino diglukonato skvarbą į žmogaus

epidermio bei dermos sluoksnius. 2 proc. chlorheksidino diglukonato, 10 proc. eterinio aliejaus ir 70 proc.

izopropilo alkoholio mišinys reikšmingai pagerino skvarbą jau po 2 min, lyginant su izopropilo alkoholio ir

chlorheksidino diglukonato mišiniu be skatintojo [89]. Nielsen ir kt. nustatė, kad pipirmėtės aliejus 0,1 ir

1,0 proc. koncentracijomis skatina benzoinės rūgšties skvarbą į žmogaus odą [90]. Nustatyta, kad baziliko

aliejus efektyviai skatina labetololio hidrochlorido skvarbą į pilno storumo žiurkės odą. Baziliko aliejus

buvo veiksmingesnis nei pavieniai terpenai – kamparas, geraniolis, timololis. Transderminė skvarba į

akceptorinę terpę buvo 46,52 karto didesnė lyginant su kontrole [91]. 2015 m. atlikto tyrimo metu nustatyta,

kad eteriniai aliejai reikšmingai skatina transderminę ibuprofeno pernašą į akceptorinę terpę. Įterpus 3 proc.

eterinių aliejų į ibuprofeno gelių formuluotes, skvarba padidėjo 3,5 – 3,7 karto. EA veikė efektyviau nei

sintetinis skvarbos skatintojas azonas [62]. Das ir kt. tyrimai parodė, kad paprastojo pankolio, eukalipto,

citrinžolių ir mėtų aliejus skatina trazodono hidrochlorido skvarbą į pelės epidermį [92]. Nustatyta, kad

losartano skvarbą į odą gerina arbatmedžio, kumino, rožių bei alavijo eteriniai aliejai [86].

Šiuo metu apie DHK skvarbą į odą duomenų nėra, tačiau yra paskelbti struktūriškai į DHK

panašaus junginio kvercetino skvarbos į odą ex vivo tyrimų rezultatai [70,93]. Kvercetino cheminė struktūra

skiriasi 2,3 dvigubuoju ryšiu. Kvercetinui yra būdingos panašios fizikinės-cheminės savybės (molekulinė

masė – 302,24 Da, lydymosi temperatūra – 316,5 °C, logP – 1,5). Tyrimų rezultatai patvirtina, kad

kvercetino skvarba į odą yra ribota, todėl vykdoma skvarbos skatinimo metodų paieška [93]. Dėl panašių

fizikinių-cheminių savybių, analogiška problema gali būti būdinga ir DHK, todėl aktualu ištirti pasirinktų

cheminių skvarbos skatintojų poveikį šio junginio skvarbai į odą.

22

2. METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Eksperimentinės dihidrokvercetino formuluotės:

• Geliai

• Mikroemulsijos

2.2. Medžiagos ir įranga

2.2.1. Medžiagos

Dihidrokvercetino ekstraktas, UAB ,,Rokiškio pragiedruliai“, Rokiškis, Lietuva

(+)-dihidrokvercetino standartas (90,44 proc.), HWI Analytik GmbH, Rülzheim, Vokietija

Acetonitrilas (≥ 99,9 proc.), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija

Skruzdžių rūgštis (≥ 98 proc.), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija

Metanolis (≥ 99,9), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija

Etanolis, 96 proc. (v/v), AB ,,Stumbras“, Lietuva

Karbomeras 980, Fagron BV, Rotterdam, Olandija

Trietanolaminas, 98 proc., Sigma - Aldrich, Saint Louis, JAV

Propilenglikolis (≥ 99,5), Kollisolv PG, BASF SE, Ludwigshafen, Vokietija

Etilo oleatas, 70 proc., Alfa Aesar GmbH & Co KG, Karlsruhe, Vokietija

PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai (Labrasol®), Gattefosse, Saint-Priest, Prancūzija

Poligliceril-6-izostereatas (Plurol isostearique®), Gattefosse, Saint-Priest, Prancūzija

Dietilenglikolio monoetilo eteris (Transcutol P®), Gattefosse, Saint-Priest, Prancūzija

Eglės spyglių eterinis aliejus, Biolat, Latvija

Pušies spyglių eterinis aliejus, Biolat, Latvija

Natrio chloridas, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija

Natrio azidas, POCh, Gliwice, Lenkija.

23

2.2.2. Įranga

Ultra-efektyvusis skysčių chromatografas: Waters Acquity UPLC System, Waters, MA, JAV.

Magnetinė maišyklė su kaitinimo įranga: IKAMAG C-MAG HS7, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija

pHmetras: ph-meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co,

Vokietija

Svarstyklės: Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija

Ultragarsinė vonelė: USC1200THD, VWR, USA

Modifikuotos Bronaugh pratakios difuzinės celės sujungtos su cirkuliacine vandens vonele Grant GD120

(Grant Instruments Ltd.,UK), peristaltiniu siurbliu (Masterflex L/S) bei daugiakanale siurblio galva (Cole-

Parmer Instrument Co., Ilinojus, JAV)

Viskozimetras: Vibro viscometer SV- 10, A&D Company ltd, Japonija

Konduktometras: Cond 3110 SET 1, Vokietija

Dinaminės šviesos sklaidos analizatorius: Zetasizer Nano ZS, Malvern, Didžioji Britanija

Termostatinė spinta su purtymo funkcija: GEL, Vokietija

2.3. Dihidrokvercetino kiekybinio nustatymo metodika

Dihidrokvercetino kiekybinė analizė atlikta naudojant Waters Acquity ultra-efektyvųjį skysčių

chromatografą (Waters, MA, USA) sujungtą su fotodiodų matricos (PDA) detektoriumi. Dihidrokvercetino

atskyrimas nuo endogeninių odos matricos komponentų buvo vykdomas Acquity UPLC BEH C18

kolonėlėje (10 cm, 1,7 µm dalelės, 2,1x50 mm). Mobilioji fazė sudaryta iš 0,2 proc. skruzdžių rūgšties

(tirpiklis A) ir acetonitrilo (tirpiklis B). Mobilios fazės gradientas: nuo 10 proc. iki 33 proc. tirpiklio B per

4 minutes. Mobilios fazės tėkmės greitis – 0,7 ml/min, injekcijos tūris – 1,0 µl. Kolonėlės temperatūra - 30

ºC. Dihidrokvercetino detekcijos UV bangos ilgis - 290 nm. Metodas validuotas remiantis ICH Q2 (R1)

gairių rekomendacijomis [94].

2.4. Dihidrokvercetino atskyrimas nuo papildomo produkto

Dihidrokvercetino tirpalai buvo paveikti žemiau nurodytomis sąlygomis ir analizuoti UESC

metodu.

Natūralios sąlygos. 10 µg/ml DHK ekstrakto tirpalai metanolyje laikyti kambario temperatūroje,

natūralioje šviesoje bei 4 °C, tamsoje. Tirpalai analizuoti po 3 dienų.

24 Stresinės sąlygos. Tyrimai atlikti remiantis ICH Q1A (R2) gairių rekomendacijomis [95]. 10 µg/ml

DHK ekstrakto tirpalai 40 proc. etanolyje paveikti temperatūra, rūgštimi bei šarmu:

1. Temperatūra. DHK tirpalai šildomi 1 valandą vandens vonelėse, kuriose palaikoma 50 ± 1°C, 60 ±

1 °C bei 70 ± 1 °C temperatūra.

2. Rūgštinė ir šarminė aplinka. DHK tirpalai parūgštinami 1M HCl iki 2 pH arba pašarminami 0,1 N

NaOH iki 8 pH reikšmių ir paliekami tamsioje aplinkoje 24 val.

2.5. Dihidrokvercetino ekstrakto grynumo vertinimas

Ekstrakto grynumas vertintas nustatant procentinį dihidrokvercetino kiekį sausąjame

dihidrokvercetino ekstrakte. Atsveriami 3 mg DHK ekstrakto ir ištirpinama 10 ml metanolio. Atliekami

skiedimai iki vidurinio kalibracinio taško (3,15 µg/ml) ir vykdoma UESC analizė.

2.6. Dihidrokvercetino ekstrakto tirpumo vertinimas

Paruošiami prisotinti dihidrokvercetino ekstrakto tirpalai vandenyje, 5, 10, 20, 30, 40 proc.

etanolyje bei 5 ir 10 proc. propilenglikolio vandeniniuose tirpaluose. Į mėgintuvėlius, apsaugotus nuo

šviesos, įpilama 10 ml tirpiklio ir dedamas DHK ekstrakto perteklius. Prisotinti tirpalai purtomi 24 valandas

termostatinėje spintoje su purtymo funkcija. Tyrimas atliekamas +37 ± 1 °C temperatūroje. Po 24 val.

tirpalai filtruojami pro membraninį filtrą. Vykdomi skiedimai ir atliekama analizė UESC metodu.

2.7. Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu gamyba

2.7.1. Gelių gamybos metodika

Gaminami 1 proc. dihidrokvercetino geliai. Kaip gelifikuojanti medžiaga pasirinktas karbomeras

980. Neutralizavimui naudojamas 98 proc. trietanolaminas [62]. Eksperimentinių gelių su DHK sudėtys

pateiktos 2 lentelėje.

25

2 lentelė. Eksperimentinių gelių su dihidrokvercetinu sudėtys

Gelis

Komponentai, proc.

Karbomeras 980

DHK ekstraktas

40 proc. etanolis DEGEE PEG-8 KG

Eglės spyglių

EA

Pušies spyglių

EA G1 0,50 1,54 97,96 - - - - G2 0,75 1,54 97,71 - - - - G3 1,00 1,54 97,46 - - - - G4 0,50 1,54 87,96 10,00 - - - G5 0,75 1,54 87,71 10,00 - - - G6 1,00 1,54 87,46 10,00 - - - G7 0,50 1,54 87,96 - 10,00 - - G8 0,75 1,54 87,71 - 10,00 - - G9 1,00 1,54 87,46 - 10,00 - - G10 1,00 1,54 94,46 - - 3,00 - G11 1,00 1,54 94,46 - - - 3,00 G12 1,00 1,54 89,46 5,00 - 3,00 - G13 1,00 1,54 89,46 - 5,00 3,00 - G14 1,00 1,54 89,46 5,00 - - 3,00 G15 1,00 1,54 89,46 - 5,00 - 3,00

Gelio gamyba. 40 proc. etanolyje ištirpinamas DHK. Tirpalas maišomas magnetine maišykle. Į

tirpalą suberiamas apskaičiuotas karbomero 980 kiekis. Mišinys parūgštinamas 0,1 M HCl rūgštimi,

tęsiamas maišymas. Neutralizuojama 98 proc. trietanolaminu, kol susidaro reikiamos konsistencijos gelis ir

pasiekiama 6 ± 0,1 pH reikšmė. Gelių gamybos metu kontroliuojamas maišymo greitis bei trukmė. Gelių

gamyba su skvarbos skatintojais vykdoma analogiškai, skvarbos skatintojus įterpus į 40 proc. etanolį.

Skvarbos skatintojų koncentracijos pasirinktos remiantis mokslinių tyrimų duomenimis [61,62,85].

2.7.2. Mikroemulsijų gamybos metodika

Dihidrokvercetino mikroemulsijos formuluojamos remiantis Juškaitės V. ir kitų autorių straipsnyje

pateiktomis optimizuotomis tuščių mikroemulsijų sudėtimis (3 lentelė) [71]. Gaminamos 1 proc. DHK

mikroemulsijos.

26

3 lentelė. Eksperimentinių mikroemulsijų sudėtys

ME Komponentai, proc.

S:KoS Vanduo Aliejinė fazė

ME 5:1 57 38 5

ME 6:1 55,5 37,9 6,6

ME 7:1 56 37,6 6,4

Mikroemulsijų gamyba. Gaminamos skirtingų surfaktanto ir kosurfaktanto (S:KoS) santykių

mikroemulsijos: ME 5:1, ME 6:1 ir ME 7:1. Kaip surfaktantas naudojami PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai

(PEG-8 KG), kosurfaktantas - poligliceril-6-izostereatas (P6I), aliejinė fazė – etilo oleatas. ME gaminamos

aliejinės fazės titravimo metodu. Apskaičiuotas reikiamas DHK kiekis ištirpinamas surfaktante maišant

magnetine maišykle. Į vandeninę fazę įterpiamas surfaktantas su jame ištirpusiu DHK bei kosurfaktantas.

Vykstant maišymo procesui, po lašą titruojama aliejinė fazė. Gamybos metu kontroliuojamas maišymo

greitis ir trukmė. Mikroemulsija laikoma susiformavusia tada, kai gaunama skaidri formuluotė. Pagamintos

mikroemulsijos paliekamos 24 valandų ekvilibracijos periodui.

2.8. Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu kokybės vertinimas

2.8.1. Eksperimentinių formuluočių fizikinių savybių nustatymas

pH reikšmių nustatymas. Formuluočių pH nustatyta pH-metru (pH-meter 766 Calimatic, Knick

Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija) su elektrodu Knick SE 104 N.

Dinaminės klampos nustatymas. Formuluočių dinaminė klampa nustatyta viskozimetru Vibro

viscometer SV-10 (A&D Company ltd, Japonija).

Vidutinio dalelių dydžio (VDD) ir polidispersiškumo indekso (PDI) nustatymas. Mikroemulsijų

dalelių dydžio vidurkis bei polidispersiškumo indeksas įvertintas dinaminės šviesos sklaidos metodu,

naudojant Zetasizer Nano ZS analizatorių (Malvern, Didžioji Britanija).

Elektrinio laidumo nustatymas. Mikroemulsijų laidumas matuojamas konduktometru (Cond 3110

SET 1, Vokietija).

27

2.8.2. Eksperimentinių mikroemulsijų termodinaminio stabilumo vertinimas

Termodinaminio stabilumo tyrimai atlikti vykdant šildymo-šaldymo ir užšaldymo-atšildymo ciklus

[71,96]. Mikroemulsijos laikytos skirtinguose temperatūriniuose režimuose šia seka: 4° C, 20° C, 32° C,

45° C (šildymo-šaldymo ciklas) ir −21° C, 4° C, 25° C (užšaldymo-atšildymo ciklas). Mikroemulsijos

visose temperatūrose laikytos ne mažiau kaip 48 valandas. Homogeniškumas vertintas vizualiai kiekvienoje

iš nurodytų temperatūrų.

2.8.3. Dihidrokvercetino atpalaidavimo iš eksperimentinių gelių in vitro tyrimai

Dihidrokvercetino atpalaidavimo tyrimai in vitro atlikti naudojant modifikuotas Franz tipo

difuzines celes. Į celės donorinę dalį įdedama donorinės fazės (gelio) begalinė dozė (~0,5 g). Donorinės

dalies atvirasis galas uždengiamas celiuliozine membrana Cuprophan® (Medicell International Ltd.,

Londonas, Didžioji Britanija). Prieš tyrimą celiuliozinė membrana yra laikoma išgrynintame vandenyje ne

mažiau 1 val. Membranos difuzijos plotas – 1,77 cm2. Akceptorinė dalis užpildoma akceptorine terpe - 50

ml 5 proc. etanoliu. Donorinė fazė patalpinama į akceptorinę terpę. Akceptorinė terpė maišoma magnetine

maišykle. Tyrimas atliekamas +37 ± 0,5° C temperatūroje. Akceptorinės terpės mėginiai imami po 0,25,

0,5, 1, 2, 4 valandų. Imamas 1 ml akceptorinės terpės ir grąžinamas toks pats tūris šviežios akceptorinės

terpės. Mėginiai analizuojami UESC metodu. Atpalaiduotas DHK kiekis išreiškiamas srautu (mg/cm2) bei

procentais nuo donorinėje fazėje esančio DHK kiekio. Atpalaidavimas iš kiekvienos formuluotės tiriamas

5 kartus.

2.9. Dihidrokvercetino skvarbos į žmogaus odą tyrimai ex vivo

Skvarbos į žmogaus odą tyrimams ex vivo atlikti naudotos modifikuotos Bronaugh tipo pratakios

difuzinės celės. Difuzinės celės su jose patalpintais žmogaus odos mėginiais pritvirtinamos ant šildomo

metalinio bloko, kuriame palaikoma +37 ± 1° C temperatūra. Odos difuzijos plotas celėse – 0,64 cm2.

Akceptorinė terpė sudaryta iš 0,9 proc. natrio chlorido bei 0,005 proc. natrio azido. Akceptorinės terpės

tėkmės greitis - 0,6 ml/min. Akceptorinės terpės tūris – 5 ml. Akceptorinė terpė cirkuliuojama po oda

naudojant peristaltinį siurblį su daugiakanale siurblio galva. Tyrimams naudota plastinių operacijų metu

pašalinta baltaodžių moterų (25–40 metų amžiaus) oda. Prieš atliekant tyrimus, oda buvo laikoma –20° C

temperatūroje ne ilgiau kaip šešis mėnesius.

28 Vykdoma ekvilibracijos fazė, kurios metu akceptorinė terpė cirkuliuoja po oda. Ekvilibracijos

periodas – 0,5 val. Po ekvilibracijos, ant odos paviršiaus (raginio sluoksnio) užnešama donorinės fazės (1

proc. dihidrokvercetino metanolinio tirpalo, gelio arba mikroemulsijos) begalinė dozė (~ 0,2 ml arba 0,2 g)

ir paliekama 6 valandoms, sandariai uždengus celes. Po 6 valandų donorinė fazė pašalinama nuo odos

paviršiaus, odos paviršius nuplaunamas 2 kartus 96 proc. etanoliu ir 3 kartus 0,9 proc. natrio chloridu [97].

Skvarba iš kiekvienos formuluotės tiriama 3 kartus.

Atlikus skvarbos tyrimus, vykdomas odos sluoksnių atskyrimas. Epidermis nuo dermos

atskiriamas sauso karščio metodu [98]. Odos mėginiai ekstrahuojami 1 ml metanolio 30 min. ultragarso

vonelėje, kambario temperatūroje. Odos mėginių ekstraktai bei akceptorinė terpė filtruojami membraniniais

filtrais ir vykdoma analizė validuotu UESC metodu.

Vertinant raginio sluoksnio įtaką dihidrokvercetino skvarbai, atlikta raginio sluoksnio pašalinimo

procedūra. Raginis sluoksnis pašalintas lipnių juostų metodu, naudojant Scotch® Crystal (3M) juostą. Toliau

vykdomas analogiškas skvarbos į odą ex vivo tyrimas.

2.10. Statistinė duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant Microsoft Office Excel 2013 ir IBM SPSS 22

programas. Apskaičiuoti tyrimų duomenų vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, santykiniai standartiniai

nuokrypiai. Duomenų analizei pritaikytas blokuotųjų duomenų analizės modelis ANOVA naudojant LSD

kriterijų. Nustatytas Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientas. Statistinis duomenų reikšmingumas

nustatytas kai p < 0,05.

29

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Dihidrokvercetino ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodo

validacija

Metodo specifiškumas vertintas analizuojant tuščius epidermio ir dermos ekstrakcijos mėginius bei

DHK išgavas, išekstrahuotas iš epidermio ir dermos. Į UESC sistemą injekuota po 4 epidermio ir 4 dermos

ekstrakcijos mėginius su ir be DHK. Endogeninių odos matricos komponentų sulaikymo laikai palyginti su

DHK sulaikymo laiku (3 pav.).

3 pav. (+)-dihidrokvercetino standarto (A), dihidrokvercetino mėginio su dermos komponentais (B),

epidermio (C) ir dermos mėginio (D) chromatograma 290 nm bangos ilgyje: 1 – dihidrokvercetinas; * - odos komponentai

Nustatytas DHK sulaikymo laikas – 1,642 min, epidermio komponento sulaikymo laikas - 0,449

min, dermos komponentų - 0,453 min ir 1,394 min. Išekstrahuoti epidermio ir dermos komponentai netrukdė

DHK analizei.

30 Kokybinio ir kiekybinio nustatymo ribos (LOD ir LOQ) apskaičiuotos lyginant smailės aukštį su

bazinės linijos triukšmu (SN). Nustatyti 0,25, 0,5 ir 1,0 μg/ml standartų tirpalų LOD ir LOQ bei išvesti jų

vidurkiai. Atsižvelgiant į kiekybinio nustatymo ribą (LOQ), sudaryta kalibracinė kreivė. Paruošti 0,35, 1,05,

3,15, 9,45, 28,35 µg/ml standarto tirpalai metanolyje ir injekuoti į UESC sistemą 3 kartus. Analitėms

suteikta regresijos lygtis, kur y – smailės ploto dydis, x – analitės kiekis. Sudarytas chromatogramos ploto

priklausomybės nuo koncentracijos grafikas. Kalibracinės kreivės tiesiškumas įvertintas pagal nustatytą

koreliacijos koeficientą (R²). Rezultatai pateikti 4 lentelėje.

4 lentelė. Dihidrokvercetino kalibracinės kreivės parametrai

Regresijos lygtis R² LOD, µg/ml LOQ, µg/ml Koncentracijų

intervalas, µg/ml

y = 5690x - 138 0,99995 0,07 0,23 0,35 - 28,35

Nustatytas koreliacijos koeficientas (R2) patvirtino kalibracinės kreivės tiesiškumą.

Metodo tikslumas ir glaudumas vertintas vykdant pakartojamumo (dienos) ir atkuriamumo (tarp

dienų) validaciją. Ruošiamos ir analizuojamos 1, 3 ir 5 kalibracinio grafiko taškų 3 tirpalų serijos tą pačią

dieną (pakartojamumas) ir 3 tirpalų serijos trimis skirtingomis dienomis (atkuriamumas) (5 lentelė).

5 lentelė. Ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacijos rezultatai

Konc., µg/ml

Pakartojamumas Atkuriamumas

Tikslumas, proc. Glaudumas, proc. Tikslumas, proc. Glaudumas, proc. 0,35 103,05 3,90 103,52 4,53 3,15 107,52 1,49 103,94 0,54 28,35 110,22 2,07 95,46 4,70

Nustatytas metodo tikslumas buvo nuo 95,46 iki 110,22 proc., o glaudumas ne didesnis kaip 4,70

proc. Metodas validuotas.

31

4 pav. Dihidrokvercetino ekstrakto chromatograma: 1 – dihidrokvercetinas, 2 – ekstrakto komponentas

Gauti validacijos rezultatai patvirtino metodo tinkamumą kokybinei ir kiekybinei DHK ekstrakto

analizei tolimesniuose in vitro bei ex vivo biofarmaciniuose tyrimuose (4 pav.).

3.2. Dihidrokvercetino atskyrimas nuo papildomo produkto

Vystant analitinį ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos (UESC) metodą, įvertinta metodo

geba atskirti DHK nuo susidariusių papildomų produktų. DHK ekstrakto 10 µg/ml tirpalai buvo paveikti

šiomis sąlygomis:

• natūrali šviesa, kambario temperatūra;

• tamsa, 4 °C temperatūra;

• stresinės sąlygos: rūgštis (pH = 2), šarmas (pH = 8), temperatūra (50 °C, 60 °C, 70 °C).

Tyrimų sąlygos detaliau aprašytos 2.4 skyriuje. DHK tirpalai analizuoti UESC metodu.

Šviesa ir kambario temperatūra. Tyrimų rezultatai parodė, kad laikant DHK tirpalą kambario

temperatūroje, šviesoje, po 3 dienų susidaro papildomas produktas, kuris nebuvo nustatytas analizuojant

šviežią DHK tirpalą (5 pav.).

32

5 pav. DHK chromatograma po 3 d. laikymo šviesoje ir kambario temperatūroje: 1 – DHK, 2 –

papildomas produktas, 3 – ekstrakto komponentas

DHK chromatografinės smailės plotas po 3 dienų sumažėjo 34,53 proc. DHK tirpalą laikant 3

dienas 4 °C temperatūroje, tamsioje aplinkoje, pakitimų nenustatyta.

Stresinės sąlygos. Po 1 valandos DHK tirpalų šildymo 50 °C, 60 °C ir 70 °C temperatūroje,

nustatytas susidaręs papildomas produktas, kurio nebuvo analizuojant stresinėmis sąlygomis nepaveiktą

DHK tirpalą (6 pav.).

6 pav. DHK chromatograma po šildymo 50 °C temperatūroje: 1 – DHK, 2 – papildomas produktas, 3 –

ekstrakto komponentas

33 Nustatyta, kad paveikus DHK tirpalą 50 °C temperatūra, chromatografinės smailės plotas sumažėja

7,41 proc. o 60 ir 70 °C temperatūra - sumažėja atitinkamai 15,17 proc. ir 13,63 proc.

DHK tirpalą parūgštinus iki pH 2, chromatogramoje pakitimų nenustatyta. Tačiau susidaręs

papildomas produktas identifikuotas DHK tirpalą paveikus silpnai šarmine (pH=8) aplinka. DHK

chromatografinės smailės plotas sumažėjo 10,99 proc.

Visais atvejais nustatyta skiriamoji geba (Rs) buvo 2,58, todėl pasiektas efektyvus DHK atskyrimas

nuo susidariusio papildomo produkto. Remiantis gautais tyrimų rezultatais, DHK formuluočių gamybos

metu buvo kontroliuojamas papildomo produkto susidarymas. Mokslinių tyrimų duomenų apie DHK

skilimo produktus nebuvo aptikta. Susidariusio papildomo produkto identifikavimas nebuvo šio tiriamojo

darbo tikslas. Siekiant nustatyti, koks produktas susidaro veikiant DHK tirpalus aprašytomis sąlygomis,

reikalinga tęsti tyrimus.

3.3. Dihidrokvercetino ekstrakto grynumas

Atlikus dihidrokvercetino ekstrakto 3,15 µg/ml tirpalų analizę UESC metodu, nustatyta DHK

koncentracija. Lyginant su standarto tirpalu, apskaičiuotas ekstrakto grynumas (6 lentelė).

6 lentelė. Dihidrokvercetino ekstrakto grynumas

DHK standarto tirpalo konc.,

µg/ml

DHK konc. ekstrakto tirpale, µg/ml Vidurkis,

µg/ml Vidurkis,

proc. 1 2 3

3,15 1,99 2,23 1,91 2,04 64,82

Nustatytas DHK kiekis analizuojamo 3,15 µg/ml ekstrakto tirpale – 2,04 ± 0,14 µg/ml (64,82

proc.). Atsižvelgiant į ekstrakto grynumą, buvo gaminamos eksperimentinės formuluotės su 1 proc. DHK

arba 1,54 proc. DHK ekstrakto.

3.4. Dihidrokvercetino ekstrakto tirpumas

DHK yra sunkiai tirpus vandenyje junginys [22]. Dėl prasto tirpumo vandenyje iškilo papildomų

iššūkių siekiant įterpti DHK į formuluotes. Todėl įvertintas DHK ekstrakto tirpumas pasirinktuose

tirpikliuose. DHK ekstrakto tirpumas vertintas pagal ištirpusį DHK kiekį (7 pav.).

34

7 pav. Dihidrokvercetino ekstrakto tirpumas vandenyje, vandeniniuose etanolio ir propilenglikolio

tirpaluose

Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas lyginant DHK tirpumą vandenyje su visais tirpikliais

(p < 0,05). Nustatyta statistiškai reikšminga tiesioginė koreliacija tarp etanolio koncentracijos ir ištirpusio

DHK kiekio (r = 0,981, p < 0,05). Lyginant DHK tirpumą 5 ir 10 proc. propilenglikolyje statistiškai

reikšmingo skirtumo nenustatyta (p > 0,05).

Remiantis tyrimų rezultatais, buvo siekiama parinkti tinkamiausią tirpiklį 1 proc. DHK gelių

formulavimui. Rezultatai patvirtino, kad į vandenį įterpus iki 10 proc. etanolio arba propilenglikolio, DHK

tirpumas išlieka mažesnis nei 1 mg/ml, todėl nėra pakankamas ištirpinti 1 proc. DHK. Pakankamas DHK

tirpumas pasiekiamas tirpinant ne mažesnės kaip 30 proc. koncentracijos etanolio tirpale. Siekiant užtikrinti,

kad DHK į gelį bus įvestas tirpalo formoje, pasirinktas 40 proc. etanolis. Tolimesnių tyrimų eigoje DHK

tirpumo problema buvo sprendžiama įterpiant į medžiagų tirpumą gerinančiomis savybėmis pasižyminčią

sistemą – mikroemulsiją.

In vitro atpalaidavimo tyrimams kaip akceptorinė terpė pasirinktas 5 proc. etanolis dėl mažesnės

nugaravimo tikimybės atliekant tyrimus + 37° C temperatūroje. Reikalingas terpės tūris apskaičiuotas

atsižvelgiant į DHK tirpumo rezultatus.

0,529 0,639 0,8052,613

13,616

36,945

0,671 0,7570

5

10

15

20

25

30

35

40

5 proc. 10 proc. 20 proc. 30 proc. 40 proc. 5 proc. 10 proc.

vanduo etanolis propilenglikolis

Kon

c., m

g/m

l

Tirpiklis

35

3.5. Eksperimentinių formuluočių su dihidrokvercetinu kokybės vertinimas

3.5.1. Gelių fizikinės savybės

Dihidrokvercetino gelių kokybės vertinimui pasirinkti pH ir dinaminės klampos reikšmių

nustatymai.

pH reikšmių nustatymas. Gamybos metu buvo siekiama pagaminti gelius, kurių pH būtų 6 ± 0,1

intervale. pH reikšmių rezultatai parodė, kad visų gelių pH svyruoja nuo 5,94 iki 6,10. Pagamintų gelių pH

reikšmės yra tinkamos vartojimui ant odos [99].

Dinaminės klampos nustatymas. Dinaminė gelių klampa gali turėti įtakos DHK atpalaidavimui iš

gelio pagrindo. Todėl atliktas tuščių gelių ir gelių su DHK bei skvarbos skatintojais dinaminės klampos

vertinimas. Rezultatai pateikti 8 paveiksle.

8 pav. Dihidrokvercetino (DHK) gelių dinaminės klampos reikšmės. Čia DEGEE – dietilenglikolio

monoetilo eteris, PEG-8 KG – PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai

Tyrimų rezultatai parodė, kad gelių dinaminė klampa didėja, didėjant gelifikuojančios medžiagos

koncentracijai. Į 0,5, 0,75 bei 1 proc. karbomero gelių sudėtį įterpus 1 proc. DHK, dinaminė klampa

atitinkamai sumažėjo 7,14 proc., 18,35 proc., 29,94 proc.

Įvertinta skvarbos skatintojų įtaka DHK gelių klampai. Į. DHK gelio sudėtį įterpus 10 proc.

DEGEE, 0,5 proc. karbomero gelio klampa padidėjo 45,84 proc., o 0,75 proc. karbomero gelio klampa –

0,56

1,09

1,57

0,52

0,89

1,100,96 0,98

1,12

0,37

0,62

1,07 1,11 1,10

0,000,200,400,600,801,001,201,401,60

0,5 proc. 0,75 proc. 1,00 proc.

Din

amin

ė kl

ampa

, Pa*

s

Karbomero koncentracija gelyjeGelis be DHK ir skvarbos skatintojų Gelis su DHK

Gelis su DHK ir DEGEE Gelis su DHK ir PEG-8 KG

Gelis su DHK ir pušies et. al. Gelis su DHK ir eglės et. al.

36 10,11 proc. Nustatyta, kad į gelius įterpus 10 proc. PEG-8 KG, 0,5 ir 0,75 proc. karbomero DHK gelių

klampa sumažėjo atitinkamai 28,85 proc. ir 30,33 proc. Gelių formuluotės su PEG-8 KG pasižymėjo

skystesne konsistencija. Analizuojant 1 proc. karbomero DHK gelius su ir be skvarbos skatintojais,

nustatyta, kad dinaminės klampos reikšmės varijuoja 1,07 – 1,12 Pa*s intervale ir tarpusavyje skiriasi tik ±

1,5 proc. Statistinė duomenų analizė neparodė reikšmingo skirtumo tarp šių formuluočių klampos reikšmių

(p > 0,05). Galima teigti, kad formuluotėje esant 1 proc. karbomero koncentracijai, skvarbos skatintojai

neturi įtakos dinaminei gelių klampai.

3.5.2. Mikroemulsijų fizikinės savybės ir termodinaminis stabilumas

Vizualinis vertinimas. Pagamintos 1 proc. DHK mikroemulsijos (ME) įvertintos vizualiai. ME yra

skaidrios, nėra matoma išsisluoksniavimo, drumstumo ar iškritusių nuosėdų.

Termodinaminis stabilumas. Termodinaminio stabilumo tyrimų metu, atlikti šildymo-šaldymo bei

užšaldymo-atšildymo ciklai, naudojant skirtingus temperatūrinius režimus. Viso tyrimo metu suformuotos

5:1, 6:1 ir 7:1 ME, sudėtyje su 1 proc. DHK, išliko skaidrios, nebuvo pastebėta fazių atsiskyrimo, iškritimo

į nuosėdas, susidrumstimo. Vertinant vizualiai, buvo patvirtintas ME termodinaminis stabilumas, todėl

pagamintos ME buvo tinkamos tolimesniam fizikinių savybių vertinimui.

Fizikinių savybių vertinimas. Suformavus 5:1, 6:1 ir 7:1 S:koS santykių mikroemulsijas su 1 proc.

DHK, atliktas jų fizikinių savybių nustatymas. ME kokybė vertinta nustatant šiuos parametrus: vidutinį

dalelių dydį (VDD), polidispersiškumo indeksą (PDI), pH, elektrinį laidumą bei klampą [65,67] (7 lentelė).

7 lentelė. Dihidrokvercetino mikroemulsijų fizikinės savybės

Mikroemulsija VDD, nm PDI pH elektrinis laidumas,µS/cm

klampa, mPa·S

ME 5:1 83,52 ± 0,665 0,342 ± 0,035 6,85 ± 0,017 99,83 ± 0,386 83,4 ± 0,1 ME 6:1 83,06 ± 0,495 0,290 ± 0,003 6,77 ± 0,005 91,43 ± 0,899 70,8 ± 0,2 ME 7:1 82,22 ± 0,181 0,284 ± 0,002 6,75 ± 0,008 77,37 ± 0,189 76,5 ± 0,2

VDD ir PDI nustatymas. Nustatytas vidutinis dalelių dydis 5:1, 6:1 bei 7:1 S:KoS santykių

mikroemulsijoms atitinkamai buvo 83,52 ± 0,665, 83,06 ± 0,495, 82,22 ± 0,181 nm. VDD buvo mažesnis

nei 200 nm, todėl dalelių dydis atitiko mikroemulsijai keliamus reikalavimus [66]. Suformuotų

37 mikroemulsijų VDD statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p < 0,05), todėl S:KoS santykis dalelių dydžiui

įtakos neturėjo. Nustatytas PDI buvo ne didesnis kaip 0,342, todėl patvirtintas suformuotų sistemų

homogeniškumas [96].

pH ir dinaminės klampos nustatymas. Nustatytos pH reikšmės 6,75 – 6,85, todėl ME yra tinkamos

vartoti ant odos [99]. Nustatyta dinaminė klampa, kuri svyravo nuo 83,4 iki 70,8 mPa*s.

Elektrinis laidumas. Visų ME formuluočių elektrinis laidumas buvo artimas 100 µS/cm. Gauti

elektrinio laidumo rezultatai patvirtino, kad suformuotos ME yra aliejus-vandenyje (A/V) tipo [71].

Tyrimų rezultatai patvirtino pagamintų DHK mikroemulsijų tinkamumą tolimesniems skvarbos į

odą tyrimams ex vivo.

3.5.3. Dihidrokvercetino atpalaidavimas iš eksperimentinių gelių in vitro

Ant odos užnešta vaistinė medžiaga pirmiausiai turi būti atpalaiduota iš puskietės vaisto formos

pagrindo ir tik tada gali skverbtis į odą. Todėl dihidrokvercetino gelių kokybei įvertinti atliktas

atpalaidavimo tyrimas in vitro.

DHK atpalaidavimo kinetika iš 0,5, 0,75 ir 1 proc. karbomero gelių formuluočių (G1, G2 ir G3)

pateikta 9 paveiksle.

9 pav. Dihidrokvercetino atpalaidavimo kinetika iš skirtingų karbomero koncentracijų gelių: G1 – 0,5

proc., G2 – 0,75 proc., G3 – 1 proc.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

DH

K sr

auta

s, m

g/cm

2

Laikas, val.

G1 (0,50 proc. karbomero) G2 (0,75 proc. karbomero) G3 (1,00 proc. karbomero)

38 Po 4 valandų iš G1 formuluotės DHK atpalaidavimo srautas buvo didžiausias - 2,15 ± 0,07 mg/cm2

(76,00 ± 2,15 proc.). Atitinkamai iš G2 ir G3 gelių atpalaiduoti mažesni DHK kiekiai - 2,13 ± 0,04 mg/cm2

(75,28 ± 1,46 proc.) bei 1,97 ± 0,04 mg/cm2 (69,83 ± 1,15 proc.). Nustatyta, kad DHK atpalaidavimas

mažėja, didėjant gelifikuojančios medžiagos karbomero koncentracijai. Karbomero koncentracijos įtaka

medžiagos atpalaidavimui iš gelio pagrindo yra nustatyta ir kitų autorių moksliniuose tyrimuose [60].

Statistiškai reikšmingi atpalaiduoto DHK kiekio skirtumai nustatyti tarp G1 ir G3 bei G2 ir G3 gelių (p <

0,05). Galima teigti, kad DHK atpalaidavimui įtakos turi karbomero koncentracijos padidinimas nuo 0,5 iki

1 proc. Tačiau DHK atpalaidavimas iš G3 formuluotės sumažėjo tik 3,87 proc. Todėl padidinus karbomero

koncentraciją iki 1 proc., atpalaiduojamas veiksmingas DHK kiekis.

Įvertinta skvarbos skatintojų įtaka DHK atpalaidavimui iš 0,5, 0,75 ir 1 proc. karbomero gelių

formuluočių. DHK atpalaidavimas iš formuluočių su 10 proc. DEGEE (G4, G5, G6) pateiktas 10 paveiksle.

10 pav. Dihidrokvercetino atpalaidavimo kinetika iš gelių su 10 proc. dietilenglikolio monoetilo eterio

(DEGEE)

Po 4 valandų didžiausias DHK kiekis atpalaiduotas iš G4 - 1,84 ± 0,06 mg/cm2 (65,11 ± 2,26 proc.),

o iš G5 ir G6 atitinkamai 1,77 ± 0,12 mg/cm2 (62,58 ± 4,14 proc.) ir 1,57 ± 0,08 mg/cm2 (55,57 ± 2,99

proc.). Statistiškai reikšmingas atpalaiduoto DHK kiekio skirtumas nustatytas tarp G4 ir G6 formuluočių (p

< 0,05). Gauti rezultatai patvirtino nustatytą tendenciją, kad atpalaiduotas DHK kiekis mažėja, didėjant

gelifikuojančios medžiagos koncentracijai. Tačiau lyginant tos pačios karbomero koncentracijos gelius su

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

DH

Ksr

auta

s, m

g/cm

²

Laikas, val.

G4 (0,50 proc. karbomero) G5 (0,75 proc. karbomero) G6 (1,00 proc. karbomero)

39 ir be DEGEE, nustatytas statistiškai reikšmingas atpalaiduoto DHK kiekio skirtumas (p < 0,05). DEGEE

įvedimas į gelio formuluotes lėmė lėtesnį DHK atpalaidavimą iš gelių pagrindo.

DHK atpalaidavimo kinetika iš gelių formuluočių su 10 proc. PEG-8 KG (G7, G8, G9) pateikta 11

paveiksle.

11 pav. Dihidrokvercetino atpalaidavimo kinetika iš gelių su 10 proc. PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridų

(PEG-8 KG)

Po 4 valandų iš G7 ir G8 DHK srautas atitinkamai buvo 0,80 ± 0,08 mg/cm2 (28,22 ± 2,92 proc.)

bei 0,80 ± 0,05 mg/cm2 (28,37 ± 1,84 proc.) ir statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p > 0,05). Iš G9

atpalaiduotas mažesnis DHK kiekis - 0,75 ± 0,04 mg/cm2 (26,62 ± 1,47 proc.). Nustatytas statistiškai

reikšmingas skirtumas tarp DHK atpalaidavimo iš G8 ir G9 (p < 0,05). DHK atpalaidavimo tendencija išliko

ta pati: atpalaiduotas kiekis sumažėja, kai karbomero koncentracija padidinama nuo 0,5 iki 1 proc. Lyginant

tos pačios karbomero koncentracijos gelius su ir be PEG-8 KG, po 4 val. atpalaiduotas DHK kiekis buvo

statistiškai reikšmingai, 2,63 – 2,68 karto mažesnis iš gelių su PEG-8 KG (p < 0,05).

DHK atpalaidavimas iš 1 proc. karbomero gelių, į kurių sudėtį buvo įterpta 3 proc. eterinių aliejų

(G10, G11), pateiktas 12 paveiksle.

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

DH

K sr

auta

s, m

g/cm

²

Laikas, val.

G7 (0,5 proc. karbomero) G8 (0,75 proc. karbomero) G9 (1,00 proc. karbomero)

40

12 pav. Dihidrokvercetino atpalaidavimo kinetika iš 1 proc. karbomero gelių su 3 proc. eterinių aliejų:

G10 – eglės spyglių eterinis aliejus, G11 – pušies spyglių eterinis aliejus

Nustatyta, kad iš G10 formuluotės per 4 valandas atpalaiduojamas DHK kiekis yra 1,98 ± 0,05

mg/cm2 (70,09 ± 1,82 proc.), o iš G11 - 2,17 ± 0,12 mg/cm2 (76,66 ± 4,36 proc.). Atpalaiduotas kiekis iš

gelio su eglės spyglių EA (G10) buvo toks pats kaip iš gelio be skvarbos skatintojo (G3), todėl šio skatintojo

įvedimas DHK atpalaidavimui įtakos neturėjo. Lyginant gelį su pušies spyglių EA (G11) su geliu be

skvarbos skatintojo (G3), statistiškai reikšmingai didesnis kiekis atpalaiduotas iš gelio su pušies eteriniu

aliejumi (G11) (p < 0,05).

Sumažėjęs atpalaidavimas iš 0,5 proc. karbomero gelio su DEGEE (G4) gali būti pagrįstas didesne

dinamine klampa (žr. sk. 3.5.1.). Tačiau 0,75 ir 1 proc. karbomero gelių klampos su ir be DEGEE

reikšmingai nesiskiria, tuo tarpu atpalaiduotas DHK kiekis yra mažesnis. Geliai su PEG-8 KG pasižymėjo

mažesne dinamine klampa, tačiau DHK atpalaidavimas buvo mažesnis nei iš gelių be skvarbos skatintojo.

Pušies eterinis aliejus nepakeitė 1 proc. karbomero dinaminės klampos, tačiau DHK atpalaidavimą padidino.

Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, kad DHK atpalaidavimui įtakos turi ne tik gelifikuojančios

medžiagos koncentracija ir dinaminė gelių klampa, tačiau ir skvarbą skatinančios medžiagos.

Medžiagos atpalaidavimo procesas iš puskiečių vaisto formų remiasi Higuchi kinetikos modeliu.

Higuchi kinetikos modelis teigia, kad medžiagos kiekis, atpalaiduotas per ploto vienetą, yra proporcingas

√𝑡𝑡 (čia t – laikas) ir sudaro tiesią liniją [100]. Linijos tiesiškumas parodo veikliosios medžiagos

atpalaidavimo efektyvumą. 13 paveiksle pateiktas DHK atpalaidavimas pagal Higuchi iš 1 proc. karbomero

gelių formuluočių su ir be skvarbos skatintojų.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

DH

Ksr

auta

s, m

g/cm

²

Laikas, val.

G10 G11

41

13 pav. Dihidrokvercetino atpalaidavimas iš 1 proc. karbomero gelių pagal Higuchi kinetikos modelį.

Srauto priklausomybės nuo √𝑡𝑡 grafiko koreliacijos koeficientai buvo nuo 0,97 iki 0,99 (R2 ≥ 0,97),

todėl DHK atpalaidavimas iš visų tirtų formuluočių atitiko Higuchi modelį.

In vitro atpalaidavimo tyrimų rezultatai retai koreliuoja su ex vivo skvarbos tyrimų rezultatais,

tačiau suteikia vertingos informacijos apie veikliosios medžiagos termodinaminį aktyvumą formuluotėje.

Rezultatai parodė, kad DHK termodinaminį aktyvumą gelių formuluotėje keičia skvarbą skatinančių

medžiagų įvedimas. Iš skirtingų gelio formuluočių po 4 valandų atpalaiduotas DHK kiekis buvo nuo 0,75

mg/cm2 (26,62 proc.) iki 2,17 mg/cm2 (76,66 proc.), todėl pagamintos formuluotės buvo laikomos

tinkamomis DHK skvarbos į odą tyrimams ex vivo atlikti.

3.6. Dihidrokvercetino skvarba į žmogaus odą tyrimuose ex vivo

3.6.1. Dihidrokvercetino skvarba į odą iš eksperimentinio gelio

Dėl veiksmingo dihidrokvercetino atpalaidavimo in vitro bei priimtinesnės konsistencijos,

skvarbos į žmogaus odą tyrimams ex vivo pasirinkta 1 proc. karbomero gelio formuluotė (G3). DHK

koncentracija gelyje – 1 proc. Kaip kontrolė buvo pasirinktas 1 proc. DHK metanolinis (MeOH) tirpalas.

DHK skvarbos į odą iš kontrolinio tirpalo bei gelio (G3) rezultatai pateikti 8 lentelėje.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5

DH

K sr

auta

s, m

g/cm

²

val.

G3

G6

G9

G10

G11

42

8 lentelė. Dihidrokvercetino skvarba į odą iš kontrolinio tirpalo ir eksperimentinio gelio

Nešiklis Epidermis Derma

Kiekis, µg/mg Srautas, µg/cm² Kiekis, µg/mg Srautas, µg/cm²

MeOH tirpalas 1,8540 ± 0,4838 20,6602 ± 3,4249 0,0038 ± 0,0011 1,6578 ± 0,3312

G3 (Be skatintojo) 1,1986 ± 0,1377 15,1410 ± 1,8623 0,0030 ± 0,0010 1,3520 ± 0,2381

Po 6 valandų iš kontrolinio tirpalo DHK skvarba į odos sluoksnius buvo statistiškai reikšmingai

didesnė nei iš gelio G3 (p < 0,05). Toks rezultatas gali būti pagrįstas geliui, kaip puskietei vaisto formai,

būdinga klampa. Vertinant DHK pasiskirstymą odos sluoksniuose, nustatyta, kad didžioji dalis yra

sulaikoma odos epidermio sluoksnyje. Apskaičiuoti DHK pasiskirstymo santykiai tarp epidermio ir dermos:

kontroliniam tirpalui – 489:1, geliui – 396:1. DHK sulaikymą epidermyje gali įtakoti fizikinės-cheminės

savybės. DHK yra sunkiai tirpus vandenyje junginys (logP – 0,95), todėl hidrofilinė derma sudaro barjerą

DHK skvarbai. Akceptorinėje terpėje DHK nustatytas nebuvo. Atsižvelgiant į ant odos užneštą DHK kiekį,

iš gelio ir kontrolinio tirpalo į odą pateko tik apie 0,7 – 0,8 proc. DHK. Galima teigti, kad DHK patekimas

į odą yra ribotas, nepaisant to, kad DHK atitinka pagrindinius skvarbai į odą tinkamos molekulės

reikalavimus. Todėl aktualu ištirti skvarbos skatintojų įtaką DHK skvarbai iš gelio formuluotės.

3.6.2. Cheminių skvarbos skatintojų ir raginio sluoksnio įtaka dihidrokvercetino

skvarbai į odą

Tirta DHK skvarba iš gelių formuluočių su cheminiais skvarbos skatintojais. Išanalizavus

mokslinių tyrimų duomenis, pasirinktos medžiagos, priklausančios skirtingoms cheminių skvarbos

skatintojų grupėms bei pasižyminčios skirtingais veikimo mechanizmais. Į 1 proc. DHK gelį įterptos šios

medžiagos: dietilenglikolio monoetilo eteris DEGEE (10 proc.); PEG8-kaprilo/kaprio gliceridai PEG-8 KG

(10 proc.); eglės spyglių eterinis aliejus (3 proc.); pušies spyglių eterinis aliejus (3 proc.). Visų 1 proc.

karbomero gelių formuluočių dinaminė klampa tarpusavyje skyrėsi tik ± 1,5 proc. (p > 0,05), todėl nebuvo

atskirai analizuojama kaip skvarbą įtakojantis faktorius (žr. sk. 3.5.1.).

Dihidrokvercetino skvarbos į žmogaus odą ex vivo iš gelių su skvarbos skatintojais DEGEE ir PEG-

8 KG rezultatai pateikti 14 ir 15 paveiksluose.

43

14 pav. Dihidrokvercetino skvarba į epidermį iš gelių su skvarbos skatintojais DEGEE ir PEG-8 KG

Nustatytas DHK srautas į epidermį iš gelio su DEGEE (G6) - 12,5387 ± 3,0684 µg/cm2, gelio su

PEG-8 KG (G6) - 8,4242 ± 0,9889 µg/cm2. DHK skvarba iš gelių su skvarbos skatintoju DEGEE (G6) arba

PEG-8 KG (G9) į epidermį buvo mažesnė nei iš gelio be skvarbos skatintojo (G3) (14 pav.). Statistiškai

reikšmingas skirtumas nustatytas tarp G3 bei G9 (p < 0,05). Lyginant DHK skvarbą iš G3 ir G6, statistiškai

reikšmingo skirtumo nenustatyta (p > 0,05).

15 pav. Dihidrokvercetino skvarba į dermą iš gelių su skvarbos skatintojais DEGEE ir PEG-8 KG

1,1986

0,9882

0,6565

0,0000 0,2000 0,4000 0,6000 0,8000 1,0000 1,2000 1,4000 1,6000

Be skatintojo (G3)

DEGEE (G6)

PEG-8 KG (G9)

DHK kiekis, µg/mg

Form

uluo

tė

Epidermis

0,0030

0,0028

0,0048

0,0000 0,0010 0,0020 0,0030 0,0040 0,0050 0,0060

Be skatintojo (G3)

DEGEE (G6)

PEG-8 KG (G9)

DHK kiekis, µg/mg

Form

uluo

tė

Derma

44 Po 6 valandų iš gelio su DEGEE (G6) srautas į dermą buvo 1,2332 ± 0,4248 µg/cm2, o iš gelio su

PEG-8 KG (G9) -1,8996 ± 0,1768 µg/cm2. Statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant DHK skvarbą iš G6

ir G3 nenustatytas (p > 0,05). Iš G9 į dermą įsiskverbė 1,6 karto didesnis DHK kiekis nei iš G3, tačiau

statistinė duomenų analizė neparodė reikšmingo skirtumo (p > 0,05). Nustatytas DHK pasiskirstymas tarp

epidermio ir dermos sluoksnių: G6 - 351:1, G9 - 136:1. Akceptorinėje terpėje DHK nustatytas nebuvo.

Skvarbos ex vivo tyrimai parodė, kad DEGEE nepagerina DHK skvarbos iš gelio į odos sluoksnius.

Gautus rezultatus iš dalies pagrindžia in vitro atpalaidavimo tyrimo rezultatai. DHK atpalaidavimas iš gelio

su DEGEE į akceptorinę terpę buvo lėtesnis nei iš gelio be skvarbos skatintojo (žr. sk. 3.5.3). DHK galėjo

būti prasčiau atpalaiduojamas ir ant odos paviršiaus. DEGEE yra efektyvus tirpiklis, gerinantis tiek

lipofilinių, tiek hidrofilinių medžiagų tirpumą [77]. Remiantis mokslinių straipsnių duomenimis, tam, kad

vyktų medžiagos persiskirstymas iš nešiklio į odą, jos tirpumas nešiklyje turi būti sąlyginai mažas [43,48].

Didelis afiniškumas DEGEE galėjo lemti suprastėjusį DHK persiskirstymą iš gelio pagrindo ant odos

paviršiaus. Šį rezultatą galima palyginti su Scalia ir kitų autorių gautais tyrimų rezultatais [93]. Tyrimų metu

buvo atliktas panašiomis fizikinėmis-cheminėmis savybėmis pasižyminčio junginio kvercetino skvarbos į

žmogaus odą tyrimas in vivo. Nustatyta, kad DEGEE nepagerina kvercetino skvarbos į raginį sluoksnį iš

A/V kremo formuluotės. Autoriai teigia, kad toks rezultatas pagrįstas padidėjusiu kvercetino tirpumu ir

sumažėjusiu termodinaminiu aktyvumu formuluotėje su DEGEE [93].

Iš gelio su PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridais (G9) epidermyje aptiktas statistiškai reikšmingai 1,8

karto mažesnis kiekis nei gelio be skatintojo (G3) (p < 0,05). Tačiau į dermą, nors ir statistiškai

nereikšmingai, pateko 1,6 karto didesnis DHK kiekis. Lyginant su geliu be skvarbos skatintojo (G3), DHK

pasiskirstymo santykis tarp epidermio ir dermos sluoksnių sumažėjo 3 kartus. Remiantis šiais rezultatais,

galima teigti, kad PEG-8 KG patenka į gilesnį odos dermos sluoksnį, kartu pernešdamas ir jame ištirpusį

DHK. Tačiau reikšmingo DHK skvarbos pokyčio į dermos sluoksnį nenustatyta.

Dihidrokvercetino skvarbos tyrimų rezultatai iš gelių su 3 proc. eglės spyglių arba pušies spyglių

eterinio aliejaus (EA) pateikti 16 bei 17 paveiksluose.

45

16 pav. Dihidrokvercetino skvarba į epidermį iš gelių su skvarbos skatintojais eglės arba pušies spyglių

eteriniais aliejais

Po 6 valandų iš formuluočių su 3 proc. eglės spyglių EA arba 3 proc. pušies spyglių EA (G10 ir

G11) nustatytas srautas į epidermį atitinkamai buvo 44,7828 ± 3,1828 µg/cm2 ir 32,8063 ± 4,8476 µg/cm2.

DHK skvarba buvo statistiškai reikšmingai didesnė iš G10 ir G11 lyginant su G3 (p < 0,05).

17 pav. Dihidrokvercetino skvarba į dermą iš gelių su skvarbos skatintojais eglės arba pušies spyglių

eteriniais aliejais

Nustatytas DHK srautas į dermą iš gelių G10 ir G11 atitinkamai buvo 11,2586 ± 1,2396 µg/cm2 ir

4,5865 ± 0,6430 µg/cm2. DHK skvarba į dermą iš G10 ir G11 buvo statistiškai reikšmingai didesnė lyginant

1,1986

3,2074

2,2325

0,0000 0,5000 1,0000 1,5000 2,0000 2,5000 3,0000 3,5000 4,0000

Be skatintojo (G3)

Eglės EA (G10)

Pušies EA (G11)

DHK kiekis, µg/mg

Form

uluo

tė

Epidermis

0,0030

0,0225

0,0091

0,0000 0,0050 0,0100 0,0150 0,0200 0,0250 0,0300

Be skatintojo (G3)

Eglės EA (G10)

Pušies EA (G11)

DHK kiekis, µg/mg

Form

uluo

tė

Derma

46 su G3 (p < 0,05). Eglės spyglių EA statistiškai reikšmingai pagerino DHK skvarbą iš gelio tiek į epidermį,

tiek į dermą lyginant su kontroliniu tirpalu (p < 0,05). Nustatyti pasiskirstymo santykiai tarp epidermio ir

dermos: G10 - 143:1, G11- 244:1. Akceptorinėje terpėje po 6 valandų DHK nebuvo nustatytas.

Gauti rezultatai patvirtino eterinių aliejų tinkamumą DHK skvarbos skatinimui į odos sluoksnius.

Mokslinių tyrimų duomenyse nurodyta, kad eteriniai aliejai veikia keisdami raginio sluoksnio lipidų

struktūrą bei pagerindami tarpląstelinę medžiagos difuziją [62]. Eterinių aliejų veikimas pagrįstas jų

sudėtyje esančiais terpenais. Monti ir kt., Chen ir kt., Lan ir kt. publikuoti skvarbos į odą ex vivo tyrimų

rezultatai patvirtina, kad eteriniai aliejai, kaip terpenų ir jų darinių mišinys, gerina veikliųjų medžiagų

skvarbą efektyviau nei juose esantys pavieniai komponentai [62,101,102]. DHK skvarba į odos sluoksnius

iš gelio su eglės spyglių EA (G10) buvo statistiškai reikšmingai didesnė nei iš gelio su pušies spyglių EA

(G11) (p < 0,05), todėl eglės EA buvo veiksmingesnis skatintojas.

Paskelbti mokslinių tyrimų rezultatai patvirtina cheminių skvarbos skatintojų mišinių sinergizmą

[72,103]. Todėl suformuoti geliai su pasirinktų skvarbos skatintojų mišiniais:

• 5 proc. DEGEE + 3 proc. eglės spyglių EA;

• 5 proc. PEG-8 KG+ 3 proc. eglės spyglių EA;

• 5 proc. DEGEE + 3 proc. pušies spyglių EA;

• 5 proc. PEG-8 KG + 3 proc. pušies spyglių EA.

DHK skvarbos iš gelių su skvarbos skatintojų mišiniais rezultatai pateikti 18 ir 19 paveiksluose.

18 pav. Dihidrokvercetino skvarba į epidermį iš gelių su skvarbos skatintojų mišiniais

2,1509

2,5154

1,2070

1,6824

0,0000 0,5000 1,0000 1,5000 2,0000 2,5000 3,0000

Eglės EA + DEGEE (G12)

Eglės EA + PEG-8 KG (G13)

Pušies EA + DEGEE (G14)

Pušies EA + PEG-8 KG (G15)

DHK kiekis, µg/mg

Form

uluo

tė

Epidermis

47 Nustatyta, kad iš gelių su skvarbos skatintojų mišiniais įsiskverbia statistiškai reikšmingai mažesni

kiekiai (p <0,05) nei iš gelių tik su eteriniais aliejais, tačiau didesni kiekiai nei iš gelio be skvarbos skatintojo

(p < 0,05). Statistiškai reikšmingi skirtumai (p < 0,05) nustatyti tarp šių formuluočių: G10 ir G12; G10 ir

G13; G11 ir G14; G11 ir G15.

19 pav. Dihidrokvercetino skvarba į dermą iš gelių su skvarbos skatintojų mišiniais

Lyginant DHK skvarbą iš G10 ir G12 nustatyta, kad DEGEE statistiškai reikšmingai (p < 0,05)

sumažina eglės spyglių EA skatinamąjį poveikį į dermą. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp G10 ir G13,

G11 ir G14, G11 ir G15 nenustatyta (p > 0,05).

Tyrimų rezultatai parodė, kad DEGEE veikia antagonistiškai eterinių aliejų atžvilgiu ir slopina jų

skvarbą skatinantį poveikį. Šie rezultatai patvirtino, kad DEGEE nėra veiksmingas skvarbos skatintojas

DHK. Vertinant PEG-8 KG ir eterinio aliejaus mišinio poveikį, nustatyta, DHK kiekis epidermyje sumažėjo

(p < 0,05), tačiau skvarba į dermą nepasikeitė (p > 0,05). Galima teigti, kad mišinyje esantys eteriniai aliejai

veikė gerindami DHK patekimą į odą pro raginį sluoksnį, o PEG-8 KG skatino DHK persiskirstymą į gilesnį

odos dermos sluoksnį. Tačiau skvarbos skatintojų mišiniai DHK skvarbos iš gelio nepagerino.

Įvertinta raginio sluoksnio barjero įtaka DHK skvarbai iš efektyviausios gelio formuluotės G10.

Raginis sluoksnis buvo pašalintas ir atliktas analogiškas 6 valandų skvarbos į odą tyrimas ex vivo. Rezultatai

pateikti 20 ir 21 paveiksluose.

0,0146

0,0242

0,0062

0,0110

0,0000 0,0050 0,0100 0,0150 0,0200 0,0250 0,0300 0,0350

Eglės EA + DEGEE (G12)

Eglės EA + PEG-8 KG (G13)

Pušies EA + DEGEE (G14)

Pušies EA + PEG-8 KG (G15)

DHK kiekis, µg/mg

Form

uluo

tė

Derma

48

20 pav. Raginio sluoksnio įtaka dihidrokvercetino skvarbai į epidermį iš gelio su eglės spyglių eteriniu aliejumi (G10): -R – oda su pašalintu raginiu sluoksniu, +R – oda su raginiu sluoksniu

Tyrimas parodė, kad pašalinus raginį sluoksnį, iš G10 formuluotės į epidermį patenka statistiškai

reikšmingas 1,6 karto didesnis DHK kiekis (p < 0,05).

21 pav. Raginio sluoksnio įtaka dihidrokvercetino skvarbai į dermą iš gelio su eglės spyglių eteriniu

aliejumi (G10): -R – oda su pašalintu raginiu sluoksniu, +R – oda su raginiu sluoksniu

Analogiškas rezultatas nustatytas dermos sluoksnyje. DHK kiekis, aptiktas dermoje, buvo

statistiškai reikšmingai (p < 0,05) 1,7 karto didesnis. Todėl raginis sluoksnis sudarė barjerą ne tik DHK,

3,2074

5,4480

0,0000 1,0000 2,0000 3,0000 4,0000 5,0000 6,0000 7,0000

eglės EA (G10) +R

eglės EA (G10) -R

DHK kiekis, µg/mg

Form

uluo

tė

Epidermis

0,0225

0,0427

0,0000 0,0100 0,0200 0,0300 0,0400 0,0500 0,0600

eglės EA (G10) +R

eglės EA (G10) -R

DHK kiekis, µg/mg

Form

uluo

tė

Derma

49 tačiau ir eglės spyglių EA patekimui į odą. Raginio sluoksnio pašalinimas nepakeitė pasiskirstymo odos

sluoksniuose tendencijos – didžioji dalis prasiskverbusio DHK kiekio aptikta epidermyje.

3.6.3. Dihidrokvercetino skvarba į odą iš mikroemulsijų

Atliktas skvarbos į žmogaus odą tyrimas ex vivo su 1 proc. DHK mikroemulsijomis (ME),

turinčiomis 5:1, 6:1 ir 7:1 surfaktanto ir kosurfaktanto santykius (S:KoS). ME sudėtyje naudojamas

surfaktantas – PEG8-kaprilo/kaprio gliceridai (PEG-8 KG), kurio skatinamasis poveikis tirtas DHK

skvarbos tyrimuose iš gelių. Kosurfaktantas - poligliceril-6-izostereatas (P6I). Kaip kontrolė buvo

naudojamas 1 proc. DHK tirpalas metanolyje. Tyrimo rezultatai pateikti 22 paveiksle.

22 pav. Dihidrokvercetino skvarba į epidermį iš skirtingų S:KoS santykių ME: 5:1, 6:1, 7:1

Dihidrokvercetinas po 6 valandų kiekybiškai nustatytas epidermio sluoksnyje. Nustatyti srautai į

epidermį: ME 5:1 - 0,7599 ± 0,1028 µg/cm2, ME 6:1 - 1,0870 ± 0,1857 µg/cm2, ME 7:1 - 0,8254 ± 0,0601

µg/cm2. Didžiausias DHK kiekis buvo nustatytas iš ME 6:1 formuluotės, tačiau skirtumas nebuvo

statistiškai reikšmingas lyginant su ME 5:1 bei ME 7:1 formuluotėmis (p < 0,05). Todėl S:KoS santykis bei

dinaminė klampa neturėjo reikšmingos įtakos DHK skvarbai į odą. Skvarba iš visų formuluočių buvo

statistiškai reikšmingai mažesnė (p < 0,05) lyginant su kontroliniu 1 proc. DHK tirpalu (1,8540 ± 0,4838

µg/mg arba 20,6602 ± 3,4249 µg/cm2). Dermoje bei akceptorinėje terpėje identifikuotas DHK buvo žemiau

UESC metodo kiekybinio nustatymo ribos. Galima teigti, kad mikroemulsijos, kaip tiekimo į odą sistema,

veikė lėčiau nei geliai, tačiau skatino DHK transderminę pernašą.

0,0793

0,0906

0,0762

0,0000 0,0200 0,0400 0,0600 0,0800 0,1000 0,1200

ME 5:1

ME 6:1

ME 7:1

DHK kiekis, µg/mg

Form

uluo

tė

Epidermis

50

3.6.4. Dihidrokvercetino skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimų rezultatų

apibendrinimas

Dihidrokvercetino skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimų rezultatai parodė, kad geliai buvo

statistiškai reikšmingai (p < 0,05) efektyvesni nešikliai nei mikroemulsijos (ME), nepaisant to, kad ME

gamyboje naudojamos skvarbą skatinančios medžiagos (S ir KoS), o dinaminė klampa yra mažesnė. Į

epidermio sluoksnį iš gelių formuluočių įsiskverbė nuo 10 iki 35 kartų didesni DHK kiekiai. Į dermą iš ME

patekęs DHK kiekis buvo žemiau kiekybinio nustatymo ribos, todėl palyginti su DHK skvarba į šį sluoksnį

iš gelių nepavyko. Vertinant pasiskirstymą tarp odos sluoksnių, nustatyta, kad didžioji dalis DHK yra

sulaikoma odos epidermio sluoksnyje. Pasiskirstymo santykiai tarp epidermio ir dermos svyravo nuo 396:1

iki 104:1 ir priklausė nuo gelio formuluotės.

Skvarbos ex vivo tyrimų rezultatai patvirtino, kad pasirinktų cheminių skvarbos skatintojų

įterpimas į gelio formuluotę turi reikšmingos įtakos DHK skvarbai į odą. Skvarbos skatintojų poveikis DHK

skvarbai į odos sluoksnius išreikštas skatinamuoju santykiu (SS), kuris apskaičiuotas šia formule [62,97]:

𝑆𝑆𝑆𝑆 =𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷 𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑏𝑏𝑠𝑠 𝑠𝑠𝑠𝑠 𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑡𝑡𝑠𝑠𝑠𝑠𝑡𝑡𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠, µ𝑔𝑔/𝑚𝑚𝑔𝑔𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷𝐷 𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑏𝑏𝑠𝑠 𝑏𝑏𝑏𝑏 𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑡𝑡𝑠𝑠𝑠𝑠𝑡𝑡𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠, µ𝑔𝑔/𝑚𝑚𝑔𝑔

Apibendrinti rezultatai pateikti 9 lentelėje.

9 lentelė. Skatinamieji santykiai SS: * - statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05)

Gelio formuluotė SSepidermis SSderma

DEGEE 0,82 0,94 PEG-8 KG 0,55* 1,61 Eglės EA 2,68* 7,49* Pušies EA 1,86* 3,05*

Eglės EA + DEGEE 1,79* 4,85* Eglės EA + PEG-8 KG 2,10* 8,05* Pušies EA + DEGEE 1,01 2,08

Pušies EA + PEG-8 KG 1,40* 3,68

Nustatyta, kad eteriniai aliejai efektyviausiai skatina DHK skvarbą į odos sluoksnius. Tyrimų

rezultatai parodė, kad didžiausia DHK skvarba į odos epidermio sluoksnį buvo iš gelio su eglės spyglių

eteriniu aliejumi (G10), o į dermą – su eglės spyglių eteriniu aliejumi (G10) arba jo mišiniu su PEG-8 KG

(G13). DEGEE nebuvo tinkamas skvarbos skatintojas ir veikė antagonistiškai mišinyje su eteriniais aliejais.

51 PEG-8 KG skvarbą į epidermį sumažino, o į dermą nepakeitė. Akceptorinėje terpėje DHK nebuvo

nustatytas, todėl į gelius įterpti skvarbos skatintojai nepasižymėjo transdermine DHK pernaša.

Skvarbos į odą tyrimas ex vivo yra informatyvus metodas vykdant formuluočių kūrimo ir vystymo

etapus. Remiantis skvarbos tyrimų rezultatais, galima įvertinti veikliosios medžiagos skvarbą bei

pasiskirstymą tarp odos sluoksnių, sumodeliuoti tinkamus nešiklius ir ištirti skvarbą skatinančių medžiagų

poveikį. Dėl barjerinių raginio sluoksnio savybių, efektyvių skvarbą skatinančių medžiagų parinkimas yra

reikšmingas formuluojant tiekimo į odą sistemas. Mokslinėse duomenų bazėse šiuo metu nėra publikuotų

dihidrokvercetino skvarbos į žmogaus odą tyrimų ex vivo rezultatų. Todėl gauti tyrimų rezultatai suteikė

pirminių įžvalgų apie dihidrokvercetino skvarbą, tiekimo į odą sistemų formulavimą bei veiksmingų

cheminių skvarbos skatintojų parinkimą.

52

IŠVADOS

1. Validuotas ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodas buvo tinkamas dihidrokvercetino

kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti biofarmaciniuose in vitro bei ex vivo tyrimuose.

2. Fizikinių savybių ir in vitro atpalaidavimo tyrimai patvirtino sumodeliuotų gelių bei mikroemulsijų

tinkamumą dihidrokvercetino tiekimui į odą.

3. Skvarbos ex vivo tyrimų rezultatai patvirtino aktyvų sumodeliuotų formuluočių vaidmenį

dihidrokvercetino skvarbai į žmogaus odą. Dihidrokvercetino skvarba į epidermį iš gelių buvo 10 –

35 kartus efektyvesnė nei iš mikroemulsijų (p < 0,05). Tačiau formuluotės neužtikrino pakankamos

dihidrokvercetino skvarbos į dermą.

4. Dihidrokvercetino skvarbą į žmogaus odos sluoksnius reikšmingai pagerina pušies bei eglės spyglių

eteriniai aliejai (p < 0,05). Efektyviausias skvarbos skatintojas buvo eglės spyglių eterinis aliejus.

Dietilenglikolio monoetilo eteris ir PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai nepasižymėjo skvarbą

skatinančiu poveikiu. Skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimų rezultatai suteikia patikimos

informacijos apie skvarbą skatinančių medžiagų poveikį ir leidžia argumentuotai parinkti

tinkamiausias formuluotes veikliosios medžiagos tiekimui į odą.

53

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. In vitro atpalaidavimo tyrimų rezultatų nepakanka siekiant patikimai įvertinti formuluočių vaidmenį

dihidrokvercetino skvarbai, todėl rekomenduojama atlikti skvarbos į odą tyrimus ex vivo.

2. Rekomenduojama nustatyti mažiausią eterinių aliejų koncentraciją, kuri veiksmingai pagerintų

dihidrokvercetino skvarbą į odą, siekiant išvengti eterinių aliejų odą dirginančio poveikio.

3. Rekomenduojama atlikti dihidrokvercetino antioksidacinio poveikio tyrimus ląstelių modeliuose ir

nustatyti efektyvią koncentraciją, kuri turėtų prasiskverbti iš formuluočių į odą.

54

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Działo M, Mierziak J, Korzun U, Preisner M, Szopa J, Kulma A. The Potential of Plant Phenolics in Prevention and Therapy of Skin Disorders. Int J Mol Sci [Internet]. 2016;17(2):160. Available from: http://www.mdpi.com/1422-0067/17/2/160

2. Nichols J a., Katiyar SK. Skin photoprotection by natural polyphenols: Anti-inflammatory, antioxidant and DNA repair mechanisms. Arch Dermatol Res. 2010;302(2):71–83.

3. Shubina VS, Shatalin Y V. Skin regeneration after chemical burn under the effect of taxifolin-based preparations. Bull Exp Biol Med. 2012;154(1):152–7.

4. An SM, Kim HJ, Kim J-E, Boo YC. Flavonoids, taxifolin and luteolin attenuate cellular melanogenesis despite increasing tyrosinase protein levels. Phyther Res. 2008 Aug;22(9):1200–7.

5. Bito T, Roy S, Sen CK, Shirakawa T, Gotoh A, Ueda M, et al. Flavonoids differentially regulate IFN gamma-induced ICAM-1 expression in human keratinocytes: molecular mechanisms of action. FEBS Lett. 2002;520:145–52.

6. Kim JY, Lee OS, Ha S, Kim JH, Park G, Kim JK, et al. In vivo assessment of the effect of taxifolin glycoside on atopic dermatitis-like skin lesions using biomedical tools in NC/Nga mice. Clin Exp Dermatol [Internet]. 2014;n/a – n/a. Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/ced.12522

7. Ghafourian T, Samaras EG, Brooks JD, Riviere JE. Validated models for predicting skin penetration from different vehicles. Eur J Pharm Sci [Internet]. Elsevier B.V.; 2010;41(5):612–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ejps.2010.08.014

8. Lane ME. Skin penetration enhancers. Int J Pharm [Internet]. Elsevier B.V.; 2013;447(1-2):12–21. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpharm.2013.02.040

9. Flaten GE, Palac Z, Engesland A, Filipovic-Grcic J, Vanic Ž, Škalko-Basnet N. In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation. Eur J Pharm Sci. 2015;75:10–24.

10. Ichihashi M, Ueda M, Budiyanto A, Bito T, Oka M, Fukunaga M, et al. UV-induced skin damage. Toxicology [Internet]. 2003;189(1-2):21–39. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0300483X03001501

11. Battie C, Jitsukawa S, Bernerd F, Del Bino S, Marionnet C, Verschoore M. New insights in photoaging, UVA induced damage and skin types. Exp Dermatol [Internet]. 2014;23 Suppl 1:7–12. Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/exd.12388\nhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25234829

12. Kozina LS, Borzova I V., Arutiunov VA, Ryzhak GA. Role of oxidative stress in skin aging. Adv Gerontol [Internet]. 2013;3(1):18–22. Available from: http://link.springer.com/10.1134/S2079057013010086

13. Kandola K, Bowman A, Birch-Machin MA. Oxidative stress - A key emerging impact factor in health, ageing, lifestyle and aesthetics. Int J Cosmet Sci. 2015;37:1–8.

14. Topal F, Nar M, Gocer H, Kalin P, Kocyigit UM, Alwasel SH, et al. Antioxidant activity of taxifolin : an activity – structure relationship. J Enzyme Inhib Med Chem. 2015;6366(October):1–10.

15. Starr JM, Starr RJ. Skin Aging and Oxidative Stress. Aging (Albany NY) [Internet]. 2014;15–22. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/B9780124059337000020

55 16. Godic A, Poljšak B, Adamic M, Dahmane R. The role of antioxidants in skin cancer prevention and

treatment. Oxid Med Cell Longev. 2014;2014.

17. Svobodová A, Psotová J, Walterová D. Natural phenolics in the prevention of UV-induced skin damage. A review. Biomed Pap Med Fac Univ Palacký, Olomouc, Czechoslov. 2003;147(2):137–45.

18. Saewan N, Jimtaisong A. Natural products as photoprotection. J Cosmet Dermatol. 2015;14(1):47–63.

19. Weidmann AE. Dihydroquercetin: More than just an impurity? Eur J Pharmacol [Internet]. Elsevier B.V.; 2012;684(1-3):19–26. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ejphar.2012.03.035

20. Oi N, Chen H, Kim MO, Lubet R a., Bode AM, Dong Z. Taxifolin suppresses UV-induced skin carcinogenesis by targeting EGFR and PI3K. Cancer Prev Res. 2012;5(9):1103–14.

21. Pozharitskaya ON, Karlina M V., Shikov AN, Kosman VM, Makarova MN, Makarov VG. Determination and pharmacokinetic study of taxifolin in rabbit plasma by high-performance liquid chromatography. Phytomedicine. 2009;16(2-3):244–51.

22. Zu Y, Wu W, Zhao X, Li Y, Wang W, Zhong C, et al. Enhancement of solubility, antioxidant ability and bioavailability of taxifolin nanoparticles by liquid antisolvent precipitation technique. Int J Pharm [Internet]. Elsevier B.V.; 2014;471(1-2):366–76. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0378517314004025

23. Janeiro P, Corduneanu O, Brett AMO. Chrysin and (+)-taxifolin electrochemical oxidation mechanisms. Electroanalysis. 2005;17(12):1059–64.

24. Teixeira S, Siquet C, Alves C, Boal I, Marques MP, Borges F, et al. Structure-property studies on the antioxidant activity of flavonoids present in diet. Free Radic Biol Med. 2005;39(8):1099–108.

25. Trouillas P, Fagnère C, Lazzaroni R, Calliste C, Marfak A, Duroux J-L. A theoretical study of the conformational behavior and electronic structure of taxifolin correlated with the free radical-scavenging activity. Food Chem [Internet]. 2004;88(4):571–82. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814604001608

26. Trouillas P, Marsal P, Siri D, Lazzaroni R, Duroux J-L. A DFT study of the reactivity of OH groups in quercetin and taxifolin antioxidants: The specificity of the 3-OH site. Food Chem [Internet]. 2006;97(4):679–88. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814605004267

27. Sato M, Murakami K, Uno M, Ikubo H, Nakagawa Y, Katayama S, et al. Structure–Activity Relationship for (+)-Taxifolin Isolated from Silymarin as an Inhibitor of Amyloid β Aggregation. Biosci Biotechnol Biochem [Internet]. 2013;77(5):1100–3. Available from: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1271/bbb.120925

28. Amic D, Amic DD, Bešlo D, Trinajstic N. Structure-radical scavenging activity relationships of flavonoids. Croat Chem acta. 2002;76(1):55–61.

29. Osorio E, Pérez EG, Areche C, Ruiz LM, Cassels BK, Flórez E, et al. Why is quercetin a better antioxidant than taxifolin? Theoretical study of mechanisms involving activated forms. J Mol Model. 2013;19(5):2165–72.

30. Anthony K, Saleh M. Free Radical Scavenging and Antioxidant Activities of Silymarin Components. Antioxidants [Internet]. 2013;2(4):398–407. Available from: http://www.mdpi.com/2076-

56

3921/2/4/398/htm

31. Chen Y, Deuster P. Comparison of quercetin and dihydroquercetin: Antioxidant-independent actions on erythrocyte and platelet membrane. Chem Biol Interact. 2009;182(1):7–12.

32. Kostyuk V a., Kraemer T, Sies H, Schewe T. Myeloperoxidase/nitrite-mediated lipid peroxidation of low-density lipoprotein as modulated by flavonoids. FEBS Lett [Internet]. 2003;537(1-3):146–50. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0014579303001133

33. Guo H, Zhang X, Cui Y, Zhou H, Xu D, Shan T, et al. Taxifolin protects against cardiac hypertrophy and fibrosis during biomechanical stress of pressure overload. Toxicol Appl Pharmacol [Internet]. Elsevier Inc.; 2015;287(2):168–77. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041008X15300090

34. Sun X, Chen R, Yang Z, Sun G, Wang M, Ma X, et al. Taxifolin prevents diabetic cardiomyopathy in vivo and in vitro by inhibition of oxidative stress and cell apoptosis. Food Chem Toxicol [Internet]. Elsevier Ltd; 2014;63:221–32. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278691513007588

35. Teselkin YO, Babenkova I V., Kolhir VK, Baginskaya a. I, Tjukavkina N a., Kolesnik Y a., et al. Dihydroquercetin as a means of antioxidative defence in rats with tetrachloromethane hepatitis. Phyther Res. 2000;14(3):160–2.

36. Theriault a, Wang Q, Van Iderstine SC, Chen B, Franke a a, Adeli K. Modulation of hepatic lipoprotein synthesis and secretion by taxifolin, a plant flavonoid. J Lipid Res. 2000;41(12):1969–79.

37. Shubina VS, Shatalin Y V. Effect of the liposomal form of flavonoid-metal complexes on skin regeneration after chemical burn. Tsitologiya. 2012;54(3):251–60.

38. Naumov a a, Shatalin Y V, Potselueva MM. Effects of a nanocomplex containing antioxidant, lipid, and amino acid on thermal burn wound surface. Bull Exp Biol Med [Internet]. 2010;149(1):62–6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21113460

39. Naumov AA, Potselueva MM. Liposomal form of dihydroquercetin contributes to skin regeneration after thermal burns. Cell tissue biol [Internet]. 2010;4(3):240–4. Available from: http://link.springer.com/10.1134/S1990519X10030041

40. Lee CW, Park NH, Kim JW, Um BH, Shpatov a. V., Shults EE, et al. Study of skin anti-ageing and anti-inflammatory effects of dihydroquercetin, natural triterpenoinds, and their synthetic derivatives. Russ J Bioorganic Chem. 2012;38(3):328–34.

41. Trommer H, Neubert RHH. Overcoming the stratum corneum: The modulation of skin penetration. A review. Skin Pharmacol Physiol. 2006;19(2):106–21.

42. Van Smeden J, Janssens M, Gooris GS, Bouwstra JA. The important role of stratum corneum lipids for the cutaneous barrier function. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Biol Lipids [Internet]. Elsevier B.V.; 2014;1841(3):295–313. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.bbalip.2013.11.006

43. Dancik Y, Bigliardi PL, Bigliardi-qi M. What happens in the skin ? Integrating skin permeation kinetics into studies of developmental and reproductive toxicity following topical exposure. Elsevier Inc.; 2015;58:252–81.

44. López O, Cócera M, Wertz PW, López-Iglesias C, de la Maza A. New arrangement of proteins and lipids in the stratum corneum cornified envelope. Biochim Biophys Acta - Biomembr.

57

2007;1768(3):521–9.

45. Asbill CS, Michniak BB, Lane ME, Asbill CS, Michniak BB. Percutaneous penetration enhancers : local versus transdermal activity. Pharm Sci Technol Today. 2000;3(1):36–41.

46. Benson HA. Transdermal drug delivery: penetration enhancement techniques. Curr Drug Deliv [Internet]. 2005;2(1):23–33. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16305405

47. Alexander A, Dwivedi S, Ajazuddin, Giri TK, Saraf S, Saraf S, et al. Approaches for breaking the barriers of drug permeation through transdermal drug delivery. J Control Release [Internet]. Elsevier B.V.; 2012;164(1):26–40. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.2012.09.017

48. Bolzinger M-A, Briançon S, Pelletier J, Chevalier Y. Penetration of drugs through skin, a complex rate-controlling membrane. Curr Opin Colloid Interface Sci [Internet]. Elsevier Ltd; 2012;17(3):156–65. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1359029412000234

49. Pilgram GSK, Engelsma-Van Pelt AM, Bouwstra JA, Koerten HK. Electron diffraction provides new information on human stratum corneum lipid organization studied in relation to depth and temperature. J Invest Dermatol [Internet]. Elsevier Masson SAS; 1999;113(3):403–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1046/j.1523-1747.1999.00706.x

50. Alkilani AZ, McCrudden MTC, Donnelly RF. Transdermal drug delivery: Innovative pharmaceutical developments based on disruption of the barrier properties of the stratum corneum. Pharmaceutics. 2015;7(4):438–70.

51. Naik A, Kalia YN, Guy RH. Transdermal drug delivery: Overcoming the skin’s barrier function. Pharm Sci Technol Today. 2000;3(9):318–26.

52. Selzer D, Abdel-Mottaleb MMA, Hahn T, Schaefer UF, Neumann D. Finite and infinite dosing: Difficulties in measurements, evaluations and predictions. Adv Drug Deliv Rev. 2013;65(2):278–94.

53. Anissimov YG, Jepps OG, Dancik Y, Roberts MS. Mathematical and pharmacokinetic modelling of epidermal and dermal transport processes. Adv Drug Deliv Rev [Internet]. Elsevier B.V.; 2013;65(2):169–90. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.addr.2012.04.009

54. Ita KB. Transdermal drug delivery: progress and challenges. J Drug Deliv Sci Technol [Internet]. Elsevier Masson SAS; 2014;24(3):245–50. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S177322471450041X

55. Rai V, Ghosh I, Bose S, Silva SMC, Chandra P, Michniak-Kohn B. A transdermal review on permeation of drug formulations, modifier compounds and delivery methods. J Drug Deliv Sci Technol [Internet]. Elsevier Masson SAS; 2010;20(2):75–87. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S1773-2247(10)50011-X

56. European Pharmacopoeia 7th ed. Council of Europe, Strasbourg 2013; 163 – 166, 734 – 735, 1184 - 1185. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21446890

57. Calo E, Khutoryanskiy V V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 2015;65:252–67.

58. Gupta P, Garg S. Recent Advances in Semisolid Dosage Forms for Dermatological Application. Pharm Technol. 2002;(March):144–62.

59. Rehman K, Zulfakar MH. Recent advances in gel technologies for topical and transdermal drug delivery. Drug Dev Ind Pharm [Internet]. 2014;40(4):433–40. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23937582

58 60. Ramanauskienė K, Stelmakienė A, Majienė D. Assessment of Lemon Balm ( Melissa officinalis L .)

Hydrogels: Quality and Bioactivity in Skin Cells. Evidence-Based Complement Altern Med. Hindawi Publishing Corporation; 2015;1–7.

61. Csizmazia E, Erős G, Berkesi O, Berkó S, Szabó-Révész P, Csányi E. Pénétration enhancer effect of sucrose laurate and Transcutol on ibuprofen. J Drug Deliv Sci Technol [Internet]. Elsevier Masson SAS; 2011;21(5):411–5. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1773224711500668

62. Chen J, Jiang QD, Wu YM, Liu P, Yao JH, Lu Q, et al. Potential of essential oils as penetration enhancers for transdermal administration of ibuprofen to treat dysmenorrhoea. Molecules. 2015;20(10):18219–36.

63. Fanun M. Microemulsions as delivery systems. Curr Opin Colloid Interface Sci [Internet]. Elsevier Ltd; 2012;17(5):306–13. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.cocis.2012.06.001

64. Burguera JL, Burguera M. Analytical applications of emulsions and microemulsions. Talanta [Internet]. Elsevier B.V.; 2012;96:11–20. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2012.01.030

65. Surabhi K, Op K, Atul N, Arun G. Microemulsions : Developmental aspects. Res J Pharm Biol Chem Sci. 2010;1(683):683–706.

66. Fahr A, Liu X. Drug delivery strategies for poorly water-soluble drugs. Expert opinion on drug delivery. 2007. 403-416 p.

67. Lawrence MJ, Rees GD. Microemulsion-based media as novel drug delivery systems. Adv Drug Deliv Rev [Internet]. 2012;64(SUPPL.):175–93. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.addr.2012.09.018

68. Ita K. Progress in the use of microemulsions for transdermal and dermal drug delivery. Pharm Dev Technol [Internet]. 2016;7450(March):1–9. Available from: http://www.tandfonline.com/doi/full/10.3109/10837450.2016.1148722

69. Sharma AK, Garg T, Goyal AK, Rath G. Role of microemuslsions in advanced drug delivery. Artif Cells, Nanomedicine, Biotechnol [Internet]. 2015;1401(December):1–9. Available from: http://www.tandfonline.com/doi/full/10.3109/21691401.2015.1012261

70. Censi R, Martena V, Hoti E, Malaj L, Di Martino P. Permeation and skin retention of quercetin from microemulsions containing Transcutol® P. Drug Dev Ind Pharm [Internet]. 2012;38(9):1128–33. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22188183

71. Juškaitė V, Ramanauskienė K, Briedis V. Design and Formulation of Optimized Microemulsions for Dermal Delivery of Resveratrol. Evidence-Based Complement Altern Med [Internet]. 2015;2015:1–10. Available from: http://www.hindawi.com/journals/ecam/2015/540916/

72. Manisha P, Geeta A, Harikumar S. Review Article Synergistic Action of Penetration Enhancers in Transdermal Drug. J Drug Deliv Ther. 2014;4(3):45–51.

73. Ahad A, Aqil M, Kohli K, Chaudhary H, Sultana Y, Mujeeb M, et al. Chemical penetration enhancers: a patent review. Expert Opin Ther Pat. 2009;19(7):969–88.

74. Sinha VR, Kaur MP. Permeation enhancers for transdermal drug delivery. Drug Dev Ind Pharm [Internet]. 2000;26(11):1131–40. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11068686

75. Barry BW. Lipid–Protein–Partitioning Theory of Skin Penetration Enhancement. J Control Release.

59

1991;15:237–48.

76. Sullivan DW, Gad SC, Julien M. A review of the nonclinical safety of Transcutol®, a highly purified form of diethylene glycol monoethyl ether (DEGEE) used as a pharmaceutical excipient. Food Chem Toxicol [Internet]. Elsevier Ltd; 2014;72:40–50. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.fct.2014.06.028

77. Osborne DW. Diethylene glycol monoethyl ether: An emerging solvent in topical dermatology products. J Cosmet Dermatol. 2011;10(4):324–9.

78. Osmałek T, Milanowski B, Froelich A, Górska S, Białas W, Szybowicz M, et al. Novel organogels for topical delivery of naproxen: design, physicochemical characteristics and in vitro drug permeation. Pharm Dev Technol [Internet]. 2016;7450(February):1–16. Available from: http://www.tandfonline.com/doi/full/10.3109/10837450.2015.1135342

79. Balázs B, Vizserálek G, Berkó S, Budai-Szűcs M, Kelemen A, Sinkó B, et al. Investigation of the Efficacy of Transdermal Penetration Enhancers Through the Use of Human Skin and a Skin Mimic Artificial Membrane. J Pharm Sci [Internet]. 2016;3549:1–7. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022354915001720

80. Chevalier Y, Oddos T, Gohier A, Boyron O, Bolzinger M. Surfactants have multi-fold effects on skin barrier function. Eur J Dermatol. 2015;25(October).

81. Pandey A. Role of Surfactants as Penetration Enhancer in Transdermal Drug Delivery System. J Mol Pharm Org Process Res [Internet]. 2014;02(02). Available from: http://www.esciencecentral.org/journals/role-of-surfactants-as-penetration-enhancer-in-transdermal-drug-delivery-system-2329-9053.1000113.php?aid=28051

82. Parikh DK, Ghosh TK. Feasibility of transdermal delivery of fluoxetine. AAPS PharmSciTech. 2005;6(2):E144–9.

83. Patel MR, Patel RB, Parikh JR, Solanki AB, Patel BG. Effect of formulation components on the in vitro permeation of microemulsion drug delivery system of fluconazole. AAPS PharmSciTech. 2009;10(3):917–23.

84. Cruz-Vega D, Verde-Star MJ, Salinas-Gonzalez NR, Rosales-Hernandez B, Estrada-Garcia I, Mendez-Aragon P, et al. Pharmaceutical and Therapeutic Potentials of Essential Oils and Their Individual Volatile Constituents: A Review. Phytother Res. 2007;21:308–23.

85. Herman A, Herman AP. Essential oils and their constituents as skin penetration enhancer for transdermal drug delivery: A review. J Pharm Pharmacol. 2015;67(4):473–85.

86. Vashisth I, Ahad A, Aqil M, Agarwal SP. Investigating the potential of essential oils as penetration enhancer for transdermal losartan delivery: Effectiveness and mechanism of action. Asian J Pharm Sci [Internet]. Elsevier Ltd; 2014;9(5):260–7. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ajps.2014.06.007

87. Aqil M, Ahad A, Sultana Y, Ali A. Status of terpenes as skin penetration enhancers. Drug Discov Today. 2007;12(23-24):1061–7.

88. Godwin D a, Michniak BB. Influence of drug lipophilicity on terpenes as transdermal penetration enhancers. Drug Dev Ind Pharm. 1999;25(8):905–15.

89. Karpanen TJ, Conway BR, Worthington T, Hilton AC, Elliott TSJ, Lambert PA. Enhanced chlorhexidine skin penetration with eucalyptus oil. BMC Infect Dis. 2010;10:278.

60 90. Nielsen JB. Natural oils affect the human skin integrity and the percutaneous penetration of benzoic

acid dose-dependently. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2006;98(6):575–81.

91. Jain R, Aqil M, Ahad A, Ali A, Khar RK. Basil oil is a promising skin penetration enhancer for transdermal delivery of labetolol hydrochloride. Drug Dev Ind Pharm [Internet]. 2008;34(4):384–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18401780

92. Das MK, Bhattacharya a, Ghosal SK. Effect of different terpene-containing essential oils on percutaneous absorption of trazodone hydrochloride through mouse epidermis. Drug Deliv [Internet]. 2006;13(6):425–31. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17002970

93. Scalia S, Franceschinis E, Bertelli D, Iannuccelli V. Comparative evaluation of the effect of permeation enhancers, lipid nanoparticles and colloidal silica on in vivo human skin penetration of quercetin. Skin Pharmacol Physiol [Internet]. 2013;26(2):57–67. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23207877

94. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. ICH Harmonised Tripartite Guideline. Validation of analytical procedures: text and methodology. Q2 (R1). 2005;1994(November 1996):1–13.

95. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Guidance for Industry Q1A (R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products. 2003;(November):1–22.

96. Thakkar PJ, Madan P, Lin S. Transdermal delivery of diclofenac using water-in-oil microemulsion: formulation and mechanistic approach of drug skin permeation. Pharm Dev Technol. 2014;19(3):373–84.

97. Kezutyte T, Desbenoit N, Brunelle A, Briedis V. Studying the penetration of fatty acids into human skin by ex vivo TOF-SIMS imaging. Biointerphases [Internet]. 2013;8(1):3. Available from: http://www.biointerphases.com/content/8/1/3

98. Kassis V, Søndergaard J. Heat-separation of normal human skin for epidermal and dermal prostaglandin analysis. Arch Dermatol Res. 1982;273(3-4):301–6.

99. Ali SM, Yosipovitch G. Skin pH: From basic science to basic skin care. Acta Derm Venereol. 2013;93(3):261–7.

100. Olejnik A, Goscianska J, Nowak I. Active Compounds Release from Semisolid Dosage Forms. J Pharm Sci. 2012;101(11):4032–45.

101. Monti D, Chetoni P, Burgalassi S, Najarro M, Saettone MF, Boldrini E. Effect of different terpene-containing essential oils on permeation of estradiol through hairless mouse skin. Int J Pharm. 2002;237(1-2):209–14.

102. Lan Y, Li H, Chen YY, Zhang YW, Liu N, Zhang Q, et al. Essential oil from Zanthoxylum bungeanum Maxim. and its main components used as transdermal penetration enhancers: a comparative study. J Zhejiang Univ Sci B [Internet]. 2014;15(11):940–52. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25367787

103. Mura P, Faucci MT, Bramanti G, Corti P. Evaluation of transcutol as a clonazepam transdermal permeation enhancer from hydrophilic gel formulations. Eur J Pharm Sci. 2000;9(4):365–72.

61

TYRIMŲ REZULTATŲ SKLAIDA

1. Čižinauskas, Vytis; Sakalauskaitė, Aušrinė; Briedis, Vitalis. Analysis of taxifolin skin penetration

and effects in vitro / Vytis Čižinauskas, Aušrinė Sakalauskaitė, Vitalis Briedis // PBP World Meeting

- 10th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, 4

Parallel Symposia on Basic Research, R&D, Industrial Practice and Analytics : Glasgow, United

Kingdom 4 to 7 April 2016 / Organiser of ResearchPharm®, [et al.]. Glasgow: ResearchPharm®,

2016. (Posters.). p. 1-2, [no. 121].

2. Sakalauskaitė Aušrinė, Čižinauskas Vytis, Briedis Vitalis. Essential oils as potential penetration

enhancers for cutaneous administration of taxifolin into human skin ex vivo. 10th international

scientific conference The Vital Nature Sign 2016. 19 – 20 May, 2016. Vilnius, Lithuania. 3-ioji vieta

geriausio stendinio pranešimo konkurse (1 priedas).

62

PRIEDAI

1 priedas. 10-tosios tarptautinės mokslinės konferencijos ,,The Vital Nature Sign 2016“ sertifikatas