DINORAH ZILBERSZTAJN GOTLIEB

Estudo da expressão da miostatina em modelos murinos para

doenças neuromusculares

São Paulo 2011

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto de Biociências, para obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia.

Dinorah Zilbersztajn Gotlieb

ESTUDO DA EXPRESSÃO DA MIOSTATINA EM MODELOS MURINOS PARA

DOENÇAS NEUROMUSCULARES.

São Paulo 2011

Área de concentração:Genética Orientadora: Profa. Dra. Mariz Vainzof

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto de Biociências, para obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia.

Ao meu querido marido e aos meus anjos chamados pai e mãe.

AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS

Agradeço especialmente à orientadora Prof. Dra. Mariz Vainzof pela oportunidade de

realizar o mestrado em seu laboratório do Centro de Estudos do Genoma Humano na USP,

me ensinando com seu próprio exemplo o que é ser uma pesquisadora justa, cativante e

por ter muita paciência comigo.

A FAPESP e ao CNPq pelo fomento deste estudo.

Aos meu colegas e amigos do laboratório de proteínas André, Áurea, Danielle Ayub,

Lydia Yamamoto, Paula Onofre, Poliana , Camila e Vanessa por doarem alguns instantes ou

horas do seu tempo se dedicando para me ajudarem em varias etapas deste estudo, e por

contribuir para uma rotina de trabalho harmoniosa.

Aos recém chegados no laboratório Amanda, Henrique, Letícia, Priscila, Stephanie e

Thais, que já demonstraram o quanto são capazes e podem crescer muito dentro da

pesquisa acadêmica.

Aqueles que passaram, deixando suas marcas na minha vida profissional e pessoal,

contribuindo para aumentar meu conhecimento em diversas áreas.

Agradeço aos demais pesquisadores e trabalhadores do Centro de Estudos do

Genoma Humano por contribuir com a dinâmica, informática, atendimento, limpeza,

contabilidades e segurança do espaço onde foi realizado o presente estudo.

A Clarice Gotlieb, que é uma ótima sogra e ajuda em tudo que é possível.

Agradeço ao meu marido pela ajuda na revisão deste trabalho, pela compreensão e

apoio nos dias que eu precisava de concentração para finalizar o trabalho e por todos os dias

que virão e estaremos juntos colhendo os frutos de muita dedicação e carinho.

Aos meus queridos irmãos Victor (por ajudar efetivamente na dissertação)e Renato

que contribuíram de forma expressiva na minha personalidade, me ensinando muito sobre a

vida, fé e perseverança.

As minhas cunhadas e amigas Denise e Karen que participam da vida familiar com

muita alegria.

A minha sobrinha Tamar Victoria, nova integrante da família, que desde tão tenra

idade já me alegra com sua serena presença despertando muita alegria no meu coração.

Ao Todo Poderoso que provê todas as minhas necessidades.

O último porem o agradecimento mais importante:

Aos meus pais pelo amor infinito, por estarem sempre ao meu lado em todas as

situações, pela paciência, dedicação integral para a minha formação intelectual e moral,

através do exemplo de pessoas maravilhosas cuja honestidade, responsabilidade, trabalho,

esperança, espiritualidade estão sempre presentes, e porque sem eles eu não teria

alcançado este estágio da vida.

Ao acender uma tocha, reúnem-se os que buscam a luz.

Rebe de Lubavitch.

RESUMO

Zilbersztajn-Gotlieb D. Estudo da expressão da miostatina em modelos murinos para doenças neuromusculares. [dissertação (Mestrado em Biotecnologia)]. São Paulo: Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo; 2010. As afecções neuromusculares humanas constituem um grupo heterogêneo de doenças genéticas caracterizadas por degeneração muscular progressiva, levando ao desenvolvimento de fraqueza muscular e perda de capacidade motora. Mutações em vários genes resultam na deficiência ou perda de função de diversas proteínas musculares de importância significativa para o bom funcionamento do músculo. Algumas das doenças associadas a alterações nestas proteínas são as distrofias musculares progressivas e as miopatias congênitas.Entre os modelos naturais conhecidos para distrofias musculares humanas estão: o camundongo Dmdmdx, que apresenta deficiência total da proteína distrofina no músculo, modelo da distrofia muscular de Duchenne; o camundongo Lama2dy-

2J/J, que apresenta deficiência da proteína α2-laminina, modelo da DM congênita 1A; o camundongo Largemyd, com defeito na via de glicosilação da proteína α-DG, modelo da DM congênita tipo 1D; e o camundongo SJL/J, com deficiência da proteína disferlina, modelo da distrofia das Cinturas tipo 2B. Todos constituem excelentes modelos para estudos histológicos e fisiopatológicos e vêm sendo utilizados para testar terapias. A proteína miostatina, é um membro da superfamília de fatores de crescimento TGF-β. Ela age como regulador negativo (inibidor) do crescimento muscular. Diversos estudos sugerem a inibição da miostatina como parte de tratamentos para recuperação de massa muscular degenerada em doenças como as distrofias musculares. Entretanto, ainda não é conhecido o real papel da miostatina no quadro distrófico. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão desta proteína nos diversos modelos de degeneração muscular através da avaliação de diferentes músculos de camundongos das linhagens distróficas Dmdmdx, SJL/J, Largemyd e Lama2dy-2J/J. Para tal, quantificamos o mRNA da miostatina e do gene endógeno GAPDH por técnica de PCR em tempo real, e comparamos os resultados de expressão com o padrão de degeneração e regeneração de cada músculo e linhagem, através da avaliação histopatológica.Observamos que em camundongos normais, a miostatina é menos expressa no músculo gastrocnêmio do que no diafragma, refletindo um músculo mais sujeito a lesão. Nas quatro linhagens de camundongos distróficos, independentemente da mutação ou do grau de degeneração do músculo, a miostatina é menos expressa do que em camundongos normais. No músculo distrófico, a expressão da miostatina é inibida tanto no músculo gastrocnêmio como no diafragma, sem diferença entre os dois. A analise comparativa da degeneração e regeneração muscular com a expressão da miostatina mostrou uma maior correlação com o padrão de degeneração do que com a regeneração.Nossos resultados sugerem que o processo de degeneração, quando iniciado, e independentemente de seu grau, causa molecular primária, ou músculo afetado, parece atuar de forma similar na inibição da expressão da miostatina, possivelmente como estímulo a regeneração do dano. Palavras-chave: Distrofias musculares. Camundongos Modelos. Miostatina.

ABSTRACT

Zilbersztajn-Gotlieb D. Myostatin expression in mouse models of neuromuscular diseases.[Masters thesis (Human Genetic)]. São Paulo: Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo;2010.

Human neuromuscular disorders are a heterogeneous group of genetic diseases, caused by mutations in genes coding sarcolemmal, sarcomeric, and cytosolic muscle proteins. Deficiencies or loss of function of these proteins leads to variable degrees of progressive loss of motor ability. Several animal models, displaying phenotypes observed in neuromuscular diseases, have been identified. These models generally present physiological alterations observed in human patients and can be used as important tools for genetic, clinic, and histopathological studies. Among them, the Dmdmdx mouse, which has total deficiency of dystrophin in the muscle, is a model for Duchenne muscular dystrophy; Lama2dy2J/J mouse, which has a deficiency of protein α2-laminin, is a model of congenital DM 1A; Largemyd mouse, defective in α-DG protein glycosylation pathway, is a model of congenital DM type 1D, and SJL/J mouse, with deficiency of the protein dysferlin, is a model of the limb girdle muscular dystrophy type 2B. The protein myostatin, a member of the growth factors TGF-β superfamily, is a negative regulator (inhibitor) of muscle growth. Several studies have suggested the inhibition of myostatin as a therapeutic strategy for the stimulation of the regeneration of the dystrophic muscle. However, the expression and role of myostatin in the dystrophic muscle is still not totally elucidated. Therefore, the main objective of this work was to evaluate the expression of this protein in two different muscles of four mouse models for muscle degeneration, as compared to normal controls. The included dystrophic mice strains were: Dmdmdx, SJL / J, Largemyd and Lama2dy2J/J. The relative expression of the myostatin mRNA was analyzed in the gastrocnemius and diaphragm muscles by real time PCR, the results were correlated with the histopathological findings of each muscle. It was observed that in normal mice muscles, myostatin is less expressed in the gastrocnemius than in the diaphragm, reflecting a muscle most prone to lesions. In the four strains of dystrophic mice myostatin expression is reduced, independently of the primary molecular defect or the degree of degeneration of the studied muscles, with a similar pattern in both gastrocnemius as diaphragm muscles. The comparative analysis of the histopathology of the muscles with the expression of myostatin showed a stronger correlation with the pattern of degeneration then regeneration. Our results suggest that, when started, the process of degeneration of the muscle, independently of the primary molecular defect, or degree, seems to act in a similar pathway leading to the inhibition of the expression of myostatin in the affected muscles, possibly as a stimulus to regeneration of damage. Keywords: Muscular dystrophies. Mouse models. Myostatin.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 17 1.1 O MÚSCULO NORMAL ..................................................................................................... 17

1.1.2 O tecido muscular no desenvolvimento embrionário .......................................... 17

1.1.3 O tecido muscular maduro .......................................................................................... 18

1.1.4 Regeneração muscular ................................................................................................. 22

1.2 O MÚSCULO DISTRÓFICO .............................................................................................. 23

1.2.1 Distrofias musculares progressiva ........................................................................... 23

1.2.2 Modelos animais para distrofias musculares ......................................................... 25

1.2.2.1 Distrofinopatias ........................................................................................................... 26

1.2.2.2 Deficiência de alfa 2 laminina .................................................................................. 26

1.2.2.3 Disferlinopatias ........................................................................................................... 27 1.2.2.4 Defeitos de glicosilação ............................................................................................ 27 1.3 MIOSTATINA ....................................................................................................................... 28 1.3.2 Expressão da Miostatina durante o desenvolvimento ........................................ 29

1.3.3 Função da miostatina e associação com doenças .............................................. 30 1.3.4 Inibição da Miostatina como abordagem terapêutica .......................................... 31

2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 33

3 MATERIAL E METODOLOGIA ...................................................................................... 34

3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA .................................. 34

3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM....................................................................... 34

3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DOS MÚSCULOS .......................................................... 36

3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS .......................................................... 36

3.5 HISTOLOGIA ....................................................................................................................... 37

3.5.1 Coloração de Hematoxilina-Eosina (HE) .................................................................. 37

3.5.2 Coloração com Picro Sirius® ....................................................................................... 37 3.6 ESTUDOS MOLECULARES ............................................................................................. 38 3.6.1 Extração de RNA total ................................................................................................... 38 3.6.2 Síntese de cDNA total ................................................................................................... 38

3.6.3 Análise de Expressão da miostatina ......................................................................... 38 3.6.4 PCR em Tempo Real (Q-PCR)- quantificação relativa da expressão da miostatina ............................................................................................................................ 39

4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 40

4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA .............................................................................. 40

4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA ............................................................. 41

4.2.1 Análise semiquantitiva.................................................................................................. 41 4.2.2 Análise quantitativa da expressão da miostatina por PCR em tempo real (qRT-PCR) ................................................................................................................................. 45

4.2.2.1 Padronização da metodologia para os genes em estudo ................................ 45 4.2.2.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio do grupo controle ..................................................................................................................... 47 4.2.2.3 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos diferentes grupos de animais distróficos................................................................. 49

4.2.2.4 Teste com normalizador específico para cada músculo .................................. 50

4.2.2.5 Análise da miostatina por linhagem (diafragma + gastrocnêmio) ................ 52 4.2.2.6 Análise comparativa da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio em cada linhagem distrófica (um só normalizador – C5746D) ........ 52 4.3 Análise Histopatológica ................................................................................................... 53

5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 61 5.1 A MIOSTATINA COMO ALVO PARA TERAPIAS ........................................................ 61

5.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA .............................................................................. 62

5.3 ESTUDO DA EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA ......................................... 64

5.3.1 Escolha do gene endógeno ......................................................................................... 64

5.3.2 Análise Semi quantitativa da miostatina .................................................................. 65

5.3.3 Análise por PCR em tempo real ................................................................................. 65 5.3.3.1 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio do grupo controle ..................................................................................................................... 66 5.3.3.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos camundongos afetados ................................................................................................. 67 5.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ....................................................................................... 69 5.5 CORRELAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA E PADRÃO DE DEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO MUSCULAR .................................................... 70 6 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 72 REFERÊNCIAS........................................................................................................................ 73

17

1111INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO 1.11.11.11.1O MÚSCULO NORMAO MÚSCULO NORMAO MÚSCULO NORMAO MÚSCULO NORMALLLL 1.1.2 1.1.2 1.1.2 1.1.2 O tecido muscular no desenvolvimento embrionárioO tecido muscular no desenvolvimento embrionárioO tecido muscular no desenvolvimento embrionárioO tecido muscular no desenvolvimento embrionário No início do estágio embrionário, na fase de nêurula, na parte paraxial da mesoderme forma-se os somitos, dos quais originam os tecidos muscular, ósseo, cartilaginoso e dérmico. O destino de cada região dos somitos é especificada por fatores secretados pelos tecidos adjacentes e sua localização em relação a eles. Figura 1-A mesoderme de um embrião no estágio de nêurula pode ser dividida em partes que darão origem

aos diversos compartimentos, órgãos e tecidos do corpo. Em laranja esta destacada a região paraxial de onde serão formados grupos de células mesodérmicas chamadas somitos. Duas regiões dos somitos sofrem influencia de fatores secretados nas suas proximidades que induzem a formação do miótomo e consequentemente das células precursoras musculares. FONTE: modificado Gilbert (2000). A secreção parácrina de fatores específicos induz duas regiões dos somitos a sintetizarem fatores de transcrição miogênica bHLH (Basic helix-loop-helix) se caracterizando em miótomos assim dando origem aos mioblastos. Os mioblastos, células precursoras do músculo,tornam-se alongados, se alinham e se fundem para formação de miotubos multinucleados, resultando em células muito longas chamadas fibras musculares.

Figura 2-No miotoma os mioblastos, células precursoras musculares, proliferam, sintetizam miogênicas bHLH, se alinham e se fundem para a formação de miotubos multinucleados. FONTE: modificado Gilbert (2000) A determinação dos mioblastospor diversos fatores de transcrição miogênicos (MYFs) pertencem à família protéica HLH (helix-loop-helix), que têm um papel fundamental na miogênese e na regeneração. Dentre estes, o MyoD (antígeno de difexpressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo de lesões musculares, uma vez que participa da ativação das células satélite (CS) (Hawke e Garry, 2001). O MYF5, estruturdeterminação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial para a diferenciação de células totipotentes ema linhagem miogênica e modulam a diferenciação final das CS; O Pax7 (paired box transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da miostatina é detectada nos miótomos, desde o iníformação do músculo esquelético adultonúmero de fibras, seu calibre e tamanho durante a miogênese embrionária, fetal e pósnatal (Kambadur et al., 1997). 1.1.31.1.31.1.31.1.3O tecido musculaO tecido musculaO tecido musculaO tecido muscular maduror maduror maduror maduro As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estresquelético, estriado cardíaco e liso. Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra tem diâmetro que varia entre 10 e 100μm, é formada por muitas miofibrilas de di

o miotoma os mioblastos, células precursoras musculares, proliferam, sintetizam miogênicas bHLH, se alinham e se fundem para a formação de miotubos multinucleados.

Gilbert (2000) A determinação dos mioblastos, e sua diferenciação em miotubos são controladaspor diversos fatores de transcrição miogênicos (MYFs) pertencem à família protéica HLH helix), que têm um papel fundamental na miogênese e na regeneração. Dentre estes, o MyoD (antígeno de diferenciação miogênico – MYF3) atua na regulação da expressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo de lesões musculares, uma vez que participa da ativação das células satélite (CS) (Hawke O MYF5, estruturalmente relacionado ao MyoD, também atua na determinação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial para a diferenciação de células totipotentes em músculo. A miogenina e MYF6 determinam a linhagem miogênica e modulam a diferenciação final das CS; O Pax7 (paired box transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da miostatina é detectada nos miótomos, desde o início da miogênese e permanece até a formação do músculo esquelético adulto. Acredita-se que este gene deve controlar o número de fibras, seu calibre e tamanho durante a miogênese embrionária, fetal e pós., 1997). r maduror maduror maduror maduro As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estrado cardíaco e liso. Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra tem varia entre 10 e 100μm, é formada por muitas miofibrilas de di

18

o miotoma os mioblastos, células precursoras musculares, proliferam, sintetizam proteínas

miogênicas bHLH, se alinham e se fundem para a formação de miotubos multinucleados. , e sua diferenciação em miotubos são controladas por diversos fatores de transcrição miogênicos (MYFs) pertencem à família protéica HLH helix), que têm um papel fundamental na miogênese e na regeneração. Dentre MYF3) atua na regulação da expressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo de lesões musculares, uma vez que participa da ativação das células satélite (CS) (Hawke almente relacionado ao MyoD, também atua na determinação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial músculo. A miogenina e MYF6 determinam a linhagem miogênica e modulam a diferenciação final das CS; O Pax7 (paired box transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da cio da miogênese e permanece até a se que este gene deve controlar o número de fibras, seu calibre e tamanho durante a miogênese embrionária, fetal e pós-As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estriado Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra tem varia entre 10 e 100μm, é formada por muitas miofibrilas de diâmetro de 1 a

19

2μm, que correm longitudinalmente à fibra muscular. Por sua vez as miofibrilas são compostas por miofilamentos. É nos miofilamentos que se encontram as estruturas contráteis do músculo chamadas sarcômeros.

Figura 3-Organização do músculo esquelético. Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra muscular é composta por muitas miofibrilas, as quais são compostas por miofilamentos.

FONTE: modificado Johnson e Raven, 2002. Os sarcômeros são constituidos principalmente por dois tipos de filamentos: filamento espesso, composto pela proteína miosina; filamento fino, formado por monômeros de actina, nebulina, tropomiosina e troponina. A organização destas proteínas revela sob microscopia eletrônica um padrão de bandas claras e escuras que se repetem ao longo dos miofilamentos (Figura 4).

Figura 4-Eletronmicrografia de fibra muscular. A linha Z serve como bordas dos sarcômeros claramente

visualizados em cada miofibrila. Os filamentos espessos compõem a banda A, os filamentos finos fazem parte da banda I e da banda A, sobrepondo os filamentos espessos. Na região central da banda A chamada por banda H, não há sobreposição dos filamentos, por isso a aparência mais clara. FONTE: modificado Johnson e Raven, 2002.

Banda A

Filamentos finos Filamentos espessos

20

As bandas espessas e escuras, denominadas bandas A, são compostas por filamentos de miosina combinadas em feixes. A miosina consiste de seis cadeias polipeptídicas – duas cadeias pesadas, de 220kD, cuja porção N-terminal, chamada cabeça, possui atividade ATPásica, e dois pares de cadeias leves diferentes, chamadas cadeias leves essenciais e cadeias leves regulatórias, cujo peso varia de 15 a 22kD, dependendo da sua proveniência.

Figura 5-Representação de uma molécula de miosina representando 2 cadeias pesadas, parte torcida, e 2

cabeças parte globular. Parte de um feixe de miosinas na disposição que compõem o fila espesso das miofibrilas.

FONTE: modificado Johnson e Raven, 2002. As bandas finas e claras, também chamadas por bandas I, são compostas de dois filamentos de actina torcidos em hélice. A actina é uma proteína globular com 375 aminoácidos.

Figura 6-Filamento fino. Duas cadeias de actina torcidas juntas na forma de hélice. FONTE: Modificado Johnson e Raven, 2002.

Através de ligações protéicas ocorre a conexão da actina com a membrana plasmática. Um modelo proposto descreve um importante papel da proteína distrofina nesta ligação. A distrofina estaria organizada em um dímero antiparalelo com o domínio N-terminal como ponto de ligação com os filamentos de actina, no interior da fibra muscular e o domínio C-terminal como sítio de ligação à membrana, através de um complexo de

Região N-terminal denominada cabeça

Filamento fino

Moléculas de actina

Molécula de miosina

Feixe de miosina

proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo DistrofinaGlicoproteínas Associadas O DGC é um complexo oligomérico, formado pelos subβ-DG), sarcoglicano (α−, β−, γ− distrofina ao complexo DGC é feita através de sua ligação àDG está associada ao complexo transmembranoso sarcoglicano, periférica de membranarelacionados a este processo sugerem que este mecanismo teria importante função na ligação e interação da α-no bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o DGC promove a ligação entre as proteínas internas da fibra musculardistrofina), e a matriz extracelular (associaçãopor três cadeias, sendo uma delas a cadeia 1995).

Figura 7- Complexo Distrofina Glicoproteída fibra muscular é feitaligada na sua porção N terminal à actina, e na sua porção C terminal à Beassociando-se às demais FONTE: Modificado de As fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração exercida: lenta, tipo I , tem rico abastecimrespiratórias aeróbicas, alfibras vermelhas; e rápida, tipo II,

proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo DistrofinaGlicoproteínas Associadas - DGC) (Ervasti e Campbell, 1993; Ozawa O DGC é um complexo oligomérico, formado pelos sub-complexoα−, β−, γ− e δ−SG), sintrofinas, e distrobrevinas. A associação da distrofina ao complexo DGC é feita através de sua ligação à proteínaDG está associada ao complexo transmembranoso sarcoglicano, e também à proteína periférica de membranaα-DG. A proteína α-DG é altamente glicosilada e estudos relacionados a este processo sugerem que este mecanismo teria importante função na -DG com a laminina na matriz extracelular, e conseqno bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o DGC promove a ligação entre as proteínas internas da fibra muscularmatriz extracelular (associação α-DG-laminina 2). A lamininapor três cadeias, sendo uma delas a cadeia α2 (Ervasti e Campbell, 1993;

Complexo Distrofina Glicoproteínas associadas. Ligação do citoesqueleto com a matriz extracelular da fibra muscular é feita por interações protéicas, em que a proteína distrofina tem um papel central, ligada na sua porção N terminal à actina, e na sua porção C terminal à Be

s demais proteínas do complexo. FONTE: Modificado de Khurana e Davies (2003). fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração exercida: lenta, tipo I , tem rico abastecimento de capilares, muitas mitocôbicas, alta concentração de mioglobinas e por isso se rápida, tipo II, com menor quantidade de capilares, mitocô

21 proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo Distrofina-Campbell, 1993; Ozawa et al., 1995). complexos distroglicano (α-, SG), sintrofinas, e distrobrevinas. A associação da proteínaβ-DG. A proteína β-e também à proteína DG é altamente glicosilada e estudos relacionados a este processo sugerem que este mecanismo teria importante função na na matriz extracelular, e conseqüentemente, no bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o DGC promove a ligação entre as proteínas internas da fibra muscular (ligação actina-laminina 2). A laminina 2 é composta 2 (Ervasti e Campbell, 1993; Ozawa et al.,

nas associadas. Ligação do citoesqueleto com a matriz extracelular distrofina tem um papel central,

ligada na sua porção N terminal à actina, e na sua porção C terminal à Beta Distroglicana

fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração ento de capilares, muitas mitocôndrias e enzimas por isso são chamadas de quantidade de capilares, mitocôndrias e

mioglobinas, são chamadas de fibras brancasanaeróbica, pois usam glicogêO músculo humano tambérápidas mas também tem uma alta capacidade oxidativa, portanto mais resistentes a fadiga. 1.1.1.1.1.1.1.1.4444Regeneração muscularRegeneração muscularRegeneração muscularRegeneração muscular A regeneração é comandada pelas células satélitetêm forma alongada e são uninucleadas, e tem papel importante na hipertrofia e no reparo de lesões sofridas pela fibra muscular. As CS se localizam na periferia dos miotubos e representam cerca de 30% dos núcleos sublaminares dos músce Garry, 2001).

Figura 8- Ativação, diferenciação e proliferação de células satélites na resposta afatores liberados pelo exercício ou lesão ativam as células satélites fazendo com que estas deixem o estado quiescente. Naos miócitos “danificados”, contribuem para a regeneração da célulaFONTE: modificado A quantidade de CS depende da idade, espécie e tipo de fibglicolítico (rápidas) apresentam quantidade menor de CS, já que estas aparecem em maior número quando próximas a capilares, mionúcleos e junções neuromusculares (JNM). Isto significa que as fibras oxidativas possuem aproximadamente 5glicolíticas. Geralmente, as CS se encontram quiescentes no músculo adulto, porém explosões de atividade muscular após treinamento de resistência ocasionam hipertrofia em

mioglobinas, são chamadas de fibras brancas e são adaptadas para respiração pois usam glicogênio e possuem altas concentrações de enzimas glicolhumano também possui uma forma intermediárim tem uma alta capacidade oxidativa, portanto mais resistentes a Regeneração muscularRegeneração muscularRegeneração muscularRegeneração muscular A regeneração é comandada pelas células satélites (CS) do músculo. Estas ctêm forma alongada e são uninucleadas, e tem papel importante na hipertrofia e no reparo de lesões sofridas pela fibra muscular. As CS se localizam na periferia dos miotubos e representam cerca de 30% dos núcleos sublaminares dos músculos dos membro

Ativação, diferenciação e proliferação de células satélites na resposta afatores liberados pelo exercício ou lesão ativam as células satélites fazendo com que estas deixem o estado quiescente. Neste estado as células podem proliferar e/ou migrar, nesse caso ao fundiraos miócitos “danificados”, contribuem para a regeneração da célula. FONTE: modificado adaptado de Hawke e Garry(2001). A quantidade de CS depende da idade, espécie e tipo de fibglicolítico (rápidas) apresentam quantidade menor de CS, já que estas aparecem em maior número quando próximas a capilares, mionúcleos e junções neuromusculares (JNM). Isto significa que as fibras oxidativas possuem aproximadamente 5 vezes mais CS que as Geralmente, as CS se encontram quiescentes no músculo adulto, porém explosões de atividade muscular após treinamento de resistência ocasionam hipertrofia em

22 daptadas para respiração altas concentrações de enzimas glicolíticas. ria de fibras que são m tem uma alta capacidade oxidativa, portanto mais resistentes a (CS) do músculo. Estas células têm forma alongada e são uninucleadas, e tem papel importante na hipertrofia e no reparo de lesões sofridas pela fibra muscular. As CS se localizam na periferia dos miotubos e ulos dos membros ( Hawke

Ativação, diferenciação e proliferação de células satélites na resposta ao dano muscular. Vários fatores liberados pelo exercício ou lesão ativam as células satélites fazendo com que estas deixem o

este estado as células podem proliferar e/ou migrar, nesse caso ao fundir-se

A quantidade de CS depende da idade, espécie e tipo de fibras. As fibras do tipo glicolítico (rápidas) apresentam quantidade menor de CS, já que estas aparecem em maior número quando próximas a capilares, mionúcleos e junções neuromusculares (JNM). Isto vezes mais CS que as Geralmente, as CS se encontram quiescentes no músculo adulto, porém explosões de atividade muscular após treinamento de resistência ocasionam hipertrofia em

23

decorrência da ativação das CS. A lesão muscular causada pelo exercício intenso provoca a migração de macrófagos para a região lesada, com conseqüente liberação de citocinas. As CS são atraídas por quimiotaxia e se fundem a miofibras já existentes, causando aumento da massa muscular (Hawke e Garry, 2001). Sugere-se que miostatina no músculo danificado deve agir como um chamariz químico de fagócitos e células inflamatórias e deve modular o processo de regeneração através de seu efeito nessas células (Kirk et al., 2000; Sharma et al., 2001). 1.2 1.2 1.2 1.2 O MÚSCULO DISTRÓFICOO MÚSCULO DISTRÓFICOO MÚSCULO DISTRÓFICOO MÚSCULO DISTRÓFICO 1111....2.1 Distrofias musculares progressiva2.1 Distrofias musculares progressiva2.1 Distrofias musculares progressiva2.1 Distrofias musculares progressiva As afecções neuromusculares humanas constituem um grupo heterogêneo de doenças genéticas caracterizadas por degeneração muscular progressiva, levando ao desenvolvimento de fraqueza muscular e perda de capacidade motora (Vainzof e Zatz, 2003). Na última década, foram identificadas mutações em vários genes, resultando na deficiência ou perda de função de diversas proteínas musculares de importância significativa para o bom funcionamento do músculo. Estudos bioquímicos e imunohistológicos têm localizado estas proteínas nos diversos compartimentos da fibra muscular. Associadas à membrana sarcolemal, encontra-se a distrofina, as 4 sarcoglicanas (α−, β−, γ− e δ-SG), disferlina e caveolina 3; na matriz extracelular, a α2-laminina e colágeno VI; nos sarcômeros, a teletonina, miotilina, titina, actina e tropomiosina; no citosol muscular, a calpaína 3, FKRP, TRIM32, miotubularina; e nos núcleos, a emerina, lamina A/C, proteína SMN. Algumas das doenças associadas a alterações nestas proteínas são as distrofias musculares progressivas e as miopatias congênitas. Dentre as diferentes miopatias, a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é a mais comum, com uma incidência de 1 em cada 3000 nascimentos do sexo masculino. Os sinais clínicos iniciam-se entre 3 e 5 anos de idade (com quedas freqüentes, dificuldades para subir escadas, correr e levantar do chão), o confinamento em cadeira de rodas se dá até os 12 anos de idade e os afetados raramente sobrevivem após a terceira década (Zatz, 2001). O gene responsável pela DMD localiza-se no braço curto do cromossomo X (Xp21).

24

O produto do gene é uma proteína de 427-kDa, denominada distrofina, que se localiza na face interna da membrana das fibras musculares esqueléticas e cardíacas, como visto anteriormente. Recentemente foram identificadas mutações em diversos genes que atuam na cascata de glicosilação da α-DG resultando em doenças neuromusculares (Martin, 2003). A ausência de distrofina no músculo distrófico resulta na deficiência secundária dos componentes do DGC (Ohlendieck et al., 1991; Ervasti e Campbell, 1993). Como conseqüência, ocorre a instabilidade desse complexo, e as fibras musculares ficam mais suscetíveis ao estresse mecânico causado pela contração muscular, levando ao processo de degeneração em pacientes com DMD. Portanto, as proteínas do complexo DGC também são de extrema importância para o bom funcionamento do músculo, e assim como a deficiência de distrofina leva às distrofias de Duchenne, alterações nas proteínas do complexo DGC causam as distrofias musculares tipo Cinturas (DMC). As formas autossômicas recessivas mais graves e de início mais precoce são as sarcoglicanopatias, causadas por mutações nos genes que codificam as 4 proteínas sarcoglicanas (α−, β−, γ− e δ-SG). Dentre as formas de distrofias das Cinturas mais benignas, a deficiência da enzima calpaína 3 causa DMC2A, a deficiência da proteína sarcolemal disferlina causa a forma DMC2B e a deficiência da proteína sarcomérica teletonina causa DMC2G. Além disso, mutações no gene LAMA2 que codifica a cadeia α2 da laminina muscular (laminina2) causam uma forma de distrofia muscular congênita muito grave, a CMD1A. A α2-laminina é expressa em vários tipos celulares, entre eles células musculares esqueléticas e cardíacas, células de Schwann, trofoblastos e células de origem mesenquimal (Vilquin et al., 1999). Em 1994, Tomé et al. identificaram a proteína merosina ou α2-laminina como a responsável pela patogênese da doença. Por outro lado, novas formas de distrofias musculares foram recentemente associadas a mutações em genes que codificam enzimas glicosiltransferases, que contribuem para a glicosilação da proteína α-DG. Curiosamente, a análise de proteínas em biópsias musculares destes pacientes mostra uma hipo-glicosilação da α-DG e redução significativa de numerosos ligantes da matriz extracelular (Muntoni et al., 2004). Dentro deste grupo de doenças, nota-se a distrofia das cinturas tipo 2I e forma congênita 1C, ambas causadas por mutações no gene FKRP que codifica uma possível

glicosiltransferase. Além disso, uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma DMC1D, também foi assocglicosilação da proteína complexo DGC muscular. Portanto, o estudo da via de glicosilação de proteínas musculares se tornou muito importante na compreensão de novos mecanismos causadores de doenças neuromusculares humanas.

Figura 9- Complexo distrofina glicoproteínas associadasFONTE: Byrne et al.(2003 1.1.1.1.2.2Modelos animais para distrofias musculares2.2Modelos animais para distrofias musculares2.2Modelos animais para distrofias musculares2.2Modelos animais para distrofias musculares

Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com características já observadas em doenças hereditárigeneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas que aparecem em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos genéticos, clínicos, histopatológicos e terapêuticos ajudando na das doenças e suas manifestações nos indivíduos afetados (Vainzof Os modelos murinos são os mais estudados e utilizados para as distrofias musculares. Porém, outros animais com diferentes miopatias já foram identificadcomo os cães Golden Retriever, Beagle, Rottweiler, modelos para DMD e Cocker Spaniel e Chihuahua, modelos para deficiência das proteínas sarcoglicanas (Shelton e Engvall, 2005).

glicosiltransferase. Além disso, uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma DMC1D, também foi associada a mutações no gene LARGE. Este gene está envolvido na glicosilação da proteína α-DG, membro essencial na formação e funcionamento do complexo DGC muscular. Portanto, o estudo da via de glicosilação de proteínas musculares se tornou muito importante na compreensão de novos mecanismos causadores de doenças neuromusculares humanas.

Complexo distrofina glicoproteínas associadas 2003). 2.2Modelos animais para distrofias musculares2.2Modelos animais para distrofias musculares2.2Modelos animais para distrofias musculares2.2Modelos animais para distrofias musculares Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com características já observadas em doenças hereditárias enquanto outros são modificados geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas que aparecem em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos genéticos, clínicos, histopatológicos e terapêuticos ajudando na compreensão da origem das doenças e suas manifestações nos indivíduos afetados (Vainzof et alOs modelos murinos são os mais estudados e utilizados para as distrofias outros animais com diferentes miopatias já foram identificadcomo os cães Golden Retriever, Beagle, Rottweiler, modelos para DMD e Cocker Spaniel e Chihuahua, modelos para deficiência das proteínas sarcoglicanas Shelton e Engvall, 2005).

25 glicosiltransferase. Além disso, uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma . Este gene está envolvido na DG, membro essencial na formação e funcionamento do complexo DGC muscular. Portanto, o estudo da via de glicosilação de proteínas musculares se tornou muito importante na compreensão de novos mecanismos

Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com as enquanto outros são modificados geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas que aparecem em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos compreensão da origem et al., 2007). Os modelos murinos são os mais estudados e utilizados para as distrofias outros animais com diferentes miopatias já foram identificados tais como os cães Golden Retriever, Beagle, Rottweiler, modelos para DMD e Boston Terrier, Cocker Spaniel e Chihuahua, modelos para deficiência das proteínas sarcoglicanas

26

1.2.2.1 1.2.2.1 1.2.2.1 1.2.2.1 DistrofinopatiasDistrofinopatiasDistrofinopatiasDistrofinopatias O camundongo Dmdmdx é modelo mais usado para DMD (Bulfield et al.,1984). O Dmdmdx tem uma mutação de ponto no gene da distrofina no cromossomo X que causa uma terminação prematura do polipeptídio (Sicinski et al., 1989), e conseqüentemente ausência total da proteína no músculo. Esse fato o torna um bom modelo molecular. No entanto, além de apresentar menor degeneração e maior regeneração muscular, o Dmdmdx não tem fraqueza muscular significativa e por isso não é usado como modelo clínico de DMD. O músculo mais afetado, que melhor representa a progressão de fraqueza e reproduz as transformações de distrofia muscular humana no Dmdmdx é o diafragma, (Stedman et al., 1991) por esta razão ele é amplamente usado em análises histológicas. 1.2.2.2 1.2.2.2 1.2.2.2 1.2.2.2 Deficiência de alfa 2 lamininaDeficiência de alfa 2 lamininaDeficiência de alfa 2 lamininaDeficiência de alfa 2 laminina Diversos camundongos modelos com deficiência de alfa 2 lamina foram produzidos. Dentre eles, dois modelos, com mutações espontâneas no gene LAMA2 foram identificados no Laboratório Jackson: o camundongo dy/dy (dystrophia-muscularis) e seu mutante alélico dy2J/dy2J.No modelo dy2J/dy2Ja distrofia é mais branda que no modelo dy/dy. Ambos exibem deficiência parcial de alfa 2 lamina e são modelos para distrofia muscular congênita com deficiência de merosina (CMD1A) (Jackson Laboratories). Estudos moleculares da expressão do gene Lama2 nos camundongos dy/dy revelaram deficiência de seu mRNA nos músculos esquelético e cardíaco e no nervo periférico, porem não se sabe ainda qual é a mutação para esse fenótipo (Jackson Laboratories). Clinicamente esses camundongos são considerados menores e mais fracos. Geralmente são estéreis. O acometimento muscular começa aproximadamente em 3 ½ semanas de vida, em que ocorre paralisia primeiramente nos músculos posteriores, depois nos axiais e por último nos anteriores. Eles apresentam defeitos na mielinação de nervos periféricos e morte prematura, antes dos 6 meses de idade (Vainzof et al., 2007). A mutação que ocorre nos modelos Lama2dyJ/J é uma substituição de um G por A, o que causa splicing anormal e conseqüentemente expressão de múltiplos mRNA. Um mRNA é traduzido num polipeptídio alfa2 com uma deleção no domínio IV (Sumada et al.,

27

1995). Os efeitos desta mutação são mais brandos que no camundongo dy/dy, porem nos dois casos as alterações clínicas e histológicas são similares. Os camundongos Lama2dyJ/J são maiores e mais ativos que os camundongos dy/dy, têm expectativa de vida normal e são férteis. Foi observado que ao levantar o animal pela cauda ele recolhe os membros em direção ao tronco (Allamand e Campbell, 2000). 1.2.2.31.2.2.31.2.2.31.2.2.3 DisferDisferDisferDisferlinopatiaslinopatiaslinopatiaslinopatias O camundongo SJL/J é um modelo natural para diferentes doenças humanas. Recentemente identificou-se nele uma deleção de 171pb no gene da disferlina, na região que codifica a maioria dos domínios C2. Essa mutação causa a deleção de 57 aminoácidos, resultando numa molécula 6.5 kD menor que a proteína normal de aproximadamente 230 kD (Bittner et al., 1999) e provocando sua instabilidade. O SJL/J apresenta uma redução média de 85% nos níveis de disferlina, tornando-o um bom modelo para LGMD2B (Vainzof et al.,2003). Ele desenvolve uma miopatia espontânea caracterizada por progressão lenta de perda muscular (Bittner et al., 1999) e força correspondente a um aumento da patologia do músculo incluindo fibras musculares com núcleos centrais, variação de calibre, splitting, infiltração inflamatória, necrose e eventual substituição de músculo por tecido gorduroso (Vainzof et al.,2003). Este quadro afeta primeiramente os músculos proximais enquanto os músculos distais permanecem menos afetados. Cruzamentos subseqüentes de SJLxC57BL/10 revelaram que o fenótipo muscular apresentado é herdado como caráter autossômico recessivo(Bittner et al., 1999). Este camundongo é extremamente suscetível a doenças autoimune, linfoma e infecções virais. Geralmente os machos (Jackson Laboratories) têm um comportamento agressivo (Hoet al., 2004). 1.2.2.4 1.2.2.4 1.2.2.4 1.2.2.4 Defeitos de glicosilaçãoDefeitos de glicosilaçãoDefeitos de glicosilaçãoDefeitos de glicosilação No camundongo, o gene que codifica uma possível glicosiltransferase é o Large. Deleções que retiram os exons 4-6 resultam na alteração da glicosilação da alfa

28

distroglicana e são responsáveis pelo fenótipo miodistrófico (Largemyd), destacando comprometimento do músculo esquelético, coração, retina, sistema nervoso periférico e sistema nervoso central (Vainzof et al., 2007). Os camundongos homozigotos Largemyd apresentam distrofia muscular progressiva grave e cardiomiopatia branda. Podem ser reconhecidos com 12-15 dias pelo seu tamanho reduzido e postura anormal (Browning et al., 2005). Defeitos neuronais aparecem no cérebro principalmente no córtex e cerebelo, também presentes no camundongo deficiente de fukutina. 1.1.1.1.3 3 3 3 MIOSTATINAMIOSTATINAMIOSTATINAMIOSTATINA A miostatina, também conhecida como GDF-8, é um membro da superfamília de fatores de crescimento TGF-β, que é composta por fatores de crescimento e diferenciação do desenvolvimento embrionário e manutenção da homeostase tecidual (McPherron e Lee, 1997). A miostatina é codificada pelo gene MSTN, localizado em 2q32.2 em humanos e em camundongo esta em 1 27.8 cM (Szabo et al.,1998). O gene MSTN foi seqüenciado por Ferrel et al.(1999), e é constituído por três exons intercalados por dois introns, contendo 7,7 kb e um mRNA de 3,1 kb. Vários polimorfismos foram identificados em humanos. A miostatina é uma proteína com 375 aminoácidos, contendo uma seqüência sinalizadora de secreção, um sítio de processamento proteolítico e nove resíduos de cisteínas na sua porção C-terminal. Em eletroforese realizada em condições não redutoras, pode-se observar duas bandas de massas de 101 kDa e 25 kDa, consistentes com o tamanho esperado para as formas diméricas não-processadas e processadas, respectivamente (McPherron e Lee, 1997). Normalmente a miostatina está em estado inativo, no qual a região madura C-terminal da molécula fica ligada não covalentemente ao seu pró-peptideo na região N-terminal. O pró-peptideo tem função inibitória sobre a proteína, pois inibe a sua ligação ao receptor (Lee e McPherron, 2001). Esse complexo latente pode ser ativado in vitro pela

29

clivagem do pró-peptideo com membros da família das metaloproteinases BMP-1/TLD (bone morphogeneticprotein-1/tolloid)(Wolfman et al., 2003). Após a ativação de seu estado latente, o dímero C-terminal da miostatina é capaz de ligar aos receptores e ativar uma cascata de transdução de sinal na célula-alvo. Estudos com miostatina recombinante purificada demonstraram que ela é capaz de se ligar aos receptores activina tipo II(receptores transmembrana serina/treonina quinase): ActRIIA e ActRIIB in vitro (Lee e McPherron 2001; Rebbapragada et al., 2003). A ligação ao ActRII leva a fosforilação e ativação do receptor Activina tipo I, que por sua vez inicia uma cascata de sinalização pela fosforilação das proteínas Smad2 e Smad3. Após a fosforilação as Smads formam heterodimeros com a CoSmad4. Esses complexos de Smads ativados são translocados do citoplasma para o núcleo onde eles regulam a transcrição de genes alvos(Langley et al., 2002) (Shi e Massague, 2003). A localização celular da miostatina parece depender do estado anatomo-patológico do músculo e do estágio de diferenciação muscular. Acredita-se também que a miostatina deve desempenhar diferentes papéis na dinâmica de desenvolvimento e do processo de degeneração/regeneração musculares (Sharma et al., 2001). Wehling et al. (2000) encontraram a proteína nas junções miotendinosas em músculo normal e em processo de reposição de massa muscular perdida por falta de uso. A miostatina foi encontrada também no citoplasma de fibras musculares e nos mionúcleos de músculo denervado, em processo de degeneração/regeneração e de ganho de massa muscular (Sakuma e cols., 2000). Por outro lado, marcação positiva para miostatina foi também encontrada em células não musculares, como os macrófagos e fibroblastos no tecido muscular em processo de regeneração (Yamanouchi et al., 2000). 1.1.1.1.3.2 3.2 3.2 3.2 Expressão da MiostatExpressão da MiostatExpressão da MiostatExpressão da Miostatina durante o desenvolvimentoina durante o desenvolvimentoina durante o desenvolvimentoina durante o desenvolvimento A análise da expressão de miostatina nos diferentes estágios de desenvolvimento embrionário mostrou que nos estágios mais incipientes, sua expressão é restrita aos somitos em desenvolvimento. O mRNA da miostatina pode ser detectado desde 9,5 dias post-coitum (p.c.), em cerca de um terço dos somitos. Por volta do dia 10,5 p.c. a expressão parece estar localizada no miótomo. Em estágios mais avançados de

30

desenvolvimento a miostatina é encontrada em uma ampla gama de músculos em desenvolvimento (McPherron et al., 1997). Em animais adultos, a miostatina continua a ser expressa quase que exclusivamente na musculatura esquelética. Entretanto, quantidades residuais de miostatina foram detectadas também em tecido adiposo. A expressão no músculo esquelético é disseminada, embora, exista variação de expressão em músculos diferentes (McPherron et al., 1997). A miostatina é expressa também na musculatura cardíaca (Sharma et al., 1999). 1.1.1.1.3.3 Função da miostatina e associação com doenças3.3 Função da miostatina e associação com doenças3.3 Função da miostatina e associação com doenças3.3 Função da miostatina e associação com doenças Diversos estudos tentam explicar a interação da miostatina com os tecidos do corpo, e sua relação com doenças humanas. Recentemente a miostatina foi relacionada com doenças como obesidade e diabetes. Administrando uma dieta rica em gordura para camundongos selvagens e transgênicos para a miostatina, et al.(2005) constataram que nesta dieta o camundongo selvagem apresentou resistência a insulina. Em seu sangue havia maior concentração de glicose, enquanto o animal transgênico, com inibição da miostatina, conseguiu manter os mesmos níveis de glicose que os camundongos transgênicos e selvagens alimentados com uma dieta balanceada de nutrientes. Em outro estudo Hitell et al.(2009) observaram um aumento da secreção de miostatina em miotubos em cultura de mulheres obesas. Resultados encontrados por Feldman et al.(2006) revelaram que a miostatina, a semelhança com a dexametasona, também tem a capacidade de induzir a adipogenese de uma linhagem de células pluripotentes. Entretanto, os adipócitos formados são menores, expressam marcadores de adipócitos imaturos e teriam a sensibilidade a insulina aumentada. Um estudo realizado por Roth et al.(2003) verificou que a expressão da miostatina estava reduzida em 37% em indivíduos sedentários que participaram de um programa de treinamento físico intenso, concluindo que a miostatina responde à carga muscular em alguns casos, e, portanto é um regulador do tamanho celular. A expressão da miostatina

31

parece, portanto, depender do tipo de contração muscular realizada, bem como a freqüência, intensidade e duração dos estímulos (Sakuma et al., 2000). Aumento da quantidade de miostatina foi observado em humanos em conseqüência da inatividade (Zimmers et al., 2002) e em casos de perda de massa muscular, como verificado em homens portadores de HIV (Gonzales-Cadavid et al., 1998). Durante o processo de regeneração muscular é observado uma elevação na replicação de células satélites. A expressão de miostatina em fibras em processo de regeneração é diferente entre fibras que sobreviveram ao processo de degeneração e fibras danificadas em regeneração. Nas primeiras a expressão é alta o que deve inibir a multiplicação de mioblastos, nas outras a expressão é baixa, ou seja, a multiplicação de mioblastos não é inibida (Kirk et al., 2000; Sharma et al., 2001). Estudos em cultura de mioblastos demonstraram que a miostatina atua bloqueando as fases G1 e G2 do ciclo celular, regulando proteínas importantes ao ciclo como Cdk2, p21 e Rb sem afetar o mecanismo de apoptose dos mioblastos. Em resposta à sinalização da miostatina, a proteína p21 é hiper-regulada inibindo a atividade ciclina E/Cdk2 causando a hipofosforilação da proteína Rb e parando o ciclo celular na fase G1 (Thomas et al., 2000). 1.1.1.1.3.43.43.43.4 Inibição da Miostatina como abordagem terapêuInibição da Miostatina como abordagem terapêuInibição da Miostatina como abordagem terapêuInibição da Miostatina como abordagem terapêuticaticaticatica Muitos estudos enfatizam a inibição da miostatina porque o tratamento de doenças musculares pela maioria das abordagens farmacológicas tem sido decepcionante (Rodino-Klapac, 2009). Por causa do importante papel da miostatina no desenvolvimento e regeneração do músculo, terapias com bloqueio de miostatina estão sendo testadas em modelos animais de distrofias musculares (Bogdanovich et al., 2002). Outros ainda focam no objetivo de produzir animais com maior massa muscular, o que seria vantajoso para a pecuária. Lee et al.(2005) descreveram um potente inibidor da miostatina (ACVR2B) que quando injetado em camundongos selvagens resulta em aumento de massa muscular. Em seu estudo demonstraram que o efeito do ACVR2B é atenuado em indivíduos nulos para a

32

miostatina, sugerindo que existe pelos menos uma outra substância que normalmente funciona limitando o crescimento da musculatura. Em pesquisa realizada por Parsons et al.(2006), comparou-se a inibição da miostatina com anticorpos monoclonais em estágios iniciais de desenvolvimento com estágios tardios em animais nulos para delta sarcoglicana. Eles observaram aumento de massa muscular, regeneração e redução de fibrose em estágios iniciais e sugeriram que a inibição pode ser benéfica em período inicial de vida ou quando a doença é branda. Heineke et al.(2010) após induzirem danos cardíacos em camundongos, detectaram aumento das concentrações plasmáticas de miostatina e conseqüente diminuição da massa muscular esquelética. Com estes dados os autores apontam a miostatina liberada na circulação sistêmica por cardiomiócitos como causadora da caquexia que ocorre em pacientes que sofrem de falhas cardíacas. Em experimentos realizados com camundongos deficientes para alfa-laminina2 e nulos para a miostatina, Li et al.(2005) observaram maiores taxas de morte pós-natal, o aumento de musculatura e regeneração muscular concomitantemente ao aumento da formação de gordura, demonstrando que a ausência desta proteína não reduziu a patologia muscular dos indivíduos afetados. Haidet et al.(2008) testaram a injeção intramuscular pós-natal de vírus adeno-associado (AAV) codificando proteínas que inibem a miostatina. Em camundongos selvagens ocorreu o aumento da musculatura e da força. Interessante que em Dmdmdx o tratamento reverteu a patologia muscular e melhorou a força, mesmo quando administrada para animais de 6 meses. Ainda que ocorra o aumento da musculatura na ausência de miostatina, a força muscular é menor em camundongos deficientes de miostatina que em camundongos selvagens (Amthor et al., 2007). Visto que o papel da miostatina no processo distrófico não está bem estabelecido, este trabalho se faz de extrema importância na tentativa de explicar uma possível relação desta proteína com o processo distrófico.

33

2 2 2 2 OBJETIVOBJETIVOBJETIVOBJETIVOS OS OS OS Avaliar e comparar a expressão da miostatina em quatro modelos murinos para distrofias musculares com diversos padrões de fraqueza muscular: Dmdmdx, SJL, Largemyd, Lama2dyJ/J. Objetivos Específicos:

• Avaliar e comparar a expressão do mRNA da miostatina, por PCR em tempo real no músculo gastrocnêmio e diafragma dos animais das diferentes linhagens. • Comparar a expressão da miostatina com as alterações histopatológicas dos músculos estudados e correlacionar com o grau de fraqueza muscular característico de cada linhagem.

34

3 3 3 3 MATERIAL E METODOLOGIAMATERIAL E METODOLOGIAMATERIAL E METODOLOGIAMATERIAL E METODOLOGIA 3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA.3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA.3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA.3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA. Os animais deste projeto são mantidos no biotério do Centro de Estudos do Genoma Humano, o qual está devidamente equipado para abrigar estes animais, em temperatura constante e boas condições de higiene e saúde. Os animais recebem alimentação e água ad libidum . Foram utilizadas as linhagens de camundongos Dmdmdx (Bulfieldet al., 1984), B6.WK-Lama2dyJ/J (Meier e Southard, 1970), SJL/J (Welleret al., 1997), Largemyd (Grewal e Hewitt, 2002), e C57Black6 (camundongo normal). Os camundongos Lama2dyJ/J (000524), SJL/J (000686) e Largemyd/J (000226) foram importados do laboratório Jackson (www.jaxmice.org). 3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPA3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPA3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPA3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEMGEMGEMGEM Duas linhagens são genotipadas em nosso laboratório: modelo Largemyd e o modelo Lama2dyJ/J. Para estas genotipagens os animais foram identificados previamente com furos na orelha, fragmentos de cauda foram colocados em tubos identificados com solução de extração e Proteinase K e incubados a 55ºC over night. Após incubação o DNA foi precipitado com isopropanol e ressuspendido com TE. Para o modelo Largemyd, utilizou-se uma reação de PCR multiplex que amplifica o alelo mutado e o alelo normal simultaneamente. Se o indivíduo for homozigoto para a mutação, a reação amplifica apenas o alelo mutado (421 pb). Se ele for normal, apenas o alelo normal (162 pb). Se for heterozigoto, os dois alelos são amplificados. Os oligonucleotideos usados (Browning, 2005) nesta etapa estão no quadro 1. O resultado desta reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de agarose 2%.

Quadro 1-Oligonucleotídeos utilizados pra genotipagem do modelo Mouse wild type forward (MWTF)Mouse wild type reverse (MWTR)Mutation forward (MUTF)Mutation reverse (MUTR)

Figura 10- Genotipagem dos camundongos

agarose 2% corado com brometo de etideo. Para o modelo Lama2fragmento de 170pb contendo a mutação. Após o PCR é feito uma reação de digestão com a enzima NDE1, pois esta mutação cria um sítio de restrição que é possesta enzima. Após a eletbanda referente ao alelo normal. Se o indivíduas bandas referentes a digestão do alelo mutado. Se for heterozigoto,os dois alelos são amplificados e o mutado é digerido, portanto aparecem reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de acrilamida.

Figura11- Genotipagem de Lama2

camundongo normal; 2

421pb

162pb

ligonucleotídeos utilizados pra genotipagem do modelo LargeMouse wild type forward (MWTF) GGC CGT GTT CCA TAA GTT CAAMouse wild type reverse (MWTR) GGC ATA CGC CTC TGT GAA AACMutation forward (MUTF) ATC TCA GTC CCA AAG GGT GAAGMutation reverse (MUTR) GCC AAT GTA AAA TGA GGG GAA A

Genotipagem dos camundongos Largemyd. Eletroforese dos produtos do PCR multiplex em gel de

agarose 2% corado com brometo de etideo. Lama2dyJ/J, utilizou-se uma reação de PCRfragmento de 170pb contendo a mutação. Após o PCR é feito uma reação de digestão com esta mutação cria um sítio de restrição que é posseletroforese dos produtos, se o indivíduo for normal aparece uma nte ao alelo normal. Se o indivíduo for homozigoto para a mutação, aparecem rentes a digestão do alelo mutado. Se for heterozigoto,os dois alelos são amplificados e o mutado é digerido, portanto aparecem três bandas. O resultado desta reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de acrilamida.

Lama2dy-2J

/J, após digestão. Gel de acrilamida corado com brometo de etídio. 1camundongo normal; 2- camundongo heterozigoto; 3- camundongo afetado.

377pb

213pb

164pb

35 Largemyd. A GTT CAA GGC ATA CGC CTC TGT GAA AAC ATC TCA GTC CCA AAG GGT GAAG GCC AAT GTA AAA TGA GGG GAA A

dutos do PCR multiplex em gel de se uma reação de PCR que amplifica um fragmento de 170pb contendo a mutação. Após o PCR é feito uma reação de digestão com esta mutação cria um sítio de restrição que é possível digerir com duo for normal aparece uma duo for homozigoto para a mutação, aparecem rentes a digestão do alelo mutado. Se for heterozigoto,os dois alelos são bandas. O resultado desta reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de acrilamida.

, após digestão. Gel de acrilamida corado com brometo de etídio. 1- camundongo afetado.

36

Após a genotipagem, os animais afetados foram separados em nova gaiola para envelhecerem até atingirem as idades requisitadas nos experimentos do laboratório. Quando necessário são formados novos casais de heterozigotos. Os normais podem ser destinados como indivíduo controle em alguns estudos. Foram utilizados: Seis camundongos SJL/J com 3 meses. Cinco camundongos Largemyd com 3 meses. Seis camundongos Lama2dy-2J/J com 3 meses. Seis camundongos Dmdmdx com 3 meses. Seis camundongos normais C57BL 3 meses. Os indivíduos selecionados foram eutanaziados em cubas de CO2. 3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DO3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DO3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DO3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DOS MÚSCULOSS MÚSCULOSS MÚSCULOSS MÚSCULOS

A partir de necropsia foram coletados diafragma e gastrocnêmio de cada animal. Os fragmentos musculares foram destinados à histologia e a estudos moleculares. 3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS Os fragmentos destinados a histologia foram crioprotegidos com talco, subseqüentemente envoltos por resina Tissue-tec®(Sakura, Japão) e montados em uma rolha de cortiça previamente identificada, mantendo as fibras musculares na orientação vertical em relação à superfície da rolha. O conjunto foi congelado e armazenado em nitrogênio líquido. As lâminas de vidro foram cobertas com polilisina para aumentar a aderência do corte histológico à lâmina. Os fragmentos musculares foram seccionados transversalmente com espessura de 6μm num micrótomo criostato à temperatura de –25oC. Em seguida as lâminas foram armazenadas em freezer –70oC.

37

3.5 HISTOLOGIA3.5 HISTOLOGIA3.5 HISTOLOGIA3.5 HISTOLOGIA 3.5.1 3.5.1 3.5.1 3.5.1 Coloração de HematoxilinaColoração de HematoxilinaColoração de HematoxilinaColoração de Hematoxilina----Eosina (HE)Eosina (HE)Eosina (HE)Eosina (HE) A coloração de HE permite analisar a morfologia das fibras musculares e dos tecidos adjacentes, podendo-se observar se existe ou não hiperplasia, hipertrofia, presença de regeneração/degeneração, estruturas anormais, entre outros. Esta reação foi realizada de acordo com a descrita em Dubowitz, 1985. 3.5.2 3.5.2 3.5.2 3.5.2 Coloração com Picro SiriusColoração com Picro SiriusColoração com Picro SiriusColoração com Picro Sirius®®®® A coloração com Picro Sirius®®®® permite a visualização dos tecidos conjuntivos perimisial e endomisial de tecidos musculares. Através de um microscópio óptico com câmera fotográfica acoplada e conectada a um computador é possível fazer a quantificação proporcional entre a área de tecido conjuntivo e a área total de um campo selecionado. Esta reação foi realizada de acordo com as seguintes etapas: Primeiramente as lâminas com os cortes histológicos ficam submersas por 20 minutos em Bouim para a fixação do tecido. Depois elas passam por um banho de água corrente para retirar o excesso de Bouim. Em seguida são submersas em solução de Sirius Red® com ácido pícrico. Após aproximadamente 30 minutos é feita a desidratação em série de 2 minutos em cada desidratante seguinte: em álcool 90%, álcool 100%, solução de álcool mais xilol e por ultimo xilol. As lâminas são retiradas uma por vez para serem montadas com resina para montagem histológica e lamínula. Para a quantificação utiliza-se o software KS 300 (2002) da Carl Zeiss, o qual calcula a área relativa ao tecido conjuntivo (corado em vermelho) em relação à área total do corte.

38

3.6 ESTUDOS MOLECULARES3.6 ESTUDOS MOLECULARES3.6 ESTUDOS MOLECULARES3.6 ESTUDOS MOLECULARES Cada fragmento destinado a estudos moleculares foi congelado em nitrogênio líquido, macerado com pistola em banho de nitrogênio líquido e dividido em duas partes, uma para extração de proteínas e outra para extração de DNA e RNA. 3.6.13.6.13.6.13.6.1Extração de RNA totalExtração de RNA totalExtração de RNA totalExtração de RNA total O RNA total foi extraído dos músculos coletados, a partir de material macerado com pistola em banho de nitrogênio líquido e estocado também em nitrogênio líquido. A extração de RNA do material pulverizado foi realizada com o reagente Trizol® (Invitrogen Inc Brasil), conforme as especificações do fabricante. O RNA foi diluído em água tratada com dietilpirocarbonato 0,01% (DEPC) (livre de ribonucleases) e guardado em freezer –70oC. 3.6.2 3.6.2 3.6.2 3.6.2 Síntese de cDNA totalSíntese de cDNA totalSíntese de cDNA totalSíntese de cDNA total O RNA foi quantificado em espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm, 1 µg de RNA total foi utilizado para a síntese de cDNA, a qual foi realizada conforme protocolo da enzima MMLV (Invitrogen). 3.6.33.6.33.6.33.6.3Análise de Expressão da miostatinaAnálise de Expressão da miostatinaAnálise de Expressão da miostatinaAnálise de Expressão da miostatina Em um primeiro momento os cDNAs foram testados através da reação em cadeia da polimerase convencional (PCR), com um par de “oligonucleotideos” que amplificam o gene endógeno GAPDH. De cada amostra 2µl. do produto de PCR foi misturado com o mesmo volume de tampão de corrida e aplicado em gel de poliacrilamida. Como todos amplificaram, foi feito o PCR Real Time para os pares de oligonucleotideos dos genes da miostatina e do endógeno GAPDH.

39

3.6.4 3.6.4 3.6.4 3.6.4 PCR PCR PCR PCR em Tempo Real (Qem Tempo Real (Qem Tempo Real (Qem Tempo Real (Q----PCR)PCR)PCR)PCR)---- quantificação relativa da expressão da miostatinaquantificação relativa da expressão da miostatinaquantificação relativa da expressão da miostatinaquantificação relativa da expressão da miostatina As amostras de cDNA foram aplicadas em triplicatas em placa ótica de 96 poços. A cada amostra foi adicionado o par de primers do gene de interesse e o MasterMix contendo Sybr Green (Applied Biosystems), num volume total de 25μL. A corrida das placas foi feita no termociclador para Real-Time 7500 da Applied Biosystems. Quadro2- Pares dos oligonucleotideos para amplificação do gene alvo da miostatina e o gene endógeno GAPDH.

MIOSTATINA forward (MSTN F) AACCTTCCCAGGACCAGGAG

MIOSTATINA reverse (MSTN R) CATCGCAGTCAAGCCCAAAG

GAPDH forward AGGTCGGTGTGAACGGATTTG

GAPDH reverse TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA Para quantificação relativa da expressão da miostatina, foi necessário realizar uma curva padrão com diferentes diluições de um cDNA controle. Nesta etapa é determinado o threshold, o qual é um valor arbitrário do limiar que determina o ciclo onde é medida a fluorescência em cada reação (Ct). O valor Ct é usado pelo programa para calcular a expressão de um gene da amostra alvo. Os valores obtidos foram comparados quanto à sua significância estatística com o auxílio do programa MiniTab. O teste realizado foi o não-paramétrico de Mann-Whitney.

40

4 RESULTADOS4 RESULTADOS4 RESULTADOS4 RESULTADOS 4.1 CARACTERIZAÇÃO DA A4.1 CARACTERIZAÇÃO DA A4.1 CARACTERIZAÇÃO DA A4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRAMOSTRAMOSTRAMOSTRA Foram avaliados no total 36 animais, pertencentes a 5 diferentes linhagens:C57Bl, SJL/J, Dmdmdx, Largemyd e Lama2dy2J/J,conforme ilustrado no Quadro 3. De acordo com os resultados obtidos e da viabilidade de material, o número de animais nos diferentes testes variou. Quadro3- Animais avaliados por cada metodologia SEMISEMISEMISEMI QUANTITATIVOQUANTITATIVOQUANTITATIVOQUANTITATIVO QPCRQPCRQPCRQPCR HISTOLOGIAHISTOLOGIAHISTOLOGIAHISTOLOGIA DIAFRAGMADIAFRAGMADIAFRAGMADIAFRAGMA GASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIO DIAFRAGMADIAFRAGMADIAFRAGMADIAFRAGMA GASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIO DIAFRAGMADIAFRAGMADIAFRAGMADIAFRAGMA GASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIO C57BlC57BlC57BlC57Bl C19 C19 C20 C20 C 20 D C 20 G C20G C21 C21D C21G C22 C22 C22D C22G C23 C23 C 23 D C 23 G C23D C23G C24 C24 C 24 D C 24 G C25 C25 C 25 G C25D C25G C46 C46 C 46 D C 46 G C46D C46G C47 C47 C 47 D C 47 G C48 C48 SJL/JSJL/JSJL/JSJL/J S1 S2 S2 S 2D S 2 G S2D S3 S3 S 3D S 3 G S3D S3G S4 S4 S 4D S 4 G S4D S4G S5 S5 S 5D S 5 G S5D S5G S6 S6 S 6D S 6 G S6D S6G S7 S7 S 7D S 7 G S7D DmdDmdDmdDmdmdxmdxmdxmdx M8 M9 M9 M 9D M 9 G M9D M9G M10 M18G M25 M 25D M 25 G M25D M25G M26 M26 M 26D M 26 G M26D M26G

41

4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOS4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOS4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOS4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOSTATINATATINATATINATATINA 4.2.1 4.2.1 4.2.1 4.2.1 AnáAnáAnáAnálise semiquantitiva.lise semiquantitiva.lise semiquantitiva.lise semiquantitiva. A avaliação do nível de expressão da miostatina nos diferentes grupos de modelos murinos para distrofias musculares, foi realizado através do método semiquantitativo, com reações de PCR para amplificação do cDNA da miostatina em 27 e 30 ciclos. Utilizou-se como gene endógeno o GAPDH. Um exemplo representativo do padrão de amplificação e corrida em gel de acrilamida estão ilustrados na figura 12.

M27 M27 M 27D M 27 G M27D M27G M28 M28 M 28D M 28 G M28D M28G M29 M29 M 29D M 29 G M29D M29G LargeLargeLargeLargemydmydmydmyd L118 L118 L 118D L 118 G L118G L121 L121 L 121D L 121 G L121D L121G L123 L123 L 123D L 123 G L123D L123G L129 L129 L 129D L129D L129G L130 L130 L 130D L 130 G L130G L131 L132 Lama2Lama2Lama2Lama2dy2Jdy2Jdy2Jdy2J/J/J/J/J 2J61 2J61 2J 61D 2J 61 G 2J61D 2J61G 2J69 2J69 2J 69 G 2J69G 2J70 2J70 2J 70 G 2J70D 2J70G 2J79 2J79 2J 79D 2J 79 G 2J88 2J88 2J 88D 2J 88 G 2J88D 2J88G 2J92 2J92 2J 92D 2J92D 2J92G

42

Figura12-Exemplo de gel de acrilamida com produtos da amplificação do cDNA dos gene GAPDH(110pb)e

MSTN(101pb), com 27 e 30 ciclos, no músculo gastrocnêmio de 3 camundongos modelos. S6 e S7 são SJL/J, M28 é Dmd

mdx. As bandas geradas foram quantificadas quanto à sua intensidade através do software Scion Image. Os resultados estão apresentados no Quadro 4. Quadro 4- Análise da intensidade das bandas resultantes da eletroforese dos produtos de PCR de

27 e 30 ciclos para os genes GAPDH e MSTN no músculo diafragma, quantificadas pelo software Scion Image, e a relação MSTN/GAPDH entre as bandas de miostatina com GAPDH.

DIAFRAGMA

GASTROCNÊMIO

27 ciclos 30 ciclos 27 ciclos 30 ciclos

MSTN/GAPDH MSTN/GAPDH MSTN/GAPDH MSTN/GAPDH

C19 0,08 0,145 C19 0,265 0,296 C20 0,324 0,435 C20 0,278 0,258 C22 0,193 0,479 C21 0,375 0,219 C23 0,025 0,079 C22 0,135 0,366 C57BL C24 0,399 0,711 C23 0,349 0,332 C25 0,016 0,101 C24 0,186 0,299 C46 0,203 0,368 C25 0,414 0,471 C47 0,172 0,405 C46 0,285 0,335 C48 0,11 0,293 C47 0,235 0,567

C48 0,232 0,333

S2 0,176 0,49 S1 0,13 0,288 S3 0,241 0,527 S2 0,257 0,388

SJL/J S4 0,153 0,372 S3 0,211 0,409

S5 0,2 0,276 S4 0,252 0,448 S6 0 0,083 S5 0,322 0,5 S7 0,138 0,373 S6 0,181 0,234

GAPDH110pb

101pb MSTN

43

S7 0,227 0,372

M9 0,18 0,423 M8 0,206 0,462 M25 0,109 0,464 M9 0,212 0,343 M26 0,15 0,258 M10 0,259 0,385 Dmdmdx M27 0,22 0,364 M25 0,288 0,439 M28 0,362 0,418 M26 0,156 0,401

M29 0,299 0,812 M27 0,367 0,384 M28 0,234 0,406

M29 0,152

L118 0,027 0,133 L121 0,24 0,303 L121 0,024 0,109 L123 0,146 0,328 Largemyd L123 0 L129 0,139 0,216

L129 0,154 0,183 L130 0,114 0,216 L130 0,135 0,372 L131 0,115 0,236 L132 0,183 0,381

L118 0,273 0,342

2J61 0,251 0,501 2J61 0,251 0,355 2J69 0,118 0,364 2J69 0,235 0,496 Lama2

dy2J/J 2J70 0,281 0,377 2J70 0,193 0,286

2J79 0,186 0,506 2J79 0,161 0,317 2J88 0,131 0,503 2J88 0,32 0,376

2J92 0,322 0,636 2J92 0,257 0,295 Como esta técnica não demonstrou ser muito sensível para o número de ciclos escolhidos para a reação de PCR, possivelmente porque algumas amostras atingiram as proximidades do platô da curva de amplificação, decidimos selecionar apenas amostras onde houvesse uma diferença na relação MSTN/GAPDH entre 27 e 30 ciclos de pelo menos 0,100 unidades de medida. Desta forma, identificamos 32 animais onde o teste foi considerado semiquantitativo. Quadro5- relação de animais selecionados para a análise semiquantitativa da miostatina

(MSTN/GAPDH>0,100 unidades) DIAFRAGMADIAFRAGMADIAFRAGMADIAFRAGMA GASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIO C20C20C20C20 C22C22C22C22 C22GC22GC22GC22G C24C24C24C24 C24GC24GC24GC24G C46C46C46C46 C47C47C47C47 C47GC47GC47GC47G C48C48C48C48 C48GC48GC48GC48G S1GS1GS1GS1G

44

S2S2S2S2 S2GS2GS2GS2G S3S3S3S3 S3GS3GS3GS3G S4S4S4S4 S4GS4GS4GS4G S5GS5GS5GS5G S6S6S6S6 S7S7S7S7 S7GS7GS7GS7G M8GM8GM8GM8G M9M9M9M9 M9GM9GM9GM9G M10GM10GM10GM10G M25M25M25M25 M25GM25GM25GM25G M26M26M26M26 M26GM26GM26GM26G M27M27M27M27 M28GM28GM28GM28G M29M29M29M29 L123GL123GL123GL123G L118L118L118L118 L121L121L121L121 L130L130L130L130 L130GL130GL130GL130G L131GL131GL131GL131G 2J612J612J612J61 2J61G2J61G2J61G2J61G 2J692J692J692J69 2J69G2J69G2J69G2J69G 2J70G2J70G2J70G2J70G 2J792J792J792J79 2J79G2J79G2J79G2J79G 2J882J882J882J88 L132GL132GL132GL132G 2J922J922J922J92

As medidas das expressões semiquantitativas da miostatina foram agrupadas em médias de cada grupo de animais e músculos e foi realizada analise por teste de Mann Whitney, que não mostrou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos afetados, quando comparados ao controle conforme observado nas figuras13 e 14.

45

Figura 13-Comparação gráfica entre as médias das semiquantificações da expressão da miostatina dos

controles normais e animais afetados no diafragma.

Figura 14- Comparação gráfica entre as médias das semiquantificações da expressão da miostatina dos

controles normais e animais afetados no gastrocnêmio. 4.2.2 4.2.2 4.2.2 4.2.2 AnáAnáAnáAnálise quantitativa da exprlise quantitativa da exprlise quantitativa da exprlise quantitativa da expressão da miostatina por PCR em tempo real (qRTessão da miostatina por PCR em tempo real (qRTessão da miostatina por PCR em tempo real (qRTessão da miostatina por PCR em tempo real (qRT----PCR) PCR) PCR) PCR) 4.4.4.4.2.2.1 Padronização da metodologia para os genes em estudo2.2.1 Padronização da metodologia para os genes em estudo2.2.1 Padronização da metodologia para os genes em estudo2.2.1 Padronização da metodologia para os genes em estudo Os pares de oligonulcleotideos GAPDH e MSTN passaram por uma padronização prévia para a confirmação de sua especificidade e determinação da concentração ideal de cDNA a ser utilizada nas reações seguintes no equipamento de Q-PCR.

C57BL SJL/J Dmdmdx Largemyd Lama2dy2J/J

46

Na figura 15 abaixo pode-se observar respectivamente: as curvas geradas pela amplificação de 5 concentrações do cDNA controle: puro, 1:1, 1:3, 1:7, 1:15, para os pares de oligonulcleotideos GAPDH e MSTN. Nesta etapa estabeleceu-se o threshold, o limiar que intercepta a curva de amplificação no ciclo quantitativo, e posteriormente, as informações dos valores do slope e do R2 de cada uma (Quadro 6). Esses valores revelam respectivamente, a inclinação da curva e a eficiência da curva gerada, e são importantes para os cálculos das quantificações das expressões. GAPDHThreshold0.1948304

MSTNThreshold0.0896150

Figura 15-Curvas de amplificação para padronização do Q-PCR. No eixo X estão números de ciclos e no eixo

Y está a fluorescência emitida na amplificação. Foram testados pares de oligonulcleotideos GAPDH e MSTN em cDNA de camundongo normal C57BL47 nas concentrações puro, 1:1, 1:3, 1:7 e 1:15.

Quadro 6- Valores obtidos do Threshold na padronização do PCR de tempo real. Slope: inclinação da curva de amplificação e respectivo R2.

GENE Threshold Slope R2

GAPDH 0.1948304 -

3,642031 0,996546

MSTN 0.08961505 -

3,633197 0,970398

47

4.4.4.4.2.2.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma 2.2.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma 2.2.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma 2.2.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma eeee gastrocnêmio do grupo controlegastrocnêmio do grupo controlegastrocnêmio do grupo controlegastrocnêmio do grupo controle Para a análise relativa do qRT-PCR, deve-se determinar uma amostra que será considerada como normalizadora para o grupo avaliado. Neste teste, determinamos a média de ddCT de todas as amostras avaliadas, e definimos como normalizador a amostra de valor mais próximo a esta média. Esta corresponde ao cDNA da amostra C57BL46D. Os resultados da expressão relativa de cada amostra estão demonstrados no Quadro7, e a distribuição, na figura 16. Quadro7- Expressões relativas da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos animais

C57BL usados como controles normais.

Controles normais D e G ddCT

Expressão relativa da miostatina C57BL 20 D 1,27 0,74 C57BL 23 D -0,09 1,15 C57BL 24 D 0,42 0,99 C57BL 46 D 3,72 0,00 C57BL 47 D 3,87 -0,04 C57BL 20 G 4,76 -0,31 C57BL 23 G 5,27 -0,47 C57BL 24 G 3,74 -0,01 C57BL 25 G 5,02 -0,39 C57BL 46 G 5,03 -0,39 C57BL 47 G 4,78 -0,32 Média 3,43

48

Figura 16-Gráfico das expressões relativas da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio de animais

controle. Os dados foram normalizados para a amostra C57BL 46 D, a qual obteve valor mais próximo da média das expressões entre os dois grupos musculares dos animais controles. Os valores obtidos foram agrupados, obtendo-se a média para cada grupo. Os resultados estão demonstrados na figura 17. Para verificar a significância entre as diferenças apresentadas pelos valores de diafragma e gastrocnêmio das amostras controles, foi feito o teste Mann-Whitney, em que observou-se diferença na expressão de miostatina entre os músculos gastrocnêmio e diafragma nos animais normais (p<0,05).

Figura 17-Comparação gráfica entre as médias das expressões dos músculos diafragma e gastrocnêmio em

controles normais.

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

C5

7B

L 2

0 D

C5

7B

L 2

3 D

C5

7B

L 2

4 D

C5

7B

L 4

6 D

C5

7B

L 4

7 D

C5

7B

L 2

0 G

C5

7B

L 2

3 G

C5

7B

L 2

4 G

C5

7B

L 2

5 G

C5

7B

L 4

6 G

C5

7B

L 4

7 G

EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA NOS MÚSCULOS DIAFRAGMA E GASTROCNÊMIO DE ANIMAIS CONTROLE

C57Bl

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

DIAPHRAGMA GASTROCNÊMIO

MÉDIAS DAS EXPRESSÕES DOS MUSCULOS DIAFRAGMA E GASTROCNÊMIO EM NORMAIS

P= 0,0137

DIAFRAGMA

49

4.2.2.34.2.2.34.2.2.34.2.2.3 Análise dAnálise dAnálise dAnálise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos diferentes a Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos diferentes a Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos diferentes a Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos diferentes grupos de animais distróficosgrupos de animais distróficosgrupos de animais distróficosgrupos de animais distróficos Como houve diferença significativa na expressão da miostatina no diafragma quando comparado ao gastrocnêmio, decidimos realizar as análises dos dois músculos de forma separada, mas continuando a usar como normalizador a mesma amostra do controle normal C57BL46D, para permitir uma melhor comparação dos resultados. A figura 18 mostra os resultados comparativos no músculo diafragma, e a figura 19, no músculo gastrocnêmio. Todos os grupos experimentais apresentaram expressão mais reduzida da miostatina em ambos os músculos.

Figura18- Gráfico das expressões relativas da miostatina no músculo diafragma de todos os animais avaliados.

Os dados foram normalizados para a amostra C57BL46D.

Figura 19-Gráfico das expressões relativas da miostatina no músculo gastrocnêmio de todos os animais

avaliados. Os dados foram normalizados para a amostra C57BL46D.

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

C5

7B

L 2

0D

C5

7B

L 2

3D

C5

7B

L 2

4D

C5

7B

L 4

6D

C5

7B

L 4

7D

SJL

2D

SJL

3D

SJL

4D

SJL

5D

SJL

6D

SJL

7D

MD

X 2

5D

MD

X 2

6D

MD

X 2

7D

MD

X 2

8D

MD

X 2

9D

MD

X 9

D

LAR

GE

11

8D

LAR

GE

12

1D

LAR

GE

12

3D

LAR

GE

12

9D

LAR

GE

13

0D

2J

61

D

2J

69

D

2J

70

D

2J

79

D

2J

88

D

2J

92

D

DIAFRAGMA

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

C5

7B

L 2

0 G

C5

7B

L 2

3 G

C5

7B

L 2

4 G

C5

7B

L 2

5 G

C5

7B

L 4

6 G

C5

7B

L 4

7 G

SJL

2 G

SJL

3 G

SJL

4 G

SJL

5 G

SJL

6 G

SJL

7 G

MD

X 2

5 G

MD

X 2

6 G

MD

X 2

7 G

MD

X 2

8 G

MD

X 2

9 G

MD

X 9

G

LAR

GE

11

8 G

LAR

GE

12

1 G

LAR

GE

12

3 G

LAR

GE

13

0 G

2J

61

G

2J

69

G

2J

70

G

2J

79

G

2J

88

G

2J

92

G

Gastrocnêmio

50

Um novo gráfico (figura 20) foi construído para representar a média da expressão relativa da miostatina de cada grupo muscular em cada linhagem. Assim foi possível observar e comparar estes dados quanto às diferenças significativas entre os grupos afetados e seus respectivos controles.

Figura 20-Comparação gráfica das médias das expressões relativas da miostatina entre diafragma e

gastrocnêmio por linhagem, com base na normalização dos dados para o valor da amostra C57BL46D.*= P< 0,05 e ** = P<0,01 4.2.2.4 Teste com normalizador específico para c4.2.2.4 Teste com normalizador específico para c4.2.2.4 Teste com normalizador específico para c4.2.2.4 Teste com normalizador específico para cada músculoada músculoada músculoada músculo Para verificar se os resultados obtidos se confirmavam na análise de cada músculo independentemente, estabeleceu-se o melhor normalizador controle para o músculo diafragma (C5720D) e gastrocnêmio (C5720G), com base na média do ddCT de cada músculo do grupo de camundongos normais (figuras 21 e 22).

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

C57BL D SJL D MDX D LARGE D 2J D C57BL G SJL G MDX G LARGE G 2J G

COMPARAÇÃO ENTRE AS MEDIAS DAS EXPRESSÕES RELATIVAS DA MIOSTATINA COM O MESMO NORMALIZADOR

P = ** * * ** ** ** **

51

Figura 21- Gráfico das expressões relativas da miostatina no músculo diafragma dos controles normais e

animais afetados. Estes dados foram normalizados para a amostra C57BL 20 D, a qual obteve valor mais próximo da média das expressões neste grupo muscular entre os animais controles.

Figura 22- Gráfico das expressões relativas da miostatina no músculo gastrocnêmio dos controles normais e animais afetados. Estes dados foram normalizados para a amostra C57BL 20 G, a qual obteve valor mais próximo da média das expressões neste grupo muscular entre os animais controles.

Figura 23- Gráfico comparativo das expressões relativas da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio

entre os controles normais e animais afetados.

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

C5

7B

L 2

0D

C5

7B

L 2

3D

C5

7B

L 2

4D

C5

7B

L 4

6D

C5

7B

L 4

7D

SJL

2D

SJL

3D

SJL

4D

SJL

5D

SJL

6D

SJL

7D

MD

X 2

5D

MD

X 2

6D

MD

X 2

7D

MD

X 2

8D

MD

X 2

9D

MD

X 9

D

LAR

GE

11

8D

LAR

GE

12

1D

LAR

GE

12

3D

LAR

GE

12

9D

LAR

GE

13

0D

2J

61

D

2J

69

D

2J

70

D

2J

79

D

2J

88

D

2J

92

D

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

C5

7B

L 2

0 G

C5

7B

L 2

3 G

C5

7B

L 2

4 G

C5

7B

L 2

5 G

C5

7B

L 4

6 G

C5

7B

L 4

7 G

SJL

2 G

SJL

3 G

SJL

4 G

SJL

5 G

SJL

6 G

SJL

7 G

MD

X 2

5 G

MD

X 2

6 G

MD

X 2

7 G

MD

X 2

8 G

MD

X 2

9 G

MD

X 9

G

LAR

GE

11

8 G

LAR

GE

12

1 G

LAR

GE

12

3 G

LAR

GE

13

0 G

2J

61

G

2J

69

G

2J

70

G

2J

79

G

2J

88

G

2J

92

G

-2

-1,5

-1

-0,5

0

C5

7B

LD

SJLD

MD

XD

LAR

GED 2JD

C5

7B

lG

SJLG

MD

XG

LAR

GEG 2JG

DIAFRAGMA GASTROCNÊMIO

DIAFRAGMA - normalizador específicoC57BL20D

P = ** ** * ** P = ** ** **

GASTROCNÊMIO - normalizador específico C57BL20G

52

Os resultados desta comparação confirmaram que as amostras são significativamente diferentes e que a expressão de miostatina é menor nos dois músculos com exceção do músculo gastrocnêmio da linhagem Largemyd. 4444.2.2.5 An.2.2.5 An.2.2.5 An.2.2.5 Anáááálise da miostatina por linhagem (diafragma + gastrocnêmio)lise da miostatina por linhagem (diafragma + gastrocnêmio)lise da miostatina por linhagem (diafragma + gastrocnêmio)lise da miostatina por linhagem (diafragma + gastrocnêmio) Para comparar as linhagens quanto à expressão relativa da miostatina geral foi feito um gráfico somando os dados obtidos nos dois grupos musculares (figura 24).

Figura 24-Comparação gráfica das médias das expressões relativas da miostatina dos músculos diafragma e

gastrocnêmio por linhagem, com base na normalização dos dados para o valor da amostra C57BL46D. Como visto anteriormente os controles normais C57BL apresentaram maiores níveis da expressão da miostatina, enquanto em todas as linhagens de camundongos afetados, a miostatina está aparentemente mais inibida.

4.2.2.6 Aná4.2.2.6 Aná4.2.2.6 Aná4.2.2.6 Análise comparativa da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio em lise comparativa da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio em lise comparativa da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio em lise comparativa da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio em cadacadacadacada linhagem distrófica (um só normalizador linhagem distrófica (um só normalizador linhagem distrófica (um só normalizador linhagem distrófica (um só normalizador –––– C5746D)C5746D)C5746D)C5746D) Para cada grupo de modelos murinos, fizemos uma analise comparativa da expressão da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio. Todos os modelos murinos apresentaram uma redução da expressão quando comparados com os normais, sem diferenças no tipo de músculo, conforme pode ser observado na figura 25. Não houve

C57BL SJL/J DmdC57BL SJL/J DmdC57BL SJL/J DmdC57BL SJL/J Dmdmdxmdxmdxmdx LargeLargeLargeLargemyd myd myd myd Lama2Lama2Lama2Lama2dy2Jdy2Jdy2Jdy2J/J/J/J/J

P = 0,001 0,002 0,017 0,001

53

diferença na expressão de miostatina entre diafragma e gastrocnêmio nas linhagens. No 2J a diferença é significativa (p<0,05).

Figura 25-Médias das expressões relativas da miostatina comparadas por grupo muscular em cada linhagem. 4.3 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA4.3 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA4.3 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA4.3 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA A análise histopatológica dos músculos gastrocnêmio e diafragma de cada animal foi feita em lâminas com coloração HE. Os critérios de avaliação se basearam na definição do grau de degeneração e regeneração, conforme descrito por Dubowitz,et al., 2007. Nesta análise, verificou-se: a variação no calibre das fibras e na forma (+ normal, ++ pouca variação, +++ muita variação), Presença de tecido conjuntivo perimisial e endomisial (+ normal, ++ pouca substituição, +++ muita substituição), fibras fendidas (0 nenhuma, + de 1-3 fibras, ++ mais ) fibras centronucleadas, necrose, Fibras basofílicas em regeneração (0 nenhuma, + uma a 3 fibras, +++ mais que 3 fibras). Os resultados obtidos estão representados na figura 26. Os dados qualitativos foram convertidos em números, e foi calculada a média de cada variável em cada linhagem(Quadro 8).

C57BL SJL/J C57BL SJL/J C57BL SJL/J C57BL SJL/J DmdDmdDmdDmdmmmmddddxxxx LargeLargeLargeLargemydmydmydmyd Lama2Lama2Lama2Lama2dy2Jdy2Jdy2Jdy2J/J/J/J/J

P = 0,01 0,17 0,09 0,39 0,02

COMPARAÇÃO ESTATÍSTICA ENTRE AS EXPRESSÕES DA MIOSTATINA NOS MÚSCULOS DIAFRAGMA E GASTROCNÊMIO DE CADA LINHAGEM

54

Quadro 8-Avaliação das características musculares de degeneração e regeneração na histologia dos músculos diafragma e gastrocnêmio por amostra.

ANIMAL

DEGENERAÇÃO REGENERAÇÃO

VARIAÇÃO DE CALIBRE FORMA

TECIDO CONJUNTIVO

FIBRAS FENDIDAS

NÚCLEOS CENTRAIS NECROSE

FIBRAS BASOFÍLICAS

C57BL

DIAFRAGMA

C21D + + + 0 + 0 0

C22D + + ++ 0 + + 0

C23D + + + 0 + 0 0

C25D + + + 0 + 0 0

C46D + + + 0 0 0 0

GASTROCNÊMIO

C20G + + + 0 0 0 0

C21G + + + 0 0 0 0

C22G + + + 0 0 0 +

C23G + + + 0 + 0 0

C25G + + + 0 + ++ 0

C46G + + + + ++ + 0

SJL/J

DIAFRAGMA

S2D ++ + + + + ++ 0

S3D + + + + + + 0

S4D + ++ + 0 + 0 0

S5D + ++ + + + + 0

S6D + ++ + 0 + 0 0

S7D + ++ + 0 0 0 0

GASTROCNÊMIO

S3G ++ + + 0 + ++ 0

S4G ++ + + 0 + ++ +

S5G + + + 0 + + 0

S6G + + + 0 + ++ 0

Dmdmdx

DIAFRAGMA

M25D +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++

M26D +++ ++ +++ + +++ +++ +++

M27D +++ +++ ++ + +++ + +

M28D +++ +++ ++ 0 ++ 0 0

M9D +++ +++ +++ ++ +++ + +

M29D +++ +++ ++ + +++ 0 0

GASTROCNÊMIO

M9G +++ + + 0 +++ ++ ++

55

M18G +++ + + 0 +++ 0 0

M25G +++ ++ + 0 +++ ++ ++

M26G +++ ++ ++ + +++ + +

M27G +++ ++ + + +++ 0 0

M28G +++ ++ ++ + +++ ++ ++

M29G +++ ++ ++ ++ +++ 0 0

Largemyd

DIAFRAGMA

L121D +++ +++ + + +++ + 0

L123D +++ +++ +++ ++ +++ +++ 0

L129D +++ +++ +++ +++ +++ ++ 0

GASTROCNÊMIO

L118G +++ + ++ 0 +++ + ++

L121G +++ ++ +++ + +++ ++ +

L123G +++ ++ ++ + +++ ++ +

L129G +++ ++ +++ 0 +++ +++ ++

L130G +++ +++ +++ + +++ + 0

Lama2dyJ

/J

DIAFRAGMA

2J61D ++ + ++ + + + 0

2J70D +++ ++ ++ 0 + + 0

2J88D ++ ++ ++ 0 + +++ +

2J92D ++ +++ ++ 0 + ++ ++

GASTROCNÊMIO

2J61G +++ +++ +++ +++ ++ ++ 1,00

2J69G +++ +++ +++ +++ ++ ++ 1,00

2J70G +++ +++ ++ + + +++ 1,00

2J88G +++ ++ +++ 0 ++ ++ 1,00

2J92G +++ +++ ++ 0 ++ + 2,00

56

Quadro 9- Avaliação das características musculares de degeneração e regeneração na histologia dos músculos diafragma e gastrocnêmio por linhagem

ANIMAL

DEGENERAÇÃO REGENERAÇÃO

VARIAÇÃO DE CALIBRE FORMA

TECIDO CONJUNTIVO

FIBRAS FENDIDAS

NÚCLEOS CENTRAIS NECROSE

MÉDIA TOTAL

FIBRAS BASOFÍLICAS

C57BL

DIAFRAGMA 1,00 1,00 1,20 0,00 0,80 0,20 0,70 0,00

GASTROCNÊMIO 1,00 1,00 1,00 0,17 0,67 0,50 0,72 0,17

SJL/J

DIAFRAGMA 1,17 1,67 1,00 0,50 0,83 0,67 0,97 0,00

GASTROCNÊMIO 1,50 1,00 1,00 0,00 1,00 1,75 1,04 0,25

Dmdmdx

DIAFRAGMA 3,00 2,83 2,33 1,17 2,67 1,17 2,19 0,50

GASTROCNÊMIO 3,00 1,71 1,43 0,71 3,00 1,00 1,81 1,43

Largemyd

DIAFRAGMA 3,00 3,00 2,33 2,00 3,00 2,00 2,56 0,00

GASTROCNÊMIO 3,00 2,00 2,60 0,60 3,00 1,80 2,06 1,40

Lama2dyJ

/J

DIAFRAGMA 2,25 2,00 2,00 0,25 1,00 1,75 1,54 0,75

GASTROCNÊMIO 3,00 2,80 2,60 1,40 1,80 2,00 2,11 1,20

57

Figura 26- Diafragma e gastrocnêmio em cortes histológicos transversais feitos em micrótomo criostato com

espessura de 6um , corados com HE. Observa-se no controle normal a presença de fibras com calibre semelhante, citoarquitetura com angularidade entre as fibras, fino tecido conjuntivo entre as

DIAFRAGMA GASTROCNÊMIO

58

fibras, núcleos periféricos. Nos músculos dos animais modelos observa-se fibras de calibre variado, perda da citoarquitetura angular, infiltração de tecido conjuntivo, núcleos centrais, necrose. No modelo SJL/J e no gastrocnêmio do Dmd

mdx essas observações são menos expressivas e muitas vezes ausentes.

Figura 27-Distribuição comparativa dos dados de degeneração nos músculos diafragma e gastrocnêmio em

cada uma das linhagens Segundo as avaliações histológicas, entre os afetados o músculo mais degenerado foi o diafragma da linhagem Largemyd e o menos degenerado foi o diafragma da linhagem SJL/J.

Figura 28-Distribuição comparativa dos dados de regeneração nos músculos diafragma e gastrocnêmio em cada uma das linhagens. Segundo as avaliações histológicas, a regeneração foi registrada pela presença de fibras basofílicas e entre os afetados o músculo que mais apresentou este tipo celular foi o gastrocnêmio da linhagem Dmdmdx. Nos músculo diafragma das linhagens SJL/J e Largemyd estas fibras não foram encontradas.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3C

57B

L

DIA

FRA

GM

A

GA

STR

OC

NÊM

IO

SJL/

J

DIA

FRA

GM

A

GA

STR

OC

NÊM

IO

Dm

dm

dx

DIA

FRA

GM

A

GA

STR

OC

NÊM

IO

Larg

emyd

DIA

FRA

GM

A

GA

STR

OC

NÊM

IO

Lam

a2d

yJ/J

DIA

FRA

GM

A

GA

STR

OC

NÊM

IO

DEGENERAÇÃO

00,20,40,60,8

11,21,41,6

C57

BL

DIA

FRA

GM

A

GA

STR

OC

NÊM

IO

SJL/

J

DIA

FRA

GM

A

GA

STR

OC

NÊM

IO

Dm

dm

dx

DIA

FRA

GM

A

GA

STR

OC

NÊM

IO

Larg

emyd

DIA

FRA

GM

A

GA

STR

OC

NÊM

IO

Lam

a2d

yJ/J

DIA

FRA

GM

A

GA

STR

OC

NÊM

IOREGENERAÇÃO

59

Como um dos objetivos do presente trabalho é verificar a relação da expressão da miostatina dentro dos modelos distróficos comparando com o padrão de degeneração e regeneração apresentado por eles, em seguida a análise histológica, foi feito a comparação das expressões relativas da miostatina nos dois músculos com a degeneração e em outro gráfico com a regeneração. A degeneração foi avaliada de acordo com as características histológicas que indicam degeneração como necrose, substituição de tecido muscular por tecido conjuntivo, variação de calibre das fibras e perda da angularidade das fibras. A regeneração foi avaliada de acordo com a presença de fibras basofílicas que são típicas de fibras em regeneração.

Figura 29- Comparação da expressão relativa da miostatina com a degeneração no músculo diafragma e gastrocnêmio.

Figura 30-Comparação da expressão relativa da miostatina com a regeneração no músculo diafragma e gastrocnêmio. Nos gráficos onde a expressão relativa da miostatina é comparada com a degeneração nos modelos murinos observa-se que onde há degeneração aumentada a expressão da miostatina está inibida.

-1,00

-0,50

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

MSTN E DEGENERAÇÃO -DIAFRAGMA

DEGENERAÇÃO

MSTN

-1,50

-1,00

-0,50

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

MSTN E DEGENERAÇÃO-GASTROCNÊMIO

DEGENERAÇÃO

MSTN

-1,00

-0,50

0,00

0,50

1,00

MSTN E REGENERAÇÃO -DIAFRAGMA

REGENERAÇÃO

MSTN

-1,50

-1,00

-0,50

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

MSTN E REGENERAÇÃO -GASTROCNÊMIO

REGENERAÇÃO

MSTN

60

Não foi possível observar alguma relação de aumento ou inibição na expressão relativa da miostatina com a regeneração nos modelos murinos.

61

5 DISCUSSÃO5 DISCUSSÃO5 DISCUSSÃO5 DISCUSSÃO 5.1 A MIO5.1 A MIO5.1 A MIO5.1 A MIOSTATINA COMO ALVO PARA TERAPIASSTATINA COMO ALVO PARA TERAPIASSTATINA COMO ALVO PARA TERAPIASSTATINA COMO ALVO PARA TERAPIAS Desde a identificação da mutação no gene da miostatina como responsável pela musculatura dupla em bovinos (Grobet, 1997), muitas estratégias tem sido desenvolvidas para estimular o crescimento muscular através de interferência na expressão da proteína miostatina (Patel, 2005). A primeira tentativa de inibição da miostatina ocorreu em 1997 quando McPherron et al. produziram um camundongo knockout para miostatina. Nas analises histológicas destes camundongos, foi revelado que o aumento da massa muscular ocorreu devido à hiperplasia e à hipertrofia das fibras musculares, sugerindo um importante papel da miostatina no controle do crescimento muscular. Posteriormente, diversos métodos foram testados para inibir a miostatina, incluindo a produção de animais geneticamente modificados com mutações no gene da miostatina, ou animais com expressão de RNA antisense da miostatina ou através do uso de anticorpos anti-miostatina. Wagner et al.(2002) geraram um camundongo Dmdmdx deficiente em miostatina pelo cruzamento do camundongo Dmdmdx com o camundongo nulo para miostatina. O camundongo gerado tinha aumento de massa e força muscular, por outro lado não teve redução significativa de necrose ou inflamação. Bogdanovich et al.(2002) também observaram uma melhora funcional no camundongo Dmdmdx, mas com o uso de anticorpos anti-miostatina. Recentemente um anticorpo anti-miostatina (MYO-029) foi administrado a pacientes com distrofias do tipo Becker (BMD), Facioescapulohumeral (FSHD) e das Cinturas (LGMD), com o objetivo de testar a tolerância e a segurança deste anticorpo. O teste clínico que está em fase I/II demonstrou que a droga usada, MYO-029 era segura (Wagner et al., 2008). Magee et al.(2006) obtiveram resultados positivos após administração de siRNA em ratos: 27% do mRNA da miostatina foi suprimido, causando um aumento de 10% da massa muscular esquelética. Este estudo comprovou sugestão anterior de que o sistema de RNAi oferece a possibilidade de controlar e silenciar genes eficientemente, e deveria ser explorado como metodologia de silenciamento da miostatina. (Novina e Sharp, 2004).

62

Existem muitas doenças em que a perda muscular ou a falta de desenvolvimento do músculo são a conseqüência direta ou efeito secundário da doença, e a miostatina parece estar envolvida. Como nos estudos com homens HIV positivos, Gonzalez-Cadavid et al.(1998) correlacionou a perda de massa muscular com a concentração sérica de miostatina. Eles observaram que quanto maior a perda muscular maior a concentração de miostatina. Portanto, a inibição da miostatina parece ser um ponto chave na ajuda da manutenção muscular em doenças com perda de massa muscular. Porem, há muito o que estudar em relação aos mecanismos que envolvem sua ação no músculo normal e distrófico. Desta forma, com o objetivo de procurar uma relação entre a expressão da miostatina e o processo de degeneração/regeneração observado nas distrofias musculares, sem a interferência de agentes externos para sua inibição ou ativação, foi feita a comparação da expressão relativa da miostatina nos modelos murinos Dmdmdx, SJL/J, Largemyd e Lama2dyJ/J, nos músculos diafragma e gastrocnêmio, e analise histológica quanto ao grau de degeneração e regeneração destes músculos. 5.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA5.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA5.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA5.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com características já observadas em doenças hereditárias enquanto outros são modificados geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas semelhantes às observadas em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos genéticos, clínicos, histopatológicos e terapêuticos ajudando na compreensão da origem das doenças e suas manifestações nos indivíduos afetados (Vainzof et al., 2008). Neste estudo, incluímos quatro modelos para distrofias musculares, pois cada um apresenta mutação em gene que codifica proteína diversa, com localização variável nos compartimentos da fibra muscular. A mutação no gene DMD leva à ausência da proteína distrofina na região sub-sarcolemal da fibra muscular, provocando em humanos a Distrofia Muscular de Duchenne que é a forma mais comum das doenças neuromusculares em crianças. A ausência desta

63

proteína também foi observada em camundongos, que assim como os pacientes com DMD, apresentam uma mutação recessiva no cromossomo X. Estes camundongos pertencem a linhagem Dmdmdx, tem curso de vida normal e podem sobreviver até mais que 2 anos (http://jaxmice.jax.org/strain/001801.html). São rotineiramente usados como modelo animal molecular e histopatológico para a doença, mas não como modelo clínico. A miopatologia do camundongo Dmdmdx é muito menos grave quando comparada ao curso da doença em humanos pois os camundongos afetados não apresentam a fraqueza observada em pacientes com DMD. Por histologia é possível verificar que os músculos posteriores do camundongo Dmdmdx conseguem compensar a falta de distrofina, enquanto o diafragma se torna progressivamente afetado e pode ser comparado pela semelhança aos músculos degenerados de pacientes com DMD (Rouger et al., 2002). A explicação para esta diferença ainda não foi esclarecida. Por isso investigamos a histologia muscular e a expressão da miostatina no camundongo Dmdmdx nos músculos diafragma e gastrocnêmio. Escolhemos o gastrocnêmio por ser um músculo posterior de composição heterogênea de fibras rápidas e lentas (Delp e Duan, 1996). Os resultados histológicos do presente trabalho foram concordantes com o padrão de degeneração e regeneração dos dois músculos nesta linhagem, havendo uma maior degeneração no diafragma, e uma maior regeneração no músculo gastrocnêmio. O camundongo SJL/J é um modelo natural para diferentes doenças humanas. Devido a uma mutação identificada no gene da disferlina (Bittner et al., 1999) ele apresenta uma redução média de 85% nos níveis desta proteína no sarcolema das fibras musculares, tornando-o um bom modelo para LGMD2B (Vainzof et al., 2003). Ele tem expectativa de vida ligeiramente reduzida sendo de 472 dias para os machos e 395 para as fêmeas, mas de um modo geral, o padrão de fraqueza muscular é leve (Storer, 1966). Os machos dessa linhagem são conhecidos por serem agressivos (Page e Glenner, 1972). Em concordância que o quadro clínico é leve, a analise histológica do camundongo SJL/J mostrou alterações muito discretas. Existem muitos modelos para as distrofias musculares congênitas relacionados com defeitos em proteínas da lâmina basal, e já foram identificadas mutações distintas no gene LAMA2, codificante da cadeia α2 da laminina 2 em diversos destes modelos. Algumas mutações levam à ausência total da proteína α2-laminina, enquanto outras levam à

64

deficiência parcial desta proteína (Vilquinet al., 1999; Vilquinet al., 2000). Em ambos os casos, há presença de uma distrofia muscular com comprometimento muscular variando de grave a extremamente severo. O camundongoLama2dyJ/J é modelo para DMC1A (Jackson Laboratories),tem expectativa de vida normal e significante fraqueza muscular, que também foi comprovada na análise histopatológica realizada. Uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma DMC1D, foi associada a mutações no gene LARGE. Este gene está envolvido na glicosilação da proteína α-DG, membro essencial na formação e funcionamento do complexo DGC muscular. O camundongo Largemyd, com defeito na via de glicosilação da proteína α-DG, é modelo da DM congênita tipo 1D. Histologicamente foi observado grande infiltração de tecido conjuntivo, fibras com calibre bastante variado e citoarquitetura muito afetada. O padrão de degeneração foi significativo tanto no músculo gastrocnêmio como diafragma, mas de forma interessante, só se observou um pouco de regeneração no músculo gastrocnêmio. 5.5.5.5.3 ESTUDO DA EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA NO MÚSCULO3 ESTUDO DA EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA NO MÚSCULO3 ESTUDO DA EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA NO MÚSCULO3 ESTUDO DA EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA NO MÚSCULO 5.3.1 Escolha do gene endógeno5.3.1 Escolha do gene endógeno5.3.1 Escolha do gene endógeno5.3.1 Escolha do gene endógeno A seleção de um gene endógeno para avaliar a expressão da miostatina envolve a escolha de gene que mantém a expressão inalterada tanto no músculo diafragma como no gastrocnêmio, em todas as linhagens estudadas. O gene ideal de referencia é aquele que é expresso no mesmo nível em todas as amostras, não importando o tipo de tecido, estágio da doença, medicação ou condições experimentais (Suzuki et al., 2000). No entanto, muitos estudos mostraram que a expressão de genes normalmente usados como referência, variam com o tipo de tecido e com o seu estado fisiológico (Thellin et al.,1999). O gene GAPDH é um gene endógeno vastamente utilizado em estudos de expressão, e foi usado como normalizador endógeno no estudo da expressão da miostatina em fetos bovinos (Milazzoto, 2006). Além disso, este gene foi também utilizado com sucesso em estudos realizados em nosso laboratório, no trabalho de mestrado de Paula Onofre-Oliveira (2009), onde o gene GAPDH apresentou a menor variação da

65

expressão nos diferentes modelos e músculos analisados. Portanto, foi escolhido como controle endógeno para os nossos experimentos posteriores. 5.3.2 Analise Semi quantitativa da miostatina5.3.2 Analise Semi quantitativa da miostatina5.3.2 Analise Semi quantitativa da miostatina5.3.2 Analise Semi quantitativa da miostatina Enquanto aguardávamos a implantação da analise da expressão gênica por técnica de PCR em tempo real, realizamos a analise semi-quantificativa da expressão da miostatina, avaliando o padrão de amplificação por PCR, utilizando diferentes números de ciclos. Optamos pela analise em 27 e 30 ciclos pois como a miostatina é um gene pouco expresso, esperávamos obter nestes ciclos, valores de amplificação localizados na parte exponencial da curva de amplificação. Se as amostras atingissem essa região da curva, seria possível detectar quantidades diferentemente amplificadas entre os produtos de PCR. Porém, quando feita a relação entre as intensidades das bandas da miostatina e do GAPDH, e a comparação estatística pelo teste Mann-Whitney, em grande parte das amostras estudadas obtivemos um padrão de amplificação similar com os 2 valores de ciclos utilizados, sugerindo que a metodologia não estava permitindo uma análise quantitativa. Mesmo quando realizamos a analise somente nas amostras onde houve diferença de amplificação entre estes ciclos, não encontramos diferenças significativas entre os controles normais e os afetados de cada grupo muscular. Portanto, este procedimento não foi informativo. 5.3.5.3.5.3.5.3.3 Analise por PCR em tempo real3 Analise por PCR em tempo real3 Analise por PCR em tempo real3 Analise por PCR em tempo real O qPCR foi realizado de acordo com as instruções do equipamento 7500 Applied Biosystems. Primeiramente a curva padrão serviu para estabelecer os valores de threshold de cada gene. O threshold é o limiar que corta a curva de amplificação na região onde as reações se tornam quantitativas. Com esse valor estabelecido é possível calcular nas futuras reações a expressão de cada amostra. Os valores obtidos da expressão da miostatina estão vinculados à sua relação ao gene endógeno do mesmo músculo e animal, sendo, portanto, uma expressão relativa. Além disso, é necessária a escolha de uma amostra considerada padrão, ou

66

normalizadora, para que a expressão das amostras teste sejam calculadas em relação a esta. Para a escolha do normalizador, que precisa ser uma única amostra das testadas, calculamos a média de expressão do grupo controle, incluindo tanto as amostras dos músculos gastrocnêmio como de diafragma, e foi escolhido um normalizador com valor de expressão mais próximo deste valor médio. Desta forma, a comparação da expressão nos dois músculos nos camundongos controle foi realizada com a amostra C57Bl46D (Quadro 7). 5.3.3.1 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio do grupo controle5.3.3.1 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio do grupo controle5.3.3.1 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio do grupo controle5.3.3.1 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio do grupo controle Na análise comparativa dos músculos gastrocnêmio e diafragma de camundongos normais, encontramos a expressão relativa da miostatina mais inibida no gastrocnêmio em comparação ao diafragma, que foi estatisticamente significativa (figura 17). A diferença poderia ser explicada pela anatomia e funções heterogêneas destes músculos. O músculo gastrocnêmio origina-se no fêmur e caudalmente se une ao tendão do músculo sóleo (Hebel et al.,1983). Ele atua na flexão dos pés para baixo e também agindo na flexão dos joelhos. Está principalmente relacionado com a locomoção e postura. É um músculo mais exposto e sujeito a sofrer danos causados por movimentação e exercícios. Danos à fibra muscular após exercício levam normalmente à desorganização na estrutura das fibras musculares, mais especificamente a ruptura, alargamento ou prolongamento da linha Z (Friden e Lieber, 1992; Clarkson e Newham, 1995), visto que a linha Z do sarcômero é o ponto de contato das proteínas contráteis, fornecendo suporte estrutural para a transmissão de força quando as fibras musculares são encurtadas (Mchugh, 2003). As alterações no músculo sob trauma ativam uma cascata de citosinas, estimulando a sua regeneração. O diafragma pode sofrer dano muscular de outra forma, quando ocorre ventilação forçada. Sobretudo em indivíduos suscetíveis a miopatias, distrofias musculares e sepse (Hamid et al., 2005). O diafragma difere em função e anatomia do músculo gastrocnêmio pois é o único entre os músculos esqueléticos em que as fibras radiam a partir do tendão central para se inserirem perifericamente nas estruturas esqueléticas (Hamid et al., 2005). Seu papel é relacionado com a respiração. Quando as fibras são estimuladas durante a

67

inspiração, elas são tensionadas e se encurtam, provocando a expansão da cavidade torácica no eixo craniocaudal, então a pressão pleural diminui, conseqüentemente o ar preenche o espaço alveolar dos pulmões. Secundariamente ocorre um deslocamento das vísceras abdominais e um aumento da pressão abdominal, que por sua vez empurra a parede do ventre para fora (Hamid et al., 2005). Para que algum dano ocorra nas fibras do gastrocnêmio basta um movimento diferente ou mais forçado. Por outro lado, o diafragma apresenta contração ritmada e constante, sendo necessária uma intervenção como a ventilação forçada para causar uma lesão. Portanto, um maior controle para a inibição da miostatina no músculo gastrocnêmio normal é importante para que as células satélites entrem em proliferação, e atuem para a reconstrução de eventuais lesões nas fibras lesionadas. Estes dados são compatíveis com resultados da literatura em que a miostatina está mais inibida em músculos de indivíduos submetidos a treinamento e exercício físico (Chargé e Rudnik, 2003; Ruth et al., 2003; Kim et al., 2005; Muniz, 2005). Como exemplo recente Matsakas et al.(2006) encontraram inibição da miostatina no músculo gastrocnêmio de ratos sujeitos a natação. Em patologias humanas como a doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), estudos que comparam as vias de sinalização no músculo diafragma com o músculo quadriceps indicam que o balanço entre a sinalização de atrofia e hipertrofia entre músculos respiratórios e músculos inferiores é heterogeneo. (Doucet et al., 2010). Portanto, os mecanismos de degeneração e regeneração da musculatura esquelética e do músculo diafragma aparentemente obedecem a vias de regulação diversas. 5.3.3.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastro5.3.3.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastro5.3.3.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastro5.3.3.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos camundongos cnêmio dos camundongos cnêmio dos camundongos cnêmio dos camundongos afetadosafetadosafetadosafetados Nas quatro linhagens distróficas analisadas, observamos que a expressão relativa da miostatina, tanto nos músculos gastrocnêmio como no diafragma, estava significativamente inibida em relação aos respectivos músculos dos camundongos normais. Esta diferença foi significativa em todos, com exceção do músculo gastrocnêmio da linhagem Largemyd. Comparando-se todas as linhagens entre si, não houve diferença significativa, mostrando que em todos os processos distróficos,

68

independentemente do defeito molecular primário, ocorre um estímulo para a inibição da miostatina. O fato de ter encontrado menor inibição na expressão relativa da miostatina na linhagem Largemyd, apesar do músculo gastrocnêmio desta linhagem ser um dos mais afetados pela degeneração, complementa os dados encontrados por Onofre (2009). Neste trabalho, foi observada baixa expressão dos genes MyoD e Myf5 nos camundongos Largemyd, sugerindo baixa atividade proliferativa das células-satélite nestes animais (Yablonka-Reuveniet al., 2008). Se há pouca inibição da miostatina, as células satélites não são estimuladas a se diferenciarem, expressando os fatores MyoD e Myf5 para repararem o músculo, resultando num quadro histopatológico muito grave como observado na histologia. O mecanismo que está defeituoso nesta linhagem é o da glicosilação da α-distroglicana. Estudo realizado em camundongo knockout temporal para a proteína α-distroglicana mostrou que como resultado do silenciamento deste gene no músculo, houve uma intensa degeneração, mas regeneração surpreendente. Isto porque o gene da α-distroglicana não estava silenciado nas células satélites e estas conseguiram reparar o músculo. A partir destes resultados os autores sugerem que um mecanismo de glicosilação da α-DG funcional constitui importante requisito para o bom funcionamento e renovação das células-satélite (Cohn et al., 2002). Por causa das já descritas diferenças no padrão de degeneração e regeneração dos músculos diafragma e gastrocnêmio no camundongo Dmdmdx, comparamos as expressões relativas da miostatina nestes músculos neste modelo bem como nas demais linhagens distróficas. Também não encontramos diferenças significativas na inibição da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio de cada linhagem, indicando que independentemente do defeito molecular primário que leva a distrofia muscular nestes modelos, em todos ocorre a inibição da miostatina em relação ao músculo normal. Pode-se justificar que a fibra em estado de degeneração tenta regenerar, e para que isto ocorra a miostatina deve estar inibida para que as células satélites possam reparar o dano muscular. Lembrando que embora não houve diferenças significativas nas expressões relativas da miostatina entre os camundongos afetados nos músculos diafragma e gastrocnêmio, ela estava diferente no controle. Portanto, para avaliar este efeito, escolhemos um

69

normalizador para cada músculo (o valor médio encontrado no grupo controle) e fizemos as comparações das linhagens separadas por grupo muscular. O resultado se repetiu, confirmando as observações originais. 5.4 ANÁLISE HISTOPATOL5.4 ANÁLISE HISTOPATOL5.4 ANÁLISE HISTOPATOL5.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓÓÓÓGICA GICA GICA GICA A coloração de HE permite analisar a morfologia das fibras musculares e dos tecidos adjacentes, podendo-se observar se existe ou não degeneração, necrose, fibras fendidas, fibras centronucleadas, e regeneração visualizada através de fibras pequenas basofílicas. Estas variáveis foram quantificadas em cruzes, em função de maior freqüência, ou predomínio em cada músculo, nas quatro linhagens, e comparadas a controles normais da mesma idade. Os resultados da analise histopatológica do presente trabalho, mostraram no músculo gastrocnêmio e no diafragma dos camundongos Dmdmdx a presença de muitas fibras com núcleos centrais com padrão de degeneração muito grande em ambos os músculos, quando comparados com os controles normais. Por outro lado, as fibras basofílicas, que são indicativas de intensa regeneração muscular, mostraram um padrão de regeneração mais significativo no músculo gastrocnêmio do que no diafragma, resultados compatíveis com a literatura (DiMarioet al., 1991). Diversos trabalhos da literatura tem mostrado neste modelo deficiente em distrofina, que os músculos envolvidos na locomoção sofrem processo de degeneração, mas com um pico de regeneração ao redor dos 2 meses de idade, que leva a melhor preservação destes músculos (Anderson et al., 1988). Já o músculo diafragma não passaria por este processo de regeneração, apresentando, portanto, características mais acentuadas de degeneração (Louboutin et al., 1993). No camundongo SJL/J, em concordância com o seu quadro clínico leve, a análise histológica mostrou a presença de discreta variação de calibre das fibras e um pequeno aumento do tecido conjuntivo. Tanto o padrão de degeneração, como o de regeneração foram muito próximos aos observados nos camundongos normais. Os resultados são semelhantes aos encontrados por Bittner et al. (1999). Os achados histopatológicos leves são compatíveis com os dados da literatura que descrevem uma progressão lenta da

70

doença, distribuição da fraqueza muscular predominante nos músculos proximais à cintura pélvica, enquanto que a cintura escapular é discretamente afetada ao longo do tempo. Nos estágios iniciais as mudanças distróficas podem ser mínimas, já nos estágios mais tardios ocorre substituição de tecido muscular por tecido adiposo, alem de fibras fendidas, núcleos centrais e necrose. (Urtizberea et al., 2008). Considerando-se que os músculos estudados não são os predominantemente afetados na LGM2B, e a idade dos animais estudados (3 meses) os classifica como jovens adultos, os dados histopatológicos são compatíveis com os esperados para músculos não acometidos gravemente. No modelo Lama2dyJ/J que tem significante fraqueza muscular (Jackson Laboratories), a análise histológica mostrou uma intensa degeneração e maior regeneração no músculo gastrocnêmio do que no diafragma, compatíveis com o grau de fraqueza observado em seus membros posteriores. Já no camundongo Largemyd, o padrão de degeneração foi significativo tanto no músculo gastrocnêmio como no diafragma, mas de forma interessante, só se observou regeneração no músculo gastrocnêmio. Como discutido anteriormente, Yablonka-Reuveni et al.(2008) sugerem que o camundongo Largemyd tenha baixa atividade proliferativa das células-satélite, que somado ao defeito de glicosilação da α-distroglicana justificariam a gravidade da degeneração muscular observada no músculo gastrocnêmio desta linhagem. 5.5 CORRELAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA E PADRÃO DE 5.5 CORRELAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA E PADRÃO DE 5.5 CORRELAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA E PADRÃO DE 5.5 CORRELAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA E PADRÃO DE DEGDEGDEGDEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO MUSCULARENERAÇÃO E REGENERAÇÃO MUSCULARENERAÇÃO E REGENERAÇÃO MUSCULARENERAÇÃO E REGENERAÇÃO MUSCULAR A análise comparativa dos resultados da regeneração com a expressão da miostatina nos quatro modelos distróficos estudados mostrou que não há uma aparente relação entre a presença da regeneração, ou sua intensidade e a expressão da miostatina. Isto pode ser melhor observado no músculo diafragma, onde a expressão da miostatina esta inibida nos quatro modelos, sendo que somente no Dmdmdx e Lama2dy2J/J foi possível identificar a presença de regeneração. Já quanto ao padrão de degeneração, houve uma relação entre aumento de degeneração acompanhado de redução da expressão da miostatina nos quatro modelos distróficos. Todos os modelos apresentaram degeneração e também inibição da

71

miostatina. Entretanto, os gráficos da degeneração e expressão relativa da miostatina revelam que o grau de degeneração observado em cada linhagem não influencia na maior ou menor expressão da miostatina. Além disso, a semelhança no padrão de inibição da miostatina nos músculos gastrocnêmio e diafragma de cada linhagem reforça esta hipótese. Portanto, o processo de degeneração, quando iniciado, e independentemente de seu grau, causa molecular primária, ou músculo afetado, parece atuar de forma similar na inibição da expressão da miostatina.

72

6 CONCLUSÕES6 CONCLUSÕES6 CONCLUSÕES6 CONCLUSÕES - Em camundongos normais, a miostatina é menos expressa no músculo gastrocnêmio do que no diafragma, refletindo um músculo mais sujeito a lesão. - Nas quatro linhagens de camundongos distróficos, independentemente da mutação ou do grau de degeneração do músculo, a miostatina é menos expressa do que em camundongos normais. - No músculo distrófico, a expressão da miostatina é inibida tanto no músculo gastrocnêmio como no diafragma, sem diferença entre os dois. - A análise comparativa da degeneração e regeneração muscular com a expressão da miostatina mostrou uma maior correlação com o padrão de degeneração do que com a regeneração. Nossos resultados sugerem que o processo de degeneração, quando iniciado, e independentemente de seu grau, causa molecular primária, ou músculo afetado, parece atuar de forma similar na inibição da expressão da miostatina, possivelmente como estímulo a regeneração do dano.

73

REFERÊNCIAS*1 Allamand V, Campbell KP.AnimalModelsForMuscularDystrophy: Valuable Tools For The Development Of Therapies Human Molecular Genetics. 2000;9(16):2459-67. Amthor H , Macharia R, Navarrete R, Schuelke M, Brown SC, Otto A, Voit T, Muntoni F, Vrbóva G, Partridge T, Zammit P, Bunger L, Patel KE. .Lack Of Myostatin Results In Excessive Muscle Growth But Impaired Force Generation.PNAS.2007;104(10):4240. Amthor H, Ottoc A, Vulina A, Rochata A, Dumonceauxa J, Garcia L, Mouisela E, Hourde C, Machariad R, Friedrichsb M, Relaixa F, Zammite PS, Matsakasc A, Patelc KE Partridgef T. Muscle hypertrophy driven by myostatin blockade does not require stem/precursor-cell activity.PNAS. 2009;106(18):7479–84.doi: 10.1073/pnas.0811129106. Anderson JE, Bressler BH, Ovalle WK. Functional regeneration in the hindlimb skeletal muscles of the mdx mouse.J Muscle Res Cell Motil. 1988;9:499–516. Bittner RE, Schöfer C, Weipoltshammer K. Recruitment of bone-marrow-derived cells by skeletal and cardiac muscle in adult dystrophic mdx mice. Anat Embryol. 1999;199:391-6. Bogdanovich S, Krag TO, Barton ER, Morris LD, Whittemore LA, Ahima RS, Khurana TS. Functional Improvement Of Dystrophic Muscle By Myostatin Blockade. Nature.2002;420:418-21. Bonilla E, Samitt CE, Miranda AF, Hays AP, Salviati G, DiMauro S, Kunkel LM, Hoffman EP, Rowland LP. Duchenne muscular dystrophy: deficiency of dystrophin at the muscle cell surface. Cell.1988;12;54(4):447-52. Browning CA, Grewal PK, Moore CJ, Hewitt JE. A Rapid Pcr Method For Genotyping The Largemyd Mouse, A Model Of Glycosylation-Deficient Congenital Muscular Dystrophy. Neurom.Disord. 2005;15:331-5. Bustin S. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of molecular endocrinology. 2000;25:193. Bulfield G, Siller WG, Wight PAL, Moore KJ. X Chromosome-Linked Muscular Dystrophy (Mdx) In The Mouse Pnas. 1984;81:1189-92. Delp MD, Duan C. Composition and size of type I,IIA, IID/X, and IIB fibres and citrate synthase activity of rat muscle. J Appl Physiol.1996;80:261–70. Clarkson PME, Newham DJ.Association between muscle soreness, damage, and fatigue. Adv Exp Med Biol. 1995; 384:457-69.

*1

De acordo com: International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to Biomedical Journal: sample references. Avaliable from: http://www.icmje.org [2007 May 22]

Dubowitz V. Normal Muscle. In: 2nded.London:Editora Balliere Tindall Ervasti JM e Campbell KP. A Role For The DystroTransmembrane Linker Between Laminin And Actin. J Feldman BJ, Streeper RS, Farese RV e Yamamoto KRgenerate adipocytes with favorable metabolic effects10.1073/pnas.0607501103. Friden J, Lieber RL. Structural and mechanical basis of eSports Exerc. 1992;24:521-530. Ferrel R,Conte V, Lawrence EC, Roth SM, Hagberg JThe Human Myostatin (Gdf-Genomics. 1999;62:203-207. Gilbert SF. Developmental Biology Gonzales-Cadavid NF, Taylor WE, Yarasheski K, et alAnd Expression InHealthy Men And Hiv43. GrobetL,MartinLJR, Poncelet D, Pirottin D, Brouwers B, Riquet JMénissier F, Massabanda Jcauses the double-muscled pheno71. Haidet AM, Rizo L, Handy C, Umapathi P, Eagle A, Shilling C, Boue D, Martin PT, Sahenk Mendell JR e Kaspar BK. Longgene administration of myostatin inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A10.1073/pnas.0709144105. Hamid Q, Shannon J, Martin J2005.793 p. Hawke TJ, Garry DJ. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. Journal of Applied Physiology.2001;91 Hebel R, Stromberg MW. Anatomy and embryology of the laborator1986;25-44. Heneike J, Auger-Messier M, Xu J, Sa Myostatin From the Heart Prevents Skeletal Muscle Atrophy in Heart Failure. Circulation121:419-25. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.109.882068.

Normal Muscle. In: Dubowitz V, Swery CA.Muscle Biopsy –Balliere Tindall; 1985.

A Role For The Dystrophin- Glycoprotein Complex As Aer Between Laminin And Actin. J Cell Biol. 1993;122:809

r RS, Farese RV e Yamamoto KR. Myostatin modulates adipogenesis togenerate adipocytes with favorable metabolic effects. PNAS. 2006;103(42):15675

Friden J, Lieber RL. Structural and mechanical basis of exercise-induced muscle injury. Med Sci530.

Ferrel R,Conte V, Lawrence EC, Roth SM, Hagberg JM, Hurley BF. Frequent Sequence Variation In-8) Gene As A Marker For Analysis Of Muscle Related Phenotypes.

207.

Gilbert SF. Developmental Biology. Sunderland: Sinauer Associates; 2000.

Taylor WE, Yarasheski K, et al. Organization of The Human MHealthy Men And Hiv-Infected Men With Muscle Wasting. Pnas.

GrobetL,MartinLJR, Poncelet D, Pirottin D, Brouwers B, Riquet J, Schoeberlein A, Dunner S,Ménissier F, Massabanda J, Fries R, Hanset R Georges M. A deletion in the

muscled phenotype in cattle. Nature Genetics. 1997;17:71

Haidet AM, Rizo L, Handy C, Umapathi P, Eagle A, Shilling C, Boue D, Martin PT, Sahenk Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single

ne administration of myostatin inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(11):4318

Hamid Q, Shannon J, Martin J. Physiologic basis of respiratory disease. Hamilton:

ogenic satellite cells: physiology to molecular biology. Journal of 91(2):534-51.

Stromberg MW. Anatomy and embryology of the laboratory rat. Wörthsee: BioMed Verlag,

Messier M, Xu J, Sargent M, York A, Welle S, Molkentin JD . Genetic Deletion oMyostatin From the Heart Prevents Skeletal Muscle Atrophy in Heart Failure. Circulation

: 10.1161/CIRCULATIONAHA.109.882068.

74

– A Practical Approach.

Glycoprotein Complex As A :809–23.

tatin modulates adipogenesis to 103(42):15675-80.doi:

induced muscle injury. Med Sci

Frequent Sequence Variation In s Of Muscle Related Phenotypes.

f The Human Myostatin Gene cle Wasting. Pnas. 1998;95:14938-

, Schoeberlein A, Dunner S, , Fries R, Hanset R Georges M. A deletion in thebovine myostatin gene

71-4.doi:10.1038/ng0997-

Haidet AM, Rizo L, Handy C, Umapathi P, Eagle A, Shilling C, Boue D, Martin PT, Sahenk Z, cle mass and strength by single

105(11):4318–22. doi:

Hamilton: BC Decker Inc.;

ogenic satellite cells: physiology to molecular biology. Journal of

y rat. Wörthsee: BioMed Verlag,

Welle S, Molkentin JD . Genetic Deletion o Myostatin From the Heart Prevents Skeletal Muscle Atrophy in Heart Failure. Circulation. 2010;

75

HittelDS, Berggren JR, Shearer J, BoyleK, Houmard JA. Increased Secretion and Expression of Myostatin in Skeletal Muscle From Extremely Obese Women. Diabetes. 2009;58(1):30-8.doi: 10.2337/db08-0943. Ho M, Post CM, Donahue Lr, Lidov HGW, Bronson RT, Goolsby H, Watkins SC, Cox GA, Brown RH . Disruption Of Muscle Membrane And Phenotype Divergence In Two Novel Mouse Models Of Dysferlin Deficiency.Human Molecular Genetics. 2004;13(18):1999-2010; Doi:10.1093/Hmg/Ddh212. Jackson Laboratories.Jax Mice Database. Available from:http://www.jaxmice.jax.org/ [2011 Jan 10]. Johnson GB, Raven PH. Biology.6thed.NewYork: McGraw Hill; 2002. Rouger K,Cunff ML, Steenman M,Potier MC,Gibelin N,Dechesne CAe Leger JJ. Global/temporal gene expression in diaphragm and hindlimb muscles of dystrophin-deficient (mdx) mice.Am J CellPhisiol.2002;238(3):773-84.doi:10.1152/ajpcell.00112.2002. Khurana TS, Davies KE. Pharmacological Strategies For Muscular Dystrophy Nature Reviews 2003;2:379-390. Langley B, Thomas M, Bishop A, Sharma M, Gilmour S,Kambadur R. Myostatin inhibits myoblast differentiation by downregulating MyoD expression. J Biol Chem. 2002;277:49831–40. Lee S, Mcpherron A. Regulation Of Myostatin Activity And Muscle Growth. Pnas.2001;98(16):9306 -11. Lee SJ. Regulation Of Muscle Growth By Multiple Ligands Signaling Through Activin Type Ll Receptors. PNAS. 2005;102(50):18117-22. Li Z, Shelton GD, Engvall E. Elimination Of Myostatin Does Not Combat Muscular Dystrophy In Mice But Increases Postnatal Lethality. Am J Pathol. 2005;166(2):491-7. Louboutin JP, Fichter-Gagnepain V, Thaon D, Fardeau M. Morphometric analysis of mdx diaphragm muscle fibres. Comparison with hindlimb muscles. Neuromusc Disord. 1993;3:463–9. Magee TR, Artaza JN, Ferrini MG, et al. Myostatin short interfering hairpin RNA genetransfer increases skeletal muscle mass.The Journal of Gene Medicine.2006;8(9):1171-81. Manceau M, Savage K, Gros J, Thomé V, Marcelle C, Mcpherron A, Peterson B. Myostatin promotes the terminal differentiation of embryonic muscle progenitors. Genes Dev. 2008;22(5):668 -81. Martin PT. Dystroglycan glycosylation and its role in matrix binding in skeletal muscle.Glycobiology. 2003;13(8):55R-66R.

76

Matsakas A, Bozzo C, Cacciani N, Caliaro F, Reggiani C, Mascarello F, Patruno M. Effect of swimming on myostatin expression in white and red gastrocnemius muscle and in cardiac muscle of rats. Experimental Physiology.2006;91(6)983–94. Mchugh M. Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise. Scand J Med Sci Sports. 2003;13:88-97. Mcpherron A, Lawler A, Lee S. Regulation Of Skeletal Muscle Mass In Mice By A New Tgf-β Superfamily Member.Nature. 1997;387:83-90. Milazzotto MP. Uso de vetor lentiviral carreando shrna para knockdown do gene da miostatina na produção in vitro de embriõestransgênicos em bovinos. [tese (Doutorado em Biotecnologia)]. São Paulo: Universidade de São Paulo; 2006. Muntoni F, Voit T. The congenital muscular dystrophies in 2004: a century of exciting progress. Review. Neuromuscul Disord. 2004;14(10):635-49. Novina CD, Sharp PA. The RNAi revolution.Nature. 2004;430(6996):161-4.

Ohlendieck K, Campbell KP.Dystrophin-associated proteins are greatly reduced in skeletal muscle from mdx mice. J Biol Chem. 1991;273:5419-22. Onofre OliveiraPCG. Avaliação do padrão de degeneração e regeneração muscular em diferentes modelos murinos para distrofias musculares progressivas. [dissertação (Mestrado em Ciências)]. São Paulo: Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo;2009. Ozawa E, Yoshida M, Suzuki A, Mizuno Y, Hagiwara Y, Noguchi S.Dystrophin, dystrophin associated protein and dystrophinopathy Review. Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi. 1995;3:289-93. Page DL, Glenner GG. Social interaction and wounding in the genesis of spontaneous murine amyloidosis. Am J Pathol. 1972;67:555-70. Parsons SA, Millay DP, Sargent MA, McNally EM, Moletin JD. Age-dependent effect of myostatin blockade on disease severity in a murine model of limb-girdle muscular dystrophy. American Journal of Pathology. 2006;168:1975-85. Rando TA. The dystrophin-glycoprotein complex, cellular signaling, and the regulation of cell survival in the muscular dystrophies. Muscle Nerve. 2001;24:1575-94. Rodino-Klapac LR, Haidet AM, Kota J, Handy C, Kaspar BK, Mendell JR. Inhibition of myostatin with emphasis on follistatin as a therapy for muscle disease Muscle Nerve. 2009;39:283–96, Roth SM, Martel GF, Ferrel RE, et al. Myostatin Gene Expression Is Reduced In HumansWithHeavy-Resistance StrengthTraining: A Brief Communication. Exp Biol Med. 2003;228(6):706-9.

77

Sakuma K, Watanabe K, Sano M, et al. Differential Adaptation Of Growth And Differentiation Factor 8/Myostatin, Fibroblast Growth Factor 6 And Leukemia Inhibitory Factor In Overloaded, Regenerating And Denervated RatMuscles. Biochim Biophys Acta. 2000;1497:77-88. Sharma M, Langley B, Bass J, Kambadur R. Myostatin In Muscle Growth And Repair. Exerc Sport Sci Rev. 2001;29(4):155-8. Shelton DG, Engvall E. Canine And Feline Models Of Human Inherited Muscle Diseases. Neuromusc Disord. 2005;15,127-38. Shi Y, Massague J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus.Cell. 2003;113:685–700. Sicinski P, Geng Y, Ryder-Cook AS, Barnard EA, Darlison MG, Barnard PJ. The Molecular Basis Of Muscular Dystrophy In The Mdx Mouse. A Point Mutation.Science. 1989;244:1578-80. Stedman HH , Sweeney HL , Shrager JB , Maguire HC , Panettieri RA , Petrof B , Narusawa M, Leferovich JM , Sladky JT, Kelly AM. The Mdx Mouse Diaphragm Reproduces The Degenerative Changes of Duchenne Muscular Dystrophy.Nature. 1991;352:536-9. doi:10.1038/352536a0. Storer JB. Longevity and gross pathology at death in 22 inbred strains of mice. J Gerontol. 1966;21:404-9. Sumada Y, Bernier SM, Utani A, et al. Identification of a novel mutant transcript of laminin alpha 2 chain gene responsible for muscular dystrophy and dysmyelination in dy2J mice. Hum Mol Genet. 1995;4:1055-61. Suzuki T, Higgins PJ, Crawford DR. Reviews - Control Selection for RNA Quantitation. Biotechniques. 2000;29:332. Szabo G, Dallmann G, Muller G, Patthy L, Soller M, Varga LA.Deletion in the Myostatin gene causes the compact (Cmpt) hypermuscular mutation in mice. Mamm Genome. 1998;9:671–2. Thellin O, Zorzi W, Lakaye B. Housekeeping genes as internal standards: use and limits. Journal of Biotechnology. 1999;75:291-5. Thomas M, Langley B, Berry C, Sharma M, Kirk S, Bass J, Kambadur R. Myostatin, A Negative Regulator Of Muscle Growth, Functions By Inhibiting Myoblast Proliferation. J Biol Chem. 2000;275(51):40235-43. Tomé FMS, Evangelista T, Leclerc A, Sunada Y, Manole E, Estournet B, Barois A, Campbell KP, Fardeau M. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency.C R Acad Sci Paris. 1994;317:351-7. Urtizberea JA, Bassez G, Leturcq F, Nguyen K, Krahn M, Levy N. Dysferlinopathies. Neurol India 2008;56:289-97.Review Article. doi: 10.4103/0028-3886.43447.

78

Vainzof M, Ayub-Guerrieri D, Onofre PCG, Martins PCM, Lopes VF, Zilbersztajn D, Maia LS, Sell K, Yamamoto LU. Animal Models for Genetic Neuromuscular Diseases.J Mol Neurosci. 2008;34(3):241-8. Vainzof M, Moreira ES, Ferraz G, Passos-Bueno MR, Marie SK e Zatz M.Further Evidences For The Organization Of The Four Sarcoglycans Proteins Within The Dystrophin-Glycoprotein Complex. European Journal of Human Genetics. 1999;7(2):251-4. Vainzof M, Zatz M. Protein Defects In Neuromuscular Disease. Brazilian Journal Of Medical And Biological Research. 2003;36:523-55. Vilquin JT, Guerette B, Puymirat J, Yaffe D, Tome FM, Fardeau M, Fiszman M, Schwartz K, Tremblay JP. Myoblast transplantations lead to the expression of the laminin alpha 2 chain in normal and dystrophic (dy/dy) mouse muscles. Gene Ther. 1999;6(5):792-800. Vilquin JT, Vignier N, Tremblay JP, et al. Identification of homozygous and heterozygous dy2J mice by PCR.Neuromuscul Disord. 2000;10(1):59-62. Wagner KR, Fleckenstein JL, Amato AA, et al. A phase I/IItrial of MYO-029in adult subjects with muscular dystrophy. Annals of Neurology.2008.Inpress.

Wagner KR, McPherron AC, Winik N, Lee SJ. Loss of myostatin attenuates severity of muscular dystrophy in mdx mice. Ann Neurol. 2002;52:832-6. Wehling M, Cai BE Tidball JG. Modulation of Myostatin Expression During Modified Muscle Use. The Faseb Journal. 2000;14:103-10. Wolfman NM, McPherron AC, Pappano WN, Davies MV, Song K, et al. Activation of latent myostatin by the BMP-1/tolloid family of metalloprotei-nases. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100: 15842–6. Yablonka-Reuveni, Z., Day, K., et al. (2008)."Defining the transcriptional signature of skeletal muscle stem cells."J Anim Sci.86(14 Suppl):E207-16. Yamanouchi K, Soeta C, Naito K, Tojo H. Expression Of Myostatin Gene In Regenerating Skeletal Muscle Of The Rat And Its Localization Biochem Biophys Res Commun. 2000;13;270(2):510-6. Zhaoa B, Wallb RJ e Yanga J. Transgenic expression of myostatin propeptide prevents diet-induced obesity and insulin resistance. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005; 337(1):248-55.doi:10.1016/j.bbrc.2005.09.044. Zatz M. Distrofias Musculares Progressivas. In: Carakushansky G, editor. Doenças genéticas em pediatria. Rio de Janeiro: Guanabara – Koogan; 2001. p. 245-60. Zimmers TA, Davies MV, Koniaris LG, Haynes P, Esquela AF ,Tomkinson KN, Mcpherron AC, Wolfman NM, Lee SJ. Induction of cachexia in mice by systemically administered myostatin. 2002;

79

296(5572):1486-8. Doi: 10.1126/Science.1069525.