Dipartimento di Scienze Biomediche e Neuromotorie ... · hanno precorso le attuali conoscenze, anche se poi la ricerca ha seguito altre strade . ... più presente in biologia a sostituire

G. Lenaz, personal communication, May 2016

Diapositiva 1

COENZYME Q AND RESPIRATORY

SUPERCOMPLEXES:PHYSIOLOGICAL AND PATHOLOGICAL

IMPLICATIONS

Giorgio Lenaz, Gaia Tioli, Maria Luisa Genova

Dipartimento di Scienze Biomediche e Neuromotorie Università di Bologna

Anna Falasca

Dip. Di Farmacia, Università di Parma

Riunione Gruppo Membrane SIB

Milano 30 maggio 2016

Diapositiva 2

Cenni storici sulla catena

respiratoria• Come spesso accade, lo sviluppo di nuove scoperte, anziché

chiarire definitivamente l’argomento, può portare a incertezze e

controversie scientifiche. E’ questo il caso della scoperta dei super-

complessi respiratori e delle polemiche sulla loro funzione . A

questo proposito è quanto mai indicato fare un breve excursus

storico sulla catena respiratoria, poiché alcune scoperte del passato

hanno precorso le attuali conoscenze, anche se poi la ricerca ha

seguito altre strade.

• La prima reale comprensione della catena respiratoria si deve a

Britton Chance negli anni ‘50.

• Nei primi anni ’50, scoperto da poco che la respirazione avviene nei

mitocondri (Lehninger AL. e Kennedy AP, J.Biol.Chem 173:753,

1948), Chance ha rappresentato la catena come una serie di

coenzimi redox immersi in una matrice proteica, che trasportano gli

elettroni dai substrati all’ossigeno (Fig. 4). Si noti l’ordine inusuale

della catena che parte dall’ossidante, anziché dal substrato, come

oggi si preferisce.


Diapositiva 3

Diapositiva 4

217(1):429-38

The respiratory chain is a series of redox carriers in a protein matrix


Diapositiva 5

Alcuni anni dopo David Green iniziò i suoi studi sul frazionamento dei

mitocondri.

Diversamente da Chance che era uno spettroscopista e lavorava su

sistemi intatti, Green era un enzimologo e biochimico delle proteine, e

così iniziò a frazionare la catena respiratoria usando metodi innovativi

con l’uso di detergenti per separare le insolubili proteine di membrana.

In tal modo Youssef Hatefi nel laboratorio di Green poté isolare 4

distinti complessi enzimatici (da I a IV) che catalizzano le tappe

separate della catena e utilizzano come substrati coenzimi solubili

(Coenzima Q e citocromo c) (Fig. 7). Uno di essi è appunto il

Coenzima Q, appena scoperto da Fred Crane nel 1957 nel laboratorio

di Green.

Il 50° anniversario della scoperta di Crane fu celebrato nel 2007 a

Kobe durante il congresso della International CoQ10 Association (Fig.

8).

Nel suo lavoro originale (Fig. 9) Crane riporta le proprietà

spettroscopiche del nuovo coenzima e la sua funzione nella catena

respiratoria.

Diapositiva 6


Diapositiva 7

The respiratory chain is composed of

discrete enzyme units that can be

isolated and reconstituted

Diapositiva 8

Fred Crane

50° anniversary of the discovery of

Coenzyme Q, Kobe 2007


Diapositiva 9

A mobile redox

component:

Coenzyme Q

Diapositiva 10

Qualche anno dopo, mentre mi trovavo come post-doc

nel laboratorio di Green, ho iniziato a lavorare sul CoQ

insieme a Karl Folkers, che è poi divenuto il più fervente

propugnatore di questa molecola in campo medico.

Da allora il ruolo del CoQ nella catena respiratoria è

stato uno dei miei principali interessi scientifici.


Diapositiva 11

Arch Biochem Biophys. 1968 Mar 11;123(3):539-50.

Organic structural specificity and sites of coenzyme Q

in succinoxidase and DPNH-oxidase systems.

Lenaz G, Daves GD Jr, Folkers K.

Diapositiva 12

Lo schema in Fig. 13 mostra il quadro emergente dagli studi di Green,

che riassume le conoscenze intorno al 1966: 4 principali complessi

respiratori collegati da due trasportatori mobili (CoQ e cit.c)

Gli studi enzimologici di Green e l’approccio cinetico di Kroeger A e

Klingenberg M (Eur J Biochem 39:313,1973), in presenza del modello

del mosaico fluido di membrana di Singer SJ e Nicolson GL (Science,

175:720, 1972), universalmente accettato, consentirono a Charlie

Hackenbrock di postulare il “Random Collision Model” della catena

respiratoria (Fig. 14).

La figura successiva (Diap. 15) mostra il sistema della fosforilazione

ossidativa come descritto nel 2000, che mostra anche la struttura

cristallografica dei complessi, eccetto il Complesso I che fu delucidata

nel 2012. Si vede anche che l’energia del trasporto degli elettroni è

raccolta come gradiente protonico che è usato dall’ATP sintasi per

sintetizzare ATP.


Diapositiva 13

D.E. Green and A. Tzagoloff 1966 Arch Biochem Biophys 116:293

Green: The respiratory chain is composed of 4 major enzyme complexes

connected by diffusable intermediates: CoQ and cyt. c

Diapositiva 14


Diapositiva 15

The oxidative phosphorylation system

Diapositiva 16

Una nuova comprensione della

biologia e in particolare anche

della bioenergetica deriva da

un approccio olistico sempre

più presente in biologia a

sostituire il precedente

approccio riduzionistico: sono

le interazioni fra molecole e

sistemi a determinare la

funzione (v. Fig. 17).


Diapositiva 17

A new understanding of mitochondrial bioenergetics derives from a progressive

holistic approach to biology

Diapositiva 18

RESPIRATORY CHAIN

SUPERCOMPLEXES

A revolution in the understanding of

the respiratory chain?

E’ stato questo approccio che ha permesso di scoprire i

super-complessi respiratori intorno al 2000.


Diapositiva 19

I supercomplessi erano già noti

negli anni ‘60?• In realtà i super-complessi erano già stati descritti e se ne era anche

compresa la funzione, ma forse l’approccio riduzionistico di allora ha

impedito di comprenderne l’importanza. Infatti Hatefi già nel 1961

aveva isolato una NADH cit.c reduttasi, che oggi potremmo definire

Super-complesso I-III (Fig. 20).

• E aveva compreso che da essa si potevano separare due complessi

singoli (I, NADH-CoQ reduttasi e III, CoQH2-cit.c reduttasi) (V. Fig.

21).

• E infine i complessi isolati potevano essere ricostituiti in proporzioni

ben definite a riformare l’intera catena respiratoria (Fig. 22). Dunque

i complessi respiratori si associano in modi ben precisi e capaci di

assicurare il trasporto di elettroni da NADH a ossigeno. Tuttavia,

come abbiamo visto, queste conoscenze non hanno impedito la

proposta e l’accettazione del Random Collision Model.

Diapositiva 20

This is a supercomplex comprising Complex I and Complex III !!


Diapositiva 21

Diapositiva 22


Diapositiva 23

Solamente nel 2000 Hermann Schägger

usando Blue Native PAGE riuscì a dimostrare

bande elettroforetiche ad alto peso molecolare

contenenti proporzioni diverse dei complessi

individuali (Schägger H, Pfeiffer K, EMBO J

17:1777-83, 2000) . Con questa tecnica,

utilizzando anche elettroforesi denaturante

nella seconda dimensione, si possono vedere

SuperComplessi in BHM (mitocondri di cuore

bovino), RLM (mitocondri da fegato di ratto),

POM (mitocondri da tubero di patata) etc. (Cf

Fig. 24)

Diapositiva 24

G. Lenaz et al. Biochim. Biophys. Acta. (2010) 1797:633-640

Detection of supercomplexes in mitochondria from different origins


Diapositiva 25

Il principale SC in cuore bovino è I1III2IV1 che

mostra la seguente struttura ricostruita in imaging

da microscopia elettronica (Fig. 26). Dalla struttura

cristallografica nota è possibile ottenere un modello

che mostra anche le distanze relative fra i

trasportatori redox dei singoli complessi. Si può così

osservare che CoQ e cit.c si trovano inseriti nei SC

a distanze compatibili col trasporto diretto degli

elettroni tra i rispettivi complessi partner.

Diapositiva 26

Picture taken from Vonck & Schäfer BBA - Molecular Cell Research 1793 (2009)

Respirasomes

Functional combinations of two or

more electron-transfer complexes.

The respiratory complexes tightly associate with each other

in the inner membrane of the mitochondrion.


Diapositiva 27

SUPERCOMPLEX

ORGANIZATION CONFERS A

KINETIC ADVANTAGE

Substrate channeling in the CoQ region

Ma i SC sono veramente funzionali? La prima idea che è stata

proposta dagli scopritori è che la vicinanza dei gruppi redox

conferisce un vantaggio cinetico tramite un meccanismo definito

channeling.

Diapositiva 28

This has been the first demonstration that supercomplexes are functional

in intact membranes and the only demonstration not involving detergents

La prima dimostrazione che i SC conferiscono proprietà cinetiche particolari

deriva da studi compiuti nel 2003 nel nostro laboratorio mediante analisi di

flusso metabolico e pubblicati in questo lavoro.


Diapositiva 29

Questa analisi studia le tappe limitanti in una via metabolica: la

tappa limitante è quella che impone il flusso dell’intera via

metabolica, perché catalizzata da un enzima presente in quantità

minori o meno attivo. Osservando l’effetto di un inibitore sul

singolo enzima e sull’intera via possiamo dire che l’enzima è

limitante se l’inibitore inibisce allo stesso modo la singola tappa e

l’intera via. Il coefficiente di controllo di flusso (CCF) è il rapporto

tra le due inibizioni: se la tappa è totalmente limitante il CCF è 1.

Può essere che più tappe condividano il controllo, ma comunque

la somma dei CCF deve essere 1.

Nella catena respiratoria, in assenza di vincoli aggiuntivi (come

il potenziale di membrana, la sintesi di ATP, l’ossidazione e

trasporto dei substrati) la tappa limitante si considera il

Complesso I. Ciò viene espresso da un CCF di 1. In altre parole

l’inibizione del CI determina una pari inibizione dell’intera catena

respiratoria.

Diapositiva 30

Da ciò si evince il razionale della nostra ricerca: se la via

metabolica (la catena respiratoria) è costituita di enzimi

separati (i singoli complessi) e comunicanti tramite diffusione

e collisioni casuali, ci sarà una tappa limitante e la tappa

limitante avrà un CCF di 1 (o comunque se ci sono più tappe

che condividono il controllo, la somma dei CCF sarà 1). Se

invece i complessi sono uniti in forma di SC con channeling

obbligato tra i complessi comunicanti, l’inibizione di ognuno di

essi inibirà allo stesso modo l’intera respirazione, e la somma

dei FCC sarà superiore a 1.


Diapositiva 31

Ciò si vede da questo schema (Fig. 32): il SC

(schema in basso) si comporta come un unico

enzima, che può essere inibito in più punti, ma

con lo stesso risultato sull’intera respirazione.

Diapositiva 32

Respiratory

complexes

Respirasome

e-

e-

e- e-

G. Lenaz and M.L. Genova, Am J. Physiol 2007

Primary function of supercomplexes: substrate channeling


Diapositiva 33

Riassumo il lavoro del 2004 con questi grafici soglia (Fig.

34), in cui il CCF è espresso valutando il calo della

respirazione totale in funzione del grado di inibizione di

ciascun complesso. Un grafico lineare indica un CCF di

1. Come si vede, nella ossidazione del NADH il CI e CIII

sono ugualmente limitanti, ma non il CIV, indicando che

CI e CIII si comportano come un unico enzima, mentre

CIV è separato funzionalmente. Nell’ossidazione del

succinato invece solo il CII è limitante, indicando che tra

II e III opera il pool del CoQ nella membrana come

agente diffusibile.

Diapositiva 34

Bianchi C., Genova M.L., Parenti Castelli G. and Lenaz G. (2004) J. Biol. Chem. 279, 36562-36569

0

50

100

0 50 100

% Complex IV inhibition

% N

AD

H o

xidase

activi

ty

cyanide titration

0

50

100

0 50 100

% Complex III inhibition

% N

AD

H o

xida

se a

ctivi

ty

mucidin titration

0

50

100

0 50 100

% Complex I inhibition

% N

AD

H o

xid

ase

activi

ty

rotenone titration

NADH oxidase

0

50

100

0 50 100


% s

uccin

ate

oxi

dase a

ctivi

ty

cyanide titration

0

50

100

0 50 100

% Complex II inhibition

% s

uccin

ate

oxi

da

se

activity

carboxin titration

0

50

100

0 50 100


% s

uccin

ate

oxi

dase a

ctivi

ty

mucidin titration

Succinate oxidase

Threshold plots of NADH oxidase and Succinate oxidase activity in

SMPBHM


Diapositiva 35

Per valutare il ruolo del CoQ in relazione ai SC

abbiamo utilizzato proteoliposomi contenenti CI,

CII e CIII (La fig. 36 mostra la preparazione dei

rpoteoliposomi).

Con BN-PAGE 2D abbiamo dimostrato che i

proteoliposomi a basso contenuto di lipidi

contengono SC, mentre ad alti lipidi i complessi

sono separati (Fig. 37). Qui p.es. con proteina :

lipidi 1:1 e 1:30 il Complesso I libero è

rispettivamente 8 e 76% rispetto al CI totale.

Diapositiva 36

Supercomplex I+III in R4B proteoliposomesComplex I and Complex III enriched fraction (R4B) from bovine heart mitochondria

(Hatefi & Rieske, Methods Enzymol 10: 235 – 239, 1967)

incorporated in phospholipid membranes at different protein:lipid ratios + Coenzyme Q10


Diapositiva 37

20

30

40

CI CIII

1D BN-PAGE

III

I

2D

SD

S-P

AG

EMW

(kDa)

Protein:PL 1:1 1:30

III

I

SC CI CIII

1D BN-PAGE

2D

SD

S-P

AG

E

20

30

40

MW

(kDa)

SC

Mitochondrial fraction (R4B) at different protein:phospholipid ratios

Complex I free/total = 8% vs. 76%

Diapositiva 38

Questa tabella (Fig. 39) mostra le velocità

effettive di NADH cit. c reduttasi confrontate con

quelle teoricamente calcolate dall’equazione di

Kroeger e Klingenberg per un pool omogeneo.

Come si vede, ad alto contenuto di lipidi i valori

sperimentali (NADH cyt.c) sono molto simili a

quelli teorici (Vobs), mentre per basso

contenuto di lipidi i valori sperimentali sono

superiori a quelli teorici, indicando un vantaggio

cinetico rispetto alla semplice diffusione .


Diapositiva 39

KINETIC ADVANTAGE OF SUPERCOMPLEX ASSOCIATION

Diapositiva 40

CINETICA DI SATURAZIONE

• La cinetica dell’attività respiratoria è stata

studiata in mitocondri depletati di CoQ

mediante estrazione con solventi e

ricostituiti con diversi livelli di CoQ. La

velocità di respirazione in funzione della

concentrazione di CoQ è una tipica

cinetica di saturazione, che risponde

all’equazione di Michaeelis-Menten (Fig.

41): come si spiega ciò, se il CoQ è

inserito in un SC?


Diapositiva 41

NADH CYTc REDUCTASE: SATURATION KINETICS OF COENZYME Q

in R4B-1:1 proteoliposomes

IS SATURATION KINETICS COMPATIBLE WITH SUPERCOMPLEX ASSEMBLY?

Diapositiva 42

Equilibrio di dissociazione

• La spiegazione è che il CoQ inserito nel

SC è in equilibrio dinamico col CoQ libero,

ma con costanti cinetiche più lente che per

il trasporto di elettroni tra I e III, per cui a

tempi lunghi il CoQ legato è funzione della

concentrazione di CoQ libero nel pool (Fig.

43). Questo spiega la cinetica di

saturazione in esperimenti di ricostituzione

e spiega perché l’aggiunta di CoQ

esogeno aumenta la respirazione.


Diapositiva 43

How CoQ pool can be reconciled with

channeling in the supercomplex

Possible mechanism for the dissociation equilibrium of the bound intercomplex quinone with the Coenzyme Q pool.

Kinetic evidence for intermediate channeling in the I-III supercomplex requires the dissociation rate constants of ubiquinone

(Q) and ubiquinol (QH2) to be considerably slower than the rates of electron transfer via the same quinone molecules bound to

the supercomplex. Quinone interactions with Complex II are assumed to follow pool behavior.

Lenaz G. and Genova M.L. (2007) Am J Physiol Cell Physiol 292, C1221-39.

Diapositiva 44

Schema di catena respiratoria

• I dati a disposizione ci permettono di

formulare questo schema (Fig. 45) in cui

CI e CIII formano sempre un SC

funzionale, mentre tra III e IV il citocromo c

sembra non funzionare col meccanismo di

channeling in maniera prevalente (Genova

ML, Lenaz G, Biol. Chem. 394:631-39,

2013; BBA 1837:427-42, 2014).


Diapositiva 45

Diapositiva 46

PLASTICITY MODEL (Enriquez 2008)

• Supercomplexes are in reversible

equilibrium with individual complexes.

Both states are functional and depend on

the physiological conditions (Acin-Perez et

al, Mol. Cell 32:529-539, 2008)


Diapositiva 47

Il laboratorio di Judy Hirst a Cambridge ha

recentemente criticato l’evidenza a favore del

channelling (Fig. 48).

• I principali argomenti addotti contro il channeling sono I

seguenti: 1. I coefficienti di flusso del Complesso I sono

falsati dal fatto che il rotenone, usato per inibire il CI, è

competitivo col CoQ. 2. La simultanea ossidazione di

NADH e succinato non è additiva, sia nell’ossidazione

aerobica in stato stazionario, sia monitorando la

riduzione dei citocromi endogeni.

Diapositiva 48

PNAS 111, 5735-40, 2014


Diapositiva 49

La riduzione dei citocromi viene studiata obbligatoriamente

in presenza di KCN o altro inibitore, per cui il channelling

(millisecondi) viene abolito e il CoQ subisce la più lenta

dissociazione nel pool (secondi) dove può ridurre gli stessi

citocromi in complessi diversi (V. Fig. 43).

Per quanto riguarda l’ossidazione aerobia questa è falsata

dal fatto che il citocromo c , come abbiamo dimostrato, si

comporta prevalentemente come pool libero. Per cui i

flussi da NADH e da succinato si omogenizzano a livello

del citocromo c (Fig. 50 B e C).

Spiegazione dei risultati di Blaza et al

(Lenaz et al BBA 1857:991-1000, 2016)

Diapositiva 50

Studying NADH + succinate oxidation by O2 involves mixing the fluxes

at the cyt. c pool


Diapositiva 51

Studiando infatti la riduzione del citocromo c

esogeno da parte di NADH e succinato aggiunti

simultaneamente sia in particelle

submitocondriali (SMP) che in un sistema

ricostituito di proteoliposomi (R4B), abbiamo

trovato additività quasi completa (Tab in Fig

52). In queste condizioni l’unico pool possibile

è quello del CoQ, quindi la additività delle

velocità da NADH e da succinato può solo

spiegarsi con l’esistenza di due compartimenti

separati di CoQ. Il compartimento per il

succinato è il pool libero di CoQ, mentre quello

per il NADH è CoQ legato nel supercomplesso.

Diapositiva 52

ADDITIVITY OF NADH- AND SUCCINATE-CYTOCHROME C REDUCTASE

Vexp, experimental values

Vadd, arithmetical sum

Vpool, rate calculated according to the

equation of a single homogeneous CoQ pool


Diapositiva 53

Controllo di flusso

• Per quanto riguarda i Coefficienti di controllo di flusso , i

risultati della Hirst sembrano dovuti alla scarsa quantità

di citocromo c, che rende limitante l’ultima tappa rispetto

al Complesso I; se viene aggiunto cit. c, il CCF del

Complesso I aumenta significativamente (Fig. 54).

• Ma il nostro risultato principale è l’alto

CCF del Complesso III, che la Hirst non ha

studiato! Si veda il plot indicato con la

freccia nella Fig. 55!

Diapositiva 54

Low flux control coefficients in Hirst’s experiments are due to low

cytochrome c, becoming rate-limiting with respect to Complex I


Diapositiva 55

Bianchi C., Genova M.L., Parenti Castelli G. and Lenaz G. (2004) J. Biol. Chem. 279, 36562-36569

0

50

100

0 50 100


% N

AD

H o

xid

ase

activi

ty

cyanide titration

0

50

100

0 50 100


% N

AD

H o

xid

ase a

ctivi

ty

mucidin titration

0

50

100

0 50 100

% Complex I inhibition

% N

AD

H o

xid

ase

activi

ty

rotenone titration

NADH oxidase

0

50

100

0 50 100


% s

uccin

ate

oxi

dase a

ctivi

ty

cyanide titration

0

50

100

0 50 100

% Complex II inhibition

% s

uccin

ate

oxi

dase a

ctivity

carboxin titration

0

50

100

0 50 100


% s

uccin

ate

oxi

dase a

ctivi

ty

mucidin titration

Succinate oxidase

Threshold plots of NADH oxidase and Succinate oxidase activity in

SMPBHM

Diapositiva 56

CONCLUSIONS

Electron transfer from NADH operates via

channelling in the CoQ region.

Electron transfer from succinate and other

donors operates through the CoQ pool.


Diapositiva 57

I SC sono anche implicati nel controllo

della produzione di ROS. Da tempo

abbiamo formulato un’ipotesi di lavoro su

questa importanza dei SC.

SUPERCOMPLESSI E ROS

Diapositiva 58

A WORKING HYPOTESIS

LINKING TOGETHER

SUPERCOMPLEX

ORGANIZATION, ROS AND

PATHOLOGICAL CHANGES

G. Lenaz, M.L. Genova,

Antioxid. Redox Signal. 12, 961-1008 (2010)


Diapositiva 59

Mitocondri e ROS

• La catena respiratoria è uno dei principali

produttori di ROS nelle cellule, soprattutto

i Complessi I e III, ma anche altri

componenti (Glicerolo P deidrogenasi,

Complesso II, diidroorotato deidrogenasi,

ETF deidrogenasi…).(Cf Lenaz G, Genova

ML, Antiox Redox Signal 23:208-38, 2015)

Diapositiva 60

Major sources of ROS in the respiratory chain


Diapositiva 61

Effetti cellulari dei ROS

• Gli effetti cellulari dei ROS dipendono

dalla loro concentrazione: a bassa

concentrazione fungono da segnali

cellulari, a concentrazione maggiore sono

segnali favorenti la proliferazione cellulare,

a concentrazioni ancora superiori

danneggiano irreversibilmente le

macromolecole e inducono morte

cellulare.

Diapositiva 62

Various levels of ROS will induce different cellular responses

ROS promote intracellular signaling, in part, by the oxidative inactivation of phosphatases

downstream of growth factor- and insulin-mediated receptor activation.

Handy D.E and Loscalzo J. (2012) Antioxid. Redox Signal. 16:1323–1367


Diapositiva 63

Circolo vizioso

• La nostra ipotesi formula la possibilità di innescare un circolo

vizioso, in cui uno stress ossidativo induce una perdita

dell’organizzazione in SC, che a sua volta determina un ulteriore

stress ossidativo.

• Questa ipotesi è basata su evidenza sperimentale: 1. I ROS

attraverso la perossidazione lipidica inducono la perdita

dell’organizzazione in SC ; 2. La dissociazione dei SC aumenta la

produzione di ROS; 3. La dissociazione dei SC attraverso i ROS

induce la perdita del Complesso I. 4. Gli stati patologici in cui

aumentano i ROS sono accompagnati da dissociazione dei SC.

Diapositiva 64

VICIOUS CIRCLE

INEFFICIENT ELECTRON TRANSFER

Complex I destabilisationand increase of

superoxide production

DECREASED OXPHOS

Membrane lipid peroxidation

LOSS OF

SUPERCOMPLEX

ORGANISATION

OXIDATIVE

STRESS

METABOLIC SIGNALLING


Diapositiva 65

La perossidazione dei lipidi porta a

dissociazione dei SC. Ciò è stato

verificando usando lipidi perossidati con

un iniziatore radicalico per formare i

proteoliposomi: in questo caso il CCF del

CIII diminuisce drasticamente indicando

che il SC è dissociato.

Diapositiva 66

Lenaz G and Genova ML. (2009) Int J Biochem Cell Biol. 41:1750-1772.

1.The maintenance of the supercomplex I1III2

in R4B proteoliposomes at high protein to

lipid ratios (1:1) is abolished if lipid

peroxidation is induced by 2,2’-azobis-(2-

amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)

prior to reconstitution.


Diapositiva 67

D’altro canto, la presenza dei SC limita la

produzione di ROS

(Maranzana E. et al Antiox. Redox Sign.

19:1469-80, 2013)

Per esempio in mitocondri la dissociazione

dei SC con detergente DDM aumenta la

produzione di ROS dal Complesso I.

Diapositiva 68

SUPERCOMPLEX I1III2 ORGANIZATION LIMITS

ROS PRODUCTION

Q

NADH

C

QH2

Q

NADH O2-.

O2-.

C

Q

Maranzana E, Barbero G, Falasca AI, Lenaz G, Genova ML (2013) Antioxid. Redox Signal. 19: 1469-1480


Diapositiva 69

Supercomplex I1III2IV1 in bovine heart mitochondria (BHM)

Complex I free/total = 13% vs. 98%

1D BN-PAGE

2D

SD

S-P

AG

E

IV

I

II

I

III

V

20

30

40

5060

I

IVIII2III2IV1

I1III2IV1

MW

(kDa)

control

I

II

IVI

V III

20

30

40

5060

MW

(kDa)

1D BN-PAGE

2D

SD

S-P

AG

E

IVIII2IV1

I

III2

DDM-treated

Diapositiva 70

Supercomplex I+III in bovine mitochondria

DDM - treated BHM show an

enhanced ROS production

mediated by Complex I

0

100

200

300

400

Media

DC

FD

A (

FU

) / C

om

ple

x I

acti

vit

y (

%)

BHM BHMDDM-treated

ROS production(Hydrogen peroxide)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Control DDM

NA

DH

-cy

toc

hro

me c

oxid

ore

du

cta

se a

cti

vit

y

BHM BHMDDM-treated

Complex I+III activity

(m

ol

NA

DH.m

in-1

.mg

-1pro

tein

)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

Control DDM

NA

DH

-ub

iqu

ino

ne

oxid

ore

du

cta

se

acti

vit

y

Complex I activity

(m

ol

NA

DH.m

in-1

.mg

-1pro

tein

)

BHMDDM-treated

BHM


Diapositiva 71

Infine vediamo che in fibroblasti

trasformati con k-Ras si ha aumento

di ROS e insieme dissociazione dei

SC (Baracca et al BBA 2010, Lenaz

et al BBA 2010).

Diapositiva 72

K-Ras cells exhibit enhanced ROS formation and

lose supercomplex organization

G. Lenaz et al. Biochim. Biophys. Acta. (2010)


Diapositiva 73

EXPECTED KINETICS

Cytochrome b reduction

Two separate pools One homogeneous pool

Diapositiva 74


Diapositiva 75

Possible mechanism for the dissociation equilibrium of the bound intercomplex quinone with the Coenzyme Q pool.

Kinetic evidence for intermediate channeling in the I-III supercomplex requires the dissociation rate constants of ubiquinone

(Q) and ubiquinol (QH2) to be considerably slower than the rates of electron transfer via the same quinone molecules bound to

the supercomplex. Quinone interactions with Complex II are assumed to follow pool behavior.

Lenaz G. and Genova M.L. (2007) Am J Physiol Cell Physiol 292, C1221-39.

Inhibitor

When electron flow is inhibited between complex III and

oxygen, dissociation of CoQ in nthe pool becomes prevalent

Diapositiva 76

0,00

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

Substrate: SuccinateSubstrates: Glutamate-Malate

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Normal K-Ras Normal K-Ras

nm

ol/

min

/mg

/CS

nm

ol/

min

/mg

/CS

-53 %

ATP synthesis rate in permeabilised cells cultured in 25 mM glucose

A. Baracca, F. Chiaradonna, G. Sgarbi, G. Solaini, L. Alberghina,

G. Lenaz, Biochim. Biophys. Acta 1797, 14-23 (2010)

5. K-Ras cells have decreased ATP synthesis

with NAD-linked substrates


Diapositiva 77

0

200

400

600

800

1000D

CF

(F

U)

/ C

om

ple

x I a

ctivity (%

)

DDM-treated samples of R4B 1:1 show enhanced ROS

production mediated by Complex I

R4B 1:1 R4B 1:1DDM-treated

(4.3 g/g protein)

ROS production

Integrated NADH-cyt. c oxidoreductase activity is decreased by

disruption of supercomplex I1III2 in proteoliposomes

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Complex I+III activity

(m

ol

NA

DH.m

in-1

.mg

-1pro

tein

)

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

Complex I activity

(m

ol

NA

DH.m

in-1

.mg

-1pro

tein

)


NA

DH

-ubi

quin

one

oxid

ored

ucta

se a

ctiv

ity


NA

DH

-cyt

ochr

ome

c ox

idor

educ

tase

act

ivity

Diapositiva 78

ROS and mitochondrial

respiration

• I. Fridovitch (1969) Discovery of SOD

• A. Boveris, N. Oshino and B. Chance (1972)

Respiration generates H2O2

• G. Loschen, A Azzi, C. Richter and L. Flohé (1974)

Respiration generates superoxide (O2°-) that is

converted to H2O2


Diapositiva 79

Diapositiva 80

The production of hydrogen peroxide was detected after 45

minutes from NADH addition in the presence of 4 μM Rotenone

and 1.8 μM Mucidin. Data are expressed as relative

fluorescence intensity by DCF normalized against Complex I

activity and shown as percentage values of the reference

sample (i.e.R4B 1:1 in the presence of 1.8 μM Mucidin only).

ROS production(Hydrogen peroxide)

0

200

400

600

800

1000

1200

R4B 1:1 R4B 1:30

DC

F (

FU

) / C

om

ple

x I a

cti

vit

y (

%)

The production of superoxide is determined as the SOD-sensitive

rate of acetylated cytochrome c reduction after addition of NADH

in the presence of 4 μM Rotenone and 1.8 μM Mucidin.

Complex I free/total = 8% vs. 76% in 1:1 and 1:30, respectively.

(nm

ole

s·m

in-1

·mg

-1·m

g-1

pro

tein)

ROS production(Superoxide)

Rate

or

acety

late

d c

yto

ch

rom

e c

red

ucti

on

0

5

10

15

20

R4B 1:1 R4B 1:30

2. ROS generation is enhanced by disruption of

supercomplex I1III2

Maranzana E, Barbero G, Falasca AI, Lenaz G, Genova ML (2013) Antioxid. Redox Signal. 19: 1469-1480


Diapositiva 81

solubilized proteincomplexes

dodecyl- -D-maltoside (DDM)

Supercomplexdissociation

supercomplex(I1III2)

Complex I free/total = 8 %

Complex I free/total = 79 %

1:1

1:1 +DDM

Documents

Dipartimento di Scienze Biomediche e Neuromotorie ... · hanno precorso le attuali conoscenze, anche se poi la ricerca ha seguito altre strade . ... più presente in biologia a sostituire