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DISEÑO Y ELABORACIÓN DE UNA GUÍA PRELIMINAR
PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ESTÁN DAR
MARÍA ANDREA ORDOÑEZ PARRA
DIANA MARCELA ROJAS SALAZAR
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
MICROBIÓLOGAS INDUSTRIALES
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
Bogotá, D. C. Noviembre de 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1946
“ La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada
contrario al dogma y la moral católica y porque la tesis no contenga ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo por
buscar verdad y justicia”.
DISEÑO Y ELABORACIÓN DE UNA GUÍA PARA LA VALIDACIÓN
DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ESTANDAR
MARÍA ANDREA ORDOÑEZ PARRA
DIANA MARCELA ROJAS SALAZAR
APROBADO
_____________________ _____________________
Dra. LORENA VALENCIA Dr. SAUL PEÑARANDA
Directora Codirector
_____________________ _____________________
NADENKA MELO ANDRES OTALORA
Jurado Jurado
DISEÑO Y ELABORACIÓN DE UNA GUÍA PARA LA VALIDACIÓN
DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ESTANDAR
MARÍA ANDREA ORDOÑEZ PARRA
DIANA MARCELA ROJAS SALAZAR
APROBADO
_________________________ _____________________________
Dra ANGELA UMAÑA MUÑOZ, Dra. JANETH ARIAS PALACIOS
M. Phil Bacterióloga M.Sc-M Ed.
Decano Académico Facultad de Ciencias Director Carreras de Microbiología
A Dios por guiarme siempre por el mejor camino. A mi mamá por ser mi mejor ejemplo de lucha y constancia. A mi
hermana por impulsarme a ser cada vez mejor. A toda mi familia por apoyarme en mis decisiones y estar conmigo
siempre que los necesito. A mis amigos por su incondicional apoyo. A todos mil Gracias.
María Andrea Ordóñez Parra
GRACIAS a Dios por ser mi luz y mi fuerza cada día y por permitirme culminar esta etapa junto a las personas
que más amo. A mi mamá por brindarme lo mejor de sus días. A mi papá por cuidarme en cada instante de mi vida. A
mi hermana por enseñarme que la lucha constante nos hace grandes triunfadores. A mis hermanos porque son mi
alegría y mi compañía. Les quiero decir que son mi mayor motivo en la vida, lo más importante e indispensable para
mi. A Sergio Muñoz porque su amor me ha ayudado a superar los más difíciles obstáculos. A mis amigos por crecer
conmigo y enseñarme cada día cosas nuevas. A Maria Andrea por querer cumplir este gran logro junto a mi.
Dios los bendiga.
Diana Marcela Rojas Salazar
1
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Lorena Valencia por todo su apoyo y dedicación y por compartir todos sus
conocimientos para sacar este trabajo adelante.
Al Dr. Saúl Peñaranda por la paciencia y todo su aporte durante el desarrollo del
trabajo.
A todas las personas que de una u otra forma con su colaboración y amistad
incondicional participaron de la elaboración de este trabajo.
2
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN
1. MARCO TEORICO 9
1.1 ANTECEDENTES 9
1.2 TIPOS DE VALIDACIÓN SEGÚN SU OBJETIVO 14
1.2.1 Validación Primaria 14
1.2.2 Validación Secundaria 15
1.3 PARAMETROS ANALÍTICOS PARA LA VALIDACIÓN DE
UNA TÉCNICA O MÉTODO 16
1.3.1 Selectividad 16
1.3.2 Especificidad 16
1.3.3 Calibrado y Linealidad 17
1.3.4 Precisión 17
1.3.5 Solidez y Robustez 18
1.3.6 Exactitud 19
1.3.7 Estabilidad 19
1.3.8 Limite de Detección 19
1.3.9 Límite de Cuantificación 20
1.3.10 Sensibilidad 20
1.4 MÉTODOS DE ENSAYO MICROBIOLÓGICOS 20
1.4.1 Métodos de Ensayo Microbiológicos Cualitativos 23
1.4.2 Métodos de Ensayo Microbiológicos Cuantitativos 24
1.5 MEDICIÓN Y ERRORES 25
1.6 MATERIAL DE REFERENCIA 26
1.6.1 Cultivos de Referencia 26
1.6.2 Cepas de Referencia 26
3
1.7 REPRESENTATIVIDAD Y CANTIDAD SUFICIENTE DE
MUESTRAS 27
1.7.1 Recuperación del Analito 28
1.7.2 Material de Ensayo 29
1.7.3 Detectores 30
1.8 SISTEMAS DE GESTIÓN DE CALIDAD EN LABORATORIOS
DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO 32
1.8.1 Aseguramiento de la Calidad de los Resultados/ Control de
Calidad 33
1.8.2 Acreditación 36
2. FORMULACIÓN Y JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA 38
2.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 38
2.2 JUSTIFICACIÓN 39
3. OBJETIVOS 41
3.1 OBJETIVO GENERAL 41
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 41
4. MATERIALES Y MÉTODOS 42
4.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN 42
4.2 POBLACIÓN ESTUDIO DE MUESTRA 42
4.3 RECOPILACIÓN Y REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 42
4.4 DOCUMENTACIÓN DE PARÁMETROS DE VALIDACIÓN PARA
MÉTODOS Y ENSAYOS EN MICROBIOLOGÍA ESTÁNDAR 43
4.5 DESPLIEGUE MODELO MATEMÁTICO PRELIMINAR PARA
VALIDACIÓN DE PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS ESTÁNDAR 43
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 45
5.1 REVISIÓN BIBLIOGRAFICA 45
5.2 MODELO MATEMÁTICO PRELIMINAR BÁSICO PARA LA
VALIDACIÓN DE MÉTODO MICROBIOLÓGICOS ESTÁNDAR 51
6. CONCLUSIONES 55
7. RECOMENDACIONES 56
4
8. REFERENCIAS 57
ANEXOS
ANEXO 1. GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS ESTÁNDAR
5
LISTA DE FIGURAS
FIGURA TITULO PAG
1 Estadísticas de la Red de Laboratorios 48
2 Esquema de Validación de Métodos Microbiológicos 65
3 Procesamiento de la Muestra 77
LISTA DE TABLAS
TABLA TITULO PAG
1 Bibliografía para procesos de validación en microbiología
Estándar 45
2 Acreditaciones 2008-2012 47
3 Grupos de alimento analizados en el Laboratorio de
Salud Pública, grupo de Vigilancia del Ambiente y del
Consumo, años 1998 - 1999 – 2000 – 2001 –2002 49
6
RESUMEN
El propósito de este trabajo es brindar una guía práctica sobre la validación de
ensayos microbiológicos estándar, ya que éstos deben brindar certeza en los
resultados obtenidos, por lo que se hace necesaria la implementación de métodos que
al ser verificados y ajustados a ciertas condiciones generan confiabilidad y
competitividad.
Para llevar a cabo esta guía, se realizó una extensa revisión y recopilación
bibliográfica para obtener la mayor información posible sobre cómo validar técnicas
microbiológicas y poder abstraer un modelo preliminar de validación de los ensayos
estándar que se realizan en microbiología. A partir de la búsqueda, se inicio una
comparación de toda la información obtenida para diseñar el protocolo. Después de
la obtención del esquema práctico que incluye desde la toma de la muestra (muestreo)
hasta el procesamiento de la misma, se procedió a la consulta y diseño de un modelo
estadístico preliminar para determinar parámetros y variables a tener en cuenta para
llevar a cabo una validación.
Como resultado se obtuvo una guía en donde de forma clara, práctica y concisa se
orienta a la aplicación de conceptos básicos de la microbiología estándar y
herramientas estadísticas para determinar variables preliminares para la validación de
un ensayo estándar en microbiología.
Gracias a la realización de éste preliminar, se pudo concluir que a pesar de la gran
cantidad de información que existe sobre el tema, éste no es fácil de abordar ni de
aplicar, por lo que se hace necesario la realización de más estudios que permitan
explicar y desplegar de forma sencilla modelos matemáticos completos que le
permitan al usuario determinar variables claves para la validación de procesos
microbiológicos.
7
INTRODUCCION
En el mundo actual donde el interés de los laboratorios de las diferentes áreas de la
microbiología es mantener controladas todas las variables que intervienen en sus
procesos, tienen particular importancia los procesos de validación como una
herramienta útil para asegurar la trazabilidad de cada una de las variables que se ve
reflejada en los resultados de las pruebas realizadas. Adicionalmente, por
requerimientos de sus sistemas de calidad y para lograr el cumplimiento de los
requisitos derivados de las buenas prácticas de laboratorio; la validación actúa como
sistema de aseguramiento de la calidad mediante el cual se establecen evidencias
documentadas para demostrar que un proceso conduce a resultados de calidad
consistentes dentro de las especificaciones predeterminadas.
Sin embargo, la gran cantidad de documentación y las pocas referencias de
investigación sobre la validación de técnicas microbiológicas, hacen difícil la
aplicación y arduo el entendimiento de este tema en los diferentes procedimientos de
pruebas y ensayos.
En Colombia, programas como el INTERLABORATORIO y PICCAP, permiten a
través de diferentes análisis la estandarización de los procedimientos microbiológicos
que se realizan en los diferentes laboratorios participantes, más no se ejercen
mecanismos de vigilancia y control sobre los procedimientos de validación, a pesar
que muchos laboratorios se encuentran en capacidad de validar sus métodos para así
poder acreditarse. No obstante, el crecimiento en el sector industrial en Colombia,
hace que la demanda en cuanto a procedimientos con calidad aumente, y así mismo
deben aumentar los laboratorios acreditados que ofrezcan a partir de la validación de
sus métodos mejores resultados al cliente.
El propósito de este trabajo es inculcar la responsabilidad de los laboratorios con sus
rutinas de análisis microbiológicos y reducir la incertidumbre de las medidas
8
microbiológicas, lo cual se traduce en la exactitud de los resultados emitidos y la
fiabilidad de sus pruebas.
Los laboratorios de análisis tienen como principal objetivo reportar resultados
altamente confiables, por eso deben controlar y asegurar la calidad de sus resultados.
El mejoramiento de la calidad en el laboratorio consiste en implementar un programa
completo que vale el resultado final emitido por el laboratorio proporcionando
resultados útiles. Este mejoramiento, no solo incluye los conceptos más tradicionales
de control de calidad, como el mejoramiento y la evaluación externa de la calidad que
tiene como propósito mantener en cualquier proceso un rendimiento a niveles
aceptables según los estándares, sino que también incluye el mejoramiento continúo
de la calidad bajo el concepto de “calidad total”.
Con la elaboración de la guía se espera de manera práctica y pedagógica facilitar la
comprensión del proceso de validación en todas sus etapas analíticas en los
procedimientos microbiológicos estándar que se llevan a cabo dentro de los
laboratorios de pruebas y ensayos y de esta manera inculcar y difundir este tipo de
tareas en todas las áreas del laboratorio.
9
1. MARCO TEÓRICO
1.1 ANTECEDENTES
Se requieren métodos analíticos fiables para cumplir con las normativas nacionales e
internacionales en todas las áreas de análisis. Por lo tanto, está admitido
internacionalmente que un laboratorio deba tomar las medidas pertinentes para
asegurarse de que es capaz de producir, y de que lo hace efectivamente, datos con el
nivel necesario de calidad. Dichas medidas comprenden:
• Utilización de métodos de análisis validados
• Utilización de procedimientos internos de control de calidad
• Participación en ensayos de aptitud; y
• Obtención de la acreditación según una norma internacional, habitualmente
ISO/IEC 17025.
Cabe resaltar que la acreditación ISO/IEC 17025 concierne específicamente el
establecimiento de la trazabilidad de las mediciones, al tiempo que fija un conjunto
de otros requisitos técnicos y de gestión que incluyen todos los indicados
anteriormente. Así, la validación de métodos es un componente esencial de las
medidas que un laboratorio debe implementar para producir datos analíticos fiables.
Otros aspectos de lo anteriormente dicho han sido tratados por el Grupo de Trabajo
Interdivisional de la IUPAC sobre Armonización de Métodos de Garantía de Calidad
para Laboratorios Analíticos, en particular mediante la elaboración de protocolos
sobre los estudios de rendimiento de los métodos, ensayos de aptitud, y control
interno de calidad (OENO, 2005).
10
En los sistemas de calidad y en general en los sistemas de aseguramiento, lo que se
busca es que los laboratorios cumplan con los requerimientos mínimos necesarios
para asegurar que sus resultados ofrezcan confiabilidad y que las técnicas y/o ensayos
utilizados sean realizados de manera correcta, hecho que minimiza totalmente las
posibilidades de error. Como consecuencia se obtienen procesos controlados que
conllevan a resultados con calidad. Esto indica que la organización, en este caso
puntual, los laboratorios de microbiología trabajan con enfoques científicos
reconocidos, de consenso general y que cualquier desviación en estos puede ser
sustentada con fundamentos (validación) considerados aceptables por los expertos en
el área. Para llegar a obtener esos resultados confiables, debemos hablar de validación
de pruebas y/o ensayos que permitan que esos resultados sean reales y fiables.
(http://www.ideam.gov.co/temas/calidad/Descripci%C3%B3n%20Gral.%20Norma%
20ISO-IEC%2017025.pdf)
Además es importante que un laboratorio demuestre la capacidad para reproducir los
ensayos y/o pruebas que hace; ya que ésta indica que si en un ensayo se obtuvieron
resultados objetivos, en los ensayos posteriores se obtendrán los mismos resultados
con desviaciones aceptadas y con las limitaciones que supone el uso de los mismos
procedimientos, equipos y personas involucradas en la ejecución del ensayo. Y
Finalmente, se debe demostrar según la ISO NTC 17025 la transparencia de sus
procesos; indicando que los resultados de los mismos están abiertos a la inspección
interna y externa a fin de mitigar e identificar fácilmente los factores que podrían
afectar de manera adversa la búsqueda de resultados objetivos basados en métodos
científicos. Con lo que se concluye que los procesos validados, son la fuente de
confianza para el que hace los análisis microbiológicos y para quien los solicita.
(http://www.ideam.gov.co/temas/calidad/Descripci%C3%B3n%20Gral.%20Norma%
20ISO-IEC%2017025.pdf)
La validación es demostrar con un alto grado de confianza, por medio de evidencia
documentada que un proceso específico producirá de forma consistente y permanente
11
servicios que poseerán las características de calidad predefinidas (WHO Technical
Report Series, No. 823, 1992).
Validar se refiere al conjunto de acciones que demuestran formalmente que un
sistema realiza lo que se supone debe hacer, de forma continuada y ajustada al
objetivo de análisis. Al validar un método se demuestra formalmente que el mismo
posee un determinado nivel de parámetros analíticos básicos: exactitud, precisión,
sensibilidad, intervalo lineal, selectividad y robustez (Useche, B).
En la validación del método en un solo laboratorio es de suma importancia tener en
cuenta el sesgo del método y el sesgo del laboratorio. Existen unos pocos laboratorios
cuyas instalaciones permiten despreciar estos sesgos, pero se trata de casos
excepcionales (sin embargo, si un solo laboratorio realiza un análisis particular, el
sesgo del método y el sesgo del laboratorio adquieren una perspectiva distinta).
Normalmente, los efectos del método y del laboratorio deben considerarse factores de
incertidumbre, pero a menudo son más difíciles de estudiar que el error de
repetibilidad y el efecto de ejecución. En general, para valorar las incertidumbres que
producen es necesario utilizar información recabada independientemente del
laboratorio. Las fuentes generalmente más útiles de dicha información son: (i)
estadísticas derivadas de ensayos colectivos (no disponibles en muchas situaciones de
validación de un método en un solo laboratorio), (ii) estadísticas derivadas de ensayos
de aptitud y (iii) resultados de análisis de materiales de referencia certificados.
(RESOLUCIÓN OENO 8/2005).
Según la ISO/TR 13843:2000 la validación para métodos microbiológicos se hace
casi siempre en varias etapas. Las investigaciones sobre el funcionamiento real del
método deberían ir precedidas de un estudio del rango de trabajo fiable en el cual es
pertinente el funcionamiento del método. Cualquier comparación entre las tasas de
recuperación de dos métodos debería estar limitada a los casos para los cuales ambos
métodos sean fiables.
12
Dentro de un proceso de validación se deben validar:
· Método analítico: En el cual se evalúan y analizan parámetros como sensibilidad,
exactitud, linealidad, selectividad, etc.
· Sistema analítico: Incluye instrumentos, ordenador y método, con este se concluye
que el conjunto funciona como se espera.
· Análisis de la muestra: Donde se evidencia por medio de la documentación la
comprobación de los datos primarios (USP XXVI, 2003).
Por otro lado, se deben tener en cuenta algunos requisitos relacionados con el proceso
de trazabilidad, tales como la confirmación de qué tan adecuada es la especificación
del método. La validación del método debe suministrar una prueba razonable de la
condición y la ecuación de medición. En un caso ideal dentro de un laboratorio
individual incluiría las siguientes actividades: (Baracaldo, R)
a. Evaluación de la selectividad y especificidad para asegurar que el método
responde a los analitos particulares de interés y no a otros similares.
b. Verificación con material de referencia certificado que demuestre que el
método no tiene errores sistemáticos significativos.
c. Verificaciones razonables de otros efectos probables específicos no incluidos
en la especificación del método.
d. Estudios de precisión en un intervalo amplio de tiempo y bajo un conjunto
razonable de condiciones. Esto suministra una prueba de la ausencia de
efectos inesperados.
13
e. Estudios adicionales sobre fuentes posibles de errores sistemáticos, incluyendo
spiking y recuperación
f. Estudios sobre interferencias probables y reactividad cruzada que demuestren
nuevamente que no hay efectos adicionales de importancia. (Baracaldo, R. )
Las comparaciones entre analistas y diferentes laboratorios o mediante otros métodos
pueden también demostrar posibles deficiencias en el método. Si se manejan como
pruebas para efectos adicionales, estás servirán de evidencia adicional de la capacidad
de la especificación del método.
Las referencias usadas en la validación del método para controlarlo, calibrarlo y
probarlo son por sí mismas trazables. Esto es importante para asegurar que los
estudios de validación son relevantes en forma directa para los resultados obtenidos
en análisis rutinarios. (Baracaldo, R)
La validación juega un papel clave para establecer la trazabilidad y no es una
actividad opcional. Incluso cuando se emplee un método estándar que ya haya sido
validado y probado totalmente sigue siendo necesario un nivel de validación. No es
necesario repetir el estudio completo de todos los efectos posibles o probables: la
especificación del método puede ser tomada completamente sin verificación
adicional. Pero los métodos analíticos son complejos y susceptibles de error.
Es indispensable demostrar por lo menos que el laboratorio está en capacidad de
llevar a cabo el método correctamente (verificación). La mejor manera de hacerlo es
con material de referencia certificado apropiado. Las evidencias de las pruebas de
aptitud y otros estudios pueden, dependiendo de la naturaleza del ejercicio,
suministrar una evidencia adecuada de la correcta operación del método. (Baracaldo,
R).
14
1.2 TIPOS DE VALIDACIÓN SEGÚN SU OBJETIVO
1.2.1 Validación primaria Esta se basa en un proceso exploratorio cuyo objetivo es
el establecimiento de los límites operativos y las características de funcionamiento de
un método nuevo que ha sido modificado o insuficientemente caracterizado. Este tipo
de validación se efectúa generalmente por medio de planes de ensayo especialmente
diseñados para este fin. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
Es conveniente que un laboratorio que esté desarrollando su propio método o una
variante de una norma existente siga las etapas de validación primaria. Es obligatorio
que los técnicos implicados en la validación primaria tengan una experiencia
considerable en otros métodos microbiológicos. (WHO Technical Report Series, No.
823, 1992).
Según la ISO/TR 13843:2000 para la identificación del objetivo en la validación
primaria, los estudios sobre cultivos puros durante el desarrollo inicial del método
proporcionan la descripción básica de las colonias objetivo o del tubos P/A.
Obviamente es preciso ensayar más de una cepa de cultivo puro del microorganismo
objetivo.
Es conveniente que la validación primaria aporte las siguientes especificaciones, en
cuánto a microbiología: (ISO/TR 13843:2000).
1. Identificación morfológica del microorganismo objetivo (presuntivo)
2. Instrucciones relativas a las condiciones de incubación (temperatura, tiempo,
atmósfera gaseosa, humedad) y las características del medio (pH, estabilidad)
3. Una instrucción relativa a los límites de trabajo en términos de número de
colonias o de placas por detector (placa, filtro de membrana)
15
4. Si es posible, expresiones de la incertidumbre dentro de los límites fiables
especificados
5. Rango de aplicación y limitaciones.
1.2.2 Validación Secundaria Llamada también verificación, tiene lugar cuando un
laboratorio pone en marcha un método desarrollado por otros. La validación
secundaria tiene como objetivo principal recopilar los datos que permitan demostrar
que el laboratorio es capaz de cumplir las especificaciones establecidas en la
validación primaria. Actualmente, dichas especificaciones no están disponibles para
la mayoría de los métodos. Puede ser necesario utilizar los resultados de
aseguramiento de calidad externa como primera etapa para una validación secundaria
completa. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
Por regla general, la validación secundaria utiliza los mismos modos operativos que
la validación primaria pero bajo formas seleccionadas y simplificadas, aunque
posiblemente extendidas a lo largo de un periodo de tiempo mayor. Las muestras
naturales son los materiales de ensayo óptimos y el trabajo necesario se refiere
exclusivamente a que el modo operativo se inscriba dentro de los límites
operacionales definidos en la validación primaria. (WHO Technical Report Series,
No. 823, 1992).
Para llevar a cabo una validación se debe tener clara la metodología analítica, la cual
va de lo general a lo particular, se inicia con la valoración de la técnica, que es el
principio científico que puede ser útil para suministrar información sobre la
composición de una muestra; seguida del método que es la adaptación de la técnica
para un propósito específico, que para ser utilizado correctamente debe ir descrito en
un procedimiento y finalmente a partir de la información recopilada se obtiene el
protocolo en donde se suministran una serie de direcciones precisas y definitivas que
16
deben seguirse si se quiere que los resultados analíticos se acepten, esta es la
evidencia objetiva de la validación. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
1.3 PARÁMETROS ANALÍTICOS PARA LA VALIDACIÓN DE UNA
TÉCNICA O MÉTODO
1.3.1 Selectividad Un método selectivo aporta resultados exactos para todos los
analitos de interés, mientras que uno específico produce resultados exactos para un
analito, al tiempo que los otros analitos de interés pueden interferir los unos con los
otros. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
La selectividad es el grado en que un método puede cuantificar el analito con
precisión en presencia de interferentes. Idealmente, la selectividad debería evaluarse
para todos los interferentes importantes susceptibles de estar presentes. Es de especial
importancia comprobar los interferentes capaces de responder a la prueba de acuerdo
con sus principios. En muchos tipos de análisis, la selectividad es esencialmente un
estudio cualitativo basado en la significación, o bien un conjunto de pruebas
pertinentes de interferencia. (RESOLUCION OENO 8/2005)
1.3.2 Especificidad Es la capacidad del método para diferenciar precisa y
específicamente el compuesto de interés, en presencia de los demás componentes, que
se espera estén presentes en la matriz de la muestra. Estos componentes pueden ser
precursores de la síntesis o subproductos de la misma, impurezas, excipientes o
productos de degradación. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
La especificidad se define como la proporción de muestras negativas (no reactivas)
correctamente identificadas. (OCHOA , Rolando., et al. 2005)
17
1.3.3 Calibrado y Linealidad Se refiere a la proporcionalidad entre la concentración
del analito y su respuesta, es decir si la técnica o método produce resultados directa o
indirectamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito, dentro de un
intervalo determinado. En algunos casos se requiere una transformación matemática
de la respuesta. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
La linealidad determina la región de la curva de cuantificación en que hay relación
directa entre la señal instrumental y la concentración del producto analizado, siendo
un método lineal cuando presenta una r > 0,99. (GOMARA, F. L, et al. 2004).
Un método de análisis presenta regresión lineal, cuando al aplicar un método se
obtienen las respuestas, las cuales directamente o después de transformaciones
matemáticas son proporcionales a la concentración del compuesto analizado dentro
de un intervalo de concentraciones apropiado. Su aplicación principal está en curvas
de calibración (Useche, B).
1.3.4 Precisión Se relaciona con la dispersión de la medida alrededor de un valor
medio o central y mide la concordancia entre ensayos individuales cuando el método
se aplica repetidas veces a muestras separadas e idénticas, obtenidas del mismo lote
de material homogéneo. (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
Mide el grado de cercanía entre las medidas obtenidas de análisis realizados
repetidamente de múltiples muestreos de una muestra homogénea. La precisión se
mide por la dispersión que puede ser expresado como desviación estándar o
coeficiente de variación (desviación estándar relativa) (Useche, B).
La precisión de un método comprende:
- Repetibilidad Medida de la precisión del método cuando éste se realiza por el
mismo analista, el mismo día, mismos reactivos, mismo instrumento (precisión
dentro del ensayo). Este término incluye las contribuciones de cualquier parte del
18
procedimiento que varía durante una ejecución, incluidas las contribuciones
procedentes de errores gravimétricos y volumétricos conocidos, de la heterogeneidad
del material de prueba y de la variación en las etapas de tratamiento del análisis, y se
observa fácilmente en la dispersión de los análisis replicados. El efecto de ejecución
se explica por las variaciones cotidianas en el sistema analítico, como los cambios de
analistas o de lotes de reactivos, el recalibrado de los instrumentos y el entorno del
laboratorio (ej.: cambios en la temperatura) (RESOLUCION OENO 8/2005).
Es la concordancia entre resultados obtenidos con el mismo método, en muestras
idénticas y bajo las mismas condiciones (experimentador, reactivos, instrumentos,
condiciones atmosféricas) (Useche, B).
- Reproducibilidad Esta se mide cuando el ensayo se realiza en diferentes
laboratorios por diferentes analistas, diferentes días, diferentes instrumentos
(precisión entre laboratorios). El grado de reproducibilidad se determina en función
de las variables del ensayo. La reproducibilidad puede ser comparada con la precisión
del análisis en condiciones normales obteniéndose así una medida de la solidez del
método (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
En conclusión, la reproducibilidad, es la concordancia entre resultados obtenidos de
diferentes laboratorios o por diferentes experimentadores usando la misma
metodología y trabajando con muestras idénticas (Useche, B.).
1.3.5 Solidez y Robustez La evaluación de solidez puede ser considerada durante la
fase de desarrollo y depende del tipo de procedimiento de estudio. Busca demostrar la
veracidad de un análisis con respecto a variaciones deliberadas en parámetros del
método. Al evaluarse la robustez de un método, se evalúa la capacidad del resultado
de no sufrir alteraciones por pequeñas modificaciones en los parámetros de análisis
(GOMARA, F. L, et al, 2004).
19
La robustez en un método es finalmente, el grado de reproducibilidad de los
resultados obtenidos para las mismas muestras bajo variadas condiciones (diferentes
experimentadores, diferentes lotes de reactivos). Se realiza un diseño experimental
con varios factores y se aplica análisis de varianza (Useche, B)
1.3.6. Exactitud Se define como el grado de concordancia o como la diferencia entre
la media de los resultados del ensayo obtenidos por el método y el valor verdadero o
el valor aceptado como correcto para la cantidad medida. Se conoce también como
error sistemático o sesgo (WHO Technical Report Series, No. 823, 1992).
Es una medida de la diferencia entre el promedio de los resultados del análisis y el
valor verdadero; de allí se puede establecer un error promedio. Mide el grado de
similitud entro los resultados del método evaluado y los obtenidos usando un método
de referencia (Useche, B).
1.3.7. Estabilidad Se considera adecuada si la desviación estándar relativa calculada
en los resultados obtenidos en diferentes intervalos de tiempo, no excede el 20% del
valor correspondiente de la precisión del sistema (WHO Technical Report Series, No.
823, 1992).
1.3.8. Límite de detección Es un número expresado en unidades de concentración (o
cantidad) que describe el más bajo nivel de concentración de un analito que puede
determinarse como estadísticamente diferente del blanco analítico (WHO Technical
Report Series, No. 823, 1992).
El límite de detección es la cantidad o concentración de analito más pequeña en la
muestra de prueba que puede distinguirse fiablemente de cero. En los sistemas
analíticos donde el rango de validación no lo incluye o no se le aproxima, no es
preciso que el límite de detección forme parte de la validación (RESOLUCION
OENO 8/2005).
20
Aquella concentración de analito que proporciona una señal significativamente
diferente de la señal de fondo. Es similar en muchos aspectos al nivel crítico. Se
estableció como 1.645 veces la desviación estándar del blanco de análisis. (Useche,
B. )
1.3.9. Limite de cuantificación Corresponde a la más baja cantidad del analito que
puede determinarse cuantitativamente con precisión y exactitud aceptables. (WHO
Technical Report Series, No. 823, 1992).
Es la concentración de analito que produce una señal más grande que el blanco y que
puede ser detectada dentro de los límites aceptados por los laboratorios. Se estableció
que es la concentración que produce una señal 10 desviaciones estándar del blanco.
(Useche, B.)
1.3.10. Sensibilidad Es definida como la proporción de muestras positivas o
reactivas correctamente identificadas por la prueba empleada. (OCHOA Rolando, . et
al, 2005 ).
La sensibilidad es entendida como la capacidad del método de distinguir, con
determinado nivel de confianza, dos concentraciones próximas (GOMARA, F. L, et
al, 2004)
1.4 MÉTODOS DE ENSAYO MICROBIOLÓGICOS
El control de calidad es importante tanto en salud pública como en la industria. Con
el desarrollo de técnicas microbiológicas de diagnóstico, ha sido posible realizar un
control apropiado de las características de inocuidad. La validación sirve como
soporte de aseguramiento de la calidad en los laboratorios brindando confianza y
solidez a los resultados emitidos por el mismo. (Cuesta, A).
21
Los laboratorios de análisis tienen como principal objetivo reportar resultados
altamente confiables, por eso deben controlar y asegurar la calidad de sus resultados,
entendiéndose calidad, como el conjunto de propiedades y características óptimas de
un producto o servicio que prueban su actitud para satisfacer necesidades específicas
e implícitas. El mejoramiento de la calidad en el laboratorio consiste en implementar
un programa completo que vale el resultado final emitido por el laboratorio
proporcionando resultados útiles. Este mejoramiento, no solo incluye los conceptos
más tradicionales de control de calidad, como el mejoramiento y la evaluación
externa de la calidad que tiene como propósito mantener en cualquier proceso un
rendimiento a niveles aceptables según los estándares, sino que también incluye el
mejoramiento continúo de la calidad bajo el concepto de “calidad total”. (Cuesta, A).
El control de calidad abarca en los laboratorios de microbiología el monitoreo de
medios de cultivo, reactivos, equipos y/o instrumentos, validación de procedimientos
técnicos y del personal. Por tanto, la validación de las pruebas microbiológicas es de
vital importancia ya que por medio de ésta se busca determinar las variaciones entre
ensayos para disminuir las posibilidades de error en los resultados, haciéndolos de
esta forma reales y confiables. Así mismo se busca garantizar que las técnicas son
compatibles con las condiciones en las que se está trabajando. En las pruebas de
diagnóstico microbiológicas tanto para alimentos, como para aguas, el recuento en
placa en profundidad es una técnica comúnmente utilizada para determinar el número
de células viables y la ausencia y/o presencia de ciertos microorganismos, al igual
que la técnica del número más probable (NMP) realizada a través del recuento en
tubos. (ROMERO, Maria., et al, 2003).
Las técnicas mencionadas anteriormente se constituyen como las más utilizadas para
el control de calidad de alimentos y aguas. La validación y verificación de estas
técnicas es importante para que el laboratorio pueda elaborar, desarrollar y generar
resultados confiables y seguros, como requisito parcial para dar cumplimiento a las
22
normas oficiales vigentes tales como la ISO-NTC 17025. (ROMERO, Maria., et al,
2003).
El análisis microbiológico tiene como fin proporcionar información confiable acerca
de la inocuidad y calidad sanitaria de una muestra cualquiera. Es por ello que es
indispensable la elección de un método de ensayo adecuado. El laboratorio debe
utilizar los métodos de ensayo que satisfagan la necesidad del cliente y que sean
apropiados para los ensayos que realiza. Se deben aplicar métodos y procedimientos
apropiados para todos los ensayos dentro de su alcance (incluye muestreo,
manipulación, transporte, almacenamiento, preparación de las muestras a ensayar,
estimación de la incertidumbre y empleo de técnicas estadísticas para el análisis de
datos de los ensayos). El laboratorio puede utilizar métodos oficiales, métodos
normalizados nacionales e internacionales, o métodos internos desarrollados por él
mismo. (Cuesta, A).
Es recomendable la utilización de métodos normalizados o de referencia, siempre y
cuando éstos estén disponibles y sean apropiados. Sin embargo, el laboratorio no está
obligado a utilizar un método normalizado, si dispone de un método propio con el
que obtenga resultados equivalentes o superiores, utilice tecnología más avanzada y
presente un grado de validación adecuado. En todos los casos, el laboratorio debe
demostrar que un método es adecuado para la finalidad pretendida.
Para decidir si un método es apropiado o no, se debe tener en cuenta: si ese método es
aplicable al analito a analizar, la cantidad de muestra necesaria para el ensayo, el
límite inferior del método (para ensayos cuantitativos), si usando esta metodología se
puede evaluar el cumplimiento de las exigencias requeridas para el analito. Cuando el
muestreo es llevado a cabo por el laboratorio, este debe usar procedimientos
documentados y técnicas estadísticas apropiadas para seleccionar las muestras. (Ver
Capítulo 6. Muestreo. Requisitos de la Norma 17025). La precisión, la especificidad,
23
la sensibilidad, el límite de cuantificación y/o de detección, los efectos matriciales y
facilidad de uso, son características que deben tenerse en cuenta antes de seleccionar
un determinado método de ensayo. El laboratorio debe elegir los métodos que mejor
se adecuen a sus objetivos, y debe documentarlos debidamente. (GUARNIZO,
Juliana. 2005).
Es necesario aplicar dos métodos en paralelo sobre las mismas muestras cuando se
está desarrollando un método interno, y también cuando se está recopilando
información justificativa del uso de un método alternativo (ISO/ TR 13843:2000).
El método que presente la tasa de recuperación más elevada para los organismos
buscados es obviamente el mejor, salvo que precise siempre de confirmación para su
utilización en rutina. Un método que permita obtener una tasa de recuperación algo
inferior, pero que no precise confirmación resulta preferible. Si no pueden corregirse
tasas elevadas de falsos positivos o de falsos negativos observadas en la validación
primaria por medio de una definición más detalladas de las colonias objetivo, es
conveniente considerar el método como no valido (ISO/TR 13843:2000).
1.4.1. Métodos de ensayo microbiológicos cualitativos Son métodos en los que el
resultado se expresa en términos de ausencia/presencia.
Los procedimientos de confirmación e identificación del microorganismo, deben ser
validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad, exactitud relativa,
desviación positiva, desviación negativa, límite de detección, efecto matricial,
repetibilidad y reproducibilidad.
24
Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse muy en cuenta al analizar
diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse utilizando métodos
estadísticos apropiados. (Cuesta, A).
1.4.2. Métodos de ensayo microbiológicos cuantitativos Debe considerarse la
especificidad, sensibilidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación
negativa, repetibilidad, reproducibilidad y el límite de cuantificación dentro de una
variabilidad establecida y, en caso necesario, determinar cuantitativamente estos
parámetros. Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse en cuenta al analizar
diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse utilizando métodos
estadísticos apropiados. (Cuesta, A).
Un ensayo cualitativo no brinda una información numérica de los resultados, pero
esto no implica que sea inferior a una prueba cuantitativa. Las aplicaciones de estos
dos ensayos pueden ser diferentes y en algunas situaciones un resultado cualitativo es
suficiente. Debe tenerse en cuenta que en muchos casos no existen materiales de
referencia y en otros la naturaleza de los mecanismos de protección no es bien
conocida, lo que limita la cuantificación de los resultados o al menos su
interpretación (OCHOA, Rolando et al. 2005)
La validación analítica es uno de los elementos básicos en sistemas de calidad. El
hecho de validar trata de disminuir o controlar los factores que llevan a la imprecisión
o inexactitud de un dato generado, a través de la realización de un trabajo analítico
dentro de unos parámetros definidos. La validación de un método analítico provoca
una mayor fiabilidad y aceptación de los datos generados, estando estas en proporción
con la calidad del proceso de obtención de los mismos (GOMARA, F. L, et al, 2004).
Para llevar a cabo validaciones, se debe contar con materiales de referencia que se
definen como material o sustancia, una de cuyas propiedades es lo suficientemente
homogénea con valores bien establecidos, como para ser usados para la calibración de
25
aparatos, la evaluación de métodos de medición o para signar valores a materiales.
Los materiales de referencia certificados son un material acompañado de un
certificado, uno o más de los valores asignados a sus propiedades se certifican
mediante un procedimiento que establece su trazabilidad a una realización exacta de
la unidad en la cual el valor de la propiedad se expresa y para la cual cada valor
certificado se acompaña de una incertidumbre a un nivel declarado de confianza.
(Hernández, A.)
Los patrones de medición son una medida material, instrumento o sistema de
medición o material de referencia destinado a definir, realizar, conservar o reproducir
una unidad o uno o más valores de una magnitud para que sirva de referencia.
(Useche, B. )
1.5 MEDICIÓN Y ERRORES
Aunque existen innumerables procesos de medición diferentes, todos ellos culminan
con la obtención de un resultado, el cual es afectado por distintos errores que surgen
de la interacción entre el aparato de medida, el observador y el sistema bajo estudio.
Los errores asociados a las mediciones pueden dividirse en dos grandes clases: a)
errores sistemáticos, y b) errores aleatorios. Los errores sistemáticos, tal como su
nombre lo indica, se cometen de una misma manera cada vez que se mide. Muchos
errores sistemáticos pueden eliminarse aplicando correcciones muy simples. Estos
errores son llamados también errores corregibles o determinados, a fines de
distinguirlos de los errores aleatorios, los cuales se encuentran en toda medición y
están fuera del control del observador.
Los errores sistemáticos no se manifiestan como fluctuaciones aleatorias en los
resultados de las mediciones. Por lo tanto, dado que el mismo error está involucrado
en cada medición, no pueden eliminarse simplemente repitiendo las mediciones
26
varias. En consecuencia, estos errores son particularmente serios y peligrosos, y
pueden eliminarse sólo después de realizar cuidadosas calibraciones y análisis de
todas las posibles correcciones. Algunas veces, los errores sistemáticos se manifiestan
como un corrimiento en valores medidos consecutivamente o como un cambio en el
valor experimental medido cuando se cambia la técnica experimental de medición.
La segunda clase de errores, los errores aleatorios o accidentales, aparecen como
fluctuaciones al azar en los valores de mediciones sucesivas. Estas variaciones
aleatorias se deben a pequeños errores que escapan al control del observador. El
propósito del tratamiento de los datos experimentales es justamente determinar el
valor más probable de una cantidad medida y estimar su confiabilidad.
(http://arfiexp.tripod.com/manual_de_laboratorio2.htm)
1.6 MATERIAL DE REFERENCIA
Se denomina material de referencia al material o sustancia que ostenta valores de una
o más propiedades suficientemente homogéneas y bien conocidas que permite su uso
en la calibración de aparatos, la evaluación de un método de medición o la atribución
de valores a estos materiales. (ISO/IEC 17025).
1.6.1. Cultivos de Referencia Es el conjunto constituido por cepas de referencia,
cepas de reserva y cepas de trabajo. Un laboratorio de microbiología cuenta con
cultivos de referencia, a fin de acreditar o conservar la acreditación de un ensayo. Así,
el número, la elección del género y su especie son dependientes de los ensayos que se
elaboran y de las necesidades que asumen estos. (ISO/IEC 17025).
1.6.2 Cepas de referencia A fin de demostrar la trazabilidad, las cepas de referencia
deben obtenerse directamente de una colección con la reseña nacional o internacional
de cultivo de referencia reconocido.
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Según la "ISO 11133-1:2000", son:
• microorganismos definidos, por lo menos a nivel de género y especie
• catalogados
• muy caracterizados
• de origen conocido
Dichas cepas son distribuidas y presentadas comercialmente liofilizadas; asimismo,
los organismos de acreditación son los encargados de considerar válida la fuente de
procedencia de la cepa a fin de que se cumpla con el requisito de prevenir
mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas. (ISO/IEC
17025).
El número de repiques a partir de la cepa de referencia ha de ser limitado,
aceptándose hasta cinco repiques como máximo a partir de dicha cepa de referencia.
Asimismo, toda cepa adquirida por una vía que no sea la propia colección, no podrá
mencionarse utilizando el número que tienen en esa colección, sino únicamente como
derivada de la cepa de colección. (ISO/IEC 17025).
1.7. REPRESENTATIVIDAD Y CANTIDAD SUFICIENTE DE MUE STRAS
La teoría estadística aporta soluciones para el cálculo del número de muestras
requeridas para las diferentes situaciones de ensayo o de estimación. Con el fin de
poner en práctica la teoría, es conveniente definir la importancia de los efectos que
realmente tienen influencia y las posibilidades de detectarlos. Es conveniente
disponer de una estimación de la incertidumbre (precisión) de la determinación y
proceder a un muestreo aleatorio. Muchos o todos los requerimientos anteriormente
indicados son difíciles de cumplir de antemano en la planificación y ejecución de
28
ensayos de funcionamiento de métodos microbiológicos. Las técnicas estadísticas, de
utilizarse, se convierten en meras líneas directrices. (ISO/TR 13843:2000).
Para ser convincente, el número y variedad de las muestras a examinar debe ser
suficiente. Sin la ayuda de la estadística no hay ninguna manera de precisa de tomar
una decisión. En ciertos casos, la primera muestra estudiada puede indicar ya que el
método no es suficientemente bueno. Pero, una sola muestra generalmente no basta.
A veces, se necesita un millar de muestras para “demostrar” que dos métodos P/A no
son equivalentes. Seleccionar una cantidad insuficiente de ejemplos puede constituir
una pérdida de tiempo.
1.7.1 Recuperación del analito El analito microbiológico se compone de partículas
vivas discretas, denominadas indistintamente unidades formadoras de colonias
(UFC), partículas formadoras de colonias (PFC), gérmenes, propágalos, etc. El
número de colonias observado es una aproximación del número de partículas vivas.
El conjunto de ensayos de funcionamiento necesarios está limitado por la casi
imposibilidad de conocer la cantidad real del analito contenida en una muestra o en
una porción de ensayo analítica. Los detectores no pueden sembrarse con un número
de gérmenes exactamente conocido. (ISO/TR 13843:2000).
La viabilidad viene definida por el crecimiento, es decir, por el método en sí mismo.
La recuperación absoluta no puede definirse y la trazabilidad es imposible. Como la
viabilidad puede ser distinta según los detectores y/o según la historia de la muestra,
la tasa de recuperación relativa (del nuevo método y de uno de referencia) resulta una
característica de funcionamiento practicable incluso aunque no se conozca el
verdadero resultado.
29
En el medio ambiente, e incluso en las muestras de laboratorio, la distribución de
partículas no es homogénea. La varianza de muestreo no es una característica del
método, mientras que la varianza debido a la toma de alícuotas de la muestra de
laboratorio sí que puede considerarse como una característica. Puede resultar
imposible utilizar métodos de homogenización suficientes para asegurar el perfecto
mezclado del contenido de la muestra sin ninguna pérdida de células viables. La
varianza intramuestra con frecuencia es considerable y da problemas en la validación.
Será necesario definir el funcionamiento para matrices diferentes, en particular en lo
que se refiere a la precisión y a los límites de trabajo superiores. (ISO/TR
13843:2000).
La variación aleatoria debido a una muestra no homogénea de las partículas entre dos
muestras paralelas, incluso en suspensiones perfectamente mezcladas, es una
característica de los métodos microbiológicos. La variación aleatoria básica es
inevitable y no tiene nada que ver con la competencia técnica o con el equipamiento.
Esta variación obedece a una ley matemática conocida, la distribución de Poisson, y
por lo tanto puede calcularse.
1.7.2 Material de Ensayo Está generalmente aceptado que la validación debe simular
en la mayor medida posible el proceso de rutina. Por lo tanto, las muestras naturales
con concentraciones naturales de microorganismos deberían ser los principales
materiales de ensayo. Hay excepciones en algunas circunstancias concretas. Los
materiales artificiales (materiales de referencia certificados y muestras enriquecidas)
se utilizan en sistemas de aseguramiento de la calidad internos y externos para
asegurar la competencia técnica básica de los laboratorios que participan en los
ejercicios de validación de métodos. (ISO/TR 13843:2000).
30
Puede ser útil e incluso necesario efectuar adición o enriquecimiento en la validación
secundaria, siempre que sea difícil conseguir muestras naturales con el
microorganismo buscado. El personal de laboratorio deberá ser capaz de
familiarizarse con los microorganismos buscados. Es conveniente limitar la
utilización de muestras negativas (blancos) a las operaciones de aseguramiento de la
calidad interna. Su inclusión entre las muestras estudiadas para ver la equivalencia de
métodos puede producir la impresión falsa de una buena correlación entre métodos.
Si es posible saber de antemano que muestras naturales no contienen ninguno de los
organismos objetivo, éstas podrían ser una buena elección para verificar los falsos
positivos en los ejercicios reales de validación.
El rango óptimo de concentraciones para la validación de métodos microbiológicos es
más estrecho que el rango de aplicación previsto. No es necesario utilizar
concentraciones muy grandes. Estas muestras son comparables a cultivos puros y no
permiten verificar el comportamiento del método o del laboratorio sometido a ensayo.
Ciertos métodos microbiológicos se han venido usando durante décadas por
centenares de laboratorios (por ejemplo, agar ENDO para coliformes totales, mFC
para coliformes termotolerantes, agar m-Enterococcus para enterococos intestinales).
Estos métodos teóricamente podrían resultar adecuados para estudios colaborativos
sobre el funcionamiento de los métodos. (ISO/TR 13843:2000).
1.7.3 Detectores Se denomina detector al medio nutritivo en su recipiente. En
diferentes variantes de métodos microbiológicos se emplean dos tipos de detectores,
sólidos y líquidos. Además están principalmente asociados con dos principios de
recuento y detección: liquido con el método A/P y NMP y sólidos con los recuentos
de colonias. En microbiología, el objetivo fundamental de todas las formas de
validación es la determinación del funcionamiento de los detectores. La serie de
tubos (NMP) o de placas (contables) utilizadas para el análisis se denomina serie de
detección o serie de detectores. Cada tubo de NMP es un detector A/P.
31
Para la mayor parte de los métodos de recuento de colonias, es posible desarrollar un
líquido equivalente de la misma composición química pero desprovisto de matriz
sólida (agar, membrana filtrante). El efecto del entorno sólido puede evaluarse
comparando los recuentos de colonias con la estimación equivalente NMP, siempre
que la reacción para la identificación del microorganismo buscado sea la misma para
los dos tipos de detectores y que el número de tubos paralelos sea suficiente para
obtener un final de precisión adecuado. Es posible evaluar la sensibilidad de los
detectores P/A procediendo a comparaciones líquido-sólido similar. (ISO/TR
13843:2000).
Para que sean útiles en la validación, es conveniente que las características de
funcionamiento sean cuantificables y que puedan ser sometidas a ensayo, esto es;
relacionado al campo de aplicación (lista de situaciones y tipos de muestras a las
cuales es aplicable el método), a la precisión, a la linealidad, tasa de recuperación,
límites de trabajo en términos de número de colonias superior e inferior que se
recomienda contar por placa, a la selectividad, especificidad y robustez (solidez).
Las interacciones de factores bióticos y abióticos en el interior de los detectores son
causa de problemas considerables. Los detectores líquidos sufren de la posible
cohabitación de microflora variada dentro del mismo tubo. Los detectores de colonias
tienen el problema de crecimiento masivo, lo que enmascara las colonias objetivo con
fragmentos o con el crecimiento de otros microorganismos. La lectura entonces se
hace difícil o imposible. (ISO/TR 13843:2000).
32
1.8. SISTEMA DE GESTIÓN DE CALIDAD EN LABORATORIOS DE
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
La validación constituye una parte esencial de las buenas prácticas de laboratorio
(BPL´s) y consiste en el establecimiento de una evidencia documentada que
suministre un alto grado de seguridad de que un proceso específico elaborará de
forma permanente un producto que cumpla con características y especificaciones de
calidad predeterminadas. Desde 1972 y durante seis años la validación buscó
satisfacer exigencias normativas y defender líneas de producción. Hacia 1983 sirvió
como método de acción fundamental de mejora de procesos. Desde allí se enfoca a
diferentes áreas de optimización de procesos. (JAIME, Carolina. 2002)
Desde una perspectiva metrológica amplia, todos los métodos microbiológicos
estándar se comportan de igual manera. Los procesos envuelven homogenización
cuidadosa de la muestra y la suspensión de una porción medida en una solución
acuosa. Además, la dilución de la suspensión puede ser necesaria para llegar a la
concentración apropiada para el instrumento de medición, donde la detección y
conteo de las partículas tiene lugar (Niemelä. S, 2002).
En muy pocos métodos la preparación envuelve otros pasos además de la agitación
para separar el analito (microorganismo específico) de la muestra matriz y de las
especies no específicas interferentes. La pasteurización y el tratamiento ácido de las
muestras son dos ejemplos de tales prácticas (Niemelä. S, 2002).
Los instrumentos de medida o sistemas de detección usualmente consisten en muchos
detectores individuales de los cuales existen dos clases: el contador de colonias
(placas de petri) y el detector de ausencia/presencia (usualmente en tubo o en liquído)
(Niemelä. S, 2002)
33
1.8.1 Aseguramiento de la calidad de los resultados/control de Calidad Según el
apartado 5.9 de la NTC ISO 17025 el control de calidad se divide en:
Control de Calidad Interno Consiste en todos los procedimientos realizados por un
laboratorio para la evaluación continua de su trabajo. El principal objetivo es asegurar
la coherencia de los resultados obtenidos diariamente y el cumplimiento de los
criterios establecidos. (G-ENAC-04).
Un programa de controles periódicos es necesario para demostrar que controla la
variabilidad (por ejemplo, entre analistas y entre equipos o materiales, etc.). Dicho
programa debe abarcar todos los ensayos incluidos en el alcance de acreditación del
laboratorio. El programa puede incluir:
· El uso de muestras inoculadas
· El uso de materiales de referencia (incluidos los materiales utilizados en
ensayos de aptitud)
· Uso de replicados
· Recuentos cruzados entre analistas
El intervalo entre estos controles dependerá del diseño del programa y del número de
ensayos realizados. Es recomendable que, en la medida de lo posible, los ensayos
incluyan controles para evaluar sus resultados. En circunstancias especiales, un
laboratorio puede estar acreditado para realizar un ensayo que rara vez se demanda.
Se reconoce que, en tales casos, un programa continuo de control interno de la
calidad no siempre será apropiado, siendo preferible un sistema que se realice en
paralelo al ensayo y que demuestre que los resultados son satisfactorios. (G-ENAC-
04).
Control de calidad analítico La aplicación de métodos válidos dentro de sus límites
especificados y fiables no garantiza automáticamente la obtención de resultados
34
válidos. Es necesario proceder a un control de calidad analítico (AQC) en relación
con los análisis de rutina cotidianos. Este control permite verificar la capacidad de
utilizar satisfactoriamente un método. El AQC es un proceso continuo. Los gráficos
de guía cuyos límites se han deducido a partir de las especificaciones del método (a
partir de la validación primaria), o a partir de consideraciones teóricas, son las
herramientas principales. (ISO/TR 13843:2000) (AOAC INTERNATIONAL)
El método de AQC es un complemento del proceso analítico de rutina, por ejemplo,
replicados a distintos niveles o simplemente cálculos que no se efectúan
corrientemente sobre los datos de rutina. Además, se utilizan materiales de
referencia, intercalibraciones y muestras con adición. El control de calidad analítico
debe efectuarse en combinación con las validaciones primaria y secundaria. Es
conveniente utilizar solo los resultados fiables desde el punto de vista del AQC para
definir los criterios de validación y las características de funcionamiento.
Diversos grupos de trabajo nacional e internacional han elaborado numerosos
documentos sobre el control de calidad de los métodos microbiológicos. En las
especificaciones se asume que los laboratorios disponen de los controles analíticos
apropiados y de sistemas de aseguramiento de la calidad internos y externos de
funcionamiento. Es preciso estudiar las muestras con un bajo contenido microbiano
por razones de salud pública, pero, por razones estadísticas, estas muestras no son
adecuadas para la comparación de métodos ni para otros ejercicios de validación. El
problema queda obviado, ya que los métodos microbiológicos generalmente no son
sensibles a la concentración en la parte baja de la escala. (ISO/TR 13843:2000)
Cada microorganismo individual reacciona con el medio nutritivo casi
independientemente de otras partículas de la muestra. Si un método tiene una tasa de
recuperación baja en comparaciones con otro método, este hecho se pone mejor de
manifiesto con veinte o treinta unidades formadoras de colonias por placa que con
una o unas cuantas.
35
Control de calidad externo (ensayos de aptitud) Los laboratorios deben participar
regularmente en ensayos de aptitud relacionados con el alcance de su acreditación,
dando preferencia a los programas de ensayos de aptitud que utilicen matrices
apropiadas. En algunos casos concretos, esta participación puede ser obligatoria. Los
laboratorios deben utilizar el control externo de la calidad no sólo para detectar
desviaciones en los resultados obtenidos, sino también para verificar la validez de
todo el sistema de calidad. (G-ENAC-04).
Cuando se hacen ensayos de competencia técnica para organismos objetivo
específicos, con medios selectivos, las muestras casi obligatoriamente han de ser
enriquecidas con cultivos puros o con mezclas de organismos. Otra solución es
utilizar materiales de referencia certificados. Se trata de una situación artificial y
simplificada. Algunas dificultades importantes experimentadas por diferentes
laboratorios en el uso en rutina de los métodos sobre muestras naturales pueden
quedar obviadas. En tanto en cuanto las características de funcionamiento de un
método microbiológico no hayan sido expresadas cuantitativamente, estos tipos de
programas de aseguramiento externo de la calidad constituyen, a pesar de todo, el
medio más satisfactorio en lo que respecta a la validación secundaria (verificación) de
un método (ISO/TR 31843:2000).
Los estudios que sobre materiales “homogéneos” en los que participan, de forma
colaborativa, varios laboratorios se consideran ensayos esenciales para el
funcionamiento del método, pero también para el de los propios laboratorios. (Una
vez identificados y eliminados los valores rechazables, se considera que los restantes
datos aportan la información necesaria sobre el funcionamiento y la eficiencia del
método). Hoy en día, los estudios colaborativos, constituyen una herramienta de
amplia aplicación para evaluar las características de precisión de los métodos
químicos. Parece algo prematuro recomendar la puesta en práctica de este tipo de
ensayos en microbiología. Se admite en efecto, que todos los laboratorios
36
participantes tienen varios años de experiencia en lo que concierne a los métodos
sometidos a ensayo y demostrada su capacidad para aplicarlos. Actualmente, la
experiencia demuestra que los estudios colaborativos encaminados a la evaluación del
funcionamiento de un método tienden a convertirse en ensayos de aptitud del
laboratorio y en ejercicios de formación.
Métodos equivalentes Es necesario aplicar dos métodos en paralelo sobre las
mismas muestras cuando se está desarrollando un método interno, y también cuando
se está recopilando información justificativa del uso de un método alternativo. Las
características de funcionamiento de un método constan de muchos aspectos. No hay
ningún ensayo individual de equivalencia de métodos ni ningún criterio numérico
correspondiente. Un método puede ser superior es especificidad pero inferior en
cuanto a recuperación. Toda la información sobre robustez, la precisión y la
especificidad recopilada durante los ensayos de validación puede utilizarse para la
comparación de los métodos. Únicamente es necesario examinar los métodos en
paralelo únicamente para las comparaciones de tasa de recuperación. (ISO/TR
31843:2000).
El método que presenta la tasa de recuperación más elevada para los organismos
buscados es obviamente el mejor, salvo que precise siempre de confirmación para su
utilización en rutina. Un método que permita obtener una tasa de recuperación algo
inferior, pero que no precise confirmación resulta preferible. Si no pueden corregirse
tasas elevadas de falsos positivos o de falsos negativos observadas en la validación
primaria por medio de una definición más detalladas de las colonias objetivo, es
conveniente considerar el método como no válido.
1.8.2 Acreditación Es el procedimiento mediante el cual, en interés de la sociedad,
un organismo autorizado evalúa y declara formalmente que un laboratorio es
37
técnicamente competente para la realización de un ensayo o grupo de ensayos
determinados. (G-ENAC-04).
La tarea de evaluar dicha competencia técnica y la eventual declaración pública de la
misma es llevada a cabo, mediante la comprobación del cumplimiento por parte de
los laboratorios de los requisitos concretos sobre estructura y organización,
imparcialidad, personal, equipos, procedimientos técnicos, sistema de la calidad, etc.,
establecidos en normas internacionales. En definitiva, los criterios sobre los que se
apoya la declaración de competencia técnica. (G-ENAC-04).
La acreditación genera, así, confianza en los informes y resultados de análisis
emitidos por los laboratorios que voluntariamente se han sometido a la evaluación
frente a estándares altamente profesionales. (G-ENAC-04).
Finalmente, el principal beneficiario del uso de laboratorios acreditados es el cliente,
quien recibe de esta manera un producto con alto nivel de calidad.
38
2. FORMULACIÓN Y JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA
2.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
Cuando un laboratorio pone en práctica pruebas microbiológicas que no están
validadas, ¿cómo demuestra la veracidad de sus resultados? La validación de las
técnicas microbiológicas ayuda a obtener resultados fiables a partir de la verificación
del correcto desempeño y funcionamiento del método microbiológico estándar
utilizado. Sin embargo, en Colombia la falta de cultura de calidad y conocimiento
sobre el tema de validación y la importancia que éste tipo de procesos tiene sobre los
ensayos microbiológicos, se ve reflejada en los escasos estudios que se han realizado
respecto a este tema. Así mismo, el crecimiento en el sector industrial en Colombia,
hace que la demanda en cuanto a procedimientos con calidad aumente, y así mismo
deben aumentar los laboratorios acreditados que ofrezcan a partir de la validación de
sus métodos mejores resultados al cliente.
Los laboratorios de análisis tienen como principal objetivo reportar resultados
altamente confiables, por eso deben controlar y asegurar la calidad de estos,
entendiéndose calidad, como el conjunto de propiedades y características óptimas de
un producto o servicio que prueban su actitud para satisfacer necesidades específicas
e implícitas. Adicionalmente, por requerimientos de sus sistemas de calidad y para
lograr el cumplimiento de los requisitos derivados de las buenas prácticas de
laboratorio; la validación actúa como sistema de aseguramiento de la calidad
mediante el cual se establecen evidencias documentadas para demostrar que un
proceso conduce a resultados de calidad consistentes dentro de las especificaciones
predeterminadas.
39
2.2 JUSTIFICACIÓN
Actualmente, los laboratorios de análisis microbiológico que prestan servicios,
cuentan con diferentes técnicas con las cuales llevan a cabo los análisis
correspondientes, pudiendo así emitir ciertos resultados; de esta manera, cada
laboratorio ha establecido y organizado sus procesos de forma aislada permitiendo así
que se generen posibles errores en la ejecución de las técnicas, disminuyendo la
confiabilidad de los resultados. Es por eso que se hace imperante la necesidad de
validar las técnicas desarrolladas para aumentar la credibilidad de las mismas,
disminuyendo las oportunidades de error.
La validación de las pruebas microbiológicas es de vital importancia ya que por
medio de ésta se busca determinar las variaciones entre ensayos para disminuir las
posibilidades de error en los resultados, haciéndolos de esta forma reales y confiables.
Así mismo se busca garantizar que las técnicas son compatibles con las condiciones
en las que se está trabajando. La validación y verificación de los ensayos
microbiológicos estándar, es importante para que el laboratorio pueda elaborar,
desarrollar y generar resultados confiables y seguros, como requisito parcial para dar
cumplimiento a las normas oficiales vigentes tales como la ISO-NTC 17025.
Con el desarrollo de la guía se pretende facilitar a los laboratorios que llevan a cabo
pruebas microbiológicas la validación de estas, orientándolos de forma clara y
sencilla en la consecución de los objetivos de la ISO 17025, ya que con ello se
sustenta el hecho de presentar al cliente o a la persona interesada resultados
confiables que permitan al mismo tomar decisiones. Se sustenta al mismo tiempo, que
los procedimientos de validación dará lugar a un sin número de beneficios, entre los
cuales está el poder garantizar la competencia de las técnicas realizadas en dichos
laboratorios, el logro y mantenimiento de la calidad de los servicios ofrecidos por
estos, apertura de nuevas oportunidades de mercado, obtención de reconocimiento y
40
de esta forma aumento de la credibilidad y confianza por parte del cliente, así como
competitividad, calidad y garantía de bienestar social, debido al logro de la
sensibilización del personal, el uso de equipos e instrumentos adecuados,
conocimiento de diferentes requisitos normativos, entre otros.
41
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
• Diseñar y elaborar una guía para la validación de ensayos y métodos de análisis
microbiológicos estándar.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Realizar una recopilación y revisión bibliográfica acerca de las validaciones de
los métodos y ensayos microbiológicos estándar.
• Proveer una descripción práctica y detallada de los métodos básicos de uso
rutinario y la estimación de variables importantes para la validación.
• Exponer los parámetros generales que se deben tener en cuenta al realizar la
validación de algún ensayo microbiológico estándar.
42
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN
Esta investigación es de tipo descriptivo. Mediante este tipo de investigación, que
utiliza el método de análisis, se logró caracterizar un objeto de estudio o una
situación concreta, señalar sus características y propiedades. Combinada con
ciertos criterios de clasificación sirve para ordenar, agrupar o sistematizar los
objetos involucrados en el trabajo indagatorio. Además, puede servir de base para
investigaciones que requieran un mayor nivel de profundidad.
4.2. POBLACIÓN Y ESTUDIO DE MUESTRA
La población objetivo de esta investigación fueron las pruebas de ensayo
microbiológicas tanto cualitativas como cuantitativas, como los son: recuento en
placa, ausencia/presencia, NMP, etc., que se desarrollan en las pruebas de
diagnóstico microbiológico; el recuento en placa en profundidad es una técnica
comúnmente utilizada para determinar el número de células viables y la ausencia
y/o presencia de ciertos microorganismos, al igual que la técnica del número mas
probable (NMP) realizada a través del recuento en tubos.
4.3. RECOPILACION Y REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
La cual se realizó a partir de fuentes secundarias, apoyándonos en fuentes de
carácter documental, como documentos de cualquier especie; normas nacionales e
internacionales, protocolos, guías, guías técnicas, normas técnicas y documentos
que se encontraron en diferentes archivos. Esta metodología se basó
principalmente, en la recolección de la información para su posterior análisis y
aplicación.
43
Con respecto a la utilización de fuentes primarias, se realizaron entrevistas con
personas involucradas con los laboratorios que llevan a cabo pruebas y/o ensayos
microbiológicos y también con personas conocedoras de temas como la
validación y los modelos matemáticos a nivel microbiológico.
Se realizó lectura y análisis de cada uno de los documentos encontrados, para
lograr a través de la organización y entendimiento de la información recolectada,
el diseño y la elaboración de la guía para la validación de los métodos
microbiológicos.
4.4. DOCUMENTACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN
PARA MÉTODOS Y ENSAYOS EN MICROBIOLOGÍA ESTÁNDAR.
Después de la obtención y recopilación de la información, análisis y aplicación de
los procedimientos estadísticos cualitativos y cuantitativos, se procedió a
documentar y desarrollar los parámetros estudiados en la información recolectada.
De esta manera, se inició el diseño de la guía para la validación de pruebas
microbiológicas estándar.
4.5. DESPLIEGUE DE MODELO MATEMÁTICO PRELIMINAR PAR A
LA VALIDACIÓN DE PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS ESTÁNDAR.
Luego del análisis de las referencias bibliográficas se pudo deducir que los
modelos lineales de la estadística paramétrica no permiten entender de forma
adecuada el crecimiento microbiano debido a la heterogeneidad que este presenta
como consecuencia del sistema físico, bioquímico y micro-ecológico de la
muestra. Debido a esto se hizo necesario profundizar más en otros métodos
estadísticos que permitieran cuantificar las observaciones realizadas en
microbiología estándar con el fin de expresarlas cuantitativamente.
44
Con la estadística no paramétrica se estima la exactitud y la precisión de las
mediciones microbiológicas. Por lo tanto se propuso un conjunto de herramientas
matemáticas propias de este tipo de estadística a través de un modelo de
validación en microbiología de proceso modular, en el cual se planteó la
validación orientada a la muestra (VOM), validación orientada al procedimiento
(VOP) y validación orientada al sistema (VOS), pero se profundizó únicamente
en la VOM.
45
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Luego de la revisión bibliografíca realizada se encontró que a nivel internacional las
principales fuentes de información sobre el tema son la ISO, la FAO, la WHO y a
nivel nacional, el ICONTEC, las secretarias de salud y el IDEAM. Sin embargo,
también se pudo observar que las más influyentes son a nivel internacional y
nacional, la ISO y el ICONTEC respectivamente. La Tabla 1 muestra la bibliografía
que más se destaca para procedimientos de validación en microbiología estándar:
Tabla 1. Bibliografía para procesos de validación en microbiología estándar
Nacional Internacional
-NTC 3529-1 (ISO 5725-1).
-NTC 3529-2 (ISO 5725-2).
-NTC 17025 (ISO 17025)
-NTC 5014 (ISO 16140)
-Articulos y presentaciones IDEAM
-Articulos y presentaciones INAS
-Secretaría Distrital de Salud
-ISO/TR 13843-2000
-ISO/TS 11133-1
-G-ENAC-4
-RESOLUCIÓN OENO 8/2005
-WHO Technical Reports.
-NIEMELÄ, Seppo. 2002. Uncertainty of Quantitative
Determinations Derived by Cultivation of Microorganisms.
Advisory Comission for Metrology. Publication J3. Finland.
-USP. United States Pharmacopeia XXVI, 2003
-CRUBELLATI, Ricardo. 2007. Análisis de Aguas:
capacidades instaladas en Iberoamérica. -1ª ed. – Buenos
Aires: Ciencia y Tecnología para el Desarrollo – CYTED.
pp. 78-87.
-CAYRÉ, María; VIGNOLO, Graciela y GARRO, Oscar.
Validación y comparación de modelos de crecimiento
microbiano. Facultad de Agroindustrias UNNE. Argentina
-CUESTA, Alicia. Guía para la acreditación de laboratorios
de microbiología de alimentos
AOAC. Peer-Verified Methods SM Program, AOAC
Internationall, Gaithersburg, MD20877-2417, USA
AOAC Research Institute. AOAC Performance Tested
Methods SM Program, AOAC International, Gaitherburg,
MD 20877-2417, USA
AOAC INTERNATINAL. AOAC International Cuts the
Number of Laboratories Required for a Collaborative Study.
46
Downloaded from http:
//64.55.218.151/pubs/storyarchives/cutlabs.htm. 8/28/2003
La revisión bibliográfica además de mostrarnos que el conocimiento y la
investigación sobre validación a nivel internacional es mayor que a nivel nacional, lo
cual se puede evidenciar por la cantidad de bibliografía internacional mostrada en la
tabla 1, también permitió obtener información acerca de la situación actual en cuanto
a validación y acreditación de los laboratorios de ensayo en Colombia.
Como resultado de la información analizada, se encontró que en Colombia la
constitución política estableció como deber del Estado, entre otros, proteger los
derechos de los consumidores frente a la calidad, la información y las garantías, y de
igual manera velar por la protección de la salud, la seguridad y el medio ambiente,
instaurando así su competencia estatal para intervenir y regular calidad (Crubellati, R.
2005).
Para dar cumplimiento a las políticas planteadas en cuanto a calidad se han venido
brindando los siguientes marcos regulatorios: El estatuto de Protección al
Consumidor y El Sistema Nacional de Normalización, Certificación y Metrología
(SNNCM) a cargo de la Superintendencia de Industria y Comercio (SIC) (Crubellati,
R. 2005). Esta superintendencia es la entidad que acredita a los organismos
evaluadores de la conformidad que operan dentro del SNNCM, el cual de acuerdo
con los lineamientos establecidos en el CONPES 3446 del 30 de octubre de 2006, se
irá transformando en el nuevo Subsistema Nacional de la Calidad. (Organismo
Nacional de Acreditación, 2007)
En desarrollo de dicha función de acreditación, a julio de 2007, la Superintendencia
de Industria y Comercio contaba con 231 organismos de evaluación de la
conformidad acreditados, discriminados así: 104 laboratorios de ensayos, 67
laboratorios de calibración, 31 organismos de certificación y 29 organismos
47
de inspección. A la misma fecha dicha entidad tenía un total de 185 solicitudes de
acreditación en trámite y 16 solicitudes de ampliación del alcance de acreditaciones
ya otorgadas.
Según las proyecciones de la demanda del futuro Organismo Colombiano de
Acreditación (OCA), a partir de las acreditaciones otorgadas por el SIC y el IDEAM
en el 2006 se realizó el calculo de la demanda para el periodo 2008-2012, en el cual,
en el año 2008 solamente se acreditarán organismos de certificación, organismos de
inspección y laboratorios de ensayo, en el año 2009 se iniciará la acreditación de
laboratorios de calibración y laboratorios clínicos/salud y en el año 2010 se iniciará la
acreditación de laboratorios ambientales siendo estas acreditaciones evaluadas
anualmente mediante una auditoría de seguimiento. (Ver Tabla 2).(Organismo
Nacional de Acreditación, 2007)
TABLA 2. Acreditaciones 2008-2012
Nuevas Acreditaciones
Según Área de Acreditación 2008 2009 2010 2011 2012
Organismos de Certificación 1 2 2 2 2
Organismos de Inspección 20 3 4 4 4
Laboratorios de Ensayo 10 13 14 16 18
Laboratorios de Calibración 0 8 9 11 12
Laboratorios Ambientales 0 0 4 5 5
Laboratorios Clínico/ Salud 0 1 3 5 7
Total 13 27 37 43 49
Por otro lado ha crecido la preocupación por la estandarización de metodologías para
de esta forma poder generar resultados confiables por parte de los diferentes
laboratorios ya sea que estos se encuentren o no acreditados. Debido a esto se han
48
creado programas como los llamados Interlaboratorios supervisados por la Red de
Laboratorios perteneciente al Laboratorio de Salud Pública, con actividades de
diagnóstico, referencia, contrarreferencia, control de calidad, capacitación,
investigación en apoyo a la vigilancia en salud pública, prevención, control y
seguimiento de enfermedades que se adelanta en atención a las personas y al medio
ambiente, análisis, vigilancia y control sanitario de medicamentos, sustancias
químicas de riesgo para la salud humana, productos biológicos, alimentos, bebidas,
cosméticos, insumos para la salud y productos varios (Secretaría Distrital de Salud:
Prospectiva del Laboratorio Distrital de Salud Pública, 2003)
La Red de Laboratorios de Alimentos se conformó en el año 2000 con 20 laboratorios
(2 de Universidades, 2 de Supermercados, 6 de Industrias y 10 particulares), para
iniciar con ellos el proceso de estandarización de técnicas y procedimientos. Al año
2003 se contaba con 104 laboratorios clínicos (76 privados y 28 públicos), 40
laboratorios de citopatología (39 privados y 1 público), 25 laboratorios privados de
alimentos y 25 laboratorios de Tamizaje neonatal (15 privados y 10 públicos) (Ver
Figura 1.).
Figura 1. Estadísticas de la Red de Laboratorios
20
54 60
20
82
20
85
22
35
20
104
25
40
25
8
0
20
40
60
80
100
120
1989 1998 2000 2001 2002 2003
R ED D E LABOR ATOR IOS
CLINICOSA LIM E NTOSCITO P A TO LOG ÍATA M IZA JE NE O NA TA LTO XICOLO GÍA
49
Fuente: Secretaría Distrital de Salud: Prospectiva del Laboratorio Distrital de Salud Pública, 2003
El enfoque de riesgo establecido en el sistema de vigilancia ambiental, permitió que
el uso de esta red fuera cada vez más racional. Esto se evidenció en el total de análisis
realizados en los laboratorios de físico químico y microbiología de alimentos al
reducir de 20.000 muestras en los años 1998 y 2000 a un promedio de 11.200 en los
años 2001-2003 (Ver Tabla 3) (Secretaría Distrital de Salud: Prospectiva del
Laboratorio Distrital de Salud Pública, 2003).
Los procesos de estandarización a los grupos operativos y la elaboración de
protocolos han sido pilares en este proceso de mejoramiento. Esto se evidencia por
ejemplo en los análisis realizados a los alimentos clasificados como de menor riesgo
que pasaron de 6000 muestras en el año 1998 a un número de 400 en el año 2002
(Ver Tabla 3).
También se determinó en conjunto con los diferentes grupos de trabajo y a la luz del
decreto 475 sobre vigilancia de la calidad del agua, establecer con claridad un
muestreo adecuado en las pruebas analíticas de agua, disminuyendo de 9000 a un
promedio de 6000 por año, que garantiza la vigilancia adecuada de la calidad de agua
de consumo humano (Secretaría Distrital de Salud: Prospectiva del Laboratorio
Distrital de Salud Pública, 2003).
Tabla 3. Grupos de alimento analizados en el Laboratorio de Salud Pública,
grupo de Vigilancia del Ambiente y del Consumo, años 1998 - 1999 – 2000 –
2001 –2002
1998 1999 2000 2001 2002
Aguas 6668 9933 6039 6005 5501
Mayor Riesgo 6867 10641 3591 1816 3094
50
Menor Riesgo 6042 298 202 413
Bebidas alcohólicas 823 1244 892 822 1272
Control Especial 1714 642 553 1377
Control de Calidad 410 457
Medicamentos 217 55 181 181
Microbiología Ambiental 11
Total 22114 22035 11517 9989 12306
Fuente: Secretaría Distrital de Salud: Prospectiva del Laboratorio Distrital de
Salud Pública, 2003
La tabla 3 también permite apreciar cómo el correcto funcionamiento de la red de
laboratorios de alimentos permite el aumento en el número de análisis con otras
entidades como las de control de calidad que incluye la supervisión indirecta a los
laboratorios de la red y las pruebas interlaboratorios que realiza el Laboratorio de
Salud Pública (LSP) con otras entidades como el Instituto Nacional de Vigilancia de
Medicamentos y Alimentos (INVIMA) y el Instituto Nacional de Salud (INAS).
El Programa Interlaboratorios de Control de Calidad para Agua Potable (PICCAP),
fue creado por el grupo de Salud Ambiental- SNRL del Instituto Nacional de Salud.
El programa consta de 3 envíos al año, de muestras sintéticas que se preparan y
envasan en ampollas de vidrio, que son empacadas y embaladas en material
apropiado. Con estas muestras control se determinan los parámetros básicos
contemplados en el Decreto 475 de 1998. Los resultados se tratan estadísticamente
para establecer el rango de resultados válidos: a) Cálculo de índices de variación
individual y móvile para determinar el desempeño del laboratorio, b) elaboración de
informes parciales y anuales para cada participante.
51
El Programa PICCAP ha impulsado la adecuación y el desarrollo de los Laboratorios
de Salud Pública y la estandarización de metodologías para generar resultados
confiables. Actualmente hay 218 laboratorios inscritos, convirtiéndose el PICCAP en
uno de los mejores programas de control de calidad externo de país (Crubellati, R. et
al, 2007).
5.2. MODELO MATEMÁTICO PRELIMINAR BÁSICO PARA LA
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ESTÁNDAR
La variabilidad representa la verdadera heterogeneidad de la población microbiana,
esto como consecuencia del sistema físico, bioquímico y micro-ecológico de la
muestra. En la microbiología tradicional la estabilidad de la muestra es considerada
como la variabilidad, pero en el modelo que se propone la variabilidad y la
incertidumbre forman un todo coherente después de un tiempo fijo.
Debido a lo anterior, se propuso un modelo de validación en microbiología de
proceso modular. Basándonos principalmente en la validación orientada a la muestra
como propuesta en este modelo, herramientas matemáticas como la distribución de
Poisson y la distribución binomial negativa, permiten realizar diferentes estimaciones
a partir de datos microbiológicos obtenidos desde la aplicación de un método,
permitiendo tomar determinaciones a cerca del funcionamiento de este. Cuando los
datos son obtenidos a partir de repeticiones de análisis de la misma muestra bajo
condiciones constantes, se analizan aplicando la distribución de Poisson y los datos
obtenidos a partir de muestras recolectadas de diferentes sitios son analizados
aplicando la distribución binomial negativa.
Esta guía plantea metodologías no solo matemáticas sino practicas ya que especifica
además, la toma de la muestra, el número de muestras tomadas, el método de
muestreo, entre otras variables que podrían o no afectar los resultados de la
validación de un método microbiológico, en caso que no se obtengan resultados
52
adecuados implicaría la realización del proceso nuevamente y esto acarrearía perdida
de tiempo y aumento de los costos de la validación que no es un proceso económico
en su implementación (Ver Anexo 1).
Por otro lado, teniendo en cuenta que los análisis microbiológicos repercuten
directamente en la salud tanto humana como animal, los métodos de ensayo, como
los laboratorios que realizan los análisis deben asegurar los resultados fiables, lo cual
implica que además de reunir los aspectos técnicos que aseguren su validez, se deben
poder reproducir y realizar con una serie de precauciones que conlleven a la
obtención de resultados comparables, independientemente del laboratorio que los
realice.
Para dar cumplimiento al propósito establecido por la ISO/IEC 17025 según la cual
“la validación es la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias
objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico
previsto”, se hace necesario el conocimiento de las características de funcionamiento
del método teniendo en cuenta que la validación de los métodos microbiológicos no
puede realizarse igual a la de métodos físicos o químicos debido a la variabilidad que
se puede presentar. Sin embargo, un laboratorio que realice actividades de control de
calidad interno y además participe en actividades interlaboratorios que lleven a cabo
comparaciones, está en la capacidad de obtener información sobre las características
de funcionamiento de los métodos.
La participación en actividades interlaboratorios permite el análisis del sesgo,
accediendo el laboratorio así a demostrar su permanencia dentro de los rangos de
aceptación definidos según las diferentes normas especificadas bien sea por el
laboratorio, por el cliente o por entidades estatales.
Debido a la carencia en la difusión de la información sobre estudios de validación ya
realizados, se hace necesaria la coordinación de todos los entes que participan en el
53
desarrollo de métodos para la validación con el fin de obtener metodologías más
completas, que faciliten al personal la toma de decisiones correctas en el proceso.
Al ser el objetivo de esta guía facilitar a los laboratorios la implementación de la
validación de sus pruebas microbiológicas, se pudo determinar a través de las
referencias consultadas que por la dificultad del tema no es fácil que las personas
involucradas en procesos microbiológicos se comprometan con el tema de la
validación, a pesar de saber que para garantizar los resultados obtenidos en los
análisis, se debe contar con metodologías, materiales y personal validado. Debido a
que los laboratorios se han preocupado únicamente en implementar metodologías
aceptadas por entes nacionales e internacionales, se ha olvidado el hecho de
comprobar si el método es capaz de alcanzar su rendimiento según las publicaciones
realizadas por estos entes (o si es capaz de cumplir los requisitos de las tareas
analíticas). El laboratorio debe realizar estudios de validación de esas metodologías
publicadas en las condiciones y ambiente en las que se desarrollan sus actividades:
EL LABORATORIO DEBE UTILIZAR UN MÉTODO BIEN ESTABLE CIDO,
PERO NO ESTUDIADO DE FORMA COLECTIVA (OENO, 2005) (AOAC
INTERNATIONAL, 2003), ya que el desempeño de los materiales, del personal y en
si de las pruebas de ensayo puede variar. Por ello lo que propone la guía debe ser
implementado y probado en las condiciones en las que se realizan normalmente los
ensayos, por lo que la comparación de los resultados de un laboratorio que ha
validado sus pruebas, no puede llevar al hecho de asumir los mismos resultados en
otro laboratorio.
Para seguir la metodología planteada por esta guía se discute también no solo la
competencia de las condiciones ambientales sino también de los materiales, así como
la más crítica y de gran importancia, la competencia técnica para desarrollar las
metodologías fuera y dentro del laboratorio (Cuesta, Alicia).
54
Al hablar de capacidad técnica y condiciones ambientales favorables para el
desarrollo de la validación, se debe hablar también de la utilización de elementos que
faciliten el proceso; como equipos, reactivos, medios de cultivo y cepas de referencia.
Esta ultima de gran importancia ya que se deben tener cepas de referencia para la
validación de métodos microbiológicos estándar (tema de esta investigación) y
métodos microbiológicos alternos. Por supuesto que la utilización de materiales y
condiciones favorables son indispensables en cualquier proceso de validación, pero
en el caso de esta guía se hablara de cepas de referencia, su conservación,
reconstitución y obtención de cepas de trabajo. (ISO 11133-1. 2000) Ya que del
tratamiento de éstas dependen los resultados de la validación de los ensayos.
55
6. CONCLUSIONES
• A pesar de encontrar disponibilidad de información sobre validación, se concluye
que la falta de interés, la falta de cultura de calidad, la desinformación, la falta de
personal capacitado, la escasez de recursos y la falta de incentivos y motivación
por parte de las entidades del Estado, dificultan la implementación de los
procedimientos de validación en los Laboratorios de Microbiología.
• El modelo propuesto es una herramienta preliminar para abordar el tema de la
validación, sin embargo, debe haber continuidad de los planteamientos
matemáticos tratados en la guía.
• La técnica, la matriz y la variable son factores influyentes en el proceso de
validación ya que dependen específicamente del objetivo del método abordado
por el analista, por lo tanto es importante diferenciar el tipo de matriz para así
poder definir la técnica o metodología a aplicar y poder hallar la variable de
interés de forma adecuada.
• El conjunto de herramientas matemáticas propuestas, plantea a partir de la
estadística no paramétrica, la estimación de la exactitud y precisión de las
mediciones microbiológicas con el fin de poder expresar cuantitativamente las
observaciones que se hacen a nivel de microbiología estándar.
• La distribución de Poisson y la binomial negativa permiten por medio de datos
obtenidos a través de diferentes condiciones de muestreo, realizar estimaciones
que permitan tomar decisiones sobre los métodos utilizados en las validaciones a
realizar.
56
7. RECOMENDACIONES
• En lo posible, deberían realizarse los estudios necesarios para obtener una
estimación realista del número y la gama de efectos que se producen durante el
uso normal de un método, al tiempo que se deben analizar la gama de
concentraciones y de tipos de muestra que abarca el método.
• Se debe hacer seguimiento al modelo matemático planteado en este trabajo, con el
fin de especificar, mejorar y profundizar todos los aspectos que en este se definen
• Se recomienda la realización de un protocolo o de otra guía que contemple la
validación de métodos microbiológicos alternos, para abarcar y avanzar más en el
tema de la validación en microbiología.
• Realizar estudios complementarios, incluyendo estudios prácticos donde se
realice un despliegue específico de propiedades de las validaciones como
reactivos y medios de cultivo, equipos, cepas de referencia, entre otros.
• Se sugiere inculcar en los diferentes laboratorios el interés por la implementación
de procedimientos que permitan la mejora continua en los métodos utilizados.
• Validar e implementar la aplicación de la presente guía o de documentos
similares en laboratorios de pruebas y ensayos, que faciliten el proceso de
validación de estos.
57
8. REFERENCIAS
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MD20877-2417, USA
AOAC Research Institute. AOAC Performance Tested Methods SM Program,
AOAC International, Gaitherburg, MD 20877-2417, USA
AOAC INTERNATINAL. AOAC International Cuts the Number of Laboratories
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http://64.55.218.151/pubs/storyarchives/cutlabs.htm. 8/28/2003
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