Reduccin de fenoles totales, DQO y DBO5 en licor negro por el hongo Pleurotus ostreatus

Reduccin de fenoles, DQO, DBO5 y color en licor negro por el hongo Pleurotus ostreatusANEXO D(Artculo para revisin Revista Colombiana de Biotecnologa)

Disminucin de fenoles, DQO, DBO5 y color en licor negro por el hongo Pleurotus ostreatus

Decreased phenols, COD, BOD5 and color in black liquor by the fungus Pleurotus ostreatus

Ivn Felipe Vidal Martnez*, Ricardo Bentez Bentez**, Clara Ins Giraldo***

RESUMENLa presencia de material lignocelulsico y coloracin ligada a ste, en aguas residuales de la industria papelera es un problema ambiental y sanitario, porque muchos de estos compuestos pueden ser txicos y/o cancergenos para las poblaciones biolgicas que hacen uso de los ros en los que se desechan estas aguas. La biorremediacin es una alternativa para la remocin de este tipo de material. En el presente trabajo se evalu la capacidad de una cepa no identifica del hongo ligninoltico Pleurotus ostreatus de degradar lignina (material lignocelulsico) contenida en licor negro proveniente del pulpeo de bagazo de caa. La cepa fue incubada en medio lquido e inmovilizada en malla de polietileno sin agitacin. Se midieron los parmetros fisicoqumicos fenoles totales (en extracto de lignina), DQO, DBO5, color American Public Health Association (APHA) y color National Council for Air and Stream Improvement (NCASI) durante 21 das cada 3 das. Se encontr que la cepa P. ostreatus sp., fue capaz de reducir el valor de los parmetros analizados en 56,3% para los fenoles totales, 80,0% de la DQO, 39,4% de la DBO5, 53,9% de unidades de color APHA y 58,4% de unidades de color NCASI en licor negro diluido al 2% a travs de los 21 das. Esta disminucin es coherente con una deslignificacin llevada a cabo muy posiblemente por las enzimas ligninolticas de la cepa P. ostreatus, y permite calificar a la especie P. ostreatus como un BUEN degradador de material lignocelulsico del licor negro diluido, an sin una adaptacin prolongada.

Palabras clave: Lignina, enzimas ligninolticas, pudricin blanca, inmovilizacin fngica.

ABSTRACTThe presence of lignocellulosic material and color linked to it, in waste water of the paper industry is an environmental and health problem because many of these compounds may be toxic and/or carcinogenic to biological populations who use the rivers in which these waters are discarded. Bioremediation is an alternative for the removal of such material. In this study we evaluated the ability of a strain does not identify the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus to degrade lignin (lignocellulosic material) contained in black liquor from the pulping of bagasse. The strain was incubated in liquid medium and immobilized in polyethylene mesh without agitation. Physicochemical parameters were measured total phenols (lignin extract), COD, BOD5, color APHA and color NCASI by 21 days every 3 days. It was found that the strain P. ostreatus sp., was able to reduce the value of the parameters analyzed in 56.3 % for total phenols, 80.0 % of COD, BOD5 39.4%, 53.9% APHA color units and 58.4 % of NCASI color units in black liquor diluted to 2% over the 21 days. This decrease is consistent with a delignification performed quite possibly by ligninolytic enzymes of the strain P. ostreatus, and able to qualify the species P. ostreatus as NICE degrading lignocellulosic material diluted black liquor, even without prolonged adaptation.

Key words: Lignin, ligninolytic enzymes, white rot, fungal immobilization.

INTRODUCCIN

En pos de convertir los procesos productivos en procesos limpios y eficientes energticamente, el uso de la biotecnologa desempea un papel crucial en esta transformacin tecnolgica. La aplicacin de microorganismos para la prevencin, control y remediacin de la contaminacin se presenta como una alternativa para reducir o eliminar el impacto ambiental generado por sta (Dvila y Vsquez, 2006). Entre estas alternativas se encuentran el uso de hongos de pudricin blanca ya que pueden usar sistemas enzimticos para la transformacin de contaminantes y compuestos xenobiticos (Ali y Sreekrishnan, 2001). Esta capacidad surge de la necesidad de alimentarse con celulosa y hemicelulosa, pero a partir sustratos lignocelulsicos, en los cuales estos compuestos se encuentran fuertemente enlazados con lignina (Lange et al. 2013).

La lignina es un heteropolmero muy recalcitrante que conserva parte de su estructura an despus de ser sometido a digestin para liberar la celulosa, tal como sucede en las industrias de pulpa y papel. Estas industrias producen grandes cantidades de efluentes de desecho con un alto y variado contenido de compuestos txicos (Prez et al. 2002).

La carga orgnica y el color de estos efluentes se debe principalmente a la lignina, a los derivados de lignina y a taninos polimerizados, que son en su mayora descargados del pulpeo, blanqueo y las secciones de recuperacin, por lo tanto, los efluentes de estas etapas estn muy coloreados y aportan el 80% de color, el 30% de la DBO y el 60% de DQO a la carga total de contaminacin de la planta (Lara et al. 2003).

La capacidad de transformacin de contaminantes y xenobiticos de los hongos de pudricin blanca, en especial su capacidad ligninoltica debida a la actividad oxidativa y la baja especificidad de sustrato de las enzimas ligninolticas (Lignino Peroxidasa, LiP; Manganeso Peroxidasa, MnP; y Lacasa, Lac), los hace ideales para su uso como biorremediadores de ste tipo de situaciones. Es por esta razn que en este trabajo de investigacin se utiliz el hongo ligninoltico Pleurotus ostreatus para degradar la lignina contenida en el licor negro proveniente de la fabricacin de pulpa de papel a partir de bagazo de caa, a travs una biopelcula formada con el hongo inmovilizado. Asimismo se determin la concentracin de fenoles totales (grupo representativo de la lignina) y algunas caractersticas fisicoqumicas (DBO, DQO, color) del licor negro antes, durante y despus de la experiencia.

Mediante esta experiencia se espera aportar informacin sobre la capacidad degradadora (de una especie de hongo muy utilizada) de lignina y el cambio de algunos parmetros fisicoqumicos hdricos en un sustrato prcticamente desconocido.

MATERIALES Y MTODOS

Obtencin del microorganismo. En este estudio se utiliz una cepa de Pleurotus ostreatus sin identificar donada por el cepario del Centro Nacional de Investigaciones del Caf (CENICAFE). Chinchin, Caldas, activada y conservada segn especificaciones del proveedor.

Obtencin del efluente. La muestra que se utiliz en este estudio se recolect del canal que transporta el licor negro desde el digestor hacia la torre de recuperacin de la empresa Carvajal Pulpa y Papel (antes PROPAL S.A.), Colombia. A la muestra se le retiraron los slidos suspendidos de mayor tamao. La muestra fue tomada por la empresa, y almacenada en refrigeracin en un recipiente de plstico.

Activacin y replicacin del hongo. La cepa fue sembrada en medio slido de Agar Extracto de Malta (EMA) el cual contiene Extracto de Malta 12,75 g/L; Dextrina 2,75 g/L; Glicerina 2,35 g/L; Peptona de Gelatina 0,78 g/L; Agar 15,0 g/L. La incubacin se realiz a 28 C por 10 das.

Medio de cultivo de pre-adaptacin. El hongo fue sembrado en medio de cultivo slido EMA que adems contena licor negro diluido al 2% suplementado con 0,0113 g/L de CuSO4; 0,1 g/L de ZnSO47H2O; 0,1 g/L FeSO47H2O, 0,5 g/L MnSO4H2O; 0,5 g/L MgSO47H2O; 1 g/L KH2PO4 y 0,1 g/L CaCl22H2O para la activacin de enzimas ligninolticas (Fernndez et al. 2009). Adems fue suplementado con Glucosa como fuente de Carbono (co-sustrato) 1 g/L, y Tartrato de Amonio 0,2 g/L como fuente de Nitrgeno (Wu et al. 2005).

Biorreactores a microescala, inmovilizacin y condiciones de cultivo. Se realiz un montaje de biorreactores a microescala por triplicado en el cual se sembr al hongo en un medio lquido, en ste se utilizaron 150 mL de licor negro diluido al 2% y suplementado como en la pre-adaptacin, pero con 3,2 g/L de Extracto de Malta; 0,7 g/L de Dextrina; 0,6 g/L de Glicerina; y 0,195 g/L de Peptona de Gelatina (un cuarto de los componentes del agar EMA, debido a que el hongo present crecimiento con estas cantidades en ensayos preliminares, no mostrado). El licor suplementado fue dispuesto en frascos de 250 mL junto con una malla de polietileno (soporte de inmovilizacin de 50 de largo por 5 de ancho), dispuesta en forma enrrollada. El conjunto fue esterilizado antes de la siembra, luego inoculado con 5 discos de agar de 1 cm de dimetro que contena el hongo P. ostreatus sp., crecido (10 das de incubacin). Los discos fueron dispuestos aleatoriamente entre las paredes de la malla. Todos los frascos fueron tapados con tapones de algodn y gasa, y recubiertos con cinta vinipel para evitar contaminacin cruzada y permitir el paso de oxgeno hacia el interior del biorreactor. Los montajes finalmente fueron incubados a 28 C por 21 das sin agitacin. Se prepar un control con idnticas condiciones a las repeticiones, pero sin hongo. Adems se realiz el seguimiento del cambio de los parmetros fisicoqumicos (fenoles totales, DQO, DBO5 y color) durante el transcurso del bioensayo realizando muestreo en cmara de flujo laminar cada 3 das, las muestras fueron centrifugadas (3000 r.p.m.) y filtradas cuando se requiri.

Determinacin de la concentracin de fenoles totales en el licor negro. Mediante este ensayo se determin el cambio en la concentracin de los fenoles totales en la lignina extrada de las muestras de licor negro diluido sometidas a deslignificacin por efecto del hongo P. ostreatus. Como es sabido la composicin qumica del licor negro se puede considerar como una solucin acuosa compleja, que comprende materiales orgnicos (lignina, polisacridos y compuestos resinosos de baja masa molecular) y compuestos inorgnicos (principalmente iones de sales solubles) (Cardoso et al. 2009). La lignina a su vez al ser una molcula muy compleja, compuesta en gran medida por grupos hidroxilo fenlicos (1,5 a 5,1% para bagazo de caa dependiendo del solvente de extraccin segn Mousavioun y Doherty, 2010), que toman parte o se forman en diversas rutas metablicas en la biodegradacin, son por tanto indicadores de un cambio en la estructura de la lignina.

Precipitacin de lignina. Se filtr la muestra para retirar impurezas y materiales fibrosos. Seguidamente se calent a 50 C en agitacin constante; con gotero se agregaron pequeas cantidades de cido sulfrico (H2SO4) 1N hasta alcanzar un pH igual a 2. La suspensin obtenida al precipitar la lignina se llev a centrifugacin a 2500 rpm por 20 minutos con la finalidad de separar el precipitado. Esta precipitacin se entremezcl con filtracin y sucesivos lavados del residuo obtenido con una solucin de NaOH 1N, agua desionizada (para reducir el contenido de Azufre) y hexano (para eliminar los compuestos orgnicos de bajo peso molecular). Dado que la purificacin se llev a cabo mediante la extraccin con hexano, se sec la lignina antes y despus de la extraccin con el mismo. Finalmente, el precipitado se llev a la estufa a 50 C, por 24 horas (Cardozo et al. 2009).

Extraccin con solventes. En Beacker de 100mL se le aadieron 25mL de agua a la muestra de lignina seca. Se someti a agitacin durante algunos minutos. Luego se decant, y el sobrenadante y se almacen; al residuo slido se le aadi el mismo solvente y se repiti todo el procedimiento anterior hasta alcanzar un sobrenadante incoloro. Al obtener todo el sobrenadante, ste se llev a la estufa a 50 C por 24 horas. De esta forma, se elimin el agua, y se obtuvo la fraccin de lignina extrada. Para aumentar la solubilidad de la fraccin, la muestra se someti a ultrasonido durante 30 segundos (Gonzales et al. 2007).

Anlisis de las fracciones. Las muestras se solubilizaron en hidrxido de sodio 0,01N. A 500 L de muestra, se adicionaron 2,5 mL de reactivo de Folin diluido 1/10. La mezcla se agit por 3 minutos y luego se aadieron 2 mL de Na2CO3 al 7,5 %. La intensidad del color desarrollada a las 2 horas se medi a 760 nm ante un blanco preparado de la misma manera con agua. La concentracin de fenoles fue determinada a partir de una curva de calibracin preparada por triplicado, usando fenol como estndar (Gonzales et al. 2007). La solucin stock de Fenol fue preparada y/o estandarizada siguiendo las recomendaciones del Mtodo Estndar (APHA, 1992) para determinacin de fenoles 5530 C.

Determinacin Demanda Qumica de Oxgeno, DQO 5220 D. Se realiz este ensayo con el fin de observar el cambio de la materia orgnica (qumicamente oxidable) presente en el licor negro como respuesta al proceso de biodegradacin generado por el hongo P. ostreatus. La metodologa utilizada fue la de DQO de reflujo cerrado, mtodo colorimtrico 5220 D del Mtodo Estndar (APHA, 1992).

Determinacin Demanda Bioqumica de Oxgeno, DBO5. El objetivo de esta determinacin fue la de corroborar junto con la DQO un cambio en la materia orgnica presente en el licor negro como respuesta al proceso de biodegradacin generado por el hongo P. ostreatus. Para esta prueba se sigui la metodologa de determinacin respiromtrica en bimetros Oxitop, de la DBO5 en aguas residuales contaminadas con productos orgnicos, toxinas o inhibidores inorgnicos (Slevogt, 2010) basada en el Mtodo Estndar en su metodologa 5210.

Determinacin del color verdadero por los mtodos estndar APHA de Platino-Cobalto y NCASI (medicin de color en las aguas residuales de plantas de celulosa). La prueba de color fue realizada con el fin de observar el cambio de este parmetro con respecto al tiempo como respuesta al proceso de biodegradacin generado por el hongo P. ostreatus. Se sigui la metodologa descrita para la determinacin del color, verdadero, aparente y NCASI descrita en el Mtodo estndar APHA 2120 de platino-cobalto para agua, aguas residuales y agua de mar. Equivalente al mtodo NCASI 253 y NCASI Mtodo Color de 71.01 (NCASI, 2000) para pulpa y el papel de efluentes utilizando 465 nm (requiere ajuste de pH).

Anlisis de la informacin. Se evaluaron para los datos obtenidos el tipo de distribucin, homogeneidad de varianzas, efectos principales e interacciones de las variables mediante pruebas paramtricas o no paramtricas cuando fue el caso. Adems para todos los casos que requirieron curvas de calibracin se realiz el anlisis mediante estadstica de regresin. Adems se realiz una prueba de correlacin simple de Pearson con el objetivo de verificar si existe independencia o no entre los parmetros determinados. El manejo estadstico integral de la informacin se realiz mediante el paquete estadstico SPSS Statistics versin 11.5.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Determinacin de la concentracin de fenoles totales. En la figura 1 se observa la tendencia de la concentracin de fenoles totales (en extractos de lignina) en el control y en las repeticiones durante el transcurso del ensayo final, en este puede notarse una disminucin de la concentracin de fenoles totales en los 21 das.

Figura 1. Tendencia de la concentracin de fenoles totales en el transcurso de los 21 das.

Esta tendencia puede explicarse en parte gracias a la actividad de las enzimas ligninolticas tales como: Manganeso Peroxidasa (MnP), Verstil Peroxidasa (VP) y Lacasas (Lac), debido a que en primera instancia complejos quelatos de Mn (III) actan como oxidantes difusibles de sustratos fenlicos que involucran la oxidacin por 1e- del sustrato para producir un radical fenoxlo intermediario, el cual se somete a reordenamientos, divisiones de enlaces, y la degradacin no enzimtica para producir diversos productos de degradacin (figura 2). El Mn (III) generado por la MnP puede catalizar la oxidacin de fenoles simples, aminas, colorantes, as como subestructuras fenlicas de lignina y dmeros. Por su parte la VP al combinar los ciclos catalticos de Lignino peroxidasa (LiP) y MnP produce en ltimas, mecanismos de oxidacin de sustratos fenlicos similares (Wong, 2009; Hofrichter, 2002). Finalmente en subestructuras fenlicas de lignina, las lacasas catalizan la sustraccin de 1e- de los grupos hidroxil fenlicos para formar nuevamente radicales fenoxlo, esta reaccin conduce a rompimientos C C, oxidacin del C (figura 2, estructura 9), rompimiento aril-alquil (figura 2, estructuras 4 y 6) y rompimiento de anillos aromticos, tambin viene acompaada por desmetilacin, y formacin de quinonas Wong, 2009; Hofrichter, 2002; Martnez, A., et al, 2005).Resultados similares a los observados en este estudio fueron encontrados por Fountoulakis et al. 2002 y Aggelis et al. 2003, quienes obtuvieron una reduccin de hasta 78,3% y 80% respectivamente de fenoles totales en aguas residuales de molienda de oliva utilizando P. ostreatus. La cintica de la concentracin de fenoles totales mostrada en este estudio arroj en promedio una disminucin del 78,3% de este parmetro con respecto al control (figura 10), mientras que con respecto al licor negro diluido al 2% fue del 56,3%. Adems la tendencia muestra para los das 3 y 12 un aumento no significativo de la concentracin de fenoles totales, sugiriendo un aumento de la actividad ligninoltica previa a la fase de oxidacin de los nuevos fenoles formados, tambin se infiere que el proceso de reduccin de fenoles totales pudo ocurrir en 2 ciclos: (i) el aprovechamiento por parte del hongo de compuestos que le sirvan de alimento tales como: celulosa, xilnos, hemicelulosa, glucosa, tartrato de amonio, etc., para el crecimiento y establecimiento de la comunidad (Wu et al. 2005; Martnez, M., et al. 2005) y (ii) una verdadera deslignificacin a partir del da 9, en la que el hongo ya establecido y con poca alimentacin hace un mayor uso de sus enzimas para degradar la lignina y asimilar compuestos enlazados a esta o de metabolitos generados a partir de esta (Martnez, A., et al, 2005).

Determinacin de la DQO. En la figura 3 se observa la tendencia de la DQO del control y de las repeticiones durante el transcurso del ensayo final, en esta se muestra un descenso de la DQO a los 21 das para todas las repeticiones.

Esta tendencia puede atribursele (en parte) a la previa oxidacin de sustratos no fenlicos llevada a cabo por las enzimas ligninolticas MnP y VP, debido a que estos sustratos contienen grupos funcionales oxidables por el dicromato tales como: aldehdos, alcoholes, tioles, aminas, y alquenos (principalmente en cidos Grasos Insaturados, AGI) (Hofrichter, 2002). En estos sustratos la oxidacin por Mn (III) involucra la formacin de radicales reactivos en presencia de un segundo mediador. Entre estos mediadores, los compuestos orgnicos de azufre, tales como los grupos SH (contenidos en pptidos y liberados durante la lisis parcial de las clulas pueden servir como fuente de mediadores tiol), han mostrado promover la oxidacin de AV y dmeros modelo no fenlicos de lignina (-O-4) en la posicin benclica, lo que da lugar a la escisin aril-ter de los dmeros (figura 4). Un segundo sistema propuesto es el de la mediacin de cidos grasos insaturados y sus derivados (lpidos), ste acta de una manera similar al anterior mediante la generacin de intermediarios reactivos (radicales perxilo) de estructuras de cidos grasos insaturados (peroxidacin lipdica). Como resultado, el sistema de MnP-lpido es lo suficientemente fuerte como para degradar C-C y -aril-ter (Hofrichter, 2002). Por su parte las lacasas oxidan compuestos no fenlicos de la lignina que contengan hidroxilos alifticos ubicados en cadenas laterales (figura 5) u oxidacin del C (figura 2, estructura 9), tambin puede darse la oxidacin de estos mismos mediante la adicin de mediadores tales como: ABTS, HBT y NHA (Lange et al. 2013; Wong, 2009).

Figura 3. Tendencia de la DQO en el transcurso del bioensayo final para el control y las repeticiones.

Entre otras la tendencia muestra que para el da 3 hay un aumento no significativo de la DQO, correspondiente con la posible oxidacin por parte del dicromato de nuevos grupos funcionales expuestos en el sustrato, debido al metabolismo de sustancias de alimento tales como: celulosa, xilnos, hemicelulosa, glucosa, tartrato de amonio, etc., o al proceso de deslignificacin que expone principalmente: aldehdos y alcoholes. Tambin se observa una etapa constante entre los das 12 y 18, sugiriendo un equilibrio entre la aparicin y desaparicin de grupos funcionales oxidables causada por la deslignificacin y la peroxidacin por las enzimas ligninolticas, respectivamente.

En este estudio se confirma el descenso de este parmetro observado por Wu et al. 2005, en el cual se utiliz licor negro al 20% proveniente de maderas duras y en el que se obtuvo una eficiencia de remocin de la DQO del 48% por parte del hongo ligninoltico P. ostreatus. Otros estudios como son los de Belm et al. 2008; y Pedroza et al. 2006, obtuvieron porcentajes de remocin de la DQO del 67% y 80% respectivamente, utilizando el mismo hongo y aguas residuales de industria papelera. La cintica de la DQO observada en este estudio exhibi en promedio una disminucin de la DQO del 89,9% con respecto al control (figura 10), y del 80,0% con respecto al licor negro diluido al 2%.

Fuente: Hofrichter, 2002

Figura 4. Esquema propuesto por Hofrichter para la oxidacin de dmeros modelo de lignina no fenlicos estructura no fenlica -O-4 (R1 = H o OCH3, R2 = H o CH2OH) (1) con MnP en presencia de cualquiera: glutatin reducido (GSH) o cidos grasos insaturados (UFA); correspondiente radical benclo de 1 (2); radical peroxilo formado despus de la adicin de O2 (3); forma ceto de 1 (4), productos de escisin: radical fenoxilo (5) derivado 1-(4-etoxi-3-metoxi)-1-hidroxi-3-hidroxi-propano (6); forma ceto de 6 (7).

321Fuente: Lange et al. 2013.

Figura 5. Oxidacin de cadenas laterales de sustratos no fenlicos por la lacasa; 3,3-dimetoxi-2,2,5,5-tetrametil-1,1-bifenil (1); (5,5-dimetoxi-6,6-dimetil-[1,1-bifenil]-3,3-diil)dimetanol (2); 5,5-dimetoxi-6,6-dimetil-[1,1-bifenil]-3,3-dicarbaldehdo (3)

Determinacin DBO5. La figura 6 muestra la tendencia de la DBO5 del blanco del agua de dilucin, el control glucosa-cido glutmico, el control del bioensayo y las repeticiones los mismos durante el transcurso del bioensayo.

Figura 6. Tendencia de la DBO5 en el transcurso del ensayo final para el control y las repeticiones.

El comportamiento exhibido de la DBO5 durante el transcurso de los 21 das, mostrada en la figura 6, es causado en su orden por: el aprovechamiento de los nutrientes adicionados al medio y por la accin conjunta de enzimas ligninolticas, celulasas, xilanasas, entre otras de P ostreatus (Snchez, 2009). El hongo en primera instancia hace uso de los nutrientes adicionados al medio (Wu et al. 2005; Martnez, M., et al. 2005), de fracciones libres de celulosa y hemicelulosa, cidos grasos, derivados de cido benzoico entre otros (Chandra et al. 2011) en el licor negro, estos mismos nutrientes, parte de las fracciones y los dems son utilizados por la batera de bacterias del inculo permitiendo en principio una alta tasa de oxidacin de los mismos. Conforme avanza el tiempo, la concentracin de nutrientes y fracciones libres disminuye, entonces el hongo hace uso de las enzimas mencionadas anteriormente comenzando por las ligninolticas, las cuales exponen mediante degradacin nutrientes que las celulasas aprovechan (hidrolizando enlaces -1,4-glicosdicos de remanentes de celulosa enlazada con la lignina del licor negro), seguido de la accin de xilanasas que en conjunto con otras enzimas (esterasas) producen principalmente xilosa, manosa y oligosacridos (a partir de hemicelulosa enlazada con la lignina) (Snchez, 2009), los cuales tambin son aprovechados por las bacterias del inculo. ste ltimo sobrevive en contra de varios factores como son: baja disponibilidad de nutrientes, acumulacin de toxinas (fenoles entre otros Tuomela et al. 2000), y aumento de la poblacin microbiana.La disminucin de la DBO5 en sustratos afines al utilizado en este estudio fue reportada por Sharari et al. 2013, quienes utilizaron aguas residuales de industria papelera (a partir de bagazo) y el hongo P. Chrysosporium inmovilizado en espuma de poliuretano, obteniendo un descenso de la DBO5 del 98,3%. Asimismo Olivieri et al. 2012, obtuvo disminucin de este parmetro del 59,1%, utilizando P. ostreatus sobre un sustrato de aguas residuales de molienda de oliva. En este estudio la disminucin de la DBO5 alcanz una reduccin del 74,4% con respecto al control (figura 10) y de 39,4% con respecto al licor negro al 2%, lo cual puede considerarse bueno para una cepa no adaptada.

Color APHA y NCASI. Las figuras 7 y 8 muestran el comportamiento del color del control y las repeticiones durante el transcurso del bioensayo para ambas pruebas.

Figura 7. Tendencia del color APHA durante el transcurso del bioensayo, del control y las repeticiones.

El comportamiento del color en ambas pruebas fue similar y al final del bioensayo mostraron una disminucin del mismo. Asimismo tanto para la prueba de color APHA como para la de NCASI se presentan altibajos de las UPtCo. Este comportamiento puede explicarse si se tiene en cuenta que en principio, el material lignocelulsico contenido en el licor presenta gran variedad de estructuras orgnicas altamente conjugadas (taninos, estilbenos, lignanos, flavonoides, quinonas, etc.) enlazadas a cromforos (carboxilatos, carbonilo, etilnico) y auxocromos (OH, NH2 y halgenos) bajo efectos crmicos (batocrmico e hipercrmico) sobre estas, que generan altos valores de absorcin en el ultravioleta y que llegan incluso al rango del visible en el que se midieron ambas pruebas (455-465 nm) (Dyer, 2004). Luego por efecto de la despolimerizacin de estas estructuras (en parte producido por las enzimas ligninolticas), el ocultamiento de cromforos y auxocromos as como la aparicin de efectos hipsocrmicos e hipocrmicos produce la disminucin de la absorcin (como se observa para el da 3 en ambas pruebas). Posteriormente una combinacin de estos ltimos eventos, ms la exposicin de nuevos cromforos (figura 9) y auxocromos (figura 5, estructura 2), la formacin de nuevos enlaces conjugados y un posible pardeamiento enzimtico, producen la variacin de las UPtCo en un sentido o en otro (aumento o disminucin).

Figura 8. Tendencia del color NCASI durante el transcurso del bioensayo, del control y las repeticiones.

Figura 9. Formacin de nuevos enlaces y cromforos; (E)-4-(2-hidroxi-3-metoxi-5metilestiril)-2-metoxi-6-metifenol (1); (E)-2-metoxi-6-((Z)-2-(3-metoxi-5-metil-4-oxociclohexa-2,5-dien-1-ilideno) etilideno)-4-metilciclohexa-2,4-dienona (2)

La disminucin en las unidades de color tambin ha sido reportada por Fountoulakis et al. 2002 en aguas residuales de molienda de olivo (diluida al 50% y esterilizada) utilizando P. ostreatus, alcanzando una reduccin de hasta un 60,7% a 600 nm. Ragunathan y Swaminathan. 2004 tambin reportaron disminucin de hasta un 66,7% utilizando varias cepas de Pleurotus en un tratamiento biolgico (a escala de laboratorio) de efluentes papeleros. En Colombia Garzn. 2009, Fernndez et al. 2009 y Moreno y Ospina. 2008 presentaron resultados sobre la disminucin de la concentracin de colorantes industriales, utilizando P. ostreatus.

La disminucin del color APHA y NCASI observada en este estudio alcanz respectivamente un 54,6% y 61,3% con respecto al control (figura 10), y de 53,9% y 58,4% con respecto al licor negro al 2%.

Porcentaje de disminucin de los parmetros determinados. El cuadro 1 muestra el valor inicial de cada parmetro determinado en el licor negro al 2%, el valor final del licor suplementado y el porcentaje de reduccin sobre el licor negro al 2%. Se advierte que el menor porcentaje fue el registrado para la DBO5, mientras que el mayor se present en la DQO. Los dems parmetros estuvieron cerca del 50% lo cual es muy significativo teniendo en cuenta que se utiliz una cepa con un aproximado de 6 meses de adaptacin a este tipo de sustratos.

Cuadro 1. Valores inicial (antes del bioensayo) y final (despus del bioensayo) de cada parmetro del licor negro al 2%.

ParmetroInicial*Final**Reduccin (%)

Fenoles totales (mg/L)53,8 9,823,5 6,456,3

DQO (mg O2/L)2094,8 206,7419,0 97,380,0

DBO5 (mg O2/L)554,2 50,4333,3 52,739,4

Color APHA (UPtCo)4092 151,41886,7 121,853,9

Color NCASI (UPtCo)3788 140,21575,5 102,858,4

*Valor promedio de las evaluaciones e incertidumbre absoluta.** Valor promedio de las repeticiones del bioensayo e incertidumbre absoluta.

Correlacin de los parmetros determinados y el tiempo del bioensayo. Para determinar el grado de relacin de los parmetros y el tiempo del bioensayo se utiliz la correlacin de Pearson la cual es un ndice que mide la relacin lineal entre dos variables aleatorias cuantitativas y es independiente de la escala de medida de las variables. El cuadro 2 muestra que existe correlacin negativa y significativa (99,9%) entre el tiempo (da) y los parmetros DQO, DBO5 y fenoles, lo que implica que los valores de dos variables varan justamente al revs: los sitios con altos valores en una variable (en X), tienden a tener bajos valores en otra variable (en Y), y los que tienen bajos valores en X, tienden a tener altos valores en Y). Adems se muestran varias correlaciones positivas y significativas (99,9%) tales como las que existen entre: DQO y fenoles, DQO y DBO5, fenoles y DBO5, Color APHA y color NCASI. Esto implica que los valores de las dos variables varan de forma similar: los sitios con altos valores en una variable (en X), tienden a tener altos valores en otra variable (en Y) y los que tienen bajos valores en X, tienden a tener bajos valores en Y. Los dems emparejamientos presentan correlaciones positivas y negativas pero no son significativas.

Cuadro 2. Correlacin de Pearson entre los promedios de cada parmetro evaluado en este estudio y el tiempo.

TiempoDQOFenolesDBOAPHANCASI

TiempoCorrelacin de Pearson1-0,930(**)-0,902(**)-0,927(**)-0,473-0,325

Sig. (bilateral).0,0010,0020,0010,2370,432

N888888

DQOCorrelacin de Pearson-0,930(**)10,879(**)0,814(*)0,3410,275

Sig. (bilateral)0,001.0,0040,0140,4080,510

N888888

FENOLESCorrelacin de Pearson-0,902(**)0,879(**)10,935(**)0,3950,193

Sig. (bilateral)0,0020,004.0,0010,3330,647

N888888

DBOCorrelacin de Pearson-0,927(**)0,814(*)0,935(**)10,5690,355

Sig. (bilateral)0,0010,0140,001.0,1410,388

N888888

APHACorrelacin de Pearson-0,4730,3410,3950,56910,929(**)

Sig. (bilateral)0,2370,4080,3330,141.0,001

N888888

NCASICorrelacin de Pearson-0,3250,2750,1930,3550,929(**)1

Sig. (bilateral)0,4320,5100,6470,3880,001.

N888888

** La correlacin es significativa al nivel 0,01 (bilateral).

Figura 10. Porcentaje de reduccin de cada parmetro en el licor suplementado (control).CONCLUSIONES

El bioensayo mostr una reduccin de los parmetros: fenoles totales (56,3%), DQO (80,0%), DBO5 (39,4%), color APHA (53,9%) y color NCASI (58,4%) en el licor negro al 2% a travs de los 21 das. El comportamiento de los parmetros fenoles totales, DQO y DBO5 durante los 21 das fue similar o tuvo la misma tendencia, conforme avanz el tiempo: disminuyeron su valor (correlacin negativa y significativa).

En este estudio se comprueba la reduccin de algunos parmetros fisicoqumicos tales como: fenoles totales, DQO, DBO5, color APHA y color NCASI, reportado en otros estudios con similar razn cientfica, adems de la formacin de una biopelcula del hongo P. ostreatus. Esta disminucin es coherente (por motivos ya explicados) con una deslignificacin llevada a cabo muy posiblemente por las enzimas ligninolticas de la cepa P. ostreatus, y permite calificar a la especie P. ostreatus como un BUEN degradador de material lignocelulsico del licor negro diluido, an sin una adaptacin prolongada.

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