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UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E
EXPERIMENTAL
Privação alimentar materna na geração F0 e dieta hipercalórica na geração F1
reduzem a expressão de GFAP em diversas áreas do SNC após desafio
imunológico da geração F2
THAIS BANDOUK CARVALHO OGASSAWARA
SÃO PAULO
2016
2
UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA AMBIENTAL E
EXPERIMENTAL
THAIS BANDOUK CARVALHO OGASSAWARA
Privação alimentar materna na geração F0 e dieta hipercalórica na geração F1
reduzem a expressão de GFAP em diversas áreas do SNC após desafio
imunológico da geração F2
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista – UNIP para obtenção do título de Mestre em Patologia Ambiental e Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Fernandes Bondan Coorientadora: Profa. Dra. Maria Martha Bernardi
SÃO PAULO
2016
3
Ogassawara, Thais Bandouk Carvalho.
Privação alimentar materna na geração F0 e dieta hipercalórica na geração F1
reduzem a expressão de GFAP em diversas áreas do SNC após desafio imunológico
da geração F2 / Thais Bandouk Carvalho Ogassawara. - 2016.
53 f. : il. color. + CD-ROM.
Dissertação de Mestrado Apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista, São Paulo, 2016.
Área de Concentração: Modelos Experimentais em Patologia e Toxicologia.
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Fernandes Bondan.
1. Astrócitos. 2. Dieta hipercalórica. 3. Efeitos transgeracionais. 4. Privação
alimentar materna. I. Bondan, Eduardo Fernandes (orientador). II. Título.
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THAIS BANDOUK CARVALHO OGASSAWARA
Privação alimentar materna na geração F0 e dieta hipercalórica na geração F1
reduzem a expressão de GFAP em diversas áreas do SNC após desafio
imunológico da geração F2
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista – UNIP para obtenção do título de Mestre em Patologia Ambiental e Experimental.
Aprovada em:
BANCA EXAMINADORA:
ORIENTADOR:
Prof. Dr. Eduardo Fernandes Bondan - Universidade Paulista – UNIP
Julgamento: _______________Assinatura: ___________________________/__/___
Prof. Dr. Jorge Camilo Florio - Universidade de São Paulo – USP
Julgamento: _______________Assinatura: ___________________________/__/___
Profa. Dra. Maria Martha Bernardi - Universidade Paulista – UNIP
Julgamento: _______________Assinatura: ___________________________/__/___
5
DEDICATÓRIA
Ao meu filho, Pedro Jun, fonte de amor e inspiração. Sua presença me
fortalece e encoraja a superar qualquer desafio.
“Mas aqueles que contam com o Senhor renovam suas forças; Ele dá-lhe
asas de águia. Correm sem cansar, vão para frente sem se fatigar. “ (Isaías 40, 31)
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, por renovar minhas forças a cada instante, por me sustentar nos dias
difíceis e por me fazer crer que sou capaz de superar todos os desafios.
Ao meu marido Marcel, companheiro amoroso, seu apoio, compreensão,
serenidade e otimismo fortaleceram minha confiança tornando possível cada passo
desta jornada.
Aos meus amados pais, Marcia e Luiz Claudio, que dedicam sua vida de
forma tão perseverante à família. Por sempre terem me apoiado, acreditando no
meu potencial. Por nunca permitirem que o medo fosse maior do que a vontade de
vencer. Por mostrarem que um dos bens mais preciosos que um ser humano pode
ter é o conhecimento.
À minha querida irmã Patricia, minha parceira de vida, exemplo de dedicação
e competência.
À minha madrinha Nadia, fonte de motivação, presente em todos os
momentos importantes, incentivando-me a buscar a cada dia desafios maiores.
Aos professores Drs. Eduardo F. Bondan e Maria Martha Bernardi, pela
dedicação e atenção em todas as etapas deste projeto. Sigo como admiradora do
trabalho desenvolvido por essa grande equipe.
À professora Dra. Leoni Bonamin, pela gentil contribuição em importantes
momentos desta pesquisa.
Ao Professor Dr. Jorge Camilo Florio, pelo aceite em compor esta banca de
mestrado, pois suas sugestões e observações enriqueceram esta dissertação.
À amiga e companheira Débora Pedrolo, que me incentivou a começar este
projeto.
Aos amigos queridos, que, com palavras de amor e incentivo, renovaram as
minhas energias me encorajando a seguir em frente.
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RESUMO
Ogassawara, T. B. C. Privação alimentar materna na geração F0 e dieta hipercalórica na geração F1 reduzem a expressão de GFAP em diversas áreas do SNC após desafio imunológico da geração F2. 2016. 53f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Patologia Ambiental e Experimental, Universidade Paulista, São Paulo, 2016.
No presente estudo foram analisados os efeitos da privação alimentar na gestação da geração F0 combinada com a dieta hipercalórica (HD) na puberdade da geração F1 sobre o comportamento dos astrócitos das gerações F1 e F2. O comportamento dos astrócitos foi investigado pela análise imuno-histoquímica da expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em diversas áreas do sistema nervoso central (SNC) incluindo córtex frontal, parietal, núcleo accumbens, núcleos periventricular e arqueado do hipotálamo, ponte e camadas molecular e granular do cerebelo das gerações F1 e F2. Além disso, foram observados os efeitos da ativação imunológica pelo LPS na geração F2. Na geração F1, foi observado um aumento da expressão de GFAP nos ratos fêmeas que receberam HD na puberdade em relação àqueles que receberam dieta normocalórica (ND) no mesmo período. Nos machos da geração F2, foi observada uma significativa redução da expressão de GFAP em ambos grupos cujas mães receberam HD, tratados ou não com LPS, em comparação aos grupos cujas mães receberam ND, com ou sem LPS. Esses dados sugerem que a atenuação do efeito do LPS pode ter ocorrido pelo efeito transgeracional provocado tanto pela privação alimentar durante o período gestacional na geração F0, quanto pela HD na puberdade da geração F1.
Palavras chaves: astrócitos, dieta hipercalórica, efeitos transgeracionais, privação
alimentar materna.
8
ABSTRACT
Ogassawara, T. B. C. Maternal food deprivation in F0 generation and hypercaloric diet in F1 generation reduce GFAP expression after an immune challenge in F2 generation in several brain areas. 2016. 53f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Patologia Ambiental e Experimental, Universidade Paulista, São Paulo, 2016.
In the present study, the effects of maternal food restriction in the pregnancy of F0 generation combined with hypercaloric diet (HD) in the puberty of F1 generation on astrocyte behavior of F1 and F2 generation were investigated. The astrocyte behavior was examined by assessing the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) by immunohistochemistry in astrocytes of several central nervous system (CNS) areas including frontal cortex, parietal cortex, nucleus accumbens, periventricular and arcuate nucleus, pons and cerebellar areas (molecular cell layer and granular cell layer) of F1 and F2 generations. In addition, the effects of immune activation by LPS in the F2 generation were observed. In the F1 generation, it was observed a larger GFAP expression in female rats that received HD on puberty than those that received normocaloric diet at the same time. In the male F2 generation, it was observed a significant reduced GFAP expression in both groups of dam’s generation fed with HD, treated or not with LPS, in relation to F2 generation of dam’s fed with normocaloric diet, treated or not with LPS. These data suggest that this attenuation of LPS effect can be occurred by a transgenerational effect of both, maternal food deprivation in pregnancy of F0 generation and HD diet in puberty of F1 generation.
Key words: astrocytes, hypercaloric diet, maternal food restriction, transgenerational
effects.
9
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 - Desenho experimental.......................................................................... 24
Tabela 1 - Expressão de GFAP na geração F1 nas diferentes áreas do SNC
analisadas...............................................................................................................
27
Tabela 2 - Expressão de GFAP na geração F2 nas diferentes áreas do SNC
analisadas...............................................................................................................
30
Figura 2 - Expressão de GFAP na geração F1 nas diferentes áreas do SNC
analisadas...............................................................................................................
31
Figura 3 - Expressão de GFAP na geração F1 nas diferentes áreas do SNC
analisadas...............................................................................................................
32
Figura 4 - Fotomicrografias:
(A) - Córtex frontal.................................................................................................. 33
(B) - Córtex parietal................................................................................................ 34
(C) - Núcleo accumbens......................................................................................... 35
(D) - Núcleo periventricular..................................................................................... 36
(E) - Núcleo arqueado............................................................................................ 37
(F) - Ponte............................................................................................................... 38
(G) - Camada molecular do cerebelo..................................................................... 39
(H) - Camada granular do cerebelo........................................................................ 40
10
LISTA DE ABREVIATURAS
SNC sistema nervoso central
GFAP glial fibrillary acidic protein (proteína glial fibrilar ácida)
TNF-α fator de necrose tumoral alfa
IL-1β interleucina - 1 beta
IL-6 interleucina - 6
LPS lipopolisacarídeo
SOCS3 supressor de citocina sinalizadora 3
PND dia de vida pós-natal
F1ND grupo de ratos fêmeas da geração F1 que recebeu dieta padrão
F1HD grupo de ratos fêmeas da geração F1 que recebeu dieta hipercalórica
F2NDS grupo de ratos machos da geração F2, cujas mães receberam dieta
padrão, e que foi tratado com solução salina
F2NDLPS grupo de ratos machos da geração F2, cujas mães receberam dieta
padrão, e que foi tratado com LPS
F2HDS grupo de ratos machos da geração F2, cujas mães receberam dieta
hipercalórica, e que foi tratado com solução salina
F2HDLPS grupo de ratos machos da geração F2, cujas mães receberam dieta
hipercalórica, e que foi tratado com LPS
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 12
2 OBJETIVOS......................................................................................................... 15
3 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................... 16
4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 22
4.1 Análise do comitê de ética................................................................................ 22
4.2 Animais.............................................................................................................. 22
4.3 Desenho do experimento.................................................................................. 23
4.4 Dieta hipercalórica............................................................................................ 24
4.5 Histopatologia e imuno-histoquímica................................................................ 25
4.6 Análise Estatística............................................................................................. 26
5 RESULTADOS..................................................................................................... 27
6 DISCUSSÃO........................................................................................................ 40
7 CONCLUSÃO...................................................................................................... 45
REFERÊNCIAS....................................................................................................... 46
12
1 INTRODUÇÃO
Atualmente a obesidade é um dos problemas epidemiológicos mais
importantes no mundo. Cerca de 500 milhões de adultos são obesos e 1,5 bilhão de
pessoas estão acima do peso. Dessa forma, a obesidade representa um problema
de saúde pública global, afetando diversos países (FINUCANE et al., 2011). O
aumento do peso corporal é considerado um importante fator de risco para saúde,
contribuindo para o desenvolvimento de outras doenças como diabetes tipo 2,
hipertensão arterial sistêmica, doenças cardiovasculares, dislipidemia, aterosclerose,
câncer e problemas psicossociais (DANIELS, 2009; HASLAM; JAMES, 2005;
KAPLAN et al., 2003; TSIROS et al., 2009). Uma maior compreensão sobre os
mecanismos que envolvem o desenvolvimento da obesidade pode contribuir para a
promoção de estratégias de tratamento mais eficientes, visando solucionar esse
importante problema de saúde pública.
Modelos experimentais em roedores e humanos evidenciaram que o consumo
excessivo de nutrientes pode provocar uma resposta inflamatória crônica de baixo
grau. Algumas vias sinalizadoras da inflamação estão associadas com essa
condição, promovendo a sua ativação crônica, tanto nos órgãos periféricos, como no
sistema nervoso central (SNC), incluindo o hipotálamo (ARRUDA et al., 2011;
MCNAY et al., 2012; RODRIGUEZ-HERNÁNDEZ et al., 2013; WANG et al., 2012).
O mau funcionamento das redes do SNC que controlam o consumo e o gasto
de energia é um dos mais importantes mecanismos para o desenvolvimento da
obesidade (BEGG; WOODS, 2013; WILLIAMS; ELMQUIST, 2012). A inflamação
hipotalâmica é uma das consequências precoces da alimentação hipercalórica, que
ocorre antes do ganho de peso corporal (GARCIA-CÁCERES et al., 2013).
Marcadores inflamatórios hipotalâmicos estão elevados após 24 horas de
exposição à dieta hipercalórica e, após uma semana de consumo da mesma,
marcadores de injúria neuronal também são evidentes no núcleo arqueado e na
eminência média do hipotálamo, associados com gliose envolvendo o recrutamento
de astrócitos e células da micróglia (THALER et al., 2012). Diferentemente da
micróglia, os astrócitos estão localizados ao redor das células endoteliais da barreira
hematoencefálica e, portanto, são diretamente afetados pelo excesso de nutrientes
(ABBOTT, 2002; GARCIA-CÁCERES et al., 2013; TAKANO et al., 2006).
13
Os astrócitos constituem as maiores e mais numerosas células gliais
presentes no SNC dos mamíferos, excedendo o número de neurônios na proporção
de 10:1 (BENVENISTE, 1992). Apesar de sua pronunciada heterogeneidade
morfológica e bioquímica, os astrócitos caracterizam-se pela presença de
prolongamentos dotados de filamentos intermediários (fibrilas gliais), cujo
componente principal é a proteína glial fibrilar ácida (GFAP - glial fibrillary acidic
protein), servindo como meio de identificação desse tipo celular em estudos in situ e
em cultivo (MONTGOMERY, 1994). Dentre as inúmeras funções dessa célula,
destacam-se a manutenção da homeostasia no microambiente neural, exercendo
importante papel na detoxificação, na captação de neurotransmissores e na
regulação do pH, da osmolaridade e da concentração iônica do tecido nervoso. Os
astrócitos relacionam-se ainda com a orientação da migração neuronal durante o
desenvolvimento do SNC; o suporte mecânico para os oligodendrócitos durante a
mielinização; o reparo após agressões no tecido nervoso; a produção e secreção de
proteínas da matriz extracelular, bem como com a síntese de moléculas de adesão,
de fatores neurotróficos e promotores do crescimento de neuritos; a indução e
manutenção das características de barreira hematoencefálica; a fagocitose de restos
celulares e funções imunes, tais como secreção de citocinas e expressão de
moléculas MHC de classe I e II (EDDLESTON; MUCKE, 1993; MONTGOMERY,
1994; PETERS et al., 1991).
Os astrócitos são células dinâmicas que respondem a mudanças no
microambiente do SNC, apresentando mudanças morfológicas e funcionais que
influenciam as atividades neuronais. Em resposta à injúria no SNC, os astrócitos
podem desenvolver um fenótipo reativo ou hipertrófico denominado astrogliose, que
é caracterizado pelo aumento da expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP),
ou podem apresentar um padrão hiperplásico denominado astrocitose. Além disso,
podem produzir mediadores inflamatórios, incluindo fator de necrose tumoral – alfa
(TNF-α), interleucina – 1 beta (IL-1β) e interleucina- 6 (IL-6) (MAYO et al., 2014;
MOUSER et al., 2009; RIDET et al., 1996; SUMMERS et al., 1995). Dessa forma, é
amplamente defendido que os astrócitos desempenham um importante papel na
regulação da resposta inflamatória na obesidade (GARCIA-CÁCERES et al., 2013;
GUYENET et al., 2013; RODRIGUEZ-HERNÁNDEZ et al., 2013).
Aspectos nutricionais maternos, incluindo a subnutrição e a obesidade, têm
sido amplamente relacionados com desordens metabólicas na prole. Modelos
14
animais têm demonstrado que a obesidade materna tem consequências na prole,
predispondo ou reprogramando para doenças metabólicas na vida adulta (SEGOVIA
et al., 2014; VICKERS, 2014) independentemente dos fatores ambientais na vida
pós-natal (HOWIE et al., 2009).
Bilbo e Tsang (2010) observaram que a prole de ratos fêmeas que receberam
dieta hipercalórica apresentava marcadores gliais aumentados (CD11b para
micróglia e GFAP para astrócitos) no hipocampo ao nascimento. Além disso,
apresentavam no desmame e na vida adulta aumento de citocinas pró-inflamatórias
após desafio com LPS, mesmo recebendo alimentação padrão, sugerindo que os
resultados encontrados foram programados em etapas precoces do
desenvolvimento. De forma semelhante, Campos et al. (2008) observaram que a
prole de ratos Wistar que receberam dieta hipercalórica apresentava maior índice de
obesidade.
A privação da alimentação materna também pode resultar em reprogramação
fetal, causando permanentes alterações na estrutura, na função e nas vias de
homeostase do metabolismo e do desenvolvimento da prole, aumentando a
predisposição para doenças na vida adulta (BARKER, 2004). A restrição de
nutrientes promove estresse sobre o sistema neuroendócrino resultando em
alteração do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (LABORIE et al., 2011) contribuindo
para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares e metabólicas na prole (RAO;
PADMAVATHI; RAGHUNATH, 2012).
Ainda são pouco claros os efeitos a longo-prazo provocados na prole pela
combinação da privação alimentar em períodos críticos do desenvolvimento
seguidos pela exposição à dieta hipercalórica. Uma melhor compreensão de como
essas mudanças epigenéticas alteram o fenótipo da prole pode contribuir para
identificação de marcadores precoces, prevenindo o risco de desenvolvimento de
algumas doenças na vida adulta.
15
2 OBJETIVOS
O objetivo principal do presente estudo foi o de avaliar os efeitos
transgeracionais da privação alimentar durante o período gestacional da geração F0
e da dieta hipercalórica administrada na puberdade da geração F1 sobre o
comportamento dos astrócitos das gerações F1 e F2.
O comportamento dos astrócitos foi observado pela avaliação da expressão
da GFAP nos astrócitos de diversas áreas do SNC (córtex frontal e parietal, núcleo
accumbens, núcleos periventricular e arqueado do hipotálamo, ponte e camadas
molecular e granular do cerebelo).
Observaram-se, ainda, os efeitos da ativação da resposta imunológica
induzida pelo LPS sobre a expressão de GFAP astrocitária nas mesmas áreas do
SNC dos machos da geração F2, originários de fêmeas que receberam dieta
normocalórica ou hipercalórica.
16
3 REVISÃO DA LITERATURA
A obesidade crônica geralmente está associada com um processo
inflamatório sistêmico permanente (RODRIGUEZ-HERNÁNDEZ et al., 2013).
Diversos mecanismos têm sido propostos para explicar a inflamação induzida pela
obesidade, tanto nos tecidos periféricos, quanto no SNC. Embora esses
mecanismos ainda não sejam completamente elucidados, sabe-se que a inflamação
hipotalâmica é um dos marcadores precoces envolvidos nesse processo (THALER
et al., 2012).
O hipotálamo mediobasal está posicionado próximo da eminência média,
sendo uma das estruturas mais próximas ao terceiro ventrículo, uma das áreas mais
sensíveis aos fatores sanguíneos e imunológicos. Sendo assim, não é
surpreendente que esse seja o primeiro local onde ocorre uma importante resposta
reativa nos indivíduos expostos à dieta hipercalórica (KALIN et al., 2015; THALER et
al., 2012). O início rápido da inflamação hipotalâmica mediobasal induzida pela dieta
hipercalórica está associado com uma robusta resposta glial e níveis aumentados de
RNAm para proteína glial fibrilar ácida (GFAP), interleucina-6 (IL-6), fator de necrose
tumoral alfa (TNF-α), supressor de citocina sinalizadora 3 (SOCS3) e IκB kinase-β
(Ikkβ) identificados nos primeiros três dias de exposição (THALER et al., 2012).
Diversos estudos apontaram uma maior expressão de GFAP no hipotálamo,
principalmente no núcleo arqueado e no núcleo periventricular de indivíduos que
consumiram dieta hipercalórica quando comparados com o grupo controle que
consumiu dieta padrão (HORVATH et al., 2010; JOAQUIM et al., 2015; KLOET et al.,
2014; THALER et al., 2012). Buckman et al. (2013) investigaram a distribuição da
imunorreatividade da GFAP em diversos núcleos do hipotálamo de camundongos
obesos. Os núcleos que apresentaram maior reatividade foram aqueles que estão
mais próximos do terceiro ventrículo, principalmente o núcleo arqueado. Portanto, a
dieta hipercalórica provoca ativação da rede neuro-imune-endócrina, assemelhando-
se às condições nas quais o sistema imunológico é o fator principal na promoção da
doença (ARGENTE-ARIZÓN et al., 2015; KALIN et al., 2015).
Os astrócitos são células dinâmicas que respondem às mudanças do
ambiente no SNC, sofrendo alterações morfológicas e funcionais que são
anatomicamente específicas e influenciam atividades neuronais (BACHOO et al.,
2004). Assim como as células da micróglia, os astrócitos participam nas respostas
17
imunológicas do SNC e participam no desenvolvimento da resposta inflamatória no
encéfalo e na medula espinhal (ASCHNER, 1998; SCHWARZ; BILBO, 2012). Os
astrócitos apresentam íntimo contato com os elementos vasculares e sinápticos, pois
estão próximos da barreira hematoencefálica. Dessa forma, encontram-se mais
expostos aos produtos do metabolismo, entre eles, os resultantes da inflamação
promovida pela dieta hipercalórica (GARCIA-CÁCERES et al., 2013; WANG et al.;
2014).
Na exposição à dieta hipercalórica, os astrócitos respondem rapidamente,
resultando na astrogliose, que está acompanhada pela expressão de citocinas e
pela diminuição da sinalização da leptina nos neurônios hipotalâmicos (PAN et al.
2011; THALER et al., 2012). São recrutados para modular a atividade inflamatória do
TNF sobre o tecido nervoso (YANG et al., 1998). Segundo Thaler et al. (2012), na
exposição a ambiente hipercalórico, o hipotálamo desenvolve uma astrogliose que
tem a função de prevenir a comunicação dos neurônios com os fatores metabólicos
circulantes, como a leptina.
Tem sido proposto que a reatividade astrocitária tem função, a curto prazo, de
proteger o tecido da injúria aguda, mas podendo ser prejudicial na recuperação em
condições crônicas; portanto, a função da astrogliose é provavelmente contexto-
dependente (ARGENTE-ARIZÓN et al., 2015; LI et al., 2008). Guyenet et al. (2013)
observaram que os astrócitos do hipotálamo mediobasal responderam rapidamente
e de forma consistente à dieta hipercalórica. Nesse estudo, foi identificado que a
clivagem da protease caspase-3 ocorreu principalmente no terceiro dia de exposição
à dieta hipercalórica, apesar de a exposição ter durado 14 dias, sugerindo a
possibilidade da ação aguda dessa protease na neuropatologia do hipotálamo.
Nesse experimento, a clivagem da caspase-3 não estava associada com o aumento
da taxa de apoptose, sugerindo que ela desempenha um papel não apoptótico
análogo à resposta da excitotoxidade dos neurônios prejudicados. Eles ainda
sugerem que, embora os astrócitos desempenhem uma função de proteção na
resposta aguda, são necessárias mais evidências para verificar se a astrogliose é
benéfica, neutra ou prejudicial nesse contexto.
Outro mecanismo do sistema imunológico envolvido na inflamação
hipotalâmica devido à obesidade é a ativação da via de sinalização NF- κβ por
mediadores inflamatórios (CHOI et al., 2014). Em condições fisiológicas, o NF- κβ
permanece em estado quiescente no citoplasma pela ação inibitória da proteína IκB.
18
Sinais inflamatórios decorrentes da dieta hipercalórica promovem a ativação da via
IKKβ-NF-κβ, permitindo a liberação do NF- κβ para dentro do núcleo e favorecendo a
transcrição de genes específicos para obesidade. Paralelamente, essa via de
sinalização também provoca perturbações no retículo endoplasmático dos neurônios
hipotalâmicos, promovendo a desregulação do controle do equilíbrio energético
(GARCIA-CÁCERES et al., 2013; KALIN et al., 2015; ZHANG et al., 2008).
A privação alimentar crônica em roedores também interfere na via NF- κβ;
entretanto, de forma distinta à obesidade, pois atua inibindo a ativação da via IKKβ
no hipotálamo, proporcionando aumento da expectativa de vida e diminuição dos
efeitos fisiológicos do envelhecimento (MARINKOVIC et al., 2007; ZHANG et al.,
2013).
Vasiljkovic et al. (2009) apontaram que a restrição alimentar pode promover
efeitos de neuroproteção, promovendo maior resistência a insultos oxidativos,
metabólicos e excitotóxicos. Observaram que ratos com privação alimentar
apresentaram, após sofrerem um traumatismo cranioencefálico, menor expressão de
GFAP e maior expressão de GAP-43 e SYP, proteínas que estão intimamente
relacionadas com a reorganização do SNC, quando comparados ao grupo controle
que recebeu dieta padrão. Portanto, sugeriu-se que a privação alimentar prévia à
lesão pode ter sido benéfica na plasticidade cortical.
No entanto, tem sido estabelecido que a privação nutricional em períodos
críticos do desenvolvimento pode promover um estado de estresse crônico no
organismo. No período gestacional pode provocar pobre crescimento fetal e maior
predisposição para diabetes tipo 2 e obesidade na prole (HALES; BAKER, 2013;
TAYLOR; POSTON, 2007). A presença de um ambiente impróprio no período
embrionário ou neonatal pode aumentar a susceptibilidade para algumas doenças
ao longo da vida. Em condições ambientais adversas, o feto pode sofrer uma
alteração de processos fisiológicos, que podem ser benéficos inicialmente para
promover a sobrevivência, mas que são mal adaptados na vida pós-natal,
prejudicando a saúde no longo prazo (PEREZ-TORRENO, 2003; RAO;
PADMEVANTHI; RAGHUNATH, 2012).
Na falta de calorias suficientes no ambiente fetal, o metabolismo neonatal
programa-se para conservar energia, mesmo na fase adulta (BOLTON; BILBO,
2014). Estudos experimentais em animais apresentam o conceito de que a
subnutrição materna durante períodos críticos do desenvolvimento pode programar o
19
metabolismo dos adipócitos, promovendo tardiamente a obesidade, especialmente
quando desafiado no período pós-natal com dieta hipercalórica (TAYLOR; POSTON,
2007).
Diversos estudos demonstraram a relação da privação alimentar durante o
desenvolvimento fetal com o metabolismo da glicose na prole, observando-se
alteração até a geração F2, mesmo que a geração F1 tenha sido alimentada
normalmente a partir da amamentação (BENYSHEK et al., 2008; BENYSHEK;
JOHNSTON; MARTIN, 2006; MARTIN et al., 2000; OZANNE, 2001). Os efeitos
transgeracionais na geração F3, entretanto, são contraditórios (DRAKE; WALKER;
SECKL, 2005; DRAKE; SECKL, 2011). Apenas Benyshek et al. (2008) apontaram
efeitos transgeracionais até a geração F3.
Assim como reportado em modelos de roedores privados, a alimentação
hipercalórica em estágios precoces do desenvolvimento também pode contribuir
para a reprogramação da prole nas gerações F1 e F2, com transmissão tanto por via
de linhagens maternas, como paternas. Níveis aumentados de insulina e de
triglicerídeos, resistência à insulina e intolerância à glicose são achados nas
gerações F1 e F2, embora o fenótipo na geração F2 apresente-se mais brando
(FULLSTON et al., 2013; PENTINAT et al., 2010). Em contrapartida, a transmissão
do fenótipo para a geração F3 foi restrita apenas para as fêmeas e somente via
linhagem paterna (DUNN; BALE, 2011). Diversos estudos reforçam a importância
de se analisar os efeitos do programa transgeracional para cada gênero específico.
A expressão pode mudar a cada geração, e linhagens gênero-específicas podem
influenciar a expressão fenotípica (DESAI; JELLYMAN; ROSS, 2015).
Regulação epigenética de múltiplos sistemas fisiológicos como consequência
do ambiente perinatal é um provável candidato para mudanças persistentes no
metabolismo e na função do SNC. Diversos estudos investigaram o impacto da
nutrição perinatal no desenvolvimento tardio via modulação epigenética das vias
metabólicas (CANANI et al., 2011; DESAI; JELLYMAN; ROSS, 2015; DUNN; BALE,
2011; VUCETIC et al., 2010).
A epigenética é caracterizada como um processo molecular em torno do DNA
que regula a atividade do genoma independentemente de mudanças na sequência
do DNA (SKINNER, 2011). Os efeitos transgeracionais no fenótipo estão associados
com a metilação do DNA, com a modificação das histonas, da estrutura da cromatina
e a seleção de RNA não codificadores em genes específicos. Dessa forma, a
20
expressão de alguns genes é alterada, induzindo marcadores epigenéticos em cada
geração e desempenhando uma função crítica no processo de desenvolvimento
biológico (DESAI; JELLYMAN; ROSS, 2015; BOLTON; BILBO, 2014; SKINNER,
2015).
Um elemento fundamental da programação do desenvolvimento é a
existência do efeito transgeracional, no qual a exposição a determinadas condições
ambientais em estágios precoces do desenvolvimento pode afetar a saúde das
próximas gerações (AIKEN; OZANE, 2014; SKINNER, 2014). Os mecanismos
envolvidos para o desenvolvimento dos efeitos transgeracionais ainda são pouco
conhecidos. Dados obtidos a partir de modelos animais sugerem que um número
significativo de mecanismos pode sustentar a transmissão transgeracional de um
fenótipo (AIKEN; OZANE, 2014). A herança não genética está relacionada com o
fenótipo materno e/ou o meio ambiente externo, quando não há prejuízo parental
direto (ENGLISH et al., 2015).
Alguns estudos sustentam que marcadores inflamatórios relacionados com a
obesidade são capazes de atravessar a placenta promovendo alteração da
expressão de alguns genes, assim como a própria placenta é capaz de produzir uma
resposta inflamatória quando desafiada pela dieta hipercalórica materna, resultando
na alteração da metilação do DNA de genes hipotalâmicos que promovem a
reprogramação do apetite e do gasto de energia. Assim sendo, mudanças
epigenéticas podem ter consequências significativas no desenvolvimento e na
função do SNC (BOLTON; BILBO, 2014; TAYLOR; POSTON, 2007).
Segundo a revisão sistemática de Aiken e Ozanne (2014), a maioria dos
modelos de programação transgeracional foi realizada em roedores, sendo a maior
parte das intervenções propostas modificações da dieta materna, inicialmente a
restrição calórica e, posteriormente, a dieta hipercalórica. Essa associação tem sido
conceitualizada como uma hipótese de programação do desenvolvimento, na qual o
ambiente influencia a plasticidade do desenvolvimento em períodos críticos,
podendo provocar efeitos ao longo da vida da prole. A transmissão fenotípica
transgeracional é frequentemente vista como uma forma de herança epigenética,
promovendo mudanças fenotípicas entre as gerações mesmo na ausência da
exposição direta (SKINNER, 2015; VICKERS, 2014).
O desenvolvimento dos circuitos hipotalâmicos que regulam o comportamento
alimentar pode ser modificado pela subnutrição materna durante a gestação. Os
21
circuitos que estão envolvidos no consumo de alimentos, assim como no controle da
satisfação, formam-se nos estágios precoces do desenvolvimento (SOUSA-
FERREIRA; ALMEIDA; CAVADAS, 2014; RAMAMOORTHY et al., 2015). Tem sido
demonstrado que tanto a obesidade quanto a subnutrição alimentar materna podem
promover a transmissão transgeracional de desordens metabólicas (VICKERS,
2014). Dessa maneira, qualquer mudança nutricional materna pode alterar o
ambiente fetal, prejudicando o desenvolvimento de alguns sistemas corporais da
prole e contribuindo para a promoção das disfunções metabólicas nas gerações
seguintes.
22
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Análise do comitê de ética
Foram utilizadas lâminas de encéfalo de ratos Wistar do experimento
realizado por JOAQUIM et al. (2015) (protocolo nº. 130/12, CEUA/ICS/UNIP,
28/11/2012). Os experimentos foram realizados de acordo com os protocolos de
práticas laboratoriais, e todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais
foram realizados.
4.2 Animais
Vinte oito ratos Wistar fêmeas adultas, com 11-12 semanas de idade e
pesando entre 200-250g (geração F0) e dez ratos machos com experiência sexual
(12-14 semanas de idade) da Escola de Medicina Veterinária da Universidade São
Paulo (São Paulo, Brasil) foram inicialmente selecionados.
Após a chegada ao laboratório, os ratos foram instalados em gaiolas (duas
fêmeas por gaiola e cinco machos por gaiola) em condições controladas de
temperatura (22-26°C), umidade (50-65%), com ciclo artificial de luz a cada 12 horas
(luzes acesas às 7:00 horas) e alimentação livre. Dez dias após a chegada ao
laboratório, fêmeas da geração F0 foram cruzadas com os machos para obter a
geração F1 (duas fêmeas por macho). Entre o nonagésimo e nonagésimo quinto dia
de vida pós-natal (PND), os ratos fêmeas da geração F1 foram cruzados com
machos experientes para obter a geração F2.
Foi permitido que todas as mães tivessem o parto de forma normal, assim
como foi permitido que amamentassem a prole. Nenhum manuseio foi realizado no
primeiro dia de vida para evitar o canibalismo (DESANTIS; SCHMALTZ, 1984). No
2º PND, oito filhotes (4 machos e 4 fêmeas) foram selecionados de forma aleatória.
Esse procedimento foi realizado precocemente no dia 2º PND para evitar diferenças
provocadas pela amamentação materna, que poderia interferir no ganho de peso da
prole (MORAG; POPLIKER; YAGIL, 1975). Nenhum procedimento de cross-fostering
foi utilizado (CHIAVEGATTO; BERNARDI, 1991). Os oito filhotes selecionados de
forma aleatória permaneceram com suas mães até o desmame no 21º PND. Após
esse período, foram separados por sexo e instalados nas mesmas condições de
seus progenitores.
23
4.3 Desenho do experimento
Fêmeas da geração F0 (n = 28) sofreram privação alimentar (40%) do quinto
ao décimo oitavo dia de gestação. Os filhotes fêmeas da geração F0 (1 animal por
ninhada) deram origem a geração F1. A geração F1 foi dividida em dois grupos: um
grupo recebeu dieta hipercalórica do 23º ao 65º PND (F1HD) e o segundo grupo
recebeu dieta normal balanceada (F1ND).
Na metade dos animais da geração F1 (n = 14) de cada grupo (F1HD, n = 6;
F1ND, n = 8) foi mensurada a expressão de GFAP no córtex frontal, no córtex
parietal, no núcleo accumbens, nos núcleos periventricular e arqueado do
hipotálamo, na ponte e nas camadas molecular e granular do cerebelo após
eutanásia dos animais entre 90º e 95º PND. A outra metade de fêmeas (n = 14) foi
cruzada com machos experientes para obter a geração F2.
Foram escolhidos apenas os filhotes machos de F1 para compor a geração
F2. No 50º PND, foram subdivididos em quatro grupos. Dois grupos que receberam
100 μg/kg de LPS (F2HDLPS e F2NDLPS) e dois grupos que receberam 1 mL/kg de
solução salina a 0,9% (F2HDS e F2NDS). O desafio com LPS foi realizado para
avaliar eventuais mudanças na prole associadas à privação alimentar na gestação
de F0 e à dieta hipercalórica em F1. Após 24 horas da aplicação do tratamento, os
filhotes machos da geração F2 foram submetidos à eutanásia e porções do encéfalo
foram coletadas para mensuração do GFAP no córtex frontal, no córtex parietal, no
núcleo accumbens, nos núcleos periventricular e arqueado do hipotálamo, na ponte
e nas camadas molecular e granular do cerebelo. Machos da geração F1 e fêmeas
da geração F2 foram utilizados em outros estudos.
Portanto, a configuração dos grupos no presente estudo foi a seguinte: F0
(ratos fêmeas que sofreram privação alimentar); F1ND (ratos fêmeas da geração F1,
nascidas das mães F0, alimentadas com dieta padrão); F1HD (ratos fêmeas da
geração F1, nascidas das mães F0, alimentadas com dieta hipercalórica); F2NDS
(ratos machos da geração F2, cujas mães receberam dieta padrão, que foram
tratados com solução salina, i.p.); F2NDLPS (ratos machos da geração F2, cujas
mães receberam dieta padrão, tratados com 100 µg/kg de LPS, i.p.); F2HDS (ratos
machos da geração F2, cujas mães receberam dieta hipercalórica, tratados com
solução salina, i.p.) e F2HDLPS (ratos machos da geração F2, cujas mães
receberam dieta hipercalórica, tratados com 100 µg/kg de LPS, i.p.). O desenho do
estudo é apresentado na Fig.1.
24
Figura 1 - Desenho experimental. F1ND, grupo de ratos fêmeas da geração F1 que receberam dieta padrão; F1HD, grupo de ratos fêmeas da geração F1 que receberam dieta hipercalórica; F2NDS, grupo de ratos machos da geração F2, cujas mães receberam dieta padrão, e que foram tratados com solução salina; F2NDLPS, grupo de ratos machos da geração F2, cujas mães receberam dieta padrão, e que foram tratados com LPS; F2HDS, grupo de ratos machos da geração F2, cujas mães receberam dieta hipercalórica, e que foram tratados com solução salina; e F2HDLPS, grupo de ratos machos da geração F2, cujas mães receberam dieta hipercalórica, e que foram tratados com LPS.
4.4 Dieta hipercalórica
Ratos fêmeas do grupo F1HD tiveram, do 23º ao 65º PND, livre acesso à
dieta hipercalórica (Ensure®; Abbot Brasil, São Paulo, Brasil; total de 1kcal
associada com a dieta do laboratório Nuvilab; Sogorb Indústria e Comércio, São
Paulo, Brasil). Ensure é uma dieta líquida muito palatável na qual cada garrafa
possui 231 kcal contendo 1.7 g de gordura poli-insaturada, 3.59 g de gordura
monossaturada e 2.2 de gordura saturada. Não contém nenhum tipo de gordura-
trans. Foi oferecida em um cilindro de graduação com uma tampa, com 600 mL por
garrafa. Ratos fêmeas no grupo HD e ND foram mantidos em 4 gaiolas, e o Ensure e
25
a dieta padrão foram disponibilizados na gaiola como um todo. O consumo de
ambas as dietas foi mensurado diariamente e ambas as dietas foram trocadas
diariamente.
4.5. Histopatologia e imuno-histoquímica
O cérebro foi coletado e fixado em solução de formol a 10% em tampão
fosfato por pelo menos 48 horas para desidratação, diafanização e inclusão em
parafina. Cortes transversais de 5 m foram obtidos, montados em lâminas
histológicas e corados pela técnica de Hematoxilina-Eosina (H-E), sendo observados
e fotografados em fotomicroscópio Olympus BHT-100.
Cortes histológicos de blocos selecionados foram colhidos em lâminas
tratadas com silano (Sigma) a 4% em acetona, objetivando uma melhor aderência
dos mesmos. Tais cortes foram desparafinados em xilol e hidratados em série
decrescente de etanol absoluto, etanol a 95%, a 80%, a 70% e a 50% e, a seguir,
fervidos durante 15 minutos em forno de microondas convencional (potência
máxima), imersos em tampão citrato 0,01 M (ácido cítrico 0,01 M e citrato de sódio
0,01 M, 1:3, pH 6,0). Depois de resfriados durante 20 minutos, a peroxidase
endógena foi bloqueada incubando-se as lâminas por 30 minutos em metanol
contendo 10% de peróxido de hidrogênio 30 volumes.
Para marcação imuno-histoquímica da GFAP, o método utilizado foi o da
avidina-biotina, seguindo protocolo de SANCHEZ et al. (2006), sendo cada
procedimento intercalado por lavagem das lâminas em solução salina tamponada
com fosfato.
Os cortes foram incubados durante 16 horas a 4°C em câmara úmida, com o
anticorpo monoclonal primário anti-GFAP (Rabbit anti-cow GFA, code number
ZO334, Dako), padronizado na diluição 1:1000, a qual, por prévia titulação, foi
considerada a mais adequada. Para tal diluição foi utilizada solução contendo soro-
albumina bovina a 5% em água destilada (1,25 mL), azida sódica a 5% em água
destilada (2,5 mL) e solução salina tamponada (59 mL).
Posteriormente, foi realizada a incubação dos cortes por 30 minutos com o
anticorpo secundário anti-imunoglobulinas de coelho (Universal LSABTM 2 Kit / HRP,
Rb / Mo, K0609-1, Dako) na diluição 1:400 e, após a aplicação por 30 minutos do
26
conjugado estreptavidina-biotina-peroxidase, foi diluído em solução salina
tamponada com fosfato (Universal LSABTM 2 Kit / HRP, Rb / Mo, Dako).
A imunorreatividade foi visualizada pela aplicação sobre os cortes de
diaminobenzidina (DAB, Sigma) a 0,1% como cromógeno e peróxido de hidrogênio a
0,5%. Os cortes foram contracorados com hematoxilina, desidratados, diafanizados
e montados com resina sintética sob lamínula. Todas as reações foram
acompanhadas por lâminas controle negativo, submetidas a todas as etapas do
procedimento; porém, suprimindo-se a aplicação do anticorpo primário.
Dez fotomicrografias do córtex frontal, do córtex parietal, do núcleo
periventricular do hipotálamo, da ponte e das camadas molecular e granular do
cerebelo e duas fotomicrografias do núcleo accumbens e do núcleo arqueado do
hipotálamo foram feitas usando objetiva de 40x do microscópio Nikon E200. A área
de astrócitos e de seus processos, marcados em marrom, foram automaticamente
calculadas, em pixels, por meio do software Methamorph®, calibrado com os filtros
de cores digitais regulando os bits vermelho, verde e azul. Dessa forma, apenas as
células positivas foram incluídas e o fundo foi excluído da medida. Os resultados
obtidos para os distintos grupos foram analisados estatisticamente para possíveis
diferenças.
4.6 Análise Estatística
O teste Mann-Whitney foi utilizado para comparar os dados não paramétricos
de 2 grupos (F1HD e F1ND). O teste ANOVA de duas vias seguido do teste de
Bonferroni foi usado para analisar resultados com dois fatores. Os resultados foram
expressos como média ± erro padrão da média. Em todos os casos, resultados
foram considerados significantes se p < 0.05.
27
5 RESULTADOS
Estudos na geração F1
Todas as áreas do SNC que foram analisadas, exceto a ponte, apresentaram
expressão maior de GFAP nos astrócitos nos grupos F1HD comparado com o grupo
F1ND (córtex frontal, Fig. 2A: t = 7,11; df = 78; p < 0,0001; córtex parietal, Fig. 2B: t
= 6,07; df = 78; p < 0,0001; núcleo accumbens, Fig. 2C: t = 7,77; df = 14; p < 0,0001;
ponte, Fig. 2D: t = 0,47; df = 14; p = 0,64; núcleo periventricular hipotalâmico, Fig.
2E: t = 4,43; df = 14; p < 0,0001; núcleo arqueado hipotalâmico, Fig. 2F: t = 3,51; df
= 14; p = 0,004; camada molecular do cerebelo, Fig. 2G: t = 23,25; df = 78; p <
0,0001; e camada granular do cerebelo, Fig. 2H: t = 9,41; df = 78; p < 0,0001).
Tabela 1 - Expressão de GFAP na geração F1 nas diferentes áreas do SNC analisadas. Dados
expressos em média ± erro padrão da média.
ÁREA GRUPOS
F1HD F1ND
CÓRTEX FRONTAL 1858,7 ± 258,2 23,8 ± 5,6
CÓRTEX PARIETAL 1702,5 ± 269,1 66,625 ± 15,4
NÚCLEO ACCUMBENS 8650,5 ± 969,5 615,88 ± 359,2
NÚCLEO PERIVENTRICULAR 4197,1 ± 692,7 1049,8 ± 161,3
NÚCLEO ARQUEADO 4926,1 ± 1381,6 78,0 ± 43,5
PONTE 12126 ± 1002,7 11464 ± 987,7
CAMADA MOLECULAR DO CEREBELO 32027 ± 1341,5 771,55 ± 78
CAMADA GRANULAR DO CEREBELO 29343 ± 3100,2 163,83 ± 74
F1HD, grupo de ratos fêmeas da geração F1 que receberam dieta hipercalórica;
F1ND, grupo de ratos fêmeas da geração F1 que receberam dieta padrão.
Estudos na geração F2
Todas as áreas do SNC nas quais a expressão da GFAP foi analisada foram
apresentadas na Fig. 3. No córtex frontal (Fig. 3A), a dieta (F1,276 = 282,9; p <
0,0001) e o tratamento (F1,276 = 8,13; p = 0,005) modificaram os resultados; foi
observada uma interação entre os fatores (F1,276 = 8,4; p = 0,005). O teste de
Bonferroni demonstrou que a área do grupo F2NDLPS aumentou em relação ao
28
grupo F2NDS. Além disso, a área dos grupos F2HDS e F2HDLPS mostrou
significativa redução comparada aos grupos F2NDS e F2NDLPS (p < 0,0001).
No córtex parietal (Fig. 3B), a dieta (F1,276 = 219,02; p < 0,0001) afetou os
resultados, mas o tratamento com LPS não afetou (F1,276 = 1,23; p = 0,27);
nenhuma interação foi observada entre esses fatores (F1,276 = 1,15; p = 0,28). O
teste de Bonferroni indicou sigficativa redução na área dos grupos F2HDS e
F2HDLPS comparado aos grupos F2NDS e F2NDLPS (p < 0,0001).
No núcleo accumbens (Fig. 3C), a dieta (F1,44 = 7,14; p < 0,0001) e o
tratamento (F1,44 = 7,14; p = 0,01) modificaram os resultados; foi observada uma
interação entre os fatores (F1,44 = 8,9; p = 0,004). O teste de Bonferroni demonstrou
que a área do grupo F2NDLPS aumentou em relação ao grupo F2NDS (p < 0,001).
Além disso, a área dos grupos F2HDS e F2HDLPS mostrou significativa redução
comparada aos grupos F2NDS e F2NDLPS (p < 0,0001).
Na ponte (Fig. 3D), a dieta (F1,296 = 108,6; p = 0,33) e não o tratamento
(F1,296 = 0,94; p < 0,0009) modificou os resultados; uma interação entre os fatores
foi observada ( F1,296 = 2,15; p = 0,10). O teste de Bonferroni demonstrou que as
áreas dos grupos F2HDS e F2HDLPS diminuiram comparadas às áreas de F2NDS e
F2NDLPS (p < 0,001).
No núcleo periventricular do hipotálamo (Fig. 3E), a dieta (F1,262 = 844,6; p <
0,0001) e o tratamento (F1,262 = 11,24; p < 0,0009) modificaram os resultados; uma
interação entre os fatores foi observada (F1,262 = 11,72; p = 0,0007). O teste de
Bonferroni mostrou aumento da área do grupo F2NDLPS comparado ao grupo
F2NDS. Além disso, as áreas dos grupos F2HDS e F2HDLPS estavam
significativamente menores comparadas aos grupos F2NDS e F2NDLPS (p <
0,0001).
No núcleo arqueado do hipotálamo (Fig. 3F), a dieta (F1,44 = 71,59, p <
0,0001) modificou os resultados, mas não o tratamento (F1,44 = 0; p = 0,97);
nenhuma interação foi observada entre os fatores (F1,44 = 0.01; p = 0.54). O teste
de Bonferroni indicou diminuição da área dos grupos F2HDS e F2HDLPS
comparados aos grupos F2NDS e F2NDLPS (p < 0,001).
Na camada molecular do cerebelo (Fig. 3G), a dieta (F1,276 = 3235,27; p <
0,0001) e o tratamento (F1,276 = 37,56; p < 0,0009) modificaram os resultados; uma
interação entre os fatores foi observada (F1,276 = 45,10; p = 0,0001). O teste de
Bonferroni mostrou que a área do grupo F2NDLPS estava aumentada em relação a
29
F2NDS. Além disso, a área F2HDS e F2HDLPS mostrou significativa diminuição em
comparação aos grupos F2NDS e F2NDLPS (p < 0.0001).
Na camada granular do cerebelo (Fig. 3H), a dieta (F1,296 = 944,2; p < 0,001)
e o tratamento (F1,296 = 17,51; p < 0,001) modificaram os resultados; foi observada
uma interação entre os fatores (F1,296 = 118,8; p < 0,001). O teste de Bonferroni
mostrou que o grupo F2NDLPS apresentou uma diminuição da área relativa ao
grupo F2NDS. Além disso, a área dos grupos F2HDS e F2HDLPS diminuiram em
relação aos grupos F2NDS e F2NDLPS (p < 0,001).
30
31
32
33
F1ND F1HD
F2NDS F2HDS
F2NDLPS F2HDLPS
Figura 4 (A) – Fotomicrografias dos grupos F1ND, F1HD, F2NDS, F2NDLPS, F2HDS e F2HDLPS no
córtex frontal.
34
F1ND F1HD
F2NDS F2HDS
F2NDLPS F2HDLPS
Figura 4 (B) – Fotomicrografias dos grupos F1ND, F1HD, F2NDS, F2NDLPS, F2HDS e F2HDLPS no
córtex parietal.
35
F1ND F1HD
F2NDS F2HDS
F2NDLPS F2HDLPS
Figura 4 (C) – Fotomicrografias dos grupos F1ND, F1HD, F2NDS, F2NDLPS, F2HDS e F2HDLPS no
núcleo accumbens.
36
F1ND F1HD
F2NDS F2HDS
F2NDLPS F2HDLPS
Figura 4 (D) – Fotomicrografias dos grupos F1ND, F1HD, F2NDS, F2NDLPS, F2HDS e F2HDLPS no
núcleo periventricular do hipotálamo.
37
F1ND F1HD
F2NDS F2HDS
F2NDLPS F2HDLPS
Figura 4 (E) – Fotomicrografias dos grupos F1ND, F1HD, F2NDS, F2NDLPS, F2HDS e F2HDLPS no
núcleo arqueado do hipotálamo.
38
F1ND F1HD
F2NDS F2HDS
F2NDLPS F2HDLPS
Figura 4 (F) – Fotomicrografias dos grupos F1ND, F1HD, F2NDS, F2NDLPS, F2HDS e F2HDLPS na
ponte.
39
F1ND F1HD
F2NDS F2HDS
F2NDLPS F2HDLPS
Figura 4 (G) – Fotomicrografias dos grupos F1ND, F1HD, F2NDS, F2NDLPS, F2HDS e F2HDLPS na
camada molecular do cerebelo.
40
F1ND F1HD
F2NDS F2HDS
F2NDLPS F2HDLPS
Figura 4 (H) – Fotomicrografias dos grupos F1ND, F1HD, F2NDS, F2NDLPS, F2HDS e F2HDLPS na
camada granular do cerebelo.
41
6 DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo indicaram que eventos ocorridos no período
pré-natal e prévios à concepção podem reprogramar o curso do desenvolvimento da
prole nas gerações seguintes. Na geração F0, as fêmeas sofreram privação
alimentar (40%) do quinto ao décimo oitavo dia gestacional, e na geração F1, as
fêmeas receberam dieta hipercalórica do PND23 até o PND65, antes de terem
experiência sexual (PND 90-95). Estudos experimentais prévios em animais
apresentam o conceito de que a subnutrição materna durante períodos críticos do
desenvolvimento pode reprogramar o metabolismo do tecido adiposo, promovendo
tardiamente a obesidade, especialmente quando o indivíduo for desafiado no
período pós-natal com dieta hipercalórica (REMACLE et al., 2011; TAYLOR;
POSTON, 2007).
Foi observado no estudo de Joaquim et al. (2016) que ratos fêmeas nascidos
de mães que sofreram privação alimentar na gestação não apresentaram diferença
de peso na vida adulta quando comparado aos ratos fêmeas da mesma geração
nascidos de mães que receberam alimentação normal, embora o aumento do peso
da gordura retroperitoneal tenha sido observado nesses últimos animais. Entretanto,
na geração seguinte (netos das fêmeas que sofreram privação alimentar na
gestação) observou-se aumento do peso corporal, aumento do peso da gordura
retroperitoneal e aumento do tamanho de pequenos adipócitos em comparação ao
grupo controle (netos das fêmeas que não sofreram privação alimentar),
caracterizando forte viés de sobrepeso nessa geração.
Na hipótese do fenótipo poupador proposta por Hales e Baker (1992), é
sustentado que a privação de nutrientes em estágios precoces do desenvolvimento
resulta em pobre crescimento fetal e aumento da predisposição de síndromes
metabólicas e doenças cardiovasculares. Quando há déficit de nutrientes, o feto
sofre uma reprogramação associada à diminuição da sensibilidade à insulina,
proporcionando melhor condição de sobrevivência. Essa adaptação se estende para
a vida adulta; entretanto, a oferta excessiva de nutrientes gera um desequilíbrio que
pode acarretar o estabelecimento da doença cardiometabólica (RIBEIRO et al.,
2015).
Além disso, este mesmo grupo de pesquisa também observou que a
intervenção com dieta hipercalórica na adolescência das mães não produziu
42
obesidade, mas provocou mudanças na composição do tecido adiposo e aumento
da expressão de GFAP nos núcleos hipotalâmicos da prole, o que pode ser
considerado um fator preditivo para o desencadeamento de síndromes metabólicas
(JOAQUIM et al., 2015).
Foi observado no presente estudo que, além dos núcleos hipotalâmicos
(arqueado e periventricular), o aumento da expressão da GFAP também ocorre no
córtex frontal, no córtex parietal, no núcleo accumbens e na camada molecular e
granular do cerebelo da geração F1 exposta à dieta hipercalórica durante a
puberdade.
Os astrócitos são as células não neuronais mais abundantes no SNC e,
devido a sua localização próxima à barreira hematoencefálica, estão em íntimo
contato com elementos vasculares e sinápticos, desempenhando um papel
fundamental na homeostase do SNC, no estabelecimento dos circuitos neuronais e
na iniciação da resposta inflamatória e imunológica nesse sítio (SICA et al., 2016).
São as primeiras células a identificar a concentração periférica de glicose e são as
únicas células do SNC capazes de oxidar os ácidos graxos em corpos cetônicos
(ARGENTE-ARIZON et al., 2015). Especialmente em condições de hipoglicemia ou
privação alimentar, os corpos cetônicos produzidos pela oxidação dos ácidos graxos
pelos astrócitos são utilizados como fonte de energia para os neurônios (PANOV et
al., 2014). Por outro lado, durante a exposição crônica à dieta hipercalórica, os
corpos cetônicos também podem ser sintetizados, já que os astrócitos, frente à
grande demanda de ácidos graxos circulantes no hipotálamo, vão promover a maior
oxidação contribuindo para o aumento da produção de corpos cetônicos. Portanto, a
dieta hipercalórica provoca um aumento precoce da produção de corpos cetônicos
nos astrócitos que subverte a sensibilidade normal dos neurônios aos nutrientes (LE
FOLL et al., 2014).
Diversas evidências em modelos de roedores apontam a relação entre a
obesidade e o sobrepeso com uma inflamação crônica no SNC, associada com a
astrogliose hipotalâmica (BUCKMAN et al., 2013; HSUCHOU et al., 2009; THALER
et al., 2012). A ativação de astrócitos hipotalâmicos pode ser observada como uma
resposta aguda à dieta hipercalórica, sendo notável a astrogliose nas primeiras
horas após a exposição (BUCKMAN et al., 2013; GUYENET et al., 2013; THALER et
al., 2012). Essa rápida ativação dos astrócitos é inicialmente associada com uma
resposta neuroprotetora às altas concentrações de ácidos graxos e citocinas pró-
43
inflamatórias que atravessam a barreira hematoencefálica. O processo
fisiopatológico torna-se evidente quando a ativação astrocitária é prolongada e
essas células gliais começam a liberar substâncias neurotóxicas e a formar cicatriz
glial (PEKNY; PEKNA, 2014).
Embora a astrogliose em decorrência da obesidade seja amplamente relatada
na literatura, existe pouca informação sobre a distribuição da astrogliose no SNC. A
maior parte das evidências aponta o acometimento dos núcleos hipotalâmicos,
principalmente os núcleos que estão próximos ao terceiro ventrículo. Buckman et al.
(2013) apontaram algumas diferenças em outras áreas do SNC, tais como
hipocampo e tálamo, particularmente a habenula medial, a cápsula interna e o
núcleo talâmico reticular. Guyenet et al. (2013) sugeriram que a resposta dos
astrócitos frente à alimentação hipercalórica pode ser mais dispersa no SNC, já que
resultados prévios apontaram aumento da expressão de genes pró-inflamatórios no
hipocampo e no córtex de roedores alimentados com dieta hipercalórica. Essas
evidências corroboram com os dados encontrados neste estudo, no qual foi
observado que a astrogliose não se limitou ao hipotálamo estendendo-se a outras
áreas do SNC, sendo a ponte a única área que não apresentou diferença
significativa.
Neste estudo também foi evidenciado que a intervenção na dieta materna em
momentos críticos do desenvolvimento acarretou a reprogramação da atividade dos
astrócitos na geração F2. Metade dos machos da geração F2, tanto do grupo de
mães que receberam dieta hipercalórica na adolescência (F2HD), como do grupo de
mães que receberam dieta normal (F2ND), foram desafiados pela administração de
LPS no PND50. O desafio com LPS foi realizado para avaliar a possibilidade de
mudanças adaptativas na prole causada pela privação alimentar na geração F0 e
pela dieta hipercalórica na puberdade da geração F1, a qual geralmente está
associada com inflamação crônica leve (GARCIA-CÁCERES et al., 2013). Modelos
experimentais com administração de LPS demonstram que esse se liga a receptores
Toll-like (TLR) de macrófagos, desempenhando importante função na ativação da
resposta imune adaptativa e resultando na amplificação de disfunções crônicas do
metabolismo, como a aterosclerose e a resistência à insulina (NÚNEZ-RUIZ et al.,
2016).
No estudo de Becskei et al. (2008), camundongos machos que sofreram
privação alimentar por doze horas e que foram posteriormente desafiados com LPS
44
apresentaram inibição da atividade neuronal no núcleo arqueado e na área
hipotalâmica lateral, áreas consideradas críticas na regulação do controle de
energia. A privação alimentar induz a expressão de alguns marcadores ligados à
ativação neuronal (RIEDIGER et al., 2010); no entanto, a administração de LPS
reverteu tal ativação provocada pela dieta, promovendo menor consumo alimentar e
consequente perda de peso.
Diversos estudos têm demonstrado que a administração de LPS promove
neuroinflamação, geralmente evidenciada por meio da maior expressão de GFAP
(BIESMANS et al., 2013; DE SOUSA et al., 2015; HUANG et al., 2015) ou maior
translocação do sinal transdutor e ativador de transcrição 3 (STAT 3) para o núcleo
(NAKANO et al., 2015), indicando maior ativação dos astrócitos. Como citado
previamente, componentes celulares da parede de bactérias Gram-negativas podem
ativar receptores TLR, inclusive no SNC (LAFLAME, 2001), promovendo aumento da
resposta inflamatória. A administração sistêmica de LPS pode provocar o aumento
dos níveis cerebrais de algumas citocinas, como a IL-6 e o TNF-α (BAY-RICHTER et
al., 2011; POHL; WOODSIDE; LUHESHI, 2014). O LPS pode afetar a integridade da
barreira hematoencefálica de diversas formas, favorecendo a entrada de citocinas
periféricas no SNC (JAEGER et al., 2011). Camundongos tratados com LPS em
diversas dosagens apresentaram aumento dos níveis periféricos e cerebrais de
citocinas pró-inflamatórias associado com aumento da expressão de GFAP, com
pico máximo após seis horas de administração, demonstrando a rápida resposta dos
astrócitos quando desafiados pelo sistema imunológico periférico e reforçando,
assim, a forte comunicação existente entre o sistema imunológico e o SNC
(BIESMANS et al., 2013).
Foi observado no presente estudo aumento significativo da expressão do
GPAP no grupo F2NDLPS no córtex frontal, no núcleo accumbens, no núcleo
periventricular e na camada molecular do cerebelo quando comparado com o grupo
F2NDS, dessa forma evidenciando a presença do processo neuroinflamatório
provocado pelo LPS. Entretanto, houve uma importante mudança no comportamento
inflamatório nos grupos nos quais as mães receberam dieta hipercalórica na
adolescência. Os grupos F2HDS e F2HDLPS apresentaram uma diminuição
significativa da expressão de GFAP no córtex frontal, no córtex parietal, no núcleo
accumbens, nos núcleos periventricular e arqueado do hipotálamo, na ponte e na
camada molecular e granular do cerebelo quando comparados aos grupos F2NDS e
45
FDNDLPS. Não apresentando mudança de expressão em resposta ao tratamento
com LPS, exceto a camada granular do cerebelo, onde o grupo F2HDLPS
apresentou maior expressão de GFAP comparado ao grupo F2HDS.
O presente resultado foi semelhante ao do experimento de Huang et al.
(2015), no qual foi observado que a prole de ratos fêmeas que recebeu dieta
hipercalórica na gestação e lactação ou que foi tratada na gestação com LPS
apresentou aumento da expressão do GFAP no hipocampo. Entretanto, o grupo que
foi tratado com LPS associado com a intervenção na dieta apresentou uma menor
expressão de GFAP, sugerindo um efeito protetor subjacente a esse processo.
A hiporreatividade observada reforça a hipótese de reprogramação da
resposta inflamatória na geração F2HD, sugerindo a presença de processo
adaptativo frente às intervenções propostas na dieta nas gerações F0 e F1. A
geração F2HD apresentou menor potencial inflamatório, mesmo na presença de
estímulos adversos, como o LPS, adaptação essa que pode implicar maior
vulnerabilidade da prole.
46
7 CONCLUSÃO
No presente estudo, foi observado aumento da expressão astrocitária de
GFAP nos ratos fêmeas da geração F1 que receberam dieta hipercalórica na
puberdade em relação àquelas alimentadas com dieta normocalórica no mesmo
período.
Por sua vez, houve significativa redução da expressão dessa proteína nos
machos da geração F2 em ambos os grupos (tratados ou não com LPS) cujas mães
foram alimentadas com dieta hipercalórica em relação àquelas cujas mães
receberam dieta padrão (com e sem LPS). Os dados sugerem que a atenuação do
efeito do LPS sobre a resposta astrocitária de expressão da GFAP ocorreu por efeito
transgeracional, provocado tanto pela privação alimentar durante o período
gestacional da geração F0, quanto pela dieta hipercalórica na puberdade da geração
F1.
47
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