DNA barkodiranje kao metoda u taksonomskoj identifikaciji biljnih …digre.pmf.unizg.hr/3972/1/Diplomski rad.pdf · 2015-05-13 · jedinstveno razlikovanje vrsta. Idealan DNA barkod

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno–matematički fakultet

Biološki odsjek

Jakob Ćosić

DNA barkodiranje kao metoda u taksonomskoj identifikaciji biljnih i

ţivotinjskih vrsta

Diplomski rad

Zagreb, 2014.


Prirodoslovno–matematički fakultet

Biološki odsjek

Jakob Ćosić

DNA barkodiranje kao metoda u taksonomskoj identifikaciji biljnih i

ţivotinjskih vrsta

Diplomski rad

Zagreb, 2014.

«Ovaj rad, izrađen u Zoologijskom zavodu Biološkog odsjeka Prirodoslovno-matematičkog

fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, pod vodstvom doc. dr. sc. Damjana Franjevića predan je

na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu

radi stjecanja zvanja magistar eksperimentalne biologije»

Zahvalio bih doc. dr. sc. Damjanu Franjeviću na iznimnom strpljenju, vođenju i pomoći

tijekom izrade rada, mr. sc. Nives Rajević na ustupljenim početnicama, izv. prof. dr. sc.

Zlatku Liberu na ustupljenom uređaju za usitnjavanje tkiva te prof. dr. sc. Marijanu

Grubešiću i dr.sc. Kristijanu Tomljanoviću sa Šumarskog fakulteta na ustupljenim uzorcima

tkiva divokoza.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA


Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek Diplomski rad

DNA BARKODIRANJE KAO METODA U TAKSONOMSKOJ IDENTIFIKACIJI BILJNIH I

ŢIVOTINJSKIH VRSTA

Jakob Ćosić

Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb

DNA barkodiranje je novo predloţena metoda molekularne taksonomije koja korištenjem

kratkih univerzalnih sekvenci koje su dovoljno različite kod svih organizama od interesa

omogućava brzu i preciznu identifikaciju biološkog materijala. U ovom radu sam istraţio

uspješnost DNA barkodiranja kao taksonomske metode za identifikaciju biljnih i ţivotinjskih

vrsta te barkodirao devet autohtonih hrvatskih biljnih vrsta i divokozu Rupicapra rupicapra

L. (Bovidae) te na osnovi dobivenih barkodova rekonstruirao filogenetski odnos populacija

divokoze iz Hrvatske. Na kraju sam se dotakao i problema s kojima se ova metoda

suočava, najčešće u vidu malih razlika među barkodovima raziličitih vrsta, problematičnog

barkodiranja biljaka zbog spore evolucije plastidnog genoma i izolacije biljnih gena i

problema pri određivanju ţivotinjskih vrsta zbog specifičnog načina evolucije ţivotinjskog

mitohondrijskog genoma te prijedloga za njezino poboljšanje.

(50 stranica, 15 slika, 15 tablica, 56 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjiţnici

Ključne riječi: molekularna taksonomija, matK, rbcL, COI, divokoza

Voditelj: doc.dr.sc. Damjan Franjević

Ocjenitelji: doc. dr. sc. Damjan Franjević, izv. prof. dr. sc. Antun Alegro, izv. prof. dr. sc.

Domagoj Đikić

Zamjena: doc. dr. sc. Petra Korać

Rad prihvaćen: 6. studenog 2014.

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb

Faculty of Science

Division of Biology Graduation Thesis

DNA BARCODING AS A METHOD IN TAXONOMICAL IDENTIFICATION OF PLANT AND

ANIMAL SPECIES

Jakob Ćosić

Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb, Croatia

DNA barcoding is a newly proposed method of molecular taxonomy, which by the usage of

short, universal sequences that are divergent enough in all organisms of interest, allows

fast and precise identification of biological material. In this paper, I examined the fidelity of

DNA barcoding as a taxonomic method for identification of plant and animal species. I also

barcoded nine autochthonous Croatian plant species and chamois Rupicapra rupicapra L.

(Bovidae), and conducted analysis of phylogenetic relations of chamois populations from

Croatia based on collected barcode sequences. In the end, I considered the problems

concerning the method, as well as suggestions for its improvement. Considered problems

are mostly small differences between barcodes of different organisms, problematic

barcoding of plants due to slow evolution of plastid genome and isolation of plant genes

and problematic determination of animals due to specific evolution of animal mitochondrial

genome.

(50 pages, 15 figures, 15 tables, 56 references, original in: croatian)

Thesis deposited in the Central Biological Library

Key words: molecular taxonomy, matK, rbcL, COI, chamois

Supervisor: Asst. Prof. Dr. Damjan Franjević

Reviewers: Asst. Prof. Dr. Damjan Franjević, Assoc. Prof. Dr. Antun Alegro, Assoc. Prof.

Dr. Domagoj Đikić

Substitution: Asst. Prof. Dr. Petra Korać

Thesis accepted: November 6, 2014.

Sadržaj

1. Uvod ............................................................................................................................... 9

1.1. Biljne vrste obuhvaćene istraţivanjem ................................................................... 14

1.2. Ţivotinjske vrste obuhvaćene istraţivanjem i njihova taksonomska problematika... 16

2. Ciljevi istraţivanja ......................................................................................................... 18

3. Materijali i metode ........................................................................................................ 19

3.1. Materijali ................................................................................................................ 19

3.1.1. Uzorci .............................................................................................................. 19

3.1.2. Kemikalije ........................................................................................................ 20

3.1.3. Početnice......................................................................................................... 21

3.1.4. Pribor ............................................................................................................... 22

3.1.5. Računalni programi ......................................................................................... 22

3.2. Metode ................................................................................................................... 23

3.2.1. Metoda izolacije i umnaţanja biljne DNA ......................................................... 23

3.2.2. Metoda izolacije i umnaţanja ţivotinjske DNA ................................................. 25

3.2.3. Računalne metode .......................................................................................... 27

4. Rezultati ....................................................................................................................... 28

4.1. Sravnjene sekvence ............................................................................................... 28

4.2. Rezultati BLAST analize ........................................................................................ 30

4.3. Rezultati analize filogenije COI sekvenci ................................................................ 34

4.4. Barkodovi uzoraka ................................................................................................. 39

5. Rasprava ...................................................................................................................... 40

6. Zaključak ...................................................................................................................... 43

7. Literatura ...................................................................................................................... 44

7.1. Internetske reference ............................................................................................. 49

8. Popis priloga................................................................................................................. 50

9

1. Uvod

DNA barkodiranje je novo predloţena metoda molekularne taksonomije kojom se

prethodno odabranim sekvencama i standardiziranim postupcima pokušava klasificirati

raznolikost ţivota. Povećanjem broja poznatih ţivućih vrsta postalo je potrebno na

jednostavan način ih razlikovati i klasificirati. Hebert i sur. (2003, 2003a) su predloţili

sistem DNA barkodiranja ţivotinja zasnovan na molekularnoj raznolikosti mitohondrijskog

gena za podjedinicu I citokrom c oksidaze (COI). Ideja molekularne taksonomije se temelji

na razlikama u kratkim genetičkim markerima koji su zajednički svim ţivim bićima, a DNA

barkodiranje se od ostalih takvih prijedloga razlikuje pozivanjem na standardizirane

markere i metode kao i samom količinom podataka (Moritz i Cicero, 2004). Molekularni

pristup određivanju svojti koristi raznolikost DNA sekvenci, koje se moţe promatrati kao

molekularne taksonomske jedinice ugrađene u svaku stanicu. Snaga molekularne

taksonomije prema tome leţi u mogućnosti određivanja vrste iz vrlo male količine tkiva

koja bi bila nedostatna za morfološku determinaciju. Njenom primjenom se zaobilaze i

ostale poteškoće s morfološkim određivanjem vrsta čija su glavna ograničenja: 1)

fenotipska plastičnost i genetička varijabilnost mogu rezultirati netočnom determinacijom;

2) teško određivanje morfološki kriptičnih svojti; 3) morfološki ključevi su upotrebljivi samo

za određeni spol ili ţivotni stadij jedinke i 4) upotreba ključeva zahtjeva visoku razinu

stručnosti što često rezultira krivom determinacijom (Hebert, 2003a).

Metoda zahtjeva postojanje jedinstvenog kodirajućeg ili nekodirajućeg

standardiziranog lokusa u svim organizmima od interesa, dovoljno kratkog za brzo rutinsko

sekvenciranje koji se kod velikog broja različitih svojti moţe umnoţiti jedinstvenim

početnicama i koji ima dovoljno visoku stopu molekularne evolucije za jednostavno i

jedinstveno razlikovanje vrsta. Idealan DNA barkod bi rutinski trebalo moći izolirati

univerzalnim parom početnica, sekvencirati iz bilo kojeg smjera te bi trebao imati

maksimalnu moć diskriminacije među različitim vrstama (CBOL Plant Working Group,

2009). Uz to, da bi DNA barkodiranje bilo uspješno mora proteći dovoljno vremena od

specijacije da bi mutacije i genetički drift fiksirali nove alele u populaciji, odvojene od

ostalih vrsta (Hollingsworth, 2011).

Za barkodiranje ţivotinja se koriste isključivo mitohondrijski geni zbog brze stope

molekularne evolucije mitohondrijskog genoma što omogućava razlikovanje blisko srodnih

ţivotinjskih vrsta iz svih koljena osim Cnidaria (Hebert, 2003). Selekcija osobito jako

10

djeluje na proteinske produkte mitohondrijskog genoma optimizirajući njihove interakcije s

proteinskim produktima jezgrinog genoma koji su puno konzervativniji. Uz to,

mitohondrijski genom ţivotinja je bolji kandidat za analizu od jezgrinog genoma zbog toga

što nema introne, rekombinacije su jako rijetke i nasljeđuje se samo od jednog roditelja.

Robusne početnice također omogućuju rutinsku izolaciju ţeljenih dijelova mitohondrijskog

genoma. Trinaest mitohondrijskih gena koji kodiraju proteine su dobri kandidati za

taksonomske analize i zbog rijetkih insercija i delecija koje najčešće rezultiraju

pomicanjem okvira čitanja (slika 1).

Slika 1: Mitohondrijski genom sisavca. Trinaest gena koji kodiraju proteine su označeni narančasto, dva

gena za ribosomalnu RNA ţuto, a dvadeset i dva gena za transportnu RNA zeleno. Ruţičasto su označene

D-petlja i kontrolna regija (Preuzeto iz Park, 2011).

COI sekvenca je jedini barkod sluţbeno priznat od strane američkog National

Center for Biotechnology Information (NCBI), a kao standard za barkodiranje ţivotinja se

koristi "Folmerova regija", minimalno 500 parova baza (pb) duga sekvenca 5' kraja COI

gena (slika 2).

11

Slika 2: COI gen i fragmenti umnoţeni različitim parovima početnica. Folmerova regija je označena ţuto

(Preuzeto iz McKeon, 2010).

Podjedinica I citokrom c oksidaze je podjedinica kompleksa IV, posljednjeg

kompleksa lanca prijenosa elektrona u oksidacijskoj fosforilaciji koji prenosi elektrone s

citokroma c na molekularni kisik pri čemu nastaje voda. Uspjeh u određivanju vrsta

povezan je s velikom brzinom promjene COI sekvence kod velike većine ţivotinjskih svojti

i ograničenjima u divergenciji mitohondrijske DNA. Iako ne postoji razlog za a priori odabir

određenog gena, gen za podjedinicu I citokrom c oksidaze ima dvije vaţne prednosti: 1)

univerzalne početnice omogućuju izolaciju 5' kraja COI gena iz svih ţivotinjskih koljena

osim Cnidaria i 2) COI pokazuje veći filogenetski signal od drugih mitohondrijskih gena.

Ţivotinjske vrste istog roda često imaju vrlo različite sekvence COI gena, a njegova

evolucija je dovoljno brza ne samo za određivanje srodnih vrsta već i filogeografskih grupa

jedne vrste. Divergencija COI sekvenci među pripadnicima iste vrste je najčešće manja od

2 % pa se zato COI moţe koristiti za vrlo točnu determinaciju (Hebert, 2003). Zbog vrlo

rijetkog pojavljivanja insercija i delecija poravnavanje COI sekvenci je također

jednostavno. Uz to, konvergencija molekularnih osobina i horizontalni prijenos gena

nemaju velik utjecaj na sposobnost determinacije COI sekvencom (Hebert, 2003a).

Sekvenca podjedinice I citokrom c oksidaze koja se koristi kao ţivotinjski barkod

nije prikladna za barkodiranje biljaka zbog puno sporije evolucije biljnog mitohondrijskog

genoma i komplicirane izolacije biljnih mitohondrijskih gena (Kress, 2005). Zbog toga

jedinstveni lokus ne ispunjava zahtjeve za barkodiranje pa se zato koristi kombinacija više

njih. Na temelju procjene lakoće izolacije, kvalitete sekvenci i razine divergencije među

vrstama kao univerzalni biljni barkod predloţena je kombinacija gena za veliku podjedinicu

ribuloza-1,5-bisfosfat karboksilaze oksigenaze (rbcL), enzima Calvinovog ciklusa koji

katalizira karboksilaciju ribuloza-1,5-bisfosfata u 3-fosfoglicerat i maturazu K (matK),

12

enzima kodiranog trnK prokariotskim intronom skupine II koji izrezuje introne skupine II iz

primarnog RNA transkripta, uz upotrebu dodatnih sekvenci ako je to potrebno (slika 3)

(Zoschke, 2010; Hausner, 2006).

Slika 3: Plastidni genom vrste Arbutus unedo L. Gen rbcL je označen zeleno, a matK narančasto (Preuzeto

iz Martinez-Alberola, 2013).

rbcL i matK barkodovi su minimalno 500 pb duge sekvence 5' kraja gena. Iako nije

najvarijabilnija regija plastidnog genoma rbcL je najbolje poznati gen, ima veliku

univerzalnost i dobru moć razlučivanja, a univerzalne početnice omogućuju laku izolaciju

dvosmjernih sekvenci iz velike većine kopnenih biljaka te je često dio najboljih kombinacija

lokusa za određivanje vrsta, dok je matK regija plastidnog genoma s jednom od najvećih

stopa molekularne evolucije te pokazuje visoku razinu razlučivosti među

kritosjemenjačama, no još uvijek ne postoje univerzalne početnice za nju (CBOL Plant

Working Group, 2009).

13

Za barkodiranje ostalih ţivih organizama predloţen je gen za 18S ribosomalnu RNA

kod protista, a za gljive mitohondrijski CO1 gen (slika 4) i jezgrine ribosomalne ITS

sekvence (slika 5) (Pawlowski, 2012; Seifert, 2007, 2009).

Slika 4: Mitohondrijski genom kvasca Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen (Preuzeto s

eplantscience.com).

Slika 5: Jezgrine ITS1 i ITS2 sekvence gljiva između gena za 18S, 5.8S i 28S ribosomalnu RNA. Zeleno,

crveno i ljubičasto su označene početnice i sekvence koje umnaţaju. Crveno su označene početnice za

umnaţanje ITS regija i 5.8S rRNA gena (Preuzeto s ibwf.de).

14

U svrhu promicanja DNA barkodiranja kao globalnog standarda za identifikaciju

bioloških uzoraka 2004. godine je osnovan Konzorcij za barkodiranje ţivota (Consortium

for the Barcode of Life, CBOL). 2010. je osnovan International Barcode of Life (iBOL)

kojemu je cilj samo barkodiranje i u kojemu sudjeluje više tisuća znanstvenika iz cijeloga

svijeta što ga čini najvećim projektom kojemu je cilj proučavanje molekularne

bioraznolikosti i DNA taksonomije (Ratnasingham i Hebert, 2007). Cilj projekta iBOL je

barkodiranje 5 milijuna uzoraka i 500 tisuća vrsta do 2015. godine. Do sada je uspješno

barkodirano više od 3 milijuna uzoraka koji uključuju više od 150 tisuća vrsta Arthropoda,

25 tisuća vrsta Chordata, 50 tisuća vrsta biljaka i 10 tisuća vrsta iz manjih svojti (BOLD,

2014). Barkodovi uzoraka su pohranjeni u Barcode of Life Database (BOLD) bazi

podataka i Banci Gena (GenBank) pri National Center for Biotechnology Information

(NCBI). Glavne primjene DNA barkodiranja se vide u molekularnoj taksonomiji vrsta i

istraţivanju njihove evolucijske povijesti te u identifikaciji prethodno nepoznatih vrsta i

biološkog materijala, uključujući i fosilne ostatke.

1.1. Biljne vrste obuhvaćene istraživanjem

Biljne vrste uključene u ovo istraţivanje su tipični predstavnici mediteranske i

submediteranske vegetacije koju nalazimo na obalama Sredozemnog mora te manjim

dijelom u drugim krajevima svijeta umjerenog pojasa. U Hrvatskoj biljke mediteranske

vegetacije nalazimo u obalnim i brdskim klimazonalnim pojasevima. U Hrvatskoj obalni

mediteranski pojas obuhvaća veći dio otoka, uski priobalni pojas te juţnu Dalmaciju, a

brdski mediteranski pojas okolne planinske masive. Mediteranske biljke su prilagođene za

ţivot u uvjetima suhog i vrućeg ljeta te blage, kišovite zime i uglavnom su zimzelene, dok

submediteransku vegetaciju predstavljaju listopadne biljke prilagođene na zime sa znatno

niţim temperaturama i većom količinom padalina. Prilagodbe biljaka uključuju koţasto

lišće s voštanim slojem, dlake te jak korijenski sustav. Ekosustavi predstavnika te

vegetacije su uglavnom makije, garizi i kamenjari, dok je šumska vegetacija zbog stoljeća

krčenja rijetka (vusz.hr, 2014).

Sve biljne vrste obuhvaćene ovim istraţivanjem su kritosjemenjače (Angiospermae,

Magnoliophyta), od kojih su Ruscus aculeatus L. (Asparagaceae) – bodljikava veprina i

Smilax aspera L. (Smilacaceae) – crvena tetivika jednosupnice; Arbutus unedo L.

(Ericaceae) – planika, Hedera helix L. (Hederaceae) – bršljan, Oxalis acetosella L.

(Oxalidaceae) – šumski cecelj, Phillyrea media L. (Oleaceae) – srednja komorika, Pistacia

15

lentiscus L. (Anacardiaceae) – tršlja i Quercus ilex L. (Fagaceae) – hrast crnika prave

dvosupnice, a Laurus nobilis L. (Lauraceae) – lovor pripada magnolidnom kompleksu

primitivnih kritosjemenjača (slika 6).

Slika 6: Filogenetski odnosi kritosjemenjača prema The Angiosperm Phylogeny Group (Preuzeto iz The

Angiosperm Phylogeny Group, 2003).

16

1.2. Životinjske vrste obuhvaćene istraživanjem i njihova taksonomska

problematika

Divokoza Rupicapra rupicapra L. je jedan od velikih sisavaca s Alpsko-dinaridskog

područja koji pripada redu parnoprstaša Artiodactyla i porodici šupljoroţaca Bovidae.

Sjeverne Dinaride i Alpe naseljava isključivo alpska podvrsta R. r. rupicapra, dok se u

središnjim i juţnim Dinaridima nalazi balkanska podvrsta R. r. balcanica, koja je morfološki

veća od alpske. Na području Velebita prije 30-ak godina se pojavila manja populacija

divokoza nastala introdukcijom obje podvrste (atos.hr, 2014; hunting-croatia.net, 2014; np-

sjeverni-velebit.hr, 2014). Divokoze ţive na nadmorskim visinama višim od 1000 m, na

granici šumske vegetacije i klekovine, a tijekom zime se spuštaju u niţe predjele. Dnevne

su ţivotinje, hrane se svim vrstama planinskog bilja, a najveće prijetnje su im vuk Canis

lupus L., ris Lynx lynx L. i u Alpskim predjelima, lavine (zasticenevrste.azo.hr., 2014). U

Hrvatskoj najveće populacije se nalaze na području Velebita i Biokova. Tijekom 19.

stoljeća u Hrvatskoj je zbog krivolova gotovo potpuno izumrla. Naporima plemstva krajem

19. stoljeća i lovačkih društava nakon drugog svjetskog rata uspostavljene su stabilne

populacije, koje iako se obnavljaju i dalje pokazuju pad broja jedinki. Danas je divokoza u

Hrvatskoj zaštićena vrsta te se nalazi na Crvenom popisu zaštićenih sisavaca Hrvatske s

regionalnom kategorijom ugroţenosti niskorizična vrsta (IUCN kategorija NT) (Tvrtković i

Grubešić, 2006).

Rod Rupicapra se pojavio u zapadnoj Euroaziji s vrstama R. rupicapra i R.

pyrenaica tijekom kasnog pleistocena (Masini i Lovari, 1988). Dosadašnja rijetka

istraţivanja filogenije ovog roda su pokazala da su jedinke vrste R. rupicapra s područja

Alpa i sjevernih Dinarida grupirane u četiri mitohondrijske filogrupe: središnju, juţnu,

sjevernu i istočnu (Schaschl, 2003; Hammer, 1995) (slika 7). Iako DNA barkodiranje nije

zamišljeno kao metoda molekularne filogenije, DNA barkodovi ţivotinja se mogu pouzdano

upotrijebiti za razlučivanje filogenetskih odnosa unutar različitih populacija iste vrste.

17

Slika 7: Populacije roda Rupicapra u Europi i zapadnoj Aziji. Bojama su predstavljene populacije različitih

podvrsta vrsta R. rupicapra i R. pyrenaica. Podvrste R. r. rupicapra i R. r. balcanica koje nalazimo u

Republici Hrvatskoj predstavljene su crvenom i sivom bojom (Preuzeto iz Pérez, 2011).

18

2. Ciljevi istraživanja

Ciljevi ovoga istraţivanja su bili:

1) Upotrijebiti metodu DNA barkodiranja za identifikaciju nekih autohtonih hrvatskih

biljnih vrsta te pomoću barkodova za populacije divokoza s područja Republike

Hrvatske ustanoviti njihov filogenetski odnos.

2) Dobivene sekvence barkodova unijeti u BOLD baza podataka iBOL-a i u Banku

Gena, što predstavlja prvi unos barkodova vrsta iz Republike Hrvatske u

međunarodnu bazu podataka barkodiranih vrsta.

19

3. Materijali i metode

3.1. Materijali

3.1.1. Uzorci

Istraţivanje sam napravio s 9 hrvatskih autohtonih biljnih vrsta: Arbutus unedo L.

(Ericaceae) – planika, Hedera helix L. (Hederaceae) – bršljan, Laurus nobilis L.

(Lauraceae) – lovor, Oxalis acetosella L. (Oxalidaceae) – šumski cecelj, Phillyrea media L.

(Oleaceae) – srednja komorika, Pistacia lentiscus L. (Anacardiaceae) – tršlja, Quercus ilex

L. (Fagaceae) – hrast crnika, Ruscus aculeatus L. (Asparagaceae) – bodljikava veprina i

Smilax aspera L. (Smilacaceae) – crvena tetivika te 11 uzoraka divokoze Rupicapra sp. L.

(Bovidae). Svi biljni uzorci su prikupljeni na području grada Rovinja (45°05'03"N,

13°37'50"E) tijekom 2013. godine. Ţivotinjski uzorci su prikupljeni na raznim lokalitetima na

području Sjevernog Velebita (44°44'45"N, 14°57'30"E), Biokova (43°23'03"N, 17°04'10"E) i

rijeke Kupe krajem 2013. i početkom 2014. godine (tablica 1). Biljni uzorci su bili

pohranjeni u silikagelu u hladnjaku, a ţivotinjski u 96 % etanolu u hladnjaku.

Tablica 1: Lokacije prikupljanja ţivotinjskih uzoraka i spol jedinki uključenih u analizu.

Uzorak Lokacija Spol

1_Rupicapra S. Velebit Muţjak



4_Rupicapra S. Velebit Ţenka




8_Rupicapra S. Velebit Ţenka


10_Rupicapra Biokovo Muţjak

11_Rupicapra Kupa Muţjak

20

3.1.2. Kemikalije

1. Etidij-bromid (3,8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridinijev bromid) (Sigma-Aldrich)

2. Agaroza (Sigma-Aldrich)

3. 96 % Etanol (Kemika)

4. Izopropanol (propan-2-ol) (Kemika)

5. Pufer TE 1x (10 mM 2-amino-2-hidroskimetilpropan-1,3-diol i 1 mM

etilendiamintetraoctena kiselina)

6. Komercijalni puferi proizvođača Qiagen: AE, AL, ATL, AP1, AP2, AP3/E, AW,

AW1, AW2, EB, PB, PE, QG

7. Proteinaza K (Qiagen)

8. RNaza A (Qiagen)

9. CoralLoad Concentrate, 10x (Qiagen)

10. GelPilot 100bp Plus Ladder (Qiagen)

11. GelPilot DNA Loading Dye 5x (Qiagen)

12. HotStarTaq Plus Master Mix 2x (Qiagen)

13. RNase Free Water (Qiagen)

21

3.1.3. Početnice

U tablici 2 prikazani su slijedovi nukleotida početnica, duljine početnica, udio CpG

mjesta, temperature mekšanja i njihove relativne molekulske mase. Sve sekvence su

prikazane od 5' prema 3' kraju. Proizvođač svih početnica je tvrtka Macrogen iz

Amsterdama.

Tablica 2: Karakteristike početnica korištenih u ovom radu. CpG = postotak CpG mjesta, Tm = temperatura

mekšanja, Mr = relativna molekulska masa.

Početnica Sekvenca Duljina / pb CpG / % Tm / °C Mr

rbcLa-F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC 26 42.31 64.7 7950.2

rbcLa-R ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC 20 45.0 56.4 6087.0

matK-KIM1R CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 27 48.15 68.3 8210.4

matK-KIM3F ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC 25 40.0 62.5 7678.0

LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 25 32.0 59.2 7722.1

HCO2198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 26 35.0 62.0 7980.3

22

3.1.4. Pribor

1. BioRad MyCycler termocycler

2. BioRad PowerPac Basic uređaj za elektroforezu

3. BioRad Wide Mini-Sub Cell GT i Mini-Sub Cell kadice za elektroforezu

4. BioRad C1301-230V mikrocentrifuga

5. BioRad transiluminator

6. Qiagen - Retsch TissueLyser MM300 uređaj za usitnjavanje tkiva

7. Qiagen DNeasy Mini spin kolone

8. Qiagen MinElute kolone

9. Eppendorf 5424 mikrocentrifuga

10. Eppendorf Research 10, 200 i 1000 μL mikropipete

11. Eppendorf SAFELOCK mikroepruvete 1.5 mL i 2 mL

12. Eppendorf PCR mikroepruvete 0.5 mL

13. Eppendorf epT.I.P.S. nastavci za mikropipete 10, 200 i 500 μL

14. Mettler Toledo AB54-3 analitička vaga

15. Pechiney Parafilm M

16. Rezač parafilma

17. Shel Lab vodena kupelj

18. Bibby Stuart Vortex Mixer SA7

19. Fotoaparat Olympus Camedia C-4000 Zoom

20. Računalo Intel Pentium (R) Core (TM) i5-3330 3.2GHz s 8 GB RAM-a

3.1.5. Računalni programi

Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) verzija 6.0 (Tamura, 2013)

Clustal X2 verzija 2.1 (Larkin, 2007)

BioEdit verzija 7.2.5 (Hall, 1999)

Cam2Com verzija 4.1.1.41. (2007)

23

3.2. Metode

3.2.1. Metoda izolacije i umnažanja biljne DNA

Prije izolacije biljne DNA 25 do 35 mg liofiliziranog biljnog tkiva je usitnjeno u

uređaju za usitnjavanje tkiva. Ukupna biljna stanična DNA je izolirana Qiagen DNeasy

Plant Mini Kit (50) kompletom prema Qiagen DNeasy Plant Handbook protokolu (Qiagen,

2006). Provjera izolacije DNA je napravljena elektroforezom na 1 % agoroznom gelu

pripremljenom u 1x TE puferu na 120 V u trajanju od 15 min. Gel je nakon elektroforeze

natopljen etidij-bromidom te promatran na transiluminatoru i fotografiran aparatom

povezanim s osobnim računalom s programom Cam2Com (slika 8).

Slika 8: Provjera izolacije biljne stanične DNA elektroforezom. LN = L. nobilis, QI = Q. ilex, OA = O.

acetosella, AU = A. unedo, HH = H. helix, PL = P. lentiscus, RA = R. aculeatus, SA = S. aspera, PM = P.

media.

Odabrane sekvence, rbcL i matK, su umnoţene koristeći Qiagen HotStarTaq Plus

Master Mix Kit komplet lančanom reakcijom polimerazom (PCR) u BioRad MyCycler

termocyleru u reakcijama od 25 μL (tablica 3) prema modificiranom Qiagen HotStarTaq

Plus PCR Handbook protokolu (tablica 4)(Qiagen, 2008a).

24

Tablica 3: Sastav 25 μL PCR reakcija za umnažanje biljnih gena.

Sastojak V / μL

HotStar Taq Plus MasterMix 10

Početnica 1 1

Početnica 2 1

DNA uzorka 1

CoralLoad Concentrate, 10x 2

RNase Free Water 10

Tablica 4: Protokol za umnaţanje biljne DNA metodom PCR. PD = preddenaturacija, D = denaturacija, A =

vezanje početnica, S = sinteza DNA, F = završna faza.

PD D A S F

95°C, 5min 94°C, 30s 53°C, 40s 72°C, 40s 72°C, 10min

35 ciklusa

Za umnaţanje rbcL sekvenci su korištene početnice rbcLa-F i rbcLa-R, a za matK

sekvence početnice matK-KIM1R i matK-KIM3F (Fazekas, 2012). Provjera umnaţanja je

napravljena elektroforezom na 1 % agaroznom gelu pripremljenom u 1x TE puferu na 120

V, u trajanju od 15 min (slika 9).

Slika 9: Elektroforeza produkata PCR reakcija umnaţanja biljnih gena. rbcL pokazuje umnaţanje u području

~600 pb, a matK u području ~800 pb. LN = L. nobilis, QI = Q.ilex, OA = O. acetosella, AU = A. unedo, HH =

H. helix, PL = P. lentiscus, RA = R. aculeatus, SA = S. aspera, PM = P. media, S = GelPilot 100bp Plus

Ladder.

Umnoţena DNA je pročišćena Qiagen MinElute Reaction Cleanup Kit kompletom

prema Qiagen MinElute Handbook protokolu (Qiagen, 2008). Pročišćeni uzorci su zajedno

s početnicama poslani u servis za sekvenciranje Macrogen u Amsterdamu.

25

3.2.2. Metoda izolacije i umnažanja životinjske DNA

Ukupna ţivotinjska stanična DNA je izolirana iz jetre 11 jedinki vrste R. rupicapra.

Za izolaciju je 10 do 15 mg u 96 % etanolu konzerviranog ţivotinjskog tkiva otopljeno u

vodenoj kupelji na 56 °C, 24 h pomoću Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit kompleta

prema Qiagen Blood & Tissue Handbook protokolu. Nakon otapanja ukupna stanična DNA

je izolirana Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit kompletom prema Qiagen Blood & Tissue

Handbook protokolu (Qiagen, 2006a). Provjera izolacije ukupne stanične DNA je

napravljena elektroforezom na 1 % agaroznom gelu pripremljenom u 1x TE puferu na 120

V, u trajanju od 15 min, koji je nakon elektroforeze natopljen etidij-bromidom te fotografiran

na transiluminatoru (slika 10).

Slika 10: Provjera izolacije ţivotinjske stanične DNA elektroforezom. Uzorci su označeni brojevima.

COI sekvenca je umnoţena koristeći Qiagen HotStarTaq Plus Master Mix Kit

komplet PCR reakcijama u 20 μL (tablica 5) u BioRad MyCycler termocyleru prema

modificiranom Qiagen HotStarTaq Plus PCR Handbook protokolu (tablica 6)(Qiagen,

2008a).

26

Tablica 5: Sastav 20 μL PCR reakcija za umnaţanje COI gena.

Sastojak V / μL

HotStar Taq Plus MasterMix 10

Početnica 1 1

Početnica 2 1

DNA uzorka 2

CoralLoad Concentrate, 10x 2

RNase Free Water 4

Tablica 6: Protokol za umnaţanje ţivotinjske DNA metodom PCR. PD = preddenaturacija, D = denaturacija,

A = vezanje početnica, S = sinteza DNA, F = završna faza.

PD D A S F

95°C, 5min 94°C, 40s 48°C, 40s 72°C, 1min 72°C, 10min

35 ciklusa

Provjera umnaţanja je napravljena elektroforezom na 1 % agaroznom gelu

pripremljenom u 1x TE puferu na 120 V, u trajanju od 15 min (slika 11). Za umnaţanje COI

gena korištene su početnice LCO1490 i HCO2198 (Folmer, 1994).

Slika 11: Elektroforeza produkata PCR reakcija umnaţanja ţivotinjskih gena. Uzorci su označeni brojevima.

S = GelPilot 100bp Plus Ladder.

Umnoţena DNA je pročišćena Qiagen MinElute Reaction Cleanup Kit kompletom

prema Qiagen MinElute Handbook protokolu (Qiagen, 2008). Pročišćeni uzorci su zajedno

s početnicama poslani u servis za sekvenciranje Macrogen u Amsterdamu.

27

3.2.3. Računalne metode

Nakon sekvenciranja dobivene sekvence višestruko su sravnjene programom

ClustalX2 i uređene u programu BioEdit. Sravnjivanje je potrebno kako bi se homologne

nukelotide svelo u jednu ravninu te s obzirom da svi potječu od zajedničkog pretka

omogućilo filogenetske analize. Sekvence su uspoređene s referentnim sekvencama u

Banci Gena i jedna s drugom pomoću Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) alata na

internetskoj stranici NCBI-ja. BLAST analiza uspoređuje sličnosti među primarnom

strukturom sekvenci te rezultate daje kao postotak sličnosti. Analizom tih podataka moţe

se utvrditi postojanje homologije među sekvencama. BLAST analiza također moţe

uspoređivati ţeljene sekvence s onima u Banci Gena pa se zato i koristi kao alat za njeno

pretraţivanje. U BLAST analizi korišteni su algoritmi megablast, discontinous megablast i

blastn koji se razlikuju po osjetljivosti na sličnosti među analiziranim sekvencama (Altschul,

1990; ncbi.nlm.nih.gov, 2014). Programom MEGA 6 su napravljena filogenetska stabla

temeljena na COI haplotipovima koristeći metode najveće štedljivosti (Maximum

Parsimony) sa supstitucijskim modelom Subtree Pruning and Regrafting (SPR) i najveće

vjerojatnosti (Maximum Likelihood) s modelom Generalised Time Reversible (GTR) i

metodom SPR. Metoda najveće štedljivosti analizu vrši samo s informativnim, varijabilnim

mjestima u slijedu nukleotida ili aminokiselina te generira velik broj mogućih filogenetskih

stabala. Nakon toga, po principu Ockhamove britve, algoritam odabire stablo za čiju je

topologiju potrebno najmanje evolucijskih koraka. Ukoliko više različitih stabala

zadovoljava princip najveće štedljivosti, algoritam generira konsenzusno stablo koje

predstavlja srednju vrijednosti najštedljivijih stabala. Supstitucijski model SPR nasumično

odabire grane već postojećih stabala te ih premješta kako bi generirao što veći broj novih

stabala.Metoda najveće vjerojatnosti isto tako generira velik broj stabala koja pod

određenim evolucijskim modelom s najvećom vjerojatnosti prikazuju filogenetske odnose

analiziranih markera. Supstitucijski model GTR je neutralan, nezavisan model evolucije

DNA. Model GTR dozvoljava različite frekvencije za sva četiri nukleotida te pretpostavlja

da je evolucija pojedinih nukleotida povratan homogeni Markovljev proces sa simetričnom

supstitucijskom matricom i zato moţe biti povratna u vremenu. Zbog toga za filogenetsku

analizu ovim modelom nije vaţno, niti je moguće odrediti koja je sekvenca ishodišna jer

sve imaju jednaku vjerojatnost za evoluciju jedne iz druge (Tavaré, 1986; Yang, 1994). Broj

poduzorkovanja (bootstrap) u svim analizama je bio 2000. Bootstrap analizom algoritam

generira stabla te ih uspoređuje prema topologiji. Vrijednosti bootstrap analize prikazane

su kao postotak stabala koja su imala jednaku topologiju.

28

4. Rezultati

4.1. Sravnjene sekvence

Nakon sekvenciranja i računalne obrade ukupno je dobiveno 29 sekvenci od kojih je

9 biljnih rbcL sekvenci (tablica 7), 9 biljnih matK sekvenci (tablica 8) i 11 ţivotinjskih COI

sekvenci (tablica 9).

Tablica 7: rbcL sekvence nakon sravnjivanja. A = adenin, T = timin, C = citozin, G = gvanin, CpG = postotak

CpG mjesta, Mr = relativna molekulska masa.

Udio baza / %

Uzorak Duljina / pb A T C G CpG / % Mr

Arbutus unedo 549 28.1 28.4 20.4 23.1 44 169825.4

Hedera helix 549 25.9 28.1 22.8 23.3 46 169547.0

Laurus nobilis 547 25.2 26.3 23.2 25.2 48 169122.7

Oxalis acetosella 549 25.7 29.3 22.0 23.0 45 169548.1

Phillyrea media 549 27.0 28.6 20.8 23.7 44 169816.3

Pistacia lentiscus 549 28.4 27.5 21.5 22.6 44 169678.3

Quercus ilex 548 26.5 28.6 21.9 23.0 45 169295.0

Ruscus aculeatus 547 25.6 28.5 22.9 23.0 46 168870.6

Smilax aspera 549 28.4 27.9 20.6 23.1 44 169828.4

Prosječna duljina umnoţenih rbcL sekvenci je 548 nukleotida.

29

Tablica 8: matK sekvence nakon sravnjivanja. A = adenin, T = timin, C = citozin, G = gvanin, CpG = postotak


Udio baza / %


Arbutus unedo 775 30.1 36.5 17.2 16.3 33 238946.0

Hedera helix 774 29.3 35.5 18.7 16.4 35 238432.5

Laurus nobilis 782 29.0 34.9 19.2 16.9 36 240916.0

Oxalis acetosella 781 28.8 36.6 16.6 17.9 35 241094.3

Phillyrea media 782 29.0 37.1 17.0 16.9 34 240882.2

Pistacia lentiscus 793 28.6 35.8 19.0 16.5 36 244222.2

Quercus ilex 781 29.6 36.1 19.1 15.2 34 240337.8

Ruscus aculeatus 799 30.0 38.2 16.6 15.1 32 246184.8

Smilax aspera 797 31.6 36.6 16.6 15.2 32 245699.5

Prosječna duljina umnoţenih matK sekvenci je 785 nukleotida.

Tablica 9: COI sekvence nakon sravnjivanja. A = adenin, T = timin, C = citozin, G = gvanin, CpG = postotak


Udio baza / %


1_Rupicapra 659 29.4 26.7 27.5 16.4 44 202136.2

2_Rupicapra 659 27.9 28.5 26.3 17.3 44 202316.4

3_Rupicapra 659 29.3 26.3 27.0 17.5 44 202347.7

4_Rupicapra 659 28.7 27.2 26.9 17.3 44 202301.3

5_Rupicapra 659 27.8 29.0 25.8 17.5 43 202377.4

6_Rupicapra 659 26.3 29.3 27.0 17.4 44 202167.2

7_Rupicapra 659 28.1 29.1 25.9 16.8 43 202282.4

8_Rupicapra 659 27.0 30.3 25.5 17.1 43 202312.4

9_Rupicapra 659 25.9 26.4 29.1 18.5 48 202113.9

10_Rupicapra 659 27.2 28.8 26.7 17.3 44 202226.3

11_Rupicapra 659 26.7 27.6 29.1 16.5 46 201833.9

Prosječna duljina umnoţenih COI sekvenci je 659 nukleotida.

30

4.2. Rezultati BLAST analize

BLAST alatom je prvo pretraţena baza podataka Banke Gena. Pretrage su

napravljene korištenjem algoritma megablast, kako bi se pronašle sekvence najsličnije

onima u Banci Gena. U tablici 10 su rezultati BLAST pretrage s identificiranom vrstom,

pristupnim brojem identificirane sekvence i postotkom poklapanja za biljne rbcL sekvence.

U tablici 11 su rezultati iste pretrage za biljne matK sekvence i u tablici 12 rezultati

pretrage za ţivotinjske COI sekvence.

Tablica 10: Rezultati BLAST analize rbcL sekvenci.

Uzorak Poklapanje / % GenBank

pristupni broj

Identificirana vrsta

Arbutus unedo 99 JQ067650.2 Arbutus unedo

Hedera helix 97 L01924.2 Hedera helix

Laurus nobilis 98 HQ619756.1 Laurus nobilis

Oxalis acetosella 95 JN893052.1 Oxalis acetosella

Phillyrea media 98 FJ862064.1 Phillyrea media

Pistacia lentiscus 99 FN599457.1 Pistacia chinensis

Quercus ilex 99 AB125020.1 Quercus ilex

Ruscus aculeatus 97 JN892402.1 Ruscus aculeatus

Smilax aspera 100 JQ711037.1 Smilax aspera

31

Tablica 11: Rezultati BLAST analize matK sekvenci.

Uzorak Poklapanje / % GenBank

pristupni broj

Identificirana vrsta

Arbutus unedo 99 JQ067650.2 Arbutus unedo

Hedera helix 99 JN895670.1 Hedera helix

Laurus nobilis 99 HQ619817.1 Laurus nobilis

Oxalis acetosella 95 JN895689.1 Oxalis acetosella

Phillyrea media 99 HE967458.1 Phillyrea augustinifolia

Pistacia lentiscus 90 KJ510922.1 Pistacia chinensis

Quercus ilex 99 AB125037.1 Quercus ilex

Ruscus aculeatus 99 HM640554.1 Ruscus aculeatus

Smilax aspera 99 KJ719970.1 Smilax aspera

Tablica 12: Rezultati BLAST analize COI sekvenci

Uzorak Preklapanje / % GenBank

pristupni broj Identificirana vrsta

1_Rupicapra 86 KF856568.1 Capricornis milneedwardsii








9_Rupicapra 97 FJ207539.1 Rupicapra rupicapra


11_Rupicapra 99 KF317908.1 Rupicapra rupicapra

Dva uzorka su određena kao divokoza R. rupicapra, dok su ostali najsličniji

sekvenci azijske koze Capricornis milneedwardsii David. Sve sekvence su određene točno

do razine porodice Bovidae.

32

Nakon pretrage Banke Gena, sekvence su uspoređene međusobno jedna s drugom

alatom BLAST s uključenom opcijom poravnavanja dvije ili više sekvenci uz korštenje

algoritama megablast, discontinous megablast i blastn. U tablici 13 su rezultati analize

sličnosti rbcL sekvenci. Rezultati su dani kao postotak razlike među sekvencama te je

izračunata srednja vrijednost divergencije za svaku od sekvenci i prosjek srednjih

vrijednosti. Rezultati iste analize za matK sekvence su u tablici 14, a za COI sekvence u

tablici 15.

Tablica 13: Postotak divergencije među rbcL sekvencama dobiven BLAST analizom. SV = srednja vrijednost.

Uzorak

A.

unedo

H.

helix

L.

nobilis

O.

acetosella

P.

media

P.

lentiscus

Q.

ilex

R.

aculeatus

S.

aspera

Arbutus unedo 0 11 12 11 8 11 11 10 10

Hedera helix 11 0 25 14 11 10 9 17 10

Laurus nobilis 12 25 0 8 11 10 10 16 9

Oxalis acetosella 11 14 8 0 14 13 10 10 12

Phillyrea media 8 11 11 14 0 8 11 10 11

Pistacia lentiscus 10 10 10 13 8 0 9 10 10

Quercus ilex 10 9 10 10 11 9 0 11 9

Ruscus aculeatus 9 17 16 10 10 10 11 0 9

Smilax aspera 16 10 9 12 11 10 9 9 0

SV 10.88 14 12.25 11.63 10.5 10.13 10 11.63 10

Srednji postotak divergencije među svim rbcL sekvencama dobiven BLAST

analizom je 11.22.

33

Tablica 14: Postotak divergencije među matK sekvencama dobiven BLAST analizom. SV = srednja

vrijednost.

Uzorak

A.

unedo

H.

helix

L.

nobilis

O.

acetosella

P.

media

P.

lentiscus

Q.

ilex

R.

aculeatus

S.

aspera

Arbutus unedo 0 16 21 22 14 19 22 25 24

Hedera helix 16 0 19 20 11 18 19 25 24

Laurus nobilis 21 19 0 22 27 20 22 20 20

Oxalis acetosella 22 20 22 0 20 18 19 26 28

Phillyrea media 14 11 27 20 0 16 18 24 23

Pistacia lentiscus 19 18 20 18 16 0 18 25 25

Quercus ilex 22 19 22 19 18 18 0 26 26

Ruscus aculeatus 25 25 20 26 24 25 26 0 16

Smilax aspera 24 24 20 28 23 25 26 16 0

SV 20.4 19 21.4 21.9 19.1 19.9 21.3 23.4 22.9

Srednji postotak divergencije među svim matK sekvencama dobiven BLAST

analizom je 21.

Tablica 15: Postotak divergencije među COI sekvencama dobiven BLAST analizom. Brojevima od 1 do 11 su

označeni uzorci, SV = srednja vrijednost.

Uzorak 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 0 8 6 5 8 6 8 9 9 7 20

2 8 0 7 5 1 8 1 2 8 6 16

3 6 7 0 5 8 6 7 8 8 5 15

4 5 5 5 0 6 5 5 5 8 7 20

5 8 1 7 6 0 9 0 3 8 7 16

6 6 8 6 5 9 0 8 7 9 7 19

7 8 1 7 5 0 8 0 2 8 7 16

8 9 2 8 5 3 7 2 0 8 6 17

9 9 8 8 8 8 9 8 8 0 8 17

10 7 6 5 7 7 7 7 6 8 0 20

11 20 16 15 20 16 19 16 17 17 20 0

SV 8.6 6.2 7.4 7.1 6.6 8.4 6.2 6.7 9.1 8 17.6

Srednji postotak divergencije među svim COI sekvencama dobiven BLAST

analizom je 8.4.

34

4.3. Rezultati analize filogenije COI sekvenci

Filogenetski odnosi među COI sekvencama su analizirani programom MEGA 6.

Najprije su izrađena filogenetska stabla metodom najveće štedljivosti (slika 12). Prikazano

stablo je izabrano kao najštedljivije s duljinom 853. Indeks homoplazije za mjesta

informativna za analizu ovom metodom je 0.632153, a indeks retencije je 0.539249.

Kompozitni indeks za sva mjesta je 0.453905, a za informativna mjesta 0.340888. U svim

analizama filogenije kao vanjska grupa za korijen stabla je izabrana sekvenca COI gena

ovce Ovis aries L. (Bovidae), pristupni broj KF977845.1. 659 nukleotida je bilo

informativno za analizu metodom najveće štedljivosti.

35

Slika 12: Filogenetsko stablo COI haplotipova dobiveno metodom maksimalne štedljivosti. Duljine grana su

prikazane kao broj supstitucija kroz cijelu sekvencu. Brojem je prikazan postotak poduzorkovanja koji je

razultirao istom topologijom grana. Crveno = Sjeverni Velebit, plavo = Biokovo, zeleno = Kupa.

36

Slika 13 prikazuje bootstrap konsenzus dendrogram dobiven iz 2000

poduzorkovanja metodom najveće štedljivosti. Stablo je dobiveno koristeći algoritam SPR

s razinom pretrage 2. Početna stabla su napravljena nasumičnim dodavanjem sekvenci

(10 poduzorkovanja).

Slika 13: Bootstrap konsenzus dendrogram COI haplotipova dobiven metodom maksimalne štedljivosti.

Brojem je prikazan postotak poduzorkovanja koji je razultirao istom topologijom grana. Crveno = Sjeverni

Velebit, plavo = Biokovo, zeleno = Kupa.

37

Nakon toga programom MEGA 6 izrađena su filogenetska stabla temeljena na

metodi najveće vjerojatnosti s evolucijskim modelom GTR i heurističkom metodom SPR.

Slika 14 prikazuje stablo dobiveno metodom najveće vjerojatnosti. Prikazano je stablo s

najvećim logaritmom vjerojatnosti -3775.9520. Duljina grana je prikazana kao broj

supstitucija po informativnom mjestu. 659 nukleotida je bilo informativno te je uključeno u

analizu metodom najveće vjerojatnosti.

Slika 14: Filogenetsko stablo COI haplotipova dobiveno metodom maksimalne vjerojatnosti. Brojem je

prikazan postotak poduzorkovanja koji je rezultirao istom topologijom grana. Crveno = Sjeverni Velebit, plavo

= Biokovo, zeleno = Kupa.

38

Na kraju je napravljen i bootstrap konsenzus dendrogram dobiven iz 2000

poduzorkovanja metodom najveće vjerojatnosti s evolucijskim modelom GTR i

heurističkom metodom SPR s razinom pretrage 3 (slika 15).

Slika 15: Bootstrap konsenzus dendrogram COI haplotipova dobiven metodom maksimalne vjerojatnosti.

Brojem je prikazan postotak poduzorkovanja koji je rezultirao istom topologijom grana. Crveno = Sjeverni

Velebit, plavo = Biokovo, zeleno = Kupa.

39

4.4. Barkodovi uzoraka

Obrađene sekvence biljnih i ţivotinjskih uzoraka poslane su u bazu podataka BOLD

i Banku Gena. Iz baze podataka BOLD i Banke Gena preuzeti su identifikacijski brojevi za

svaku sekvencu, a iz baze BOLD preuzeti su i ilustrativni prikazi barkodova. Barkodovi

svih biljnih i ţivotinjskih uzoraka su u prilozima.

40

5. Rasprava

Ovim istraţivanjem pokazao sam da je DNA barkodiranje brza i jednostavna

metoda za identifikaciju biljnih i ţivotinjskih vrsta. Za barkodiranje biljaka sam koristio gene

rbcL i matK koje predlaţe CBOL. Prosječne i stvarne razlike među rbcL i matK

sekvencama su puno veće od 2% te se uzorci identificirani ovom metodom lako mogu

povezati s odgovarajućim vrstama. Također, prosječne razlike među matK sekvencama

(21%) su puno veće nego one među rbcL sekvencama (11.22%), čime sam potvrdio već

prije poznatu činjenicu o većoj selektivnosti matK gena za određivanje vrsta (Kress, 2005;

CBOL Plant Working Group, 2009; Hollingsworth, 2011; Burgess, 2011). Stvarne razlike

među svim biljnim sekvencama su bile puno veće od 2% te se sve analizirane sekvence

mogu pripisati jedinstvenim vrstama, neovisno o analiziranom genu. Taj postotak

uspješnosti u jedinstvenom određivanju vrsta je puno veći od već objavljenih istraţivanja s

puno većim brojem istraţivanih vrsta te se moţe objasniti isključivo vrlo malim brojem

analiziranih uzoraka (Hollingsworth, 2011; Burgess, 2011). BLAST analiza rbcL sekvenci je

točno odredila 8 uzorka (88%) do razine vrste i 9 uzoraka (100%) do razine porodice s

prosječnim poklapanjem od 98%, a analiza matK sekvenci 7 uzoraka (77%) do razine

vrste i 9 uzoraka (78%) do razine porodice s prosječnim poklapanjem od 98%. Rezultati

BLAST određivanja su takvi zbog nepostojanja barkodova za veliku većinu ţivih

organizama pa BLAST analiza novu sekvencu identificira kao najbliţeg srodnika.

Pronalaţenje univerzalnog lokusa za molekularnu taksonomiju biljaka se pokazalo

osobito teškim zbog spore molekularne evolucije plastidnog genoma te nedostatka

univerzalnih početnica za sve biljne organizme. Također su moguće i translokacije dijelova

plastidnog genoma u druge organele što dodatno moţe zakomplicirati analizu (Delwiche i

Palmer, 1996; Wang, 2007; Hazkani-Covo, 2010). Zbog toga drugi autori kao standardne

biljne barkodove predlaţu nekodirajuće regije kao Internal Transcibed Spacer (ITS) regiju

jezgrinog ribosomalnog cistrona 18S-5.8S-26S, ili nekodirajuće plastidne regije trnL-F i

trnH-psbA (Chase, 2007; China Plant BOL Group, 2011; Kress, 2005, 2007).

Hebert i sur. (2003 i 2003a) su objavili da je divergencija COI sekvenci među

različitim vrstama istog roda redovito veća od 2%, a među jedinkama iste vrste manja od

2% te da se COI sekvence vrlo pouzdano mogu koristiti za određivanje vrsta i

filogeografsku analizu kod svih ţivotinjskih koljena osim Cnidaria. Wiemers i Fiedler (2007)

su ustanovili da je prosječna razlika veća od 2% kod barkodiranja ţivotinja zapravo

41

rezultat nedovoljnog broja istraţivanih uzoraka te da velik broj dobro definiranih vrsta ima

vrlo slične ili jednake sekvence COI gena. Zbog toga predlaţu korištenje DNA barkodiranja

kao pomoći pri razlikovanju kriptičnih vrsta. Razlika među mojim sekvencama je puno veća

od 2% te bi se moglo zaključiti da sekvence pripadaju različitim kriptičnim vrstama

divokoza ili različitim mitohondrijskim filogrupama vrste Rupicapra rupicapra čije su

postojanje ustanovili Schaschl i sur. (2003). Problemi s određivanjem i nesrazmjer među

COI sekvencama potencijalno jedne vrste su već otprije poznati te su pripisanim kriptičnim

svojtama (Hebert, 2004). BLAST analiza je sve sekvence točno odredila samo do razine

porodice. Neuspjeh u određivanju vrsta ostalim sekvencama mogu pripisati nepostojanju

barkodova za potencijalno kriptične vrste. Istraţivane vrste ne moraju nuţno biti kriptične

jer je zbog specifičnog načina evolucije mitohondrijskog genoma moguća i mitohondrijska

heteroplazmija kod jedinki iste vrste koja rezultira mitohondrijskom polifilijom te umnaţanje

translociranih mitohondrijskih pseudogena iz jezgre metodom PCR (Ballard, 2004;

Hazkani-Covo, 2010). Ti pseudogeni su često jako udaljeni od ortologne mitohondrijske

sekvence te se već pokazali problematičnima za DNA barkodiranje ţivotinja (Hazkani-

Covo, 2010; Song, 2008; Buhay, 2009). Treba naglasiti i da organizam nije određen samo

redoslijedom baza u svom mitohondrijskom genomu, već i svojim jezgrinim genima,

morfologijom, ekologijom i ostalim biološkim faktorima te se DNA barkodiranje vidi kao

pomoć pri tradicionalnom određivanju vrsta (Moritz i Cicero, 2004). Veličina područja

uzorkovanja također utječe na uspješnosti barkodiranja COI sekvencom, tako što se

povećanjem područja uzorkovanja povećavaju i razlike među sekvencama iste vrste

(Bergstein, 2012). Pošto se za barkodiranje kao standardni barkod uzima konsenzusna

sekvenca, vrlo brza evolucija mitohondrijskog genoma, ali i spora evolucija plastidnog

genoma moţe rezultirati jednakim barkodom među različitim vrstama (Meier, 2006).

Uzorci 9 i 11 prikupljeni na Sjevernom Velebitu i Kupi u većini slučajeva pokazuju

odvajanje od ostalih sekvenci koje podupire i visoka bootstrap vrijednost. Ostale sekvence

pokazuju visoku razinu bliskosti, no njihova srodnosti nije potvrđena bootstrap

vrijednostima. Prema tome, zbog samog odvajanja većine uzoraka na filogenetskim

stablima i niskih bootstrap vrijednosti ne moţe se puno zaključiti o filogenetskim odnosima

među populacijama divokoza, kao ni o potencijalnoj hibridizaciji tih populacija. Sama

razlika među sekvencama 11 i referentnim sekvencama KF317908.1 i FJ207539.1 iz

Banke Gena je do 3% te se moţe zaključiti da sve pripadaju vrsti Rupicapra rupicapra L.

Takav rezultat filogenetske analize upućuje na postojanje mitohondrijske heteroplazmije

unutar populacija divokoza s područja Republike Hrvatske.

42

Sama metoda DNA barkodiranja, uz postojanje popratnog sistema za identifikaciju i

baze sekvenci, bi omogućila brzu, jeftinu, pristupačnu i jednostavnu identifikaciju svih ţivih

organizama na Zemlji te dala nove spoznaje o diverzifikaciji ţivota, kriptičnim vrstama i

pravilima molekularne evolucije (Hebert, 2003a). Iako problemi s metodom postoje,

najčešće u vidu malih razlika u sekvencama jako bliskih vrsta, mitohondrijske i plastidne

heteroplazmije, umnaţanja mitohondrijskih pseudogena kod ţivotinja te nepostojanja

jedinstvenog lokusa za barkodiranje biljaka, sama metoda je vrlo jednostavna te zahtijeva

samo osnovnu laboratorijsku opremu i tehnike, što je čini osobito pogodnom za male

laboratorije i vrlo brzo određivanje velikog broja vrsta i uzoraka.

43

6. Zaključak

Na osnovu provedenog istraţivanja, prema postotku divergencije među rbcL i matK

sekvencama, većina biljnih uzoraka je identificirana do razine vrste neovisno o korištenom

genu.

Rezultati dobiveni barkodiranjem uzoraka divokoza s područja Republike Hrvatske

ukazuju na postojanje više od jedne vrste divokoza s obzirom na postotak divergencije

među njihovim COI sekvencama.

Dobivene rezultate barkodiranja divokoza potvrđuju i filogenetski odnosi dobiveni

metodom najveće vjerojatnosti i najveće štedljivosti.

44

7. Literatura

Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J., 1990. Basic local alignment

search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.

Ballard J.W.O., Whitlock M.C., 2004. The incomplete natural history of mitochondria, Mol.

Ecol. 13(4): 729 – 744, doi:10.1046/j.1365-294X.2003.02063.x

Bergsten J., Bilton D.T., Fujisawa T., Elliott M., Monaghan M.T., Balke M., Hendrich L.,

Geijer J., Herrmann J., Foster G.N., Ribera I., Nilsson A.N., Barraclough T.G., Vogler A.P.,

2012. The Effect of Geographical Scale of Sampling on DNA Barcoding, Syst. Biol. 61(5):

851 – 869, doi:10.1093/sysbio/sys037

Buhay J.E., 2009. "COI–like" Sequences are Becoming Problematic in Molecular

Systematic and DNA Barcoding Studies, J. Crustac. Biol. 29(1): 96 – 110, doi:10.1651/08-

3020.1

Burgess K.S., Fazekas A.J., Kesanakurti P.R., Graham S.W., Husband B.C., Newmaster

S.G., Percy D.M., Hajibabaei M., Barrett S.C.H., 2011. Discriminating plant species in a

local temperate flora using the rbcL + matK DNA barcode, Methods Ecol. Evol. 2: 333 –

340, doi:10.1111/j.2041-210X.2011.00092.x

CBOL Plant Working Group, 2009. A DNA Barcode for land plants, PNAS 106(31): 12794

– 12797, doi:10.1073/pnas.0905845106

Chase M.W., Cowan R.S., Hollingsworth P.M., van den Berg C., Madriñán S., Petersen G.,

Seberg O. i sur., 2007. A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants,

Taxon 56(2): 295 – 299

China Plant BOL Group, Li D.-Z. i sur., 2011. Comparative analysis of a large dataset

indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core

barcode for seed plants, PNAS 108(49): 19641 – 19646

Delwiche C.F., Palmer J.D., 1996. Rampant Horizontal Transfer and Duplication of

Rubisco Genes in Eubacteria and Plastids, Mol. Biol. Evol. 13(6): 873 – 882

45

Fazekas A.J., Kuzmina M.L., Newmaster S.G., Hollingsworth P.M. (2012): DNA Barcoding

Methods for Land Plants. U: Kress W.J., Erickson D.L. (ur.) DNA Barcodes: Methods and

Protocols, Methods Mol. Biol., 858: str. 238, doi:10.1007/978-1-61779-591-6_11, Springer

Science+Business Media, ISBN:978-1-61779-590-9

Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R., 1994. DNA primers for amplification

of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates, Mol.

Mar. Biol. Biotechnol. 3(5): 294 – 299

Hammer S., Nadlinger K., Hartl G.B., 1995. Mitochondrial DNA differentiation in chamois

(genus Rupicapra): implications for taxonomy, conservation and management, Acta

Theriologica Suppl. 3: 145 – 155

Hausner G., Olson R., Simon D., Johnson I., Sanders E.R., Karol K.G., McCourt R.M.,

Zimmerly S., 2006. Origin and Evolution of the Chloroplast trnK (matK) Intron: A Model for

Evolution of Group II Intron RNA Structures, Mol. Biol. Evol., 23(2): 380 – 391,

doi:10.1093/molbev/msj047

Hazkani-Covo E., Zeller R.M., Martin W., 2010. Molecular poltergeists: Mitochondrial DNA

Copies (numts) in Sequenced Nuclear Genomes, PLoS Genet. 6(2): e1000834,

doi:10.1371/journal.pgen.1000834

Hebert P.D.N., Ratnasingham S., deWaard J.R., 2003. Barcoding animal life: cytochrome c

oxidase subunit 1 divergences among closely related species, Proc. R. Soc. Lond. B 270

(suppl. 1): S96 – S99, doi:10.1098/rsbl.2003.0025

Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L., 2003a. Biological identifications through DNA

barcodes, Proc. R. Soc. Lond. B 270(1512): 313 – 321, doi:10.1098/rspb.2002.2218

Hebert P.D.N., Penton E.H., Burns J.M., Janzen D.H., Hallwachs W., 2004. Ten species in

one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes

fulgerator, PNAS 101(41): 14812 – 14817, doi:10.1073/pnas.0406166101

Hollingsworth P.M., Graham S.W., Little D.P., 2011. Choosing and Using a Plant DNA

Barcode, PLoS ONE 6(5): e19254, doi:10.1371/journal.pone.0019254

46

Kress W.J., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A., Janzen D.H., 2005. Use of DNA

barcodes to identify flowering plants, PNAS 102(23): 8369 – 8374,

doi:10.1073/pnas.0503123102

Kress W.J., Erickson D.L., 2007. A Two-Locus Global DNA Barcode for Land Plants: The

Coding rbcL Gene Complements the Non-Coding trnH-psbA Spacer Region, PLoS ONE

2(6): e508. doi:10.1371/journal.pone.0000508

Martínez-Alberola F., del Campo E.M., Lázaro-Gimeno D., Mezquita-Claramonte S.,

Molins A., i sur., 2013. Balanced Gene Losses, Duplications and Intensive

Rearrangements Led to an Unusual Regularly Sized Genome in Arbutus unedo

Chloroplasts, PLoS ONE 8(11): e79685. doi:10.1371/journal.pone.0079685

Masini F., Lovari S., 1988. Systematics, phylogenetic relationships, and dispersal of the

chamois (Rupicapra spp.), Quartern. Res. 30(3): 339 – 349, doi:10.1016/0033-

5894(88)90009-9

McKeon S.N., Lehr M.A., Wilkerson R.C., Ruiz R.F., Sallum M.A., Lima J.B.P., Povoa

M.M., Conn J.E., 2010. Lineage divergence detected in the malaria vector Anopheles

marajoara (Diptera: Culicidae) in Amazonian Brazil, Malar. J. 9:271, doi:10.1186/1475-

2875-9-271

Meier R., Shiyang K., Vaidya G., Ng P.K.L., 2006. DNA Barcoding and Taxonomy in

Diptera: A Tale of High Intraspecific Variability and Low Identification Success, Syst. Biol.

55(5): 715 – 728, doi:10.1080/10635150600969864

Moritz C., Cicero C., 2004. DNA Barcoding: Promise and Pitfalls, PLoS Biol 2(10): e245,

doi:10.1371/journal.pbio.0020354

Park C.B., Larsson N.G., 2011. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging, J. Cell

Biol. 193(5): 809 – 818, doi:10.1083/jcb.201010024

Pawlowski J., Audic S., Adl S., Bass D., Belbahri L. i sur., 2012. CBOL Protist Working

Group: Barcoding Eukaryotic Richness beyond the Animal, Plant and Fungal Kingdoms,

PLoS Biol 10(11): e1001419, doi:10.1371/journal.pbio.1001419

47

Pérez T., Hammer S.E., Albornoz J., Domínguez A., 2011. Y–chromosome phylogeny in

the evolutionary net of chamois (genus Rupicapra), BMC Evol. Biol. 11(272):

doi:10.1186/1471-2148-11-272

Ratnasingham S., Hebert, P.D.N., 2007. BOLD: The Barcode of Life Data System

(www.barcodinglife.org), Mol. Ecol. Resour. 7: 355 – 364, doi:10.1111/j.1471-

8286.2006.01678.x

Schaschl H., Kaulfus D., Hammer S., Suchentrunk F., 2003. Spatial patterns of

mitochondrial and nuclear gene pools in chamois (Rupicapra r. rupicapra) from the Eastern

Alps, Heredity 91: 125 – 135, doi:10.1038/sj.hdy.6800290

Seifert K.A., Samson R.A., deWaard J.R., Houbraken J., Lévesque C.A., Moncalvo J.M.,

Louis-Seize G., Hebert P.D.N., 2007. Prospects for fungus identification using CO1 DNA

barcodes, with Penicillium as a test case, PNAS 40(9): 3901 – 3906, doi:

10.1073/pnas.0611691104

Seifert K.A., 2009. Progress towards DNA barcoding of fungi, Mol. Ecol. Resour. 9 (suppl.

1): 83 – 89, doi: 10.1111/j.1755-0998.2009.02635.x

Song H., Buhay J.E., Whiting M.F., Crandall K.A., 2008. Many species in one: DNA

barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes

are coamplified, PNAS 105(36): 13486 – 13491, doi:10.1073/pnas.0803076105

The Angiosperm Phylogeny Group, 2003. An update of the Angiosperm Phylogeny Group

classification for the orders and families of flowering plants: APG II, Bot. J. Linn. Soc. 141:

399 – 436

Tavaré S., 1986. Some Probabilistic and Statistical Problems in the Analysis of DNA

Sequences, Lectures Math. Life Sci. 17: 57 – 86

Tvrtković N., Grubešić M., (2006): Divokoza. U: Tvrtković N. (ur.) Crvena knjiga sisavaca

Hrvatske. Zagreb, Ministarstvo kulture, Drţavni zavod za zaštitu prirode, str. 42, ISBN:

953-7169-12-X.

http://www.barcodinglife.org/

48

Wang D., Wu Y.W., Shih C.C.A., Wu C.S., Wang Y.N., Chaw S.M., 2007. Transfer of

Chloroplast Genomic DNA to Mitochondrial Genome Occured At Least 300 MYA, Mol. Biol.

Evol. 24(9): 2040 – 2048, doi:10.1093/molbev/msm133

Wiemers M., Fiedler K., 2007. Does the DNA barcoding gap exist? – a case study in blue

butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae), Front. Zool. 4(8), doi:10.1186/1742-9994-4-8

Yang Z., 1994. Estimating the Pattern of Nucleotide Substitution, J. Mol. Evol. 39: 105 –

111

Zoschke R., Nakamura M., Liere K., Sugiura M., Börner T., Schmitz-Linneweber C., 2010.

An organellar maturase associates with multiple group II introns, PNAS 107(7): 3245 –

3250, doi: 10.1073/pnas.0909400107

Hall, T., 1999. BioEdit: a user–friendly biological sequence alignment editor and analysis

program for Windows 95/98/NT, Nucleic Acids Symp. Ser. 41: 95 – 98 (program:

http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html, pristupljeno 5. srpnja 2014.)

Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H.,

Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J., Higgins D.G.,

2007. Clustal W and Clustal X version 2.0, Bioinformatics 23(21): 2947 – 2948,

doi:10.1093/bioinformatics/btm404, (program: http://www.clustal.org/download/2.1/ ,

pristupljeno 5. srpnja 2014.)

Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski A., Kumar, S., 2013. MEGA 6: Molecular

Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0, Mol. Biol. Evol. 30(12): 2725 – 2729,

doi: 10.1093/molbev/mst197 (program: http://www.megasoftware.net/mega.php ,

pristupljeno 5. srpnja 2014.)

Qiagen®, 2006. DNeasy® Plant Handbook, 24–27

Qiagen®, 2006a. DNeasy® Blood & Tissue Handbook, 28–30

Qiagen®, 2008. MinElute® Handbook, 23–24

Qiagen®, 2008a. HotStarTaq® Plus PCR Handbook, 28–30

http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html

http://www.clustal.org/download/2.1/

http://www.megasoftware.net/mega.php

49

7.1. Internetske reference

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (pristupljeno 11. rujna 2014.)

http://www.boldsystems.org/index.php/ (pristupljeno 11. rujna 2014.)

http://www.eplantscience.com/index/genetics/maternal_effects_and_cytoplasmic_inheritan

ce/mitochondrial_genetics.php (pristupljeno 11. rujna 2014.)

http://www.ibwf.de/taxon_index.htm

http://atos.hr/hr/hrvatska-lovni-turizam/divokoza.html (pristupljeno 11. rujna 2014.)

http://zasticenevrste.azo.hr/vrsta.aspx?id=260 (pristupljeno 11. rujna 2014.)

http://www.hunting-croatia.net/uvjeti.html (pristupljeno 11. rujna 2014.)

http://www.np-sjeverni-velebit.hr/park/zivapriroda/zivotinje/ (pristupljeno 11. rujna 2014.)

http://www.vusz.hr/Cms_Data/Contents/VSZ/Folders/dokumenti/javanustanovazaupravljan

jezasticenimprirodnimvrijednostima/arhiva/~contents/NDW2SALP92LHTQZ7/2011-3-15-

5947916-2009-12-7-5331263-vegetacijahrvatske.pdf (pristupljeno 11. rujna 2014.)

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://www.boldsystems.org/index.php/

http://www.eplantscience.com/index/genetics/maternal_effects_and_cytoplasmic_inheritance/mitochondrial_genetics.php

http://www.eplantscience.com/index/genetics/maternal_effects_and_cytoplasmic_inheritance/mitochondrial_genetics.php

http://www.ibwf.de/taxon_index.htm

http://atos.hr/hr/hrvatska-lovni-turizam/divokoza.html

http://zasticenevrste.azo.hr/vrsta.aspx?id=260

http://www.hunting-croatia.net/uvjeti.html

http://www.np-sjeverni-velebit.hr/park/zivapriroda/zivotinje/

http://www.vusz.hr/Cms_Data/Contents/VSZ/Folders/dokumenti/javanustanovazaupravljanjezasticenimprirodnimvrijednostima/arhiva/~contents/NDW2SALP92LHTQZ7/2011-3-15-5947916-2009-12-7-5331263-vegetacijahrvatske.pdf



50

8. Popis priloga

I Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

II Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

III Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

IV Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

V Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

VI Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

VII Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

VIII Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

IX Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

X Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

XI Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

XII Arbutus unedo – planika rbcL barkod

XIII Arbutus unedo – planika matK barkod

XIV Hedera helix – bršljan rbcL barkod

XV Hedera helix – bršljan matK barkod

XVI Laurus nobilis – lovor rbcL barkod

XVII Laurus nobilis – lovor matK barkod

XVIII Oxalis acetosella – šumski cecelj rbcL barkod

XIX Oxalis acetosella – šumski cecelj matK barkod

XX Phillyrea media – srednja komorika rbcL barkod

XXI Phillyrea media – srednja komorika matK barkod

XXII Pistacia lentiscus – tršlja rbcL barkod

XXIII Pistacia lentiscus – tršlja matK barkod

XXIV Quercus ilex – hrast crnika rbcL barkod

XXV Quercus ilex – hrast crnika matK barkod

XXVI Ruscus aculeatus – bodljikava veprina rbcL barkod

XXVII Ruscus aculeatus – bodljikava veprina matK barkod

XXVIII Smilax aspera – crvena tetivika rbcL barkod

XXIX Smilax aspera – crvena tetivika matK barkod

I

I Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod

Rupicapra rupicapra - divokoza (fotografija: Z. Marasović)

BOLD pristupni broj: FOC001-14

GenBank pristupni broj: KM527375

Nukleotidna sekvenca:

ACTTTACCTTTAGCATTTTGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACCGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC

CCTACTCTGAGACAACCAAATCTACTACGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG

GAGGATTCTGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAACATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC

CCTCCCTCTTTCCTACTACTTCTGGGATCATCTATAGTCGAAGCTGGGGCAGGAACAGGCTGAACCGTGTACCCCACTCTGGGAGGTAA

TCTGGCCCATGCAGGAGCCTCAGTAGACTTAACCATTTTTTCTTTACACCTGGCAGGTGTTTCCTCAATTTTAGGAGCTATTAATTTTA

TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCATTTGGGGGAACCATAACAAATACTGGCGGATTA

CCGGTTCTCCCACTTTCCGGAATAACGGCTGGGAATACCAAACCCCTTACAAAACCAAAATCAAAAACACCCTCCTTGAACCCACCAGG

AGAAGGGAACCCAATCTTAAACCCAACCCCAATTTT

Sekvenca aminokiselina:

TLPLAFCTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLWDNQIYYVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFCNWLVPLMIGGLDMTFLRMNNMSFWLL

PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFGGTMTNTGGL

PVLPLSGMTAGNTKPLTKPKSKTPSLNPPGEGNPILNPTPIX

Ilustrativni COI barkod vrste roda Rupicapra rupicapra – divokoza.

II

II Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod




ACTCAACCTTTAGGATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC

CCTACTCGGAGACAACCAAATCTACAAGGTATTTGTAACCACACATGCATTCGTAATAATTTTCTGTATAGTGATACCAATTATAATCG

GAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC



TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCATTTGTGTGATCCATACGAATCACTGCTGTATTA

CTGCTTCTCTCACTTCCCGTATTAGCGGCTGGTATTACAATACCACTAACAGACCGAAATCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCAGG

AGGAGGGGACCCTATCCTATATCAACACCTATTTTT


TQPLGFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL

PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFVWSMRITAVL

LLLSLPVLAAGITMPLTDRNLNTTFFDPAGGGDPILYQHLFX


III

III Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod




ACTTTATCTTTAGTATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC





TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCAATTGGGGGAACCCTTCCAAACCCTGGTGGAATA

ACGGTTCCCCCAATTCCCGGAATAACGGGTGGGATTAACATTCCCCTAAACGAACCAAATCCAAATACAACCTCCTTGAACCCACCGGA

AGAAGGGAACCCAATCCAAAATCCACACCCAATTTT


TLSLVFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL

PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPIGGTLPNPGGM

TVPPIPGMTGGINIPLNEPNPNTTSLNPPEEGNPIQNPHPIX


IV

IV Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod




ACTTCAACTTTAGTATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC


AAGGATTCGGCAACTGACTAGTCCCTCTGATAATTGGTGGCCTCGACATAGCATTCCTCCGAATAAATAATATAAGCTTCTGACTCCTC



TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCATTTGGGGGAACCATACCAATCACTGGTGGATTA

CTGGTTCCCTCCCTTTCCGGATTAACGGGTGGGATTACCATACCCCTAACAGAACGAAATCCAAATACACCCTCCTTGAACCCACAAGA

AGAAGGGAACCTAATCTATATCCCACCCCCAATTTT


TSTLVFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIEGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL

PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFGGTMPITGGL

LVPSLSGLTGGITMPLTERNPNTPSLNPQEEGNLIYIPPPIX


,

V

V Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod




ACTTTATCTTTAGGATTTGGGTACTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC






CTGCTTCTCTCACTTCCCGTATTAGCGGCTGGTATTACAATACCACTAACAGACCGAAATCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCAGG



TLSLGFGYWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL


LLLSLPVLAAGITMPLTDRNLNTTFFDPAGGGDPILYQHLFX


VI

VI Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod




ACATTACCTTTAGGATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC





TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCCTTTGGGGGATCCCTAACAAACCTTGCCGGATTT

CCGGCTCCCTCCCTTTCCGGAATATCGGCGGGAATTACAAAACTCCTAACTTATCTAAACCTTAAAACAACCTATTTTTCCCTCCTCTG

GGGAGGGGGCCCTTTTCCTTTTCCACCTTTATTTTT


TLPLGFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL

PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFGGSLTNLAGF

PAPSLSGMSAGITKLLTYLNLKTTYFSLLWGGGPFPFPPLFX


VII

VII Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod




ACTTTAACTTTATTATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC






CTGCTTCTCTCACTTCCCGTATTAGCGGCTGGTATTACAATACCACTAACAGACCAAAATCTAAATACAACCTTCTTTGACCCAGCAGG



TLTLLFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL


LLLSLPVLAAGITMPLTDQNLNTTFFDPAGGGDPILYQHLFX


VIII

VIII Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod




ACTTTATCTTTAGTATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC





TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCGACCCCCCCCATTTGTGTGATCCATACGAATCACTGCTGTATTA

CTGTTTCTCTCATTTCCCGTATTATCGGCTGGTATTACAATACCTCTAACTGACCTAAATCTAAATACGACCTTCTTTGACCCTTCATG

AGGAGGGGACCCTATCGTAGATCAACACCTATTTTT


TLSLVFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL

PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYRPPPFVWSMRITAVL

LFLSFPVLSAGITMPLTDLNLNTTFFDPSWGGDPIVDQHLFX


IX

IX Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod




ACATTACATTTGAGTCTTGGTTGCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC




TCTGGCCCATGAGGGAATCTCCTCACACTTAGGCATTTTATCCTGACACCTGGAAAGTGTTGGGATAACTTTAGAAGGAACAAGTTACT

ACAGCAATTCTTTATATATAACCCCCCAAAAGGCTCCGTTGCTGGCTCCCTCCATATGCTCCGCCCCCCAGAAGCATCACAGCATTCCA

CCCTCAATCCCTATGTGGCTAAACCCCACGGACTATAAAGATACCAAGCGTTCCCAACCTGGAAAACCCCTCTCGTTCTCTCCTGTTCC

GACCCTGCCGCTTACCTGATACCTGTCCGCCTTTTT


TLHLSLGCWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL

PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHEGISSHLGILSWHLESVGMTLEGTSYYSNSLYMTPQKAPLLAPSMCSAPQKHHSIP

PSIPMWLNPTDYKDTKRSQPGKPLSFSPVPTLPLTWYLSAFX


X

X Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod




ACCCTTAAACTCCAATTTGGTACCTGAGCCGGCATAGTAGGAACAGCCCTAAGCCTGCTAATTCGCGTTGAACTGGGTCAACCCACAAC





TTACAACAATTATTAATATAAAAGCCCCTGCAATATCACAATATCAACCCCCCCCCTTTGGGGGGACCCTACCAATCCTTGTGGAATTA

CGGCTTCCCTACTTTCCCGGAATAACGGCTGGGATTTCCATACCCCTAAAAAACCAAAATCTAAATTCAACCTTTTTTGACCCACCGGG

AGGAGGGAACCCATTCCCTTTTTCATCCCTAATCTG


TLKLQFGTWAGMVGTALSLLIRVELGQPTTLLGDNQIYKVFVTTHAFVMIFCMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGGLDMAFLRMNNMSFWLL

PPSFLLLLGSSMVEAGAGTGWTVYPTLGGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKAPAMSQYQPPPFGGTLPILVEL

RLPYFPGMTAGISMPLKNQNLNSTFFDPPGGGNPFPFSSLIX


XI

XI Rupicapra rupicapra – divokoza COI barkod




ACTTTTAACGTCCTATTTGGCGCCTGAGCCGGCATAGTAGGGACCGCCCTAAGCTTACTGATTCGCGCTGAACTAGGCCAACCCGGAAC

TCTACTCGGAGACGATCAAATCTACAACGTAATTGTAACCGCACATGCATTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATCATAATCG

GAGGTTTTGGCAACTGACTAGTTCCTCTAATAATTGGAGCCCCTGACATAGCATTTCCTCGGATAAATAACATAAGCTTCTGACTCCTT

CCCCCTTCTTTCCTGCTACTCCTAGCATCTTCTATAATCGAAGCCGGAGCAGGAACAGGTTGAACCGTGTATCCCCCTCTAGCAGGTAA

CCTGGCCCATGCAGGAGCTTCAGTAGACCTAACCATTTTCTCCTTACACCTAGCAGGTGTCTCCTCAATTCTAGGGGCCATTAACTTTA

TCACGACTATCATTAATATAAAACCCCCCGCAATATCACAATACCAAACTCCCCTATTCGTATGATCTGTATTAATTACTGCCGTACTA

CTCCTCCTCTCACTCCCTGTATTAGCAGCCGGCATTACAATGCTACTGACTGACCGAAACCTAAACACAACCTTCTTCGACCCAGCAGG

AGGAGGGGATCCCATCTTATATCAACACCTGTTCTG


TFNVLFGAWAGMVGTALSLLIRAELGQPGTLLGDDQIYNVIVTAHAFVMIFFMVMPIMIGGFGNWLVPLMIGAPDMAFPRMNNMSFWLL

PPSFLLLLASSMIEAGAGTGWTVYPPLAGNLAHAGASVDLTIFSLHLAGVSSILGAINFITTIINMKPPAMSQYQTPLFVWSVLITAVL

LLLSLPVLAAGITMLLTDRNLNTTFFDPAGGGDPILYQHLFX


XII

XII Arbutus unedo – planika rbcL barkod

Arbutus unedo L. – planika.

BOLD pristupni broj: ATG010-14



GGTAAGGCTTGGGGCTGGTGTTAAGAATTACAAATTGACTTATTATACTCCTAAATATGAAACAAAAGATACTGATATCTTGGCAGCAT

TCCGAGTAACTCCTCAACCAGGAGTTCCACCTGAAGAAGCAGGGGCCGCGGTAGCTGCAGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG

TGGACCGATGGACTTACTAGCCTTGATCGTTACAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGC

TTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCCGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAG

CCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAAGATCTACGAATCCCTGTTTCGTATGTTAAAACTTTCCAAGGGCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAA

AGAGATAAATTGAACAAATATGGTCGTCCCCTGTTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTATCTGCTAAAAACTATGGGCGAAC

ACTTTATGAGTGTCTGCCCGGGGGAG


VRLGAGVKNYKLTYYTPKYETKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIEPVAGEENQYIA

YVAYPLDLFEEGSVTNMFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPVSYVKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRT

LY

Ilustrativni rbcL barkod vrste A. unedo.

XIII

XIII Arbutus unedo – planika matK barkod




GGGTAAAAGATGTCTCTTCTTTTGCTTTATTACGATTTTTTTTCCACGCGTATCGTAATTGGAATAGTCTTATGACTCAAAAGAAATCG

AGTTTTTCTTTTTCAAAAACAAATAAAAGATTATTCTTGTTCCTATATAATTTTCATGTATGTGAATATGAATCTATCTTCCTTTTTCT

CCGCAACCAATCTTCTCATTTACGTTCAATATCTTCTGAAACCTTTCTTGAACGAATATATTTCTATAGAAAAATAGAACTAGAAGTCT

TTACTAAGGATTTTAAGGCTATTCTATGGGTGTTCAAAGATCCTTTCCTGCATTATGTTAGGTATCAAGGAAAATCCACTTTGGCTTCA

AAAGGGACGTCTCTTTTAATGAATAAATGGAAATATTACCTTGTCAAGTTCTGGCAATGTTATTTTTACATGTGGTCTCAACCAAGAAG

GATCCATATAAACCAATTATCCAACGATTCCCTCGACTTTCTGGGCTATCTTTCAAGTGTGCGATTAAACCCTTTAATGGTACGGAGTC

AAATGCTAGAAAATTCTTTTCTAATAGGGAATGCTTTTAAGAAGTTCGATACCCTAGTGCCAATTATTCCAATGATTGGATCATTGTCT

AAAGCGAAATTTTGTAACGTCTTAGGACATCCCATGAGTAAGTCAGTCTGGGCTGATTTATCAGATTCTGATATTATTGACCGATTCGG

GCGTATATATAGAAATCTTTCTCATTATCATAGCGGATCCTTAAATAAAATGAGTTTGTATCGAGTAAAGTATATACTTCGA


VKDVSSFALLRFFFHAYRNWNSLMTQKKSSFSFSKTNKRLFLFLYNFHVCEYESIFLFLRNQSSHLRSISSETFLERIYFYRKIELEVF

TKDFKAILWVFKDPFLHYVRYQGKSTLASKGTSLLMNKWKYYLVKFWQCYFYMWSQPRRIHINQLSNDSLDFLGYLSSVRLNPLMVRSQ

MLENSFLIGNAFKKFDTLVPIIPMIGSLSKAKFCNVLGHPMSKSVWADLSDSDIIDRFGRIYRNLSHYHSGSLNKMSLYRVKYILR

Ilustrativni matK barkod vrste A. unedo.

XIV

XIV Hedera helix – bršljan rbcL barkod

Hedera helix L. – bršljan.




TGTTGGGATCACAGCTGGTGTTAAAGATTACAGATTGACTTATTATACTCCTGACTATCAAACCAAAGATACTGACATCTTGGCAGCAT

TCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCACCTGAAGAAGCAGGGGCCGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG

TGGACCGATGGACTTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGGCGATGCTACGGAATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAGTCAATTTATTGC

TTATGTAGCTTACCCATTAGACCTTTTTGAAGAAGGGTCTGTTACTCACATGTTTACCTCCATTGTAGGTAAAGGGTTTGGGGTCCAAC

CGCCCCCAGCGTTTTCCCTGGAACAAGATAAAATTCCTGTTGCTTGTGCCCCGGTTTTCCAAGGGGGAACTCCAGGGATCCAAGTTAAT

CGAGATAAGCTGCCCAAATGTCAGTATCTTTGGTTCAGAGTCACGAGTATAATAAATCTGTTAATCTTTAACACCAGCTTTGAATCCCA

CACTTCGTTATTCTCTGTGTGGGGGGG


VGITAGVKDYRLTYYTPDYQTKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYGIEPVAGEESQFIA

YVAYPLDLFEEGSVTHMFTSIVGKGFGVQPPPAFSLEQDKIPVACAPVFQGGTPGIQVNRDKLPKCQYLWFRVTSIINLLIFNTSFESH

TSLFSVWGX

Ilustrativni rbcL barkod vrste H. helix.

XV

XV Hedera helix – bršljan matK barkod




GGGTTAAAGATGCTTCTTCTTTGCATTTATTACGATTCTTTCTCCACGAGTATTGTAATTGGAATACTCCAAATAAAGCCGGTTCTTCT

TTTTCAAAAAGAAATCAAAGACTATTCTTCTTCCTATATAATTCTCATCTATGTGAATACGAATCCATCTTCATCTTTCTCCGTAACCA

ATCTTCTCATTTACGCTCAACATCTTCTGGAACCCTTCTTGAACGAATATATTTCTATGGAAAAATAAAATATCTTGTAAAAGTCTTTG

TTAAGGCTTTTCAAGTCAATCTATTGTTGTTGAAGGATCCTTTCATGCATTATGTTAGGTATCAAGGAAAATCAATTCTCGCTTCAAAA

GGGACGCCCTTTTTGATGAAAAAATGGACATATTACTTTGTTAATTTATGGCAATGTCATTTTTACCTGTGGTCTCAACCGGGAAGGAT

CTGTATAAACCAATTATACAATCATTCCCTCGACCTTCTGGGCTATCTATCAAGTGCGCGGCTAAACCCTTCAATGGTACGCGGTCAAA

TGCTAGAAAATTCATTTCTAATTGATAATGCTATTAATAAGTTCGATACTATTGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCATTGGCTAAA

GCGAAATTTTGTAACGTATTGGGGCATCCTATTAGTAAGGCGGTTTGGACCGATTTATCAGATTCTGATATTATTGACCGATTTGGGGC

GTATATGCAGAAATCTTTCTCATTATCACAGTGGATCCTCACAAAAAAAAGAGTTTGTATCG


VKDASSLHLLRFFLHEYCNWNTPNKAGSSFSKRNQRLFFFLYNSHLCEYESIFIFLRNQSSHLRSTSSGTLLERIYFYGKIKYLVKVFV

KAFQVNLLLLKDPFMHYVRYQGKSILASKGTPFLMKKWTYYFVNLWQCHFYLWSQPGRICINQLYNHSLDLLGYLSSARLNPSMVRGQM

LENSFLIDNAINKFDTIVPIIPLIGSLAKAKFCNVLGHPISKAVWTDLSDSDIIDRFGAYMQKSFSLSQWILTKKRVCIX

Ilustrativni matK barkod vrste H. helix.

XVI

XVI Laurus nobilis – lovor rbcL barkod

Laurus nobilis L. – lovor.




GCTGGGTGTAAAAGATACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAAGTACTGATATTTTGGCAGCATTTCGAGTAACTCC

TCAACCCGGAGTTCCACCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGAC

TTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAGGAAAGTCAATTTATTGCCTATGTAGCTTAC

CCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGGTCTGTTACGAACATGTTTACTTCTATTGTGGGTAAAGGGTTTGGGGTCCATCGGGCCCCACAGTT

GTCCCTGGACCAATTGAAAAATCCGCCGCCGGAACCCCCGGTTCCTCGGGGGGGACTCCGGGGTTTCCAAGATGAATCCAATAAGGTGG

CCAAATATCAAGACCTTTGGTTTCGAGTCCCGGATAAAATCAATTTGGTAACCTTTACAACAACTTTTGGTCCCACACTTGGTGAATCT

CCGCGTGGGGGAG


AGCKRYKLTYYTPDYETKSTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIEPVAGEESQFIAYVAY

PLDLFEEGSVTNMFTSIVGKGFGVHRAPQLSLDQLKNPPPEPPVPRGGLRGFQDESNKVAKYQDLWFRVPDKINLVTFTTTFGPTLGES

PRGGX

Ilustrativni rbcL barkod vrste L. nobilis.

XVII

XVII Laurus nobilis – lovor matK barkod




GGATTACAGATACTCTTTCGTTGCATTTATTGCGATTTTCTCTCTACGAGTATTGGAATTCAAATAGTCTCATTACTCCAAAAAATTCC

ATTTCCCTTTTTTCAAAAGAGAATCAAAGATTCTTCTTGTTCCTCTCTAATTCTCATGTATATGAATGTGAATTCATATTCATTTTTCT

CCGTAAACAACCCTTTCATTTACGATCAAAATCTTTTGGATCCTTTCTTGAACGAACACATTTCTATGCAAAAATAGAATATCTTGTAG

TAGTGCTTTGTAACGATTTTCAGAAAACCCTATGGTTGTTCAAAGACCCTTTTATGCATTATGTCAGATATCAAGGAAAATCGATTCTG

GCTTCAAGGGGGGCTCGTCTTCTGATAAAGAAATGGAAATCTCACCTTGTCAACTTTTGGCAATGTCATTTTGACTTGTGGTCTCAACC

GGCCAGGATCCATATAAAGCAATTATATAATCATCCCTTCTATTTTCTAGGCTATCTTTCAAGTGTACGACTAAACTCTTCGGTGATAA

GGAGTCAAATGCTAGAGAATTCGTTTCGAATAGATACTGCTATTAAGAAATTCGAGACCGTAGTCCCAATTATTCCTCTGATTGGATCA

TTGGCTAAAGCAAAATTTTGTAATGTATCAGGGCATCCCATTAGTAAGCCGTTTCGGGCTGATTTGTCAGATTCTGAGATTCTCAATCG

ATTTGGGGCGGATATGCAGAAATCTTTCTCATTATCACAGTGGATCCTCAAAAAAACAGAGTTTGTATCGTATAAAGTATATACTTCGA


ITDTLSLHLLRFSLYEYWNSNSLITPKNSISLFSKENQRFFLFLSNSHVYECEFIFIFLRKQPFHLRSKSFGSFLERTHFYAKIEYLVV

VLCNDFQKTLWLFKDPFMHYVRYQGKSILASRGARLLIKKWKSHLVNFWQCHFDLWSQPARIHIKQLYNHPFYFLGYLSSVRLNSSVIR

SQMLENSFRIDTAIKKFETVVPIIPLIGSLAKAKFCNVSGHPISKPFRADLSDSEILNRFGADMQKSFSLSQWILKKTEFVSYKVYTSX

Ilustrativni matK barkod vrste L. nobilis.

XVIII

XVIII Oxalis acetosella – šumski cecelj rbcL barkod

Oxalis acetosella L. – šumski cecelj.




GTTCGAATCCAGGCCGGTGTTACAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT

CCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCCCCTGAGGAAGCCGGGGCAGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGT

GGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAGTCAATTTATTGCT

TATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTGTTTGGGTTCCAGGC

GCTCCGGGCTCTACCTCTAGAGGATTTGCGAATCCCTACTGCTTATGTTCAAACTTTTCAAGGGGGGAATCACGGGATCCAAGTTTACA

CAGATAGATTGAACAATTACGGCCGCCCCCGATTGGGATGCACGATTAAAACAAATCTGTTTATAACCCTTAACAACTATGGTGAATCC

GACTATTGCTGTAGTCTCTGTTGTG


VRIQAGVTDYKLTYYTPDYETKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIEPVAGEESQFIA

YVAYPLDLFEEGSVTNMFTSIVGNVFGFQALRALPLEDLRIPTAYVQTFQGGNHGIQVYTDRLNNYGRPRLGCTIKTNLFITLNNYGES

DYCCSLCCX

Ilustrativni rbcL barkod vrste O. acetosella.

XIX

XIX Oxalis acetosella – šumski cecelj matK barkod




GAGGCGAAGATGCCTCTTCTTTGCATTTAGTACGGCTCTTTCTCTACGAGTATTATAAGTGGAATAGTCTTATTAATTCAAAGAACTCT

AGTTCCATTTTTTGGAAGAGTAATCCAAGATTGTTCTTGTTCTTATATAATTCTCATGTATATGAATACGAATCCATTCTTCTTTTTCT

CTCTAACCAATCTTCTCATTTACGATCAACATCTTCTCGGATTTTTTTTGAGCGAATCTATTTTTATGGAAAAATAGAGTATCTTGCAA

AAATCTTTGCGAATGATTTCAGGGGTATCCTGTGGTTATTGAAAGATCCTTTCATGCATTATGTTCGATACCAAGGAAAATCCGTTTTG

GCTTCAAAAGATACGCGTCTTCTGATAAATAAATGGAAATTTTATCTTGTTAATTTATGTCAATGTCATTATTATGCGTGGTCTCAACC

GGAAAGGGTCTCTATAAACCGATTATTCAAGCATTCTCTCAACTTTTTGGGATATTTTTCAAGTGTGCGACTAAATCCTTCAGTGGTAC

GGAGTCAAATGTTGGAACAGTCGTTTATAATAGATAATGTTATGAAGAAACTCGATACGATAATTCCGATTATTCCTTTGATTGGATCA

TTGGCAAAATCGAAATTTTGTAACACATCGGGCTATCCCATTAGTAAGCCGACTTGGGCGGATTCGTCGGATTCTGATATTATGGACCG

ATTTGTGCGTATATACAGTAATCTTTCTCATTATTATAGGGGATCCTCAAAAAAAAAGAGTTTATATCGAATAAATTATATACTTCGC


GEDASSLHLVRLFLYEYYKWNSLINSKNSSSIFWKSNPRLFLFLYNSHVYEYESILLFLSNQSSHLRSTSSRIFFERIYFYGKIEYLAK

IFANDFRGILWLLKDPFMHYVRYQGKSVLASKDTRLLINKWKFYLVNLCQCHYYAWSQPERVSINRLFKHSLNFLGYFSSVRLNPSVVR

SQMLEQSFIIDNVMKKLDTIIPIIPLIGSLAKSKFCNTSGYPISKPTWADSSDSDIMDRFVRIYSNLSHYYRGSSKKKSLYRINYILR

Ilustrativni matK barkod vrste O. acetosella.

XX

XX Phillyrea media – srednja komorika rbcL barkod

Phillyrea media L. – srednja komorika.




TGTTGCGATTCAAGCGGGTGTTAAGAGGAACAAATTGACTTATTATACTCCTGAATACGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCAT

TCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTGGCACATGGACAACTGTG

TGGACCGATGGACTTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGGCGATGCTACCATATTGAGCCTGTTCCTGGAGAAGCAGATCAATATATCTG

TTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTGACTTCCATTGTAGGTAATGTATTTGGGTTCAAAG

CCCTGCGTGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAGTCCCTACTGCTTATATTAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGGGATCCAAGTTGAG

AGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTGTTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTATCTGCTAAAAACTATGGTAGAGC

AGTTTATGAATGTCTTCCCGGTGGTG


FGIKPGVKDYKLTYYTPDYITKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYNIEPVAGEENQYIC

YVAYPLDLFEEGSVTNMFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPTAYTKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRA

VYECLRGGX

Ilustrativni rbcL barkod vrste P. media.

XXI

XXI Phillyrea media – srednja komorika matK barkod




GGGTAAAAGATGCCTCTTCTTTGCATTTATTACGATTCTTTCTTCACGAGTATTGTAATTGGAATAGTCTTATTACTCCAAAGAAAGCC

AGTTCTTCTTTTTCAAAAAGGAATCAAAGATTATTCTTCTTCTTATATAATTCTCATGTATGTGAATACGAATCTATTTTCGTCTTTCT

ACGTAACCAATCTTCTCATTTACGATCAATATCTTCTGGAGCTCTTCTTGAACGAATATATTTCTATGGAAAAATAGAACGTCTTGTAG

ACGTCTTTGTTAAGGATTTTCAGACCAATCTATGCTTGTTCAAGGATCCTTTCATGAATTATGTTAGGTATCAAGGAAAATCAATTCTG

GCTTCAAAAGGGACGCCTCTTTTGATGAATAAATGGAAATATTACCTTGTAACTTTTTGGCAATGTTATTTTTCGCTGTGGTTTCATCC

AAGAAGGATTTATCTAAACCAATTATCTAATCATTCCCTTGAATTTGTGGGCTATCTTTCAAGTGTGCGACTAAACGCTTCAGTGGTAC

GGAGTCAAATTCTAGAAAATTCATTTCTAATCAATAATGCTATTAAGAAGTTCGATACTCTTGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCA

TTGGCTAAAGCGAAATTTTGTAACGTACTAGGGTATCCCATTAGTAAGCCGGTTCGGGCTGATTTATCAGATTCTGATATTATTGATCG

ATTTTGGGCGTATATGCAGAAATCTTTCTCATTATCACAGCGGATCTTCAAAAAAAAAGAGTTTGTATCGAATAAAGTATATACTTCGA


VKDASSLHLLRFFLHEYCNWNSLITPKKASSSFSKRNQRLFFFLYNSHVCEYESIFVFLRNQSSHLRSISSGALLERIYFYGKIERLVD

VFVKDFQTNLCLFKDPFMNYVRYQGKSILASKGTPLLMNKWKYYLVTFWQCYFSLWFHPRRIYLNQLSNHSLEFVGYLSSVRLNASVVR

SQILENSFLINNAIKKFDTLVPIIPLIGSLAKAKFCNVLGYPISKPVRADLSDSDIIDRFWAYMQKSFSLSQRIFKKKEFVSNKVYTSX

Ilustrativni matK barkod vrste P. media.

XXII

XXII Pistacia lentiscus – tršlja rbcL barkod

Pistacia lentiscus L. – tršlja.




GTTTGGGATCAAGCCGGGCGTTAAAGACTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATATAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCAT

TCCGAGTCACTCCTCAACCTGGAGTTCCACCCGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCGGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG

TGGACCGATGGGCTTACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACAACATTGAGCCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATATG

TTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAG

CCCTGCGCGCTCTACGTCTAGAGGATCTACGAATCCCTACCGCGTATACAAAAACTTTCCAAGGACCACCACATGGGATCCAAGTTGAG

AGAGATAAATTGAACAAGTATGGACGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCTAAATTAGGTTTATCCGCTAAGAACTACGGTAGAGC

TGTTTATGAATGTCTACGCGGTGGAC


VAIQAGVKRNKLTYYTPEYETKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIEPVPGEADQYIC

YVAYPLDLFEEGSVTNMLTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRVPTAYIKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRA

VYECLPGGX

Ilustrativni rbcL barkod vrste P. lentiscus.

XXIII

XXIII Pistacia lentiscus – tršlja matK barkod




GAGGTAAAGATGCCTCTTCTTTACATTTATTACGGTTCTTTCTACACGAGTATTTTAATTTGAATTGGAATAGTCTTAGTAATCCAAAG

AAATCTATTTCCTTTTTTTCAAAAAGTAATTCAAGATTATTCTTGTTCCTATATAATTCTCATGTATGTGAATATGAATCCATCTTCTT

TTTTCTCCGTAACCAATCTTCTCATTTACGATCAACATCTTCTGGAGTCCTTCTTGAGCGAATATATTTCTATCGAAAAGTAGAACATC

TTGTCGAAGTCTTGGCTAATGATTTTGATTTTCAGGACATCTTATGCTTGTTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGTTAAATATCAAGGA

AAATCCATTCTGTCTTCAAAGGATACGCCTCTTCTGATGAATAAATGGAAATATTACCTTGTCAATTTATGGCAATCGCATTTTCACAT

GTGGTCTCAACCGGGAAGGGTTCATATAAAGCACTTCTACAAGCATTCTATCAACTTTCTGGGCTATCTTTCCAGTGTGCAACTAAATC

CTTTGTTGGTACGGAGTCAAATGCTAGAAAATTCATTTATCATAGATAAGGCTATGAAGAAGTTCGATACAACCGTTCCAATTATTCCT

CTGATTGGATCATTGACTAAGGCACGGTTTTGTAACACCTTAGGGCATCCCATTAGTAAGCCGACCCGGGCTGATTCCTCCGATTTTGA

TATTATTGACCGATTTGTGCGTATATGCAGAAATCTTTCTCATTATCACAGCGGGTCCTCAAAAAAAAAGAGTTTGTATCGAATAAAAT

ATATACTTCGG


GKDASSLHLLRFFLHEYFNLNWNSLSNPKKSISFFSKSNSRLFLFLYNSHVCEYESIFFFLRNQSSHLRSTSSGVLLERIYFYRKVEHL

VEVLANDFDFQDILCLFKDPFMHYVKYQGKSILSSKDTPLLMNKWKYYLVNLWQSHFHMWSQPGRVHIKHFYKHSINFLGYLSSVQLNP

LLVRSQMLENSFIIDKAMKKFDTTVPIIPLIGSLTKARFCNTLGHPISKPTRADSSDFDIIDRFVRICRNLSHYHSGSSKKKSLYRIKY

ILR

Ilustrativni matK barkod vrste P. lentiscus.

XXIV

XXIV Quercus ilex – hrast crnika rbcL barkod

Quercus ilex L. – hrast crnika.




ATCAAGCTGGGTGTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATCAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCCTTCCGAGTA

ACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCCGAGGAAGCAGGGGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCCACTGGGACATGGACAACTGTGTGGACTGA

CGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCGGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATTTATTGCTTATGTAG

CTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGATTCAAGGCCCTGCGC

GCTCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTACTTCTTATTCTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAGAGGGATAA

ATTAAACAAGTATGGCCGCCCCCTATTAGGATGTACTATTAAACCTAAATTGGGATTATCCGCTAAGAATTACGGTAGAGCAGTTTATG

AATGTCTCCGCGGTGGAT


QAGCKDYKLTYYTPDYQTKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIEPVAGEENQFIAYVA

YPLDLFEEGSVTNMFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPTSYSKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRAVYE

CLRGGX

Ilustrativni rbcL barkod vrste Q. ilex.

XXV

XXV Quercus ilex – hrast crnika matK barkod




GGGGTGAAGATGCTTCTTATTTGCATTTATTGCGGTTCTTTCTTCATGAGTATTCTAATTGTAACAGTCTTATTATTACAAATAAATCT

CTTTCCATTTTTTCAAAAAGTAATCCGAGATTCTTTTTATTCCTATATAATTCTTATATATGTGAATACGAATCCATCTTCCTTTTTCT

CCGTAACCAATCTTCTCATTTACGATTAACATCTTCTGGAATCCTTTTTGAACGACTCTGTTTATATAGAAAAATAGAACATTTTGCCG

AAGTCTTTGCTAATGATTTTACGGGCATCCCATGCTTTCTCAAGGATCCTTTCATGCATTATGTTAGATATCAAGGAAAATCAATTCTG

GCTTCCAAAGACACACCTCTTCTAATGAATAAATGTAAATCTTACCTTGTCAATTTATGGCAATGTCATTTTGATGTATGGTCTCACGC

GGCAAGTATCCGTACAAACCAATTATCCAAGCATTCCCTCGATTTTTTGAGTTACTTGTCAAGTGTTCGACGAAATCCTGCAGTGGTGC

GGAATCAAATGCTAGAAAATTCATTTCTACTAAATAATGCTCCCAATAAACTCGATACAATAGTTCCAATTATTCCTCTGATTGGATCA

TTGGCTAAAGCGAAATTTTGTAACGCAGTTGGGCATCCAATTAGTAAGCTGACTCGGGCCGATTTATCGGATTTTGAGATTATCAATCG

ATTTTTGCATATATGCAGAAATCTTTCTCATTATTACAGCGGATCCTCAAAAAAAAAGAATATGTATCGAATAAAATATATACTTCGG


GEDASYLHLLRFFLHEYSNCNSLIITNKSLSIFSKSNPRFFLFLYNSYICEYESIFLFLRNQSSHLRLTSSGILFERLCLYRKIEHFAE VFANDFTGIPCFLKDPFMHYVRYQGKSILASKDTPLLMNKCKSYLVNLWQCHFDVWSHAASIRTNQLSKHSLDFLSYLSSVRRNPAVVR

NQMLENSFLLNNAPNKLDTIVPIIPLIGSLAKAKFCNAVGHPISKLTRADLSDFEIINRFLHICRNLSHYYSGSSKKKNMYRIKYILR

Ilustrativni matK barkod vrste Q. ilex.

XXVI

XXVI Ruscus aculeatus – bodljikava veprina rbcL barkod

Ruscus aculeatus L. – bodljikava veprina.




GTTGCGATCACAGCTGGGTGTAAAGATTACAGATTGACTTATTATACTCCTGATTACGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATT

CCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCCGCTGAAGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCCGAATCCTCTACTGGTACATGGACAACTGTGT

GGATGGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATTGAGGCCGTTGTTGGGGAAGAAAATCAATATATTTGT

TATGTAGCTTATCCTTTATACCTTTTTGAAAAAAGGTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAAAGAATTTGGATTCCAACA

CCCCCCACAGTTTTCCCTGGGGCATCTGAGGAATCCGCCCCCGTATCCCCCGCTTCTTCGGCGGGGACTCCGGGGTGTTCAAGTTGAAA

CGGATAAGCTGCCCAAAAATTGGGATCTTTGGTTTGGAATCACGAGTATAATAAATCTGTTATCCTTAACACCACCTTACATCCCACAC

TTCGTTAGTCTCTGCGTGTGGGGGC


VAITAGCKDYRLTYYTPDYETKDTDILAAFRVTPQPGVPAEEAGAAVAAESSTGTWTTVWMDGLTSLDRYKGRCYHIEAVVGEENQYIC

YVAYPLYLFEKRSVTNMFTSIVGKEFGFQHPPQFSLGHLRNPPPYPPLLRRGLRGVQVETDKLPKNWDLWFGITSIINLLSLTPPYIPH

FVSLCVWGX

Ilustrativni rbcL barkod vrste R. aculeatus.

XXVII

XXVII Ruscus aculeatus – bodljikava veprina matK barkod




GGATTAAAGGTTTCCCTTTTTTACATTTATTGCGGTTCTTTCTTCACGAATATCATAATTTGAATAGTCTTCTCATTACTCAGAAGAAA

TCGATTTACGTTTTTTCAAAAGAAAATAAAAGAGTATTTCGGTTCCTATACAATTTTTATGTATTTGAATGGGAATTTTTATTCGTTTT

TATTCGTAAACAATCCTCTTATTTACGATTAACATCTTCTGGAACCTTTCTTGAGCGAACACATTTCTATGAAAAAATAGAACATCTTA

AAATAGAACATTTTGTAGTAGTATGTCGTAACTTTTTTCAGAGAACCCTATGGTTCTGCAAAGATCCTTTCATGCATTATGTTCGATAT

CAAGGAAAAGCAATTCTTGCTTCAAAGGGGACTCATCTTCTGATGAAGAAATGGAAATATCTTTTTTTCAATTTCTGGCAATATTATTT

TCATGTTTGGTCGCAACCGTACAGGATCCATATAAACCAATTATCAAACTATTCTTTTTATTTTCTGGGTTATCTTTCAAGTCTCCTAC

TCCATTTTTCGGCGGTAAGGAATCAAATGTTAAAGAATTCATTTCTAATAGATACCATTACTAAGAAATTTGATACCATAGTCCCAGTT

ATTTTTCTTATTGGATCTTTGGCTAAAGCGAAATTTTGTACTGTATCGGGCCATCCTATTAGTAAACCGATCTGGACCGATTTATCGGA

TTCTGATATTCTTGATCGATTCGGTCGGATATGTAAAAATCTTTCTCATTATCATAGTGGATCCTCAAAAAAACAGAGTTTGTATCGAA

TAAAGTATATACTTCGA


IKGFPFLHLLRFFLHEYHNLNSLLITQKKSIYVFSKENKRVFRFLYNFYVFEWEFLFVFIRKQSSYLRLTSSGTFLERTHFYEKIEHLK

IEHFVVVCRNFFQRTLWFCKDPFMHYVRYQGKAILASKGTHLLMKKWKYLFFNFWQYYFHVWSQPYRIHINQLSNYSFYFLGYLSSLLL

HFSAVRNQMLKNSFLIDTITKKFDTIVPVIFLIGSLAKAKFCTVSGHPISKPIWTDLSDSDILDRFGRICKNLSHYHSGSSKKQSLYRI

KYILR

Ilustrativni matK barkod vrste R. aculeatus.

XXVIII

XXVIII Smilax aspera – crvena tetivika rbcL barkod

Smilax aspera L. – crvena tetivika.




GTTGGGATTACAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCAT

TCCGAGTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCGCCTGAAGAGGCAGGGGCAGCGGTAGCCGCAGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTG

TGGACTGATGGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATAGAGAGCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTGC

TTATGTAGCTTATCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGCTCGGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGTTTCAAAG

CCCTACGAGCTCTACGTCTAGAGGATTTGCGAATTCCTACTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGCCCACCCCATGGCATCCAAGTTGAA

AGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACCATTAAACCAAAATTGGGATTATCCGCAAAGAACTACGGTAGAGC

GGTTTATGAATGTCTGCGCGGGAGGG


LGLQAGVKDYKLTYYTPDYETKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYHIESVVGEENQYIA

YVAYPLDLFEEGSVTNMFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPTSYSKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRA

VYECLRGRX

Ilustrativni rbcL barkod vrste S. aspera.

XXIX

XXIX Smilax aspera – crvena tetivika matK barkod




AGATTCAAGATGTTCCCTCTTTTACTTTATTGCGACTCTTTCTTCATAAATATCATAATTTGAATAGATTTATTACTCAGAATAAATCT

ATTTACGTTTTTTCAAAAGAAAATACAAGACTATTTCGCTTCCTGTATAATTCTTATGTAGCTGAATGTGAATTTTTATTAGTTTTTCT

TCGTAAACAATCCTATTATTTACGATCAACATCTTCTGGAACCTTTCTTGAACGAACACATTTCTATGGAAAAATAGAACATATTCATA

TTATAGTAGTAGGGTGTCATAATTATTTTCAGAAGACCCTATGGCCCGTCAAGGGTCCTTTCATGCATTATGTTAGATATCAGGGAAAA

GCGATTCTAGCTTCAAGGGGGACCCATCTTCTGATGAAAAAATGGAGATATTACCTTGTTAATTTCTGGCAATATTATTTTAGCTTTTG

GTCTCAACCGTACAGGATCCATATAAACCAATTATCAAACTATTCCTTCTATTTTCTGGGGTATCTTTCAAGTGTACTAATAAATACTT

CAGCAATAAAGAATCAAATGCTAGAGAACTCATTTCTAATAGATACTGTTATTAATATTAACAAATTTGATACCATAGTCCCAATTATT

CCTCTTATTGGATCATTGTCTAAAGCGAAATTTTGTACTGCCTCAGGGCATCCTATTAGTAAGCCGATGTGGGCTGATTTATCAGATTC

TGATATTATTGATCGATTTGGTCGGATATGTGGAAATCTTTCTCATTATAAAAAGGGGATCTTCAAAAAAACAAAGTTTGTATCGAATA

AAGTATATACTTA


IQDVPSFTLLRLFLHKYHNLNRFITQNKSIYVFSKENTRLFRFLYNSYVAECEFLLVFLRKQSYYLRSTSSGTFLERTHFYGKIEHIHI

IVVGCHNYFQKTLWPVKGPFMHYVRYQGKAILASRGTHLLMKKWRYYLVNFWQYYFSFWSQPYRIHINQLSNYSFYFLGYLSSVLINTS

AIKNQMLENSFLIDTVININKFDTIVPIIPLIGSLSKAKFCTASGHPISKPMWADLSDSDIIDRFGRICGNLSHYKKGIFKKTKFVSNK

VYTX

Ilustrativni matK barkod vrste S. aspera.

Životopis

Osobni podaci:

Ime i prezime: Jakob Ćosić

Datum i mjesto rođenja: 17. siječnja 1989., Zagreb

Adresa: Vodička ulica 2, 10040 Zagreb

Mobitel: 091 5301 385

E-mail: [email protected]

Obrazovanje:

2011. – danas, Prirodoslovno – matematički fakultet, diplomski studij

eksperimentalne biologije, modul botanika

2008. – 2011., Prirodoslovno – matematički fakultet, Sveučilište u Zagrebu,

sveučilišni prvostupnik biologije

2003. – 2007., Prirodoslovna škola Vladimira Preloga, Zagreb, kemijski tehničar

Znanja i vještine:

Napredno poznavanje rada na računalu

Engleski jezik, napredno poznavanje u govoru, osnovno u pismu

Njemački jezik, osnovno poznavanje u govoru i pismu

Napredno poznavanje rada u laboratoriju

Vozačka dozvola B kategorije

Izrada herbara

Bavljenje planinarenjem

Ostalo:

Rad u ugostiteljstvu

Rad u skladištu

Pomoćni poslovi u tvornici tekstila

Sakupljanje geoloških uzoraka

mailto:[email protected]

Documents

DNA barkodiranje kao metoda u taksonomskoj identifikaciji biljnih …digre.pmf.unizg.hr/3972/1/Diplomski rad.pdf · 2015-05-13 · jedinstveno razlikovanje vrsta. Idealan DNA barkod