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GATA family
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7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 1/12
MOLECULAR
A ND
C E L L U L A R
B I O L O G Y ,
J U l Y
1 9 9 3 ,
p .
3 9 9 9 - 4 0 1 0
V o l .
1 3 ,
N o .
7
0 2 7 0 - 7 3 0 6 / 9 3 / 0 7 3 9 9 9 - 1 2 $ 0 2 . 0 0 / 0
C o p y r i g h t
C
1 9 9 3 ,
A m e r i c a n S o c i e t y
f o r
M i c r o b i o l o g y
D N A - B i n d i n g
S p e c i f i c i t y
o f
GATA
F a m i l y
T r a n s c r i p t i o n
F a c t o r s
M ENIE MERIKA
AND
STUA RT H .
ORKIN*
D i v i s i o n o f
H e m a t o l o g y / O n c o l o g y ,
C h i l d r e n ' s
H o s p i t a l ,
D a n a - F a r b e r
C a n c e r
I n s t i t u t e
a n d
D e p a r t m e n t
o f P e d i a t r i c s ,
H a r v a r d
M e d i c a l
S c h o o l ;
a n d Howard
H u g h e s
M e d i c a l
I n s t i t u t e ,
B o s t o n , M a s s a c h u s e t t s 0 2 1 1 5
R e c e i v e d 4
F e b r u a r y 1 9 9 3 / R e t u r n e d
f o r
m o d i f i c a t i o n 1 1 M a r c h
1 9 9 3 / A c c e p t e d
8
A p r i l
1 9 9 3
G A T A - b i n d i n g
p r o t e i n s
c o n s t i t u t e
a
f a m i l y
o f
t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r s
t h a t
r e c o g n i z e
a
t a r g e t
s i t e
c o n f o r m i n g
t o
t h e c o n s e n s u s
WGATAR
(W
= A
o r
T
a n d
R
=
A
o r
G ) .
H e r e w e
h a v e
u s e d
t h e m e t h o d o f
p o l y m e r a s e
c h a i n
r e a c t i o n - m e d i a t e d
r a n d o m s i t e s e l e c t i o n
t o a s s e s s
i n
a n
u n b i a s e d manner
t h e
D N A - b i n d i n g
s p e c i f i c i t y
o f
GATA
p r o t e i n s .
C o n t r a r y
t o o u r
e x p e c t a t i o n s ,
we s h o w
t h a t
GATA
p r o t e i n s
b i n d a
v a r i e t y
o f
m o t i f s
t h a t
d e v i a t e
f r o m
t h e
p r e v i o u s l y
a s s i g n e d
c o n s e n s u s .
Many
o f
t h e
n o n c o n s e n s u s
s e q u e n c e s
b i n d
p r o t e i n
w i t h
h i g h
a f f i n i t y ,
e q u i v a l e n t
t o t h a t
o f
c o n v e n t i o n a l
GATA
m o t i f s .
B y u s i n g
t h e s e l e c t e d
s e q u e n c e s
a s
p r o b e s
i n
t h e
e l e c t r o -
p h o r e t i c m o b i l i t y s h i f t
a s s a y ,
we d e m o n s t r a t e
o v e r l a p p i n g ,
b u t
d i s t i n c t , s e q u e n c e
p r e f e r e n c e s
f o r GATA
f a m i l y
m e m b e r s , s p e c i f i e d b y
t h e i r
r e s p e c t i v e D N A - b i n d i n g
d o m a i n s .
F u r t h e r m o r e ,
we
p r o v i d e
a d d i t i o n a l
e v i d e n c e
f o r i n t e r a c t i o n
o f
a m i n o
a n d
c a r b o x y
f i n g e r s
o f GATA-1 i n
d e f i n i n g
i t s
b i n d i n g
s i t e .
B y
p e r f o r m i n g
c o t r a n s f e c t i o n
e x p e r i m e n t s ,
we
a l s o
s h o w
t h a t t r a n s a c t i v a t i o n
p a r a l l e l s
DN A
b i n d i n g .
A c h i m e r i c
p r o t e i n
c o n t a i n i n g
t h e
f i n g e r
d o m a i n
o f
a r e A
a n d t h e
a c t i v a t i o n
d o m a i n s
o f
GATA-1 i s
c a p a b l e
o f
a c t i v a t i n g
t r a n s c r i p t i o n
i n
m a m m a l i a n
c e l l s
t h r o u g h
GATA
m o t i f s .
Our
f i n d i n g s s u g g e s t
a m e c h a n i s m
b y
w h i c h
GATA
p r o t e i n s
m i g h t
s e l e c t i v e l y
r e g u l a t e g e n e
e x p r e s s i o n
i n
c e l l s
i n
w h i c h
t h e y
a r e
c o e x p r e s s e d .
T h e GATA
f a m i l y
o f
p r o t e i n s
c o n s i s t s
o f
a
s m a l l ,
b u t
e n l a r g i n g ,
f a m i l y
o f
t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r s w i t h i n d i v i d u a l
m e m b e r s
r e p r e s e n t e d
i n
h u m a n s ,
m i c e ,
c h i c k e n s , X e n o p u s
l a e v i s ,
C a e n o r h a b d i t i s
e l e g a n s ,
D r o s o p h i l a
m e l a n o g a s t e r
( 7 a ) ,
a n d
f u n g i . Among
v e r t e b r a t e s ,
f o u r
G A T A - b i n d i n g
p r o t e i n s
( d e s i g n a t e d
GATA-1
t o
G A T A - 4 ) ,
e a c h w i t h a
d i f f e r e n t t i s s u e a n d
d e v e l o p m e n t a l
p r o f i l e ,
h a v e
b e e n
i d e n t i -
f i e d
( s e e
r e f e r e n c e 2 5
f o r a
r e v i e w ) .
G A T A - 1 ,
t h e
f o u n d i n g
member o f
t h e
f a m i l y ,
was
i n i t i a l l y
i d e n t i f i e d
a s a n
e r y t h r o -
c y t e - s p e c i f i c
D N A - b i n d i n g
a c t i v i t y
w i t h
p r e s u m p t i v e
t a r g e t
s i t e s
i n
t h e
p r o m o t e r s
a n d / o r
e n h a n c e r s o f
human
a n d
c h i c k e n
g l o b i n g e n e s ( 1 0 , 2 1 , 3 8 ) .
cDNAs
w e r e f i r s t
c h a r a c -
t e r i z e d a s
e n c o d i n g
t h e
m o u s e
a n d c h i c k e n
h o m o l o g s ( 8 , 3 7 ) .
As
r e v e a l e d
t h r o u g h t a r g e t e d
g e n e
d i s r u p t i o n ,
e x p r e s s i o n
o f
GATA-1 i s e s s e n t i a l
f o r n o r m a l
e r y t h r o i d d e v e l o p m e n t
( 2 6 ) .
cDNAs
f o r
o t h e r v e r t e b r a t e
m e m b e r s o f
t h e GATA
f a m i l y
h a v e
b e e n
i s o l a t e d
b y
v i r t u e o f
t h e i r
c l o s e
s e q u e n c e
h o m o l -
o g y
t o t h e
D N A - b i n d i n g
d o m a i n
o f
GATA-1
( 6 ,
1 3 , 1 4 , 1 8 ,
4 0 , 4 5 ) .
I n
v e r t e b r a t e s ,
t h i s
D N A - b i n d i n g
d o m a i n
( 2 0 ,
4 1 ) i n c l u d e s
t w o s i m i l a r z i n c
f i n g e r s
o f
t h e
g e n e r a l c o n f i g u r a t i o n
C y s - X 2 -
C y s - X 1 7 - C y s - X 2 - C y s .
N o n v e r t e b r a t e
m e m b e r s i n c l u d e
t h e
t w o - f i n g e r e d
C .
e l e g a n s p r o t e i n
e l t - 1
( 3 1 )
a n d s e v e r a l
s i n g l e -
f i n g e r
f u n g a l
f a c t o r s
w h i c h a l s o
b i n d GATA m o t i f s
( 4 , 1 1 ,
1 2 ,
1 6 , 2 3 ,
4 3 ) .
T h e
f u n g a l f i n g e r
r e g i o n i s
m o r e
c l o s e l y r e l a t e d
t o
t h e
c a r b o x y
f i n g e r
o f
t h e
v e r t e b r a t e
m e m b e r s
( 1 6 ) .
D e l e t i o n
a n d
m u t a g e n e s i s
a n a l y s e s h a v e
i d e n t i f i e d
d i s t i n c t f u n c t i o n a l
r o l e s f o r t h e
t w o
f i n g e r s
o f
m o u s e
GATA-1
( m G A T A - 1 ) ( 2 0 )
a n d
c h i c k e n
GATA-1
( c G A T A - 1 ) ( 4 1 )
p r o t e i n s . T h e
c a r b o x y
f i n g e r
i s
r e q u i r e d f o r
b i n d i n g ,
w h e r e a s
t h e
a m i n o f i n g e r
c o o p e r a t e s w i t h
i t
t o
p r o v i d e f u l l
s t a b i l i t y
a n d
s p e c i f i c i t y o f
b i n d i n g .
E a c h
GATA
f a m i l y
member
e x h i b i t s
a
d i s t i n c t i v e , o f t e n
o v e r l a p p i n g ,
p a t t e r n
o f
e x p r e s s i o n i n
t i s s u e s
a n d c e l l l i n e s .
*
C o r r e s p o n d i n g
a u t h o r .
GATA-1 i s
f o u n d
i n c e l l s
o f t h e
e r y t h r o i d
l i n e a g e ( 8 , 3 7 ) ,
i n
t w o o t h e r
h e m a t o p o i e t i c l i n e a g e s
( m e g a k a r y o c y t i c
a n d
b o n e
m a r r o w - d e r i v e d
m a s t
c e l l s
[ 2 2 ,
2 9 ] ) ,
a n d
i n
h e m a t o p o i e t i c
p r o g e n i t o r
c e l l s
( 3 ,
3 2 ) .
GATA-2 i s
a l s o
e x p r e s s e d
i n p r o -
g e n i t o r c e l l s ,
m a s t
c e l l s , m e g a k a r y o c y t e s
( 4 4 ) , e m b r y o n i c
b r a i n
c e l l s , p r i m i t i v e
e r y t h r o b l a s t s
( 4 0 ) ,
e n d o t h e l i a l
c e l l s ,
e m b r y o n i c
s t e m
c e l l s , a n d a
v a r i e t y o f
o t h e r c e l l s a n d t i s s u e s
( 6 ,
1 8 , 3 9 ,
4 0 ) .
I n
f a c t ,
GATA-2 h a s
b e e n
i m p l i c a t e d a s a
d i r e c t e f f e c t o r
o f s e l e c t e d
e n d o t h e l i u m - s p e c i f i c
g e n e s , s u c h
a s
p r e p r o e n d o t h e l i n - 1
( 6 ,
1 8 , 3 9 ) .
GATA-3
p r o t e i n
i s
h i g h l y
e x p r e s s e d
i n
T - l y m p h o i d c e l l s
a n d
e m b r y o n i c
b r a i n
c e l l s
( 1 3 - 1 5 , 4 0 ) ,
b u t
e l s e w h e r e
( e n d o t h e l i a l
c e l l s a n d
e m b r y o n i c
s t e m
c e l l s )
i t
i s
e x p r e s s e d a t a l o w l e v e l .
A r o l e o f t h i s p r o t e i n
i n
t h e
r e g u l a t i o n o f
T - c e l l
r e c e p t o r a - a n d
B - c h a i n
g e n e s
h a s
b e e n
s u g g e s t e d ( 1 3 - 1 5 ) .
E x p r e s s i o n o f
GATA-4
i s
r e s t r i c t e d
t o t h e
h e a r t , i n t e s t i n a l
e p i t h e l i u m ,
p r i m i t i v e e n d o d e r m ,
a n d
g o n a d s ( 1 ) .
A common
p r o p e r t y
o f
a l l GATA
p r o t e i n s
i s t h e i r h i g h -
a f f i n i t y b i n d i n g
t o
a
s e q u e n c e m o t i f
c o n f o r m i n g
t o
t h e
c o n s e n s u s
T / A ( G A T A )
A / G .
M o t i f s w i t h a s s i g n e d
f u n c -
t i o n a l
s i g n i f i c a n c e t h a t c o n f o r m
t o t h i s
c o n s e n s u s h a v e
b e e n
f o u n d i n v a r i o u s
r e g u l a t o r y
r e g i o n s
( p r o m o t e r s
o f
g e n e s
e x p r e s s e d
i n
e r y t h r o i d ,
m e g a k a r y o c y t i c ,
m a s t ,
a n d e n d o t h e -
l i a l
c e l l s ;
g l o b i n a n d T - c e l l r e c e p t o r
a - a n d
B - c h a i n g e n e
e n h a n c e r s ;
a n d
a -
a n d
3 - g l o b i n
l o c u s
c o n t r o l
r e g i o n s
( f o r
a
r e v i e w ,
s e e r e f e r e n c e
2 5 ) .
T h e
a b i l i t i e s
o f v a r i o u s
m e m b e r s o f
t h e
GATA
f a m i l y
t o
r e c o g n i z e
c l o s e l y r e l a t e d , b u t n o t
i d e n t i c a l , DNA
s e q u e n c e
e l e m e n t s
r a i s e s
i n t e r e s t i n g
p o s s i b i l i t i e s
a s
t o
how d i f f e r e n t i a l
g e n e r e g u l a t i o n i s
a c c o m p l i s h e d i n
c e l l s e x p r e s s i n g m o r e
t h a n
o n e
GATA
p r o t e i n .
T h a t i s , d i f f e r e n t i a l r e g u l a t i o n
m i g h t
b e a c h i e v e d
b y
s e l e c t i v e
h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g o f
o n e ,
b u t n o
o t h e r , GATA
f a m i l y m e m b e r s
t o a
t a r g e t s e q u e n c e
b e c a u s e
o f
s u b t l e
v a r i a t i o n s i n
t h e i r
D N A - b i n d i n g
d o m a i n s . To d e f i n e
t h e
s p e c t r u m
o f
D N A - b i n d i n g s i t e s
r e c o g n i z e d b y
d i f f e r e n t
GATA
f a m i l y m e m b e r s i n
a n u n b i a s e d m a n n e r ,
w e h a v e
e m p l o y e d
t h e m e t h o d
o f p o l y m e r a s e c h a i n
r e a c t i o n
( P C R ) -
3 9 9 9
7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 2/12
4 0 0 0
MERIKA
AND
ORKIN
m e d i a t e d r a n d o m s i t e
s e l e c t i o n
t o i d e n t i f y s i t e s r e c o g n i z e d
b y
d i f f e r e n t
GATA m e m b e r s .
I n t e r e s t i n g l y ,
we f o u n d t h a t
a s u b s t a n t i a l p r o p o r t i o n o f
DNA
m o t i f s s e l e c t e d
b y
a l l G A T A - b i n d i n g p r o t e i n s d e v i a t e
s i g n i f i c a n t l y f r o m
t h e
p r e v i o u s ly d e s c r i be d
c o n s e n s u s .
F u r -
t h e r m o r e , we
h a v e
i d e n t i f i e d b i n d i n g s i t e s
w h i c h
a r e p r e f e r -
e n t i a l l y r e c o g n i z e d b y a s p e c i f i c
GATA f a m i l y m e m b e r . W e
a l s o
s h o w
t h a t
mGATA-1
a n d
human
GATA-2
( h G A T A - 2 )
p r o t e i n s
a p p e a r t o e x h i b i t
a
b r o a d e r s e q u e n c e
s p e c i f i c i t y
c o m p a r e d w i t h t h a t o f h G A T A - 3 .
W e p r o v i d e
d i r e c t e v i d e n c e
t h a t t h e
s i n g l e z i n c f i n g e r
o f
t h e
a r e A
g e n e f r o m t h e f u n g u s
A s p e r gi l lu s n i d ul a n s
( 1 6 ) i s
c a p a b l e
o f
m e d i a t i n g s p e c i f i c
i n t e r a c t i o n s
w i t h c o n s e n s u s
a n d
n o n c o n s e n s u s GATA m o t i f s .
By p e r f o r m i n g c o t r a n s f e c -
t i o n e x p e r i m e n t s ,
we
o b s e r v e d
t h a t
t r a n s a c t i v a t i o n o f r e -
p o r t e r
c o n s t r u c t s
b y
mGATA-1 a n d
hGATA-3
p r o t e i n s
p a r a l l e l s t h e i r
i n
v i t r o b i n d i n g t o
t h e r e s p e c t i v e
s i t e s .
F u r -
t h e r m o r e , a h y b r i d p r o t e i n d e r i v e d b y
s u b s t i t u t i o n
o f t h e
f i n g e r r e g i o n
o f
mGATA-1 p r o t e i n b y t h e
c o r r e s p o n d i n g
r e g i o n o f t h e
a r e A
m o l e c u l e i s
c a p a b l e
o f a c t i v a t i n g t r a n -
s c r i p t i o n
f r o m
r e p o r t e r
c o n s t r u c t s , c o n t a i n i n g d i f f e r e n t
GATA
m o t i f s ,
i n m a m m a l i a n c e l l s .
MATERIALS A ND
M ET H O DS
E x p r e s s i o n
a n d
p u r i f i c a t i o n o f
b a c t e r i a l l y
e x p r e s s e d
p r o -
t e i n s . P r o t e i n s u s e d w e r e
p r o d u c e d
i n
E s c h e r i c h i a c o l i b y t h e
b a c t e r i o p h a g e
T 7
RNA
p o l y m e r a s e
e x p r e s s i o n
s y s t e m
( 3 4 ) .
cDNAs f o r
mGATA-1; CfmGATA-1
( r e s i d u e s
2 3 0
t o
3 3 6 ) ;
h G A T A - 3 ;
t h e
h y b r i d m o l e c u l e s m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 ) ,
m G A T A - 1 ( N f / f a r e A ) ,
a n d m G A T A - 1 ( f a r e A ) ;
a s w e l l a s t h e
g e n o m i c
s e q u e n c e
o f
t h e
a r e A
g e n e ( r e s i d u e s
4 6 7
t o
5 8 7 )
w e r e r e c o v e r e d
b y
PC R
w i t h
a p p r o p r i a t e
p r i m e r s
a n d
c l o n e d
i n t o
t h e
b a c t e r i a l e x p r e s s i o n
v e c t o r
pET8C ( 3 5 ) .
I n
t h i s
m a n n e r ,
n o n f u s i o n
p r o t e i n s
w e r e
e x p r e s s e d .
T h e
cDN A f o r
hGATA-2 p r o t e i n
( r e s i d u e s
2 8 4 t o
4 0 6 ) ( 6 , 1 8 )
was c l o n e d
i n t o
p E T 1 5 b ( N o v a g e n )
u n d e r
t h e
T 7
RNA
p o l y m e r a s e
p r o m o t e r , b u t
i n f u s i o n
w i t h
2 7
a m i n o
a c i d s
c o n t r i b u t e d
b y
t h e v e c t o r ,
i n c l u d i n g
t h e
s i x - h i s t i d i n e
m o i e t y .
P l a s m i d s
w e r e
i n t r o d u c e d
i n t o t h e b a c t e r i a l
s t r a i n
B L 2 1 ( D E 3 ) ,
w h i c h
e x -
p r e s s e s
t h e T7 RNA
p o l y m e r a s e
u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e
l a c U V S p r o m o t e r .
mGATA-1
p r o t e i n
a n d t h e C
f i n g e r
o f mGATA-1 w e r e
r e c o v e r e d f r o m
i n c l u s i o n b o d i e s
a s f o l l o w s . C u l t u r e s
were
g r o w n
t o
a n
o p t i c a l d e n s i t y
a t 6 0 0
n m o f 0 . 5 .
I s o p r o p y l - p 3 - D -
t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e
( 0 . 5 mM)
w a s
t h e n
a d d e d ,
a n d
c u l -
t u r e s w e r e i n c u b a t e d f o r 3
h . C e l l s
were
h a r v e s t e d
a n d
l y s e d
b y
a d d i n g
c o l d
l y s i s
b u f f e r
( 5 0
mM
T r i s - C l
[ p H
8 . 0 ] ,
2 0 0
mM
N a C l ,
2
mM
EDTA
[ p H
8 . 0 ] ,
1 mM d i t h i o t h r e i t o l
[ D T T ] ,
1
mM
p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l
f l u o r i d e
[ P M S F ] ,
1 0
mM b e n z -
a m i d i n e ) .
L y s o z y m e
was a d d e d
t o
a
f i n a l
c o n c e n t r a t i o n o f
0 . 2
m g / m l ,
a n d
t h e
l y s a t e
w a s i n c u b a t e d
on
i c e f o r 2 0
m i n .
T r i t o n X - 1 0 0
was t h e n a d d e d
t o
a f i n a l
c o n c e n t r a t i o n
o f
1
f o r
1 0
m i n
o n
i c e .
L y s i s
was
c o m p l e t e d
b y
s o n i c a t i o n
( s i x
t i m e s
f o r
1 5
s
[ e a c h ]
w i t h
a
m i c r o t i p ) .
A p p r o x i m a t e l y
1 0
m l
o f
t h e s o n i c a t e d
s o l u t i o n
w a s
l a y e r e d
o n t o
1 5
m l
o f s u c r o s e
s o l u t i o n
( 4 0 % s u c r o s e ,
1 0 mM
T r i s - C l
[ p H
8 . 0 ] ,
0 . 2 M
N a C l ,
1 mM EDTA
[ p H
8 . 0 ] )
a n d
c e n t r i f u g e d
a t
1 , 5 0 0
x
g
f o r
3 0
m i n
a t
4 ° C .
T h e
p e l l e t
( i n c l u s i o n b o d i e s )
w as
r e s u s p e n d e d
i n
0 . 5
m l o f
p h o s p h a t e - b u f f e r e d
s a l i n e s o l u t i o n
p l u s
2 . 5 m l o f
e x t r a c t i o n b u f f e r
( 8
M
u r e a ,
0 . 5 M
N a C l ,
0 . 5
M
T r i s - C l
[ p H
8 . 0 ] ,
1
mM
E DT A
[ p H
8 . 0 ] ,
1
mM
D T T ,
1
mM
P M S F ,
1 0
mM
b e n z a m i d i n e )
a n d
t h e n
g e n t l y
v o r t e x e d .
T h e
s u s p e n s i o n
was
i n c u b a t e d o n
i c e
f o r 1 0
m i n .
D e n a t u r e d
p r o t e i n s
were
s l o w l y
a l l o w e d t o
r e n a t u r e
b y s t e p w i s e
d i a l y s i s a g a i n s t
b u f f e r s
( 5 0
mM T r i s - C l
[ p H
7 . 5 ] ,
1 0 0
mM
N a C l ,
1 0 %
g l y c e r o l ,
1
mM
PMSF,
1
mM b e n z a m i d i n e , 0 . 5
mM
D T T , 1 0
, u M Z n S O 4 ) c o n t a i n i n g
6 ,
4 , 2 , a n d 0 M u r e a .
R e n a t u r e d
p r o t e i n
w a s c e n t r i f u g e d
a t
7 , 5 0 0 x g f o r 1 0
m i n
a t
4 ° C a n d
w a s
a l i q u o t e d f o r
s t o r a g e
a t - 8 0 ° C .
h G A T A - 3 , a r e A , m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 ) ,
m G A T A - 1 ( N f /
f a r e A ) a n d
m G A T A - 1 ( f a r e A ) p r o t e i n s
d o
n o t f o r m
i n c l u s i o n
b o d i e s i n b a c t e r i a a n d
w e r e
p u r i f i e d i n
a
t o t a l
b a c t e r i a l l y s a t e
a s f o l l o w s : p e l l e t e d
c e l l s
w e r e
r e s u s p e n d e d
i n
l y s i s
b u f f e r
c o n t a i n i n g
25 s u c r o s e ,
0 . 2 mM
EDTA,
4 0 mM
T r i s - C l
( p H
7 . 5 ) ,
a n d 1
mM
D T T . L y s o z y m e , PMSF, a n d
u r e a
w e r e t h e n
a d d e d
a t
f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f
1
m g / m l ,
1 m M ,
a n d
8 M,
r e s p e c t i v e l y .
T h e l y s a t e w a s i n c u b a t e d a t
4 ° C
f o r 1
h , a n d
t h e n
c e n t r i f u g e d a t 7 , 5 0 0
x
g f o r
1
h
a t 4 ° C
t o
r e m o v e
i n s o l u b l e m a t e r i a l .
T h e
s u p e r n a t a n t
w a s
s u b j e c t e d
t o s t e p -
w i s e
d i a l y s i s
a g a i n s t b u f f e r s ( 1 0 mM T r i s - C l
p H
7 . 5 ,
2 5
mM
N a C l ,
1
mM EDTA, 0 . 1 % T r i t o n
X - 1 0 0 , 1 mM
DTT,
1 0 %
g l y c e r o l ,
1 mM
PMSF,
0 . 1
mM
b e n z a m i d i n e , 1 0 , u M Z n S O 4 )
c o n t a i n i n g
6 ,
4 , 2 ,
a n d
0
M u r e a . R e n a t u r e d
p r o t e i n
w a s
c e n t r i f u g e d
a t 7 , 5 0 0
x
g f o r 1 0 m i n
a t
4 ° C a n d a l i q u o t e d f o r
s t o r a g e
a t - 8 0 ° C .
hGATA-2
p r o t e i n u s e d i n a l l
e x p e r i m e n t s ,
a s w e l l a s
mGATA-1
a n d
hGATA-3 p r o t e i n s
e m p l o y e d
f o r a f f i n i t y
m e a s u r e m e n t s ,
was
p u r i f i e d
t o
h o m o g e n e i t y
a s
H i s
f u s i o n
p r o t e i n s . cDNAs w e r e
c l o n e d
i n t o t h e
v e c t o r
p E T l S b
( N o v a g e n ) .
P r o t e i n s
w e r e p u r i f i e d
a s
f o l l o w s . I n d u c e d b a c -
t e r i a l
p e l l e t s
w e r e
r e s u s p e n d e d
i n
b u f f e r A ( 1 0 mM T r i s - C l
[ p H
8 . 0 ] ,
0 . 1 M
N a H 2 P O 4 , 8
M
u r e a ) , p H 8 . 0 .
L y s i s
w a s
c o m p l e t e d
b y
r e p e a t e d
s o n i c a t i o n c y c l e s . I n s o l u b l e m a t e r i a l
w a s
r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n
a t
7 , 5 0 0
x
g
f o r
3 0
m i n .
T h e
c l e a r
l y s a t e
w a s
a p p l i e d
t o
a n i c k e l
c h e l a t e
a f f i n i t y
r e s i n
( Q i a g e n ) ,
a n d
p r o t e i n s
w e r e
e l u t e d
b y
a
p H g r a d i e n t o f
b u f f e r
A . P u r i f i e d p r o t e i n s
w e r e r e n a t u r e d
s l o w l y b y
d i a l y s i s
a g a i n s t
b u f f e r
B
( 5 0 0
mM
N a C l ,
2 0
mM
H E P ES
[ N - 2 -
h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N ' - 2 - e t h a n e s u l f o n i c a c i d ] [ p H 7 . 9 ] -
KOH,
0 . 1 % N o n i d e t P - 4 0 , 0 . 2
mM
EDTA,
1
mM
D T T ,
0 . 5
mM
P M S F )
c o n t a i n i n g
6 , 4 ,
2 ,
1 , a n d
0 M
u r e a .
A l t h o u g h
mGATA-1 a n d
hGATA-2
a r e
e f f i c i e n t l y
r e n a t u r e d
b y
t h i s
p r o c e d u r e ,
hGATA-3 p r e c i p i t a t e d
e v e n i n
t h e
p r e s e n c e
o f
h i g h
a m o u n t s o f
c a r r i e r
p r o t e i n .
T h e r e f o r e ,
w e
r e n a t u r e d
hGATA-3 b y
1 0 0 - f o l d d i l u t i o n
o f t h e d e n a t u r e d
p r o t e i n
i n
r e n a t u r i n g
b u f f e r
c o n t a i n i n g 1 0 % g l y c e r o l ,
0 . 2
mM
EDTA,
4 0
mM
T r i s - C l
( p H 7 . 5 ) ,
1 mM
D T T ,
5 0 mM
N a C l ,
a n d
1 0
p , M
Z n S O 4
s u p p l e m e n t e d
w i t h
0 . 1
mg
o f b o v i n e
s e r u m
a l b u m i n
( B S A )
p e r
m l . R e n a t u r a t i o n was a l l o w e d
t o
p r o c e e d
o v e r n i g h t
a t
4 ° C .
Random b i n d i n g
s i t e
s e l e c t i o n .
T h e
o l i g o n u c l e o t i d e
u s e d
c o n t a i n s 2 0 r a n d o m
n u c l e o t i d e s f l a n k e d
b y
1 4
b a s e s o f
d e f i n e d
s e q u e n c e
o n e i t h e r
s i d e
t o
p e r m i t
PCR
a m p l i f i c a t i o n
a n d
s u b s e q u e n t c l o n i n g
o f
s e l e c t e d
s e q u e n c e s .
D o u b l e -
s t r a n d e d
m o l e c u l e s w e r e
g e n e r a t e d
b y
a n n e a l i n g p r i m e r
1
(AAGCGGCCGCTCGAGGATCC)
a n d
e x t e n s i o n
b y T a q
DNA
p o l y m e r a s e .
T h e d o u b l e - s t r a n d e d
p o o l
was
p u r i f i e d b y
g e l e l e c t r o p h o r e s i s
a n d i n c u b a t e d
w i t h
b a c t e r i a l l y e x p r e s s e d
GATA
p r o t e i n s .
P r o t e i n - D N A
c o m p l e x e s
were
s e p a r a t e d
on
4 ( i n
t h e c a s e
o f mGATA-1
a n d
h G A T A - 3 )
o r 8
( i n
t h e
c a s e o f
a r e A a n d
h G A T A - 2 )
n a t i v e
p o l y a c r y l a m i d e g e l s .
B o u n d
DNA
was
e l u t e d
i n
a
s o l u t i o n o f 0 . 5
M
ammonium
a c e t a t e ,
0 . 1
mM
EDTA,
1 0
mM
m a g n e s i u m a c e t a t e ,
a n d
0 . 1 %
s o d i u m
d o d e c y l
s u l f a t e .
DNA
w a s
a m p l i f i e d b y
PC R
w i t h
p r i m e r s
1
a n d
2
( T G T A A G C T T C C C G G G A A T T C ) .
O n e - f i f t h
o f t h e PCR
r e a c t i o n
m i x t u r e
w a s
u s e d
i n
a s e c o n d
c y c l e
o f
b i n d i n g
a n d
a m p l i f i c a t i o n .
T h e
p r o d u c t
o f t h e
f o u r t h
c y c l e
was
d i g e s t e d
w i t h
X h o I
a n d
H i n d I I I
a n d
c l o n e d
i n t o
p S P 7 3 ( P r o m e g a ) .
I n d i v i d u a l
c l o n e s
were c h o s e n a n d s e -
q u e n c e d
b y
s t a n d a r d
m e t h o d s .
D N A - b i n d i n g
r e a c t i o n s ,
b a n d
s h i f t
a s s a y s ,
a n d
K d
measure-
M O L . C E L L .
B I O L .
7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 3/12
DNA-BINDING
S P E C I F I C I T Y O F GATA
PROTEINS
4 0 0 1
m e n t s .
B i n d i n g
r e a c t i o n s
w e r e
p e r f o r m e d
i n
a
b u f f e r c o n t a i n -
i n g 1 0
mM H E P E S
( p H 7 . 8 ) , 5 0
mM
p o t a s s i u m g l u t a m a t e ,
5
mM M g C l 2 ,
1
mM
EDTA,
1 mM
D T T ,
a n d
5
g l y c e r o l .
T h e
b a c t e r i a l
l y s a t e p r o t e i n
p r e p a r a t i o n s
w e r e m i x e d
i n
2 0 - , u l
r e a c t i o n
m i x t u r e s
i n c l u d i n g 1 , u g
o f
p o l y ( d I - d C ) ( d I - d C )
( P h a r m a c i a )
a n d BSA
a t
a
f i n a l c o n c e n t r a t i o n
o f 0 . 1
m g / m l .
I n c u b a t i o n s
w e r e
p e r f o r m e d
o n i c e f o r
2 0 m i n . R e a c t i o n s
w e r e
a n a l y z e d
o n
0 . 4 x
T r i s - b o r a t e - E D T A
n a t i v e g e l s o f
a c r y l a m i d e
c o n c e n t r a t i o n b e t w e e n
4
a n d
8
( d e p e n d i n g
o n
t h e
s i z e
o f
t h e p r o t e i n s ) .
B i n d i n g
r e a c t i o n s
w i t h
t h e
p u r i f i e d
p r o t e i n s u s e d i n t h e
Kd
d e t e r m i n a t i o n
e x p e r i m e n t s
w e r e
p e r f o r m e d
a n d a n a l y z e d
a s
m e n t i o n e d
a b o v e ,
w i t h t h e e x c e p t i o n s
t h a t n o n o n s p e c i f i c
c o m p e t i t o r
w a s i n c l u d e d
a n d t h e
BSA
c o n c e n t r a t i o n
w a s
r a i s e d t o
1 m g / m l .
T h e d i s s o c i a t i o n
c o n s t a n t ( K d )
d e t e r m i n a t i o n s
w e r e
p e r -
f o r m e d
u n d e r t h e
b i n d i n g a n d
r u n n i n g c o n d i t i o n s
i n d i c a t e d
a b o v e
b y
u s i n g a
c o n s t a n t
a m o u n t
o f
p r o t e i n
a n d
s e r i a l
d i l u t i o n s
o f
o l i g o n u c l e o t i d e
p r o b e s . Q u a n t i t a t i o n
o f
f r e e
a n d
b o u n d
DNA w a s
p e r f o r m e d
w i t h a P h o s p h o r l m a g e r
( M o l e c -
u l a r D y n a m i c s ) .
P l a s m i d
c o n s t r u c t i o n s . P l a s m i d s w e r e
c o n s t r u c t e d b y s t a n -
d a r d
m e t h o d s . E u k a r y o t i c
e x p r e s s i o n
c o n s t r u c t s
f o r
mGATA-1,
m G A T A - l ( f h G A T A - 3 ) ,
a n d
m G A T A - l ( f a r e A )
c o n t a i n
t h e
r e s p e c t i v e
cDNAs
c l o n e d a t
t h e EcoRV s i t e
o f
pCDNA1
( I n v i t r o g e n ) .
R e p o r t e r p l a s m i d s
c o n t a i n i n g
s e -
l e c t e d
o l i g o n u c l e o t i d e s e q u e n c e s
w e r e
g e n e r a t e d
b y
i n s e r t -
i n g o n e c o p y
o f t h e r e s p e c t i v e
o l i g o n u c l e o t i d e
a t
t h e H i n d I I I
s i t e
o f
TATA-GH
( 2 0 ) .
A l l
p l a s m i d
c o n s t r u c t i o n s
w e r e
v e r i f i e d
b y
DNA
s e q u e n c i n g .
T h e m G A T A - l ( f h G A T A - 3 )
c h i m e r i c cDNA
c o n t a i n s
mGATA-1
s e q u e n c e s
c o r r e s p o n d i n g
t o a m i n o
a c i d
r e s i d u e s
1
t o 2 0 1
a n d 3 0 6 t o 4 1 3 .
T h e f i n g e r
d o m a i n s
o f mGATA-1
( r e s i d u e s 2 0 2 t o
3 0 5 )
( 3 7 )
w e r e
r e p l a c e d
b y t h e
c o r r e s p o n d i n g
r e g i o n
o f hGATA-3
( r e s i d u e s
2 6 0 t o
3 6 5 )
( 1 3 ) .
S i m i l a r l y ,
t h e
m G A T A - l ( f a r e A )
c h i m e r a
c o n t a i n s
t h e f i n g e r
o f a r e A ( r e s i -
d u e s
5 0 1
t o
5 6 7 ) ( 1 6 )
i n
p l a c e
o f t h e t w o
f i n g e r s o f mGATA-1.
m G A T A - 1 ( N f / a r e A )
r e t a i n s t h e
a m i n o
f i n g e r
o f
mGATA-1.
I n t h e a r e A f i n g e r
c o n s t r u c t ,
t h e e x p r e s s e d
r e g i o n
i n c l u d e d
a m i n o a c i d s
4 6 7
t o
5 8 7 o f a r e A
( 1 6 ) .
C h i m e r i c c o n s t r u c t s
w e r e
g e n e r a t e d
b y
PC R
a m p l i f i c a t i o n .
C e l l c u l t u r e , t r a n s i e n t
DNA t r a n s f e c t i o n s ,
a n d
h u m a n
g r o w t h
h o r m o n e ( h G H )
a n d
l a c Z
a s s a y s . M o u s e
NIH
3 T 3
c e l l s w e r e g r o w n a n d
t r a n s f e c t e d a s
p r e v i o u s l y
d e s c r i b e d
( 2 0 ) . I n a l l e x p e r i m e n t s ,
t h e
i n p u t
r e p o r t e r
p l a s m i d
w a s 2
, u g .
A c t i v a t o r p l a s m i d
w a s v a r i e d
f r o m
0
t o
1 2
p , g
i n t h e a c t i v a t o r
t i t r a t i o n e x p e r i m e n t s .
V e c t o r
DNA w a s a d d e d
a s
n e c e s s a r y
t o
a c h i e v e a c o n s t a n t
a m o u n t
o f DNA.
As
a n
i n t e r n a l
c o n t r o l
f o r
t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y ,
p C M V , B - l a c Z
p l a s m i d
( 1 9 )
w a s
a d d e d
i n
a l l e x p e r i m e n t s .
Medium f o r g r o w t h
h o r m o n e a s s a y
was r e m o v e d 4 8 t o
6 4 h a f t e r r e m o v a l o f
c a l c i u m
p h o s p h a t e
p r e c i p i t a t e s .
3 - G a l a c t o s i d a s e
a c t i v i t y
w a s
d e t e r m i n e d
a s
p r e v i o u s l y
d e s c r i b e d
( 3 0 ) .
RESULTS
S e l e c t i o n o f D N A - b i n d i n g s i t e s
f o r GATA
f a m i l y
m e m b e r s .
WGATAR
(W
=
A o r T a n d
R
=
A o r
G ) ,
a
m o t i f
c o m m o n l y
f o u n d i n
p r o m o t e r s
a n d e n h a n c e r s
o f
g l o b i n
g e n e s ,
h a s
g e n e r a l l y b e e n
t a k e n
a s
a c o n s e n s u s
s e q u e n c e
f o r b i n d i n g
o f
GATA f a m i l y m e m b e r s ( 1 0 ,
3 8 ) . To
d e f i n e
t h e
s p e c i f i c i t y
o f
t h e s e p r o t e i n s
i n
a n
u n b i a s e d m a n n e r ,
we
u s e d t h e
m e t h o d o f
P C R - m e d i a t e d
r a n d o m o l i g o n u c l e o t i d e
s i t e s e l e c t i o n
( l a ,
3 6 )
( s e e M a t e r i a l s
a n d
M e t h o d s ) . As
p r o t e i n s f o r t h i s a n a l y s i s ,
G A T A - 1 ,
- 2 ,
a n d
- 3 w e r e p r o d u c e d
i n
b a c t e r i a
b y u s i n g t h e
T 7
p o l y m e r a s e
e x p r e s s i o n
s y s t e m
( 3 4 ) ( s e e
M a t e r i a l s
a n d
M e t h o d s ) .
A s
f u l l - l e n g t h GATA-2
w a s
e x c e e d i n g l y
t o x i c t o
E .
c o l i ,
we e x p r e s s e d
a
p o r t i o n
o f
t h e
p r o t e i n
( a m i n o
a c i d s
2 8 4
t o 4 0 6 )
c o n t a i n i n g
t h e
D N A - b i n d i n g d o m a i n
f o r t h e s e
e x p e r i m e n t s .
A c o m p i l a t i o n
o f
s e q u e n c e s s e l e c t e d b y t h e s e
p r o t e i n s i s
p r e s e n t e d i n F i g . 1 .
T h e
s e l e c t e d
m o t i f s
a r e d i v i d e d i n t o
f o u r
g r o u p s a c c o r di n g t o
t h e i r
s i m i l a r i t y t o t h e p r o p o s e d
c o n s e n -
s u s GATA r e c o g n i t i o n
s i t e .
G r o u p s
1
a n d
2 s h a r e
a
GATA
c o r e
w i t h c o n s e n s u s
( g r o u p
1 )
o r
n o n c o n s e n s u s
( g r o u p 2 )
f l a n k i n g n u c l e o t i d e s .
T h o s e
i n g r o u p s 3 a n d 4 d e v i a t e
f r o m
t h e
c o n s e n s u s e i t h e r
w i t h i n t h e c o r e
i t s e l f
( g r o u p 3 ) o r
i n
b o t h t h e c o r e a n d f l a n k i n g
s e q u e n c e s ( g r o u p 4 ) .
A
c o n s e n s u s
s e q u e n c e
d e d u c e d
f o r
t h e
b i n d i n g s i t e o f e a c h p r o t e i n i s
s h o w n
b e l o w
i n F i g . 1 .
From t h e
c o m p i l a t i o n o f s e l e c t e d
s e q u e n c e s ,
s e v e r a l c o n -
c l u s i o n s c a n b e d r a w n . F i r s t , a s u r p r i s i n g f r a c t i o n
o f t h e
s e q u e n c e s
( g r o u p s
3 a n d 4 ) f o r a l l
p r o t e i n s d e v i a t e
f r o m
t h e
p r i o r
p r o p o s e d
c o n s e n s u s s i t e f o r
GATA
p r o t e i n s . I n a l l
i n s t a n c e s ,
a t l e a s t 50
o f
t h e
s e l e c t e d
s e q u e n c e s a r e
w i t h i n
g r o u p s 3
a n d 4 . As
s h o w n b e l o w , t h e s e d o
n o t m e r e l y
r e p r e s e n t l o w - a f f i n i t y
b i n d i n g s i t e s .
S e c o n d ,
m e m b e r s o f t h e
GATA f a m i l y e x h i b i t o v e r l a p p i n g , b u t d i s t i n c t , s p e c i f i c i t i e s ,
a s
w i l l
a l s o
b e
e x p a n d e d
u p o n
b e l o w .
T h i r d ,
a m o n g
t h e
m a m m a l i a n p r o t e i n s , s e q u e n c e s
s e l e c t e d f o r GATA-3 b i n d -
i n g
e x h i b i t
t h e l e a s t
v a r i a t i o n i n
t a r g e t
s i t e s ,
w h e r e a s
m o d e s t
a n d
c o n s i d e r a b l y h i g h e r
v a r i a t i o n i s e v i d e n t f o r t h e b i n d i n g
o f GATA-2
a n d
G A T A - 1 , r e s p e c t i v e l y .
I n
v i t r o b i n d i n g
o f
GATA
p r o t e i n s t o
r a n d o m l y
s e l e c t e d
c l o n e s .
T h o u g h t h e r e l a t i v e
f r e q u e n c i e s o f b a s e s
a t
s p e c i f i c
p o s i t i o n s
i n t h e d e d u c e d c o n s e n s u s s e q u e n c e s
f o r
G A T A - 1 ,
- 2 , a n d - 3
a p p a r e n t l y
v a r y ,
t h e o v e r a l l c o n s e n s u s m o t i f s
a r e
n o t
s u f f i c i e n t l y
d i f f e r e n t
t o d i s t i n g u i s h
t h e GATA f a m i l y
m e m b e r s
o n
t h i s b a s i s i n
a c l e a r c u t m a n n e r . I n p a r t , t h i s
i s
t h e
c a s e b e c a u s e t h e
c o n j o i n e d
f r e q u e n c i e s a t s p e c i f i c p o s i -
t i o n s may
b e
m o r e r e l e v a n t t o
b i n d i n g
a f f i n i t i e s
t h a n t h e
o v e r a l l c o n s e n s u s
s e q u e n c e . T o d e m o n s t r a t e
t h a t t h e s e -
l e c t e d
s e q u e n c e s
a r e
a u t h e n t i c
p r o t e i n
b i n d i n g
s i t e s
a n d
t o
a s c e r t a i n
w h e t h e r
i n d i v i d u a l f a m i l y
m e m b e r s
e x h i b i t
d i s t i n c -
t i v e b i n d i n g
p r o p e r t i e s ,
we u s e d
t h e
e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y
s h i f t
a s s a y (EMSA)
w i t h p r o b e s
d e r i v e d f r o m
t h e s e l e c t e d
s e q u e n c e s . T h e p r o b e s
u s e d ( r e s t r i c t i o n
f r a g m e n t s o f
r e s p e c -
t i v e
c l o n e s ) w e r e r a n d o m l y
c h o s e n f r o m
g r o u p s 1 t o 4
o f
s e q u e n c e s
s e l e c t e d
w i t h GATA-1 a n d GATA-3
p r o t e i n s . T h e
b i n d i n g o f
GATA-1 t o
v a r i o u s
s i t e s i s d i s p l a y e d i n
F i g .
2 A .
A s a n t i c i p a t e d ,
GATA-1
b i n d s t o g r o u p
1 - s e l e c t e d c l o n e s
( e . g . ,
A / G A T A I G
[ l a n e s
5
a n d
6 ] )
w i t h
a n a p p a r e n t
a f f i n i t y
s i m i l a r t o
t h a t
e v i d e n t w i t h a
n a t i v e
A / G A T A / A
s i t e
p r e s e n t
i n t h e e r y t h r o p o i e t i n
r e c e p t o r
( E p o R )
g e n e p r o m o t e r
( 4 2 ) .
H o w e v e r ,
s t r o n g i n t e r a c t i o n s
a r e a l s o
o b s e r v e d w i t h
p r o b e s
b e l o n g i n g
t o g r o u p
2
( C / G A T A / T
[ l a n e s
9
a n d
1 0 ] a n d
C/GATA/G
[ l a n e s 1 1 a n d 1 2 ] ) ;
h e n c e , f l a n k i n g
n u c l e o t i d e s d o
n o t
p l a y a p r e d o m i n a n t
r o l e
i n p r o t e i n
b i n d i n g . DNA s e -
q u e n c e s
o f g r o u p s 3 a n d
4 e x h i b i t e d e i t h e r
s t r o n g
o r weak
b i n d i n g
( T / G A T T / G
[ l a n e s
1
a n d
2 ] , C/GATG/C
[ l a n e s
3
a n d
4 ] ,
T/GATG/G
[ l a n e s
7
a n d
8 ] , a n d
C / G A T T / G
[ l a n e s
1 3
a n d
1 4 ] ) , d e p e n d i n g
o n t h e
s e q u e n c e s
f l a n k i n g
t h e c o r e m o t i f .
F o r e x a m p l e ,
t h e
C/GATG/C
m o t i f
r e p r e s e n t s
a h i g h e r
a f f i n i t y s i t e
t h a n T/GATG/G
( c o m p a r e
l a n e s 3
a n d
4
w i t h
7
a n d
8 ) .
A s s a y s
o f
t h e
s a m e p r o b e s w i t h GATA-3
r e v e a l
a
d i s t i n c t
b i n d i n g p r o f i l e
( F i g . 2 B ) . O n l y
t w o
p r o b e s
( T / G A T T / G
[ l a n e s
1 a n d 2 ]
a n d
A / G A T A / G
[ l a n e s 5
a n d 6 ] )
s h o w h i g h - a f f i n i t y
b i n d i n g . O t h e r s e q u e n c e s
b i n d
p o o r l y ,
i f
a t a l l . N o t e t h a t
t h e
T/GATT/G
p r o b e
b i n d s s t r o n g l y
b u t
d e v i a t e s w i t h i n t h e
GATA
c o r e
f r o m
t h e o r i g i n a l
WGATAR
c o n s e n s u s ,
a s w e l l
a s f r o m
t h e GATA-3
c o n s e n s u s
d e r i v e d
f r o m
r a n d o m s i t e
V O L .
1 3 ,
1 9 9 3
7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 4/12
4 0 0 2 MERIKA
AND
ORKIN
m G A T A - 1
h G A T A - 2
h G A T A - 3
ATAGctogtgcg c g a t c . h .
4w t g c g c g aggagcgc
a g t g c ? C
g g c g g g a q A d A A g c c a t t a
acgggcgg
cacttccccc
t g g g t t g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . g t c c a g g
c o - T 2 A 4 c a a g a c a c a gt g t g c c c g a g g a t g g t
. . . . .
t a 4 & . 0 c g t a c g t c c c c
a t a A b A t M t a c c g g g t g t g
a g g c g g g c j A q . M . .
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g a c g g g t t a t g t b M A * c c
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.............
a c a g a g . 0 0 =
t g a A O A M c a g g g t t g t g c
g g g c . 0 . W '' A ' , a c a c t a t g t g g
g W.
g c a t A 4 A M a g c t a c a t c a
............
.......
g t a t c a a t t c g t g
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d o M a t g c t c c t a c c c a
t g c c a g t a a c g c t
. . . .
g g g t a g .
t A ' 2 W a c a c c g c c
. . . . . . . . . .
.........
lw
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g c g c a 4 d a W
g g t t g A p
& M c a c g a g c c c
c a c c c g c . . .
. . g a g t g c c
t g g g . o
A ' C t t g c c g t t g
t t g c a t A d l M a a g g g t g g
g g c c c a t . A . ' . g c t c a c c c
G M A G c g g t g t c t t g t g t t
gg g c a g t g t a t g c
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c a a t t g c c c
............
g g g c t a c c c a g A r A T A R a c c
g g g g a c g c i b A t t d t t g c c c a c g a a t g l C G a M W t g t g c
. . . . . . . . . . . 9
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T AX g g g g gt c
a g c c t a c a c a g c t c c c . T G A . =
99999
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. . . . . . . . . . . . .
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............
W
T a g g t c t a c a t
g c g a t g g g . T q h
t g c a c c a t c c c g c
. . . . . . . . . . . g
. . . . . . . . . . . . . .
g g g C . X
cctcactttc
egacctaacccgtc
g g g g A P AMt c g c c t g c c
a g c a t c d d M . t a t c g t g c
g g g g t g d A i . g t g t t c c
g g a g g c a c t i
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tgcctagcccataCA TAC
g t a c g c g g g W . . M . . . . G t t g t g
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4 r A 2 W a c a a t g c c c a g t g t
c g g T - O A = . . . . . . t t t g g g t g c c
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g a g t g g g a g c c 2 r A 2 ' G A
t g
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t t g a c t t g t g g t
a t g c a C C A V A g t g t t g g t t a
g g c g t a t g c c a a A g J d = - c c
g g c a a c c t g g c t g 6 V
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g g c t g d d k . t t g c t c c c c t
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c t t g g a t g t d A t A g g t g c g
g g c a a t a C . C A T W ' . g a c g c a c
9
g g t a c c c t g W J I M
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g
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c g t c t t t g T q o g * c t g t t c
c g c c a g g c c g c t i V M ,
' , M c
. . . . .
g a g c t a a A Q A I I M t g c t g c
gagggggaAdTT Uccgttg
g c ; . T Q J . M
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t a c t c a g a c a c g c c A M . T A Q
g c g g t g a T C u M M . g g g t g c c
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t a a c t g g c g t g t c 2 C m A M A
g c a c t c e c a c a c c A 4 A W c
g a g a c c g c c t c g A Q G A S C J L a
a g l G A G A A c c a g c t t g t a g a
A Q & M t a a c g t c a c a g c c c
c t c c t a t a g t g a 4
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' gt gc gat agc
a g g T Q A
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. . . . . . .
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T 6 1 1
16616.6
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G
A T A A / G G
A G j
7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 5/12
DNA-BINDING SPECIFICITY O F GATA
PROTEINS
4 0 0 3
F I G .
1 .
C o m p i l a t i o n
o f
s e q u e n c e s
s e l e c t e d
b y
m G A T A - 1 ,
h G A T A - 2 ,
a n d hGATA-3
p r o t e i n s .
DNA
w a s s e l e c t e d
b y u s i n g
b a c t e r i a l l y
e x p r e s s e d
G A T A - b i n d i n g p r o t e i n s
a n d
a r a n d o m
o l i g o n u c l e o t i d e ,
a s
d e s c r i b e d
i n M a t e r i a l s a n d M e t ho d s . A f t e r
f o u r
r o u n d s
o f
s e l e c t i o n ,
t h e
DNA was
c l o n e d
a n d
a n a l y z e d
b y
DNA
s e q u e n c i n g .
T h e
DNA
s e q u e n c e s
a r e
a l i g n e d
t o
c o n f o r m t o
t h e
p r e v i o u s l y
d e s c r i b e d
consensus
f o r
G A T A - b i n d i n g
s i t e s a n d
g r o u p e d
( g r o u p s
1 t o
4 )
a c c o r d i n g
t o
t h e
c o r e
a n d i m m e di a t e
f l a n k i n g
s e q u e n c e s
( i n
b o l d f a c e ) ( s e e t e x t ) . O n l y t h e
r a n d o m p o r t i o n o f t h e
o l i g o n u c l e o t i d e
s e q u e n c e
i s s h o w n . On t h e
b a s i s o f
t h e
f r e q u e n c y
o f
e a c h
n u c l e o t i d e
a t e a c h
p o s i t i o n ,
a
c o n s e n s u s
s e q u e n c e c a n
b e
d e d u c e d
( b o t t o m )
f o r
e a c h
p r o t e i n ' s
b i n d i n g
s i t e .
T h e
c o m p i l e d
s e q u e n c e s
a r e i n c l u s i v e f o r e a c h
p r o t e i n , i . e . ,
a l l
c l o n e s
t h a t
w e r e
s e q u e n c e d a r e s h o w n .
s e l e c t i o n
( F i g . 1 ) .
From t h e d i r e c t
c o m p a r i s o n
o f
b i n d i n g
a s s a y s
s h o w n i n
F i g .
2A
a n d
B ,
w e c o n c l u d e
t h a t
t h e
p r e c i s e
b i n d i n g
s p e c i f i c i t i e s
o f
GATA-1
a n d
GATA-3
d i f f e r
a n d t h a t
GATA-3
h a s a more r e s t r i c t e d
r a n g e
o f
p o t e n t i a l
b i n d i n g
s i t e s .
As shown i n
F i g . 3 ,
t h e
b i n d i n g
s p e c i f i c i t y
o f
t h e
GATA-2
f i n g e r
d o m a i n
a p p r o x i m a t e s
t h a t o f t h e GATA-1
p r o t e i n
m o r e
c l o s e l y
t h a n
t h a t o f G A T A - 3 .
N o n e t h e l e s s ,
a s r e v e a l e d
b y
a s s a y
w i t h
a p r o b e
c o n t a i n i n g
t h e
T/GATG/G m o t i f ,
t h e
b i n d i n g
s p e c i f i c i t i e s o f GATA-1 a n d GATA-2
c a n
b e d i s t i n -
g u i s h e d
i n
a t
l e a s t
o n e
i n s t a n c e .
I n
t o t a l ,
2 2
d i f f e r e n t
p r o b e s
w e r e
t e s t e d f o r
G A T A - 1 ,
- 2 ,
a n d - 3
b i n d i n g .
R e s u l t s a r e
p r e s e n t e d
i n
T a b l e
1 ,
w i t h
r e l a t i v e
b i n d i n g
a f f i n i t i e s
s c o r e d
a s
-
t o
+ +
+
+
p e r m i t t i n g
c l e a r c u t
d i s c r i m i n a t i o n b e t w e e n GATA-1
a n d
GATA-3
b i n d -
i n g a n d m o r e s u b t l e
d i s t i n c t i o n s b e t w e e n
GATA-1
a n d
GATA-2
b i n d i n g .
To s u b s t a n t i a t e t h e
r e l a t i v e
b i n d i n g d i f f e r e n c e s
s e e n
i n t h e
/ 1 1
0 . 1
1
0 . 1
1 0 . 1 1 0 1 1
0 . 1
1
. 1
1
0 . 1 1
1
mGATA-1 [
W I , 1
F
A
-_
_
-
`
1 2
3
4
5
6
7 8
9
1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5
5 e 5
515 1
5
P l t
1
5
1 5 1 5
1
5
1
5
1 5
1
S
3
hGATA-3
-
B
F -
1 2
345
7
8 1 0 1 1 1 2
3 1 4
1 5
F I G . 2 .
C o m p a r a t i v e
i n
v i t r o b i n d i n g
s t u d i e s
b e t w e e n mGATA-1
a n d
hGATA-3
p r o t e i n s b y
u s i n g d i f f e r e n t r a n d o m l y
s e l e c t e d c l o n e s
a s
p r o b e s .
EMSA
was
p e r f o r m e d
f o r t h e
c o m p l e x e s f o r m e d
b e t w e e n
r a n d o m l y s e l e c t e d
s e q u e n c e s
( r e s t r i c t i o n
f r a g m e n t s
o f
r e s p e c t i v e
c l o n e s )
w i t h t h e
i n d i c a t e d GATA
m o t i f s ( s h o w n o n
t h e t o p
o f
t h e
l a n e s ) a n d
e i t h e r
mGATA-1 ( 0 . 1
a n d
1 p l J ( A )
o r hGATA-3 ( 1
a n d 5
1 l ) ( B )
b a c t e r i a l l y e x p r e s s e d
p r o t e i n s .
As
a
c o n t r o l
p r o b e a n
o l i g o n u c l e o t i d e
f r o m
t h e
e r y t h r o p o i e t i n r e c e p t o r
p r o m o t e r ( Ep o R )
( 4 2 )
i n c l u d i n g
t h e A/GATA/A
m o t i f was u s e d
( l a n e s
1 5 ) .
S p e c i f i c
c o m p l e x e s
a r e
i n d i c a t e d
b y b r a c k e t
( m G A T A - 1 ) o r a r r o w
(hGATA-
3 ) .
F ,
f r e e
p r o b e .
EMSA,
w e
a l s o
d e t e r m i n e d d i s s o c i a t i o n
c o n s t a n t s ( K d s ) f o r
t h e
b i n d i n g
i n t e r a c t i o n s o f
p u r i f i e d b a c t e r i a l l y
e x p r e s s e d
p r o t e i n s
a n d
o l i g o n u c l e o t i d e s
c o r r e s p o n d i n g t o v a r i o u s
n a t -
u r a l
o r
r a n d o m l y s e l e c t e d
s e q u e n c e s
( s e e M a t e r i a l s a n d
M e t h o d s ) . A
r e p r e s e n t a t i v e
s a t u r a t i o n e x p e r i m e n t
f o r
GATA-1 b i n d i n g a n d
t h e
d e r i v e d
S c a t c h a r d
p l o t a r e
s h o w n
i n
F i g .
4 .
K d
m e a s u r e m e n t s
a r e
s u m m a r i z e d i n T a b l e
2 .
T h e s e c l o s e l y
p a r a l l e l t h e r e l a t i v e b i n d i n g
e v i d e n t i n
t h e
EMSA.
H i g h - a f f i n i t y
b i n d i n g
s i t e s
e x h i b i t K d s
o f -10 t o 1 5
n M f o r
G A T A - 1 , - 2 ,
a n d
- 3
p r o t e i n s . As
e x p e c t e d
f r o m t h e
EMSA
r e s u l t s
s h o w n i n
F i g .
2 , q u a n t i t a t i v e d a t a c a n n o t
b e
o b t a i n e d
f o r
t h e i n t e r a c t i o n o f t h e
H i s
f u s i o n
p u r i f i e d
GATA-3
p r o t e i n
a n d t h e
G/GATAIG s i t e ,
r u l i n g
o u t t h e
p o s s i b i l i t y t h a t
t h e
p u r i t y
o f
t h e
GATA-3
p r e p a r a t i o n
i n f l u -
e n c e s
i t s b i n d i n g
s p e c i f i c i t y .
A l s o a s e x p e c t e d ,
m e t h y l a t i o n
i n t e r f e r e n c e
e x p e r i m e n t s
( d a t a n o t
s h o w n )
c o n f i r m e d
t h a t
mGATA-1 m a k e s
s p e c i f i c c o n t a c t s w i t h i n t h e
n o n t y p i c a l
T / G A T T / G
m o t i f .
To e s t a b l i s h
w h e t h e r
t h e
d i f f e r e n t
D N A - b i n d i n g
p r e f e r -
e n c e s
w e i d e n t i f i e d f o r
b a c t e r i a l l y e x p r e s s e d GATA-1
a n d
GATA-3
p r o t e i n s
a r e a l s o
s h a r e d
b y
t h e i r
n a t i v e
c o u n t e r -
p a r t s ,
w e
t e s t e d
o u r
s e l e c t e d
s e q u e n c e s
i n
EMSA w i t h
MEL
c e l l
n u c l e a r e x t r a c t a s a
s o u r c e o f
e n d o g e n o u s
mGATA-1,
MOLT-4
c e l l
n u c l e a r
e x t r a c t ,
a n d
C O S c e l l s
t r a n s f e c t e d w i t h
a hGATA-3
e x p r e s s i o n
v e c t o r
e x t r a c t
a s
a
s o u r c e
o f
hGATA-3. T h e
b i n d i n g s p e c i f i c i t i e s
w e r e i d e n t i c a l
t o t h o s e
o b s e r v e d w i t h
b a c t e r i a l l y e x p r e s s e d p r o t e i n s
( d a t a
n o t
s h o w n ) .
H e n c e ,
t h e d i f f e r e n t
s p e c i f i c i t i e s o f
t h e
GATA
ov, u
,,
G \
yN
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4-
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1
2 3 4
5 6 7 8
9
1 0
1 1 1 2
1 3 1 4
1 5
1 6 1 7
L
GAT
I
GATA-1
h ( ; A T A - 2 h C ( J A T A - 3
F I G . 3 .
E M S A
d e m o n s t r a t i n g
d i f f e r e n t i a l b i n d i n g
s p e c i f i c i t y o f
d i f f e r e n t
G A T A - b i n d i n g
p r o t e i n s f o r s e l e c t i v e
GATA s i t e s .
R a d i o -
l a b e l l e d
p r o b e s
c o n t a i n i n g t h e
i n d i c a t e d
GATA m o t i f s ( t o p
o f
t h e
l a n e s )
w e r e
i n c u b a t e d
w i t h
mGATA-1
( l a n e s
1 t o 5 ) ,
hGATA-2
( l a n e s
6
t o
1 1 )
a n d hGATA-3
( l a n e s 1 2 t o
1 7 ) b a c t e r i a l l y
e x p r e s s e d
p r o t e i n s .
C o m p l e x e s w e r e
a n a l y z e d o n
a n a t i v e
p o l y a c r y l a m i d e
g e l .
S p e c i f i c c o m p l e x e s
a r e i n d i c a t e d
b y b r a c k e t
( m G A T A - 1 ) , f i l l e d
a r r o w
( h G A T A - 3 ) ,
a n d
o p e n
a r r o w
( h G A T A - 2 ) . F , f r e e
p r o b e s .
VOL.
1 3 ,
1 9 9 3
7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 6/12
4 0 0 4
MERIKA
AND ORKIN
TA B L E 1 . D i s c r i m i n a t i o n
i n
D N A - b i n d i n g s p e c i f i c i t i e s
b e t w e e n
d i f f e r e n t
GATA p r o t e i n s a
D N A - b i n d i n g
s p e c i f i c i t y
P r o b e
SitemGT1AA1
m G A T A - 1
h G A T A - 3
( f a r e A )
mGATA1l
C f m G A T A - 1
h G A T A - 2
1
T/GATT/G
+++
++++
+++
++++ + +
+++
2
C/GATG/C
+ ( + )
+l-
-
+
-
+ +
3
A/GATA/G
+++
++
+ ++
ND
+++
++
4
T/GATG/G
+ I -
-
- -
-
+
5 C/GATA/T
++
-
+ + -
++
++
6
C/GATA/G
+ + +
+++
ND +++ +
7
C/GATT/G
+ + ( + )
-
I-
8
A/GTTA/G
+ / -
-
-
9
A / G A T T / G
+++
+-
+++
ND
+++ +++
1 0
G / G A T A / A
+++
-
++
ND
+ ( + )
ND
1 1
A/GAAT/G
-
1 2
T/GATT/A
+++
+++
++
ND
+++
+++
1 3
G/GTTA/G
+++
++ ND
+
+ ( + )
+ +
1 4
G/GATT/T
+
-
+ / -
ND
_
ND
1 5
C/GATC/G
-
-
-
-
-
1 6
G/GATA/G
+++
1 7
C/GATA/C
+++
+++
ND
+++
ND
1 8
C/GATT/C
++
-
+ +
ND
+ / -
ND
1 9
G/GATG/G
+
-
+
ND + / -
ND
2 0
C / G A T T / A
+++ +++
ND ND
2 1 C/GATA/G
ND
ND ND
+++
2 2
A/GATA/A
+++
+++
+++
+++
+++
+++
a
R e s u l t s
a r e s u m m a r i z e d
a f t e r E M S A
w a s
p e r f o r m e d
w i t h
r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s
o f d i f f e r e n t r a n d o m l y
s e l e c t e d
c l o n e s
a s
p r o b e s a n d
b a c t e r i a l l y e x p r e s s e d
G A T A - b i n d i n g p r o t e i n s .
P r o b e 2 2
i s
a n o l i g o n u c l e o t i d e
i n c l u d i n g
t h e
n a t u r a l l y
e x i s t i n g
G A T A - b i n d i n g s i t e ( A / G A T A / A ) f r o m
t h e e r y t h r o p o i e t i n
r e c e p t o r
( E p o R )
p r o m o t e r
( 4 2 ) .
ND,
b i n d i n g
s p e c i f i c i t y
n o t
d e t e r m i n e d ;
- , n o
d e t e c t a b l e
b i n d i n g . D i f f e r e n t
d e g r e e s
o f
b i n d i n g
a r e
i n d i c a t e d a s
+ / -
t o + + + + .
m e m b e r s
a r e i n t r i n s i c
t o
t h e p r o t e i n s
r a t h e r
t h a n t h e c o n s e -
q u e n c e
o f m o d i f i c a t i o n s
i n m a m m a l i a n
c e l l s .
R e s t r i c t e d
b i n d i n g
s p e c i f i c i t y
o f
t h e c a r b o x y
f i n g e r
d o m a i n
o f
G A T A - 1 .
P r e v i o u s
s t u d i e s h a v e
s u g g e s t e d
d i f f e r e n t r o l e s
f o r
t h e t w o - z i n c
f i n g e r
d o m a i n s
o f b o t h mGATA-1
a n d
c G A T A - 1 p r o t e i n s .
S p e c i f i c a l l y ,
t h e
c a r b o x y f i n g e r
i s
s u f f i -
c i e n t f o r
DNA
b i n d i n g , y e t
t h e a m i n o
f i n g e r
c o n t r i b u t e s
t o
t h e
s t a b i l i t y
o f
t h e
p r o t e i n - D N A c o m p l e x
( 2 0 ,
4 1 ) .
U s i n g
o u r
c o l l e c t i o n
o f
s e l e c t e d
s e q u e n c e s ,
w e h a v e
a s k e d
d i r e c t l y
w h e t h e r
t h e b i n d i n g
s p e c i f i c i t y
o f t h e
c a r b o x y
f i n g e r
c a n b e
d i s t i n g u i s h e d
f r o m t h a t
o f
GATA-1 b e a r i n g
t w o
f i n g e r s .
F o r
t h e s e
e x p e r i m e n t s ,
t h e
c a r b o x y
f i n g e r
o f mGATA-1
( a m i n o
a c i d s 2 3 0
t o
3 3 6 )
was
c l o n e d
i n a b a c t e r i a l
e x p r e s s i o n
v e c t o r
( s e e
M a t e r i a l s
a n d M e t h o d s ) .
B a c t e r i a l
l y s a t e s
f o r t h i s
p e p -
t i d e , d e s i g n a t e d
C f m G A T A - 1 ,
w e r e
t e s t e d i n
p a r a l l e l
w i t h
i n t a c t
GATA-1
b y u s i n g
t h e
s e l e c t e d m o t i f s
s h o w n i n T a b l e
1 .
A l t h o u g h
t h e
m a j o r i t y
o f
s e l e c t e d
m o t i f s
b i n d w i t h
c o m -
p a r a b l e
a f f i n i t i e s t o
t h e
t w o
p r o t e i n s ,
t h e r e
a r e s e v e r a l
m o t i f s
( C / G A T G / C ,
G / G A T T / T ,
T / G A T G / G ,
A / G T T A / G ,
G / G A T T
/ T ,
C / G A T T / C ,
a n d
G / G A T G / G )
w h i c h
b i n d
w i t h v a r i o u s
a f f i n i t i e s t o
i n t a c t
GATA-1
b u t f a i l
t o
b i n d t o
t h e
e x p r e s s e d
c a r b o x y
f i n g e r p e p t i d e .
T h e r e f o r e ,
t h e s e
r e s u l t s
d e m o n s t r a t e
t h a t
o n e
r o l e
o f
t h e
a m i n o
f i n g e r
i s
t o
i n c r e a s e
t h e
s p e c t r u m
o f
s e q u e n c e s
r e c o g n i z e d b y
t h e c a r b o x y f i n g e r .
T h u s ,
t h e
t w o - f i n g e r
d o m a i n s
i n t e r a c t
i n
a
c o m p l e x
m a n n e r
i n
b i n d i n g
s i t e r e c o g n i t i o n .
R e s t r i c t e d
b i n d i n g
p o t e n t i a l
o f GATA-3
i s l o c a l i z e d t o
t h e
z i n c f i n g e r
r e g i o n .
A s u b s e t o f
s e l e c t e d
s e q u e n c e s
a r e b o u n d
b y
GATA-1
b u t n o t G A T A - 3 .
To d e t e r m i n e
w h e t h e r
t h i s
d i f f e r e n c e
i n
s p e c i f i c i t y
c a n
b e
a t t r i b u t e d
t o
t h e
z i n c
f i n g e r
d o m a i n s
a n d / o r
o t h e r
p o r t i o n s
o f
t h e
p r o t e i n s ,
w e
c o n -
s t r u c t e d a
c h i m e r i c
m o l e c u l e
i n w h i c h
t h e
tw o z i n c
f i n g e r s
o f
GATA-1
were
r e p l a c e d
w i t h
t h o s e o f
G A T A - 3 .
T h i s
c h i -
m e r a , d e s i g n a t e d
m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 ) ,
was
a s s a y e d
i n
p a r a l l e l
w i t h
i n t a c t GATA-1
a n d
GATA-3
i n EMSA.
As
s h o w n
i n
F i g .
5 , we f i n d t h a t
t h e
z i n c f i n g e r d o m a i n
o f
GATA-3
i s
p r e d o m i n a n t l y
r e s p o n s i b l e
f o r i t s r e s t r i c t e d
b i n d -
i n g s p e c i f i c i t y .
V e r y
l o w b i n d i n g
o f s o m e
p r o b e s
( C / G A T T / G
a n d
C / G A T G / C )
t o t h e c h i m e r a i m p l i e s
a
m i n o r
c o n t r i b u t i o n
o f t h e b o d y
o f
GATA-1
i n d i r e c t i n g o r s t a b i l i z i n g
c o m p l e x
f o r m a t i o n . N o n e t h e l e s s ,
t h i s
f i n g e r
r e p l a c e m e n t
e x p e r i m e n t
d e m o n s t r a t e s
t h a t
t h e b i n d i n g s p e c i f i c i t i e s
o f t h e GATA
p r o t e i n s
a r e d e t e r m i n e d
b y
t h e i r
f i n g e r d o m a i n s , a
r e s u l t
c o n s i s t e n t
w i t h
i n d e p e n de n t e x p e r i m e n t s
w h i c h
d e f i n e
t h i s
r e g i o n
a s
n e c e s s a r y a n d
s u f f i c i e n t f o r
DNA r e c o g n i t i o n ( 2 0 ,
4 1 ) .
T h e b i n d i n g
s p e c i f i c i t y
o f
t h e
a r e A
f i n g e r
c l o s e l y
r e s e m b l e s
t h a t
o f
G A T A - 1 .
T h e
c a r b o x y
f i n g e r
d o m a i n
o f t h e v e r t e b r a t e
GATA
p r o t e i n s
i s
more s i m i l a r
t o t h e
s i n g l e f i n g e r
o f a r e A
t h a n i s t h e a m i n o
d o m a i n
( 1 6 ) .
We h a v e
e x a m i n e d t h e
b i n d i n g p r o p e r t i e s
o f
t h e a r e A
f i n g e r
b y e x p r e s s i n g
t h e f i n g e r
a l o n e o r
a s
c h i m e r a s
w i t h
t h e
b o d y
o f
GATA-1
i n
w h i c h
t h e
a r e A
f i n g e r
r e p l a c e d
o n l y
t h e
c a r b o x y
GATA-1
f i n g e r
[ m G A T A - 1 ( N f / f a r e A ) ]
o r b o t h f i n g e r s [ m G A T A - 1 ( f a r e A ) ] .
By
t h e r a n d o m
s i t e
s e l e c t i o n
m e t h o d , t h e e x p r e s s e d
a r e A
f i n g e r - s e l e c t e d
s e q u e n c e s
r e s e m b l e d
t h o s e r e c o v e r e d
w i t h
t h e
v e r t e b r a t e
p r o t e i n s
( F i g .
6 A ) .
A g a i n ,
a b o u t 5 0
o f
t h e
s e q u e n c e s
w e r e
w i t h i n
g r o u p s
3 a n d 4 .
To s e a r c h
more
d i r e c t l y f o r b i n d i n g
s i t e d i s t i n c t i o n s ,
w e
a s s a y e d
t h e
c h i -
m e r i c
G A T A / a r e A
p r o t e i n s
w i t h i n d i v i d u a l
s e l e c t e d s e -
q u e n c e s .
T h e
b i n d i n g
s p e c i f i c i t i e s
o f
m G A T A - 1 ( N f / a r e A )
a n d m G A T A - 1 ( f a r e A )
w e r e
v i r t u a l l y
i d e n t i c a l
( F i g . 6 B ) .
T h e s e
p r o t e i n s ,
a s i l l u s t r a t e d
b y
m G A T A - l ( f a r e A ) ,
w e r e
m o s t
s i m i l a r t o
i n t a c t G A T A - 1 ,
r a t h e r
t h a n
G A T A - 3 ,
i n t h e i r
b i n d i n g p r o f i l e s
( T a b l e 1 ) .
N o n e t h e l e s s ,
t h e
b i n d i n g
o f
m G A T A - 1 ( f a r e A )
a n d GATA-1
t o
some
t a r g e t
s e q u e n c e s
( e . g . ,
T / G A T G / G , C / G A T G / C ,
a n d
A / G T T A / G )
c o u l d
b e
d i s t i n g u i s h e d .
From t h e s e r e s u l t s
w e
c o n c l u d e
t h a t
( i )
t h e
s i n g l e f i n g e r
o f a r e A
a p p r o x i m a t e s
t h e
s p e c i f i c i t y
o f
t w o -
M O L . C E L L .
B I O L .
7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 7/12
DNA-BINDING SPECIFICITY
O F GATA PROTEINS 4 0 0 5
GGATAG,
mGATA-1
1 . 2
-
1 . 0
-
0 . 8
-
P.-
0 . 6
-
0 . 4 '
0 . 2
-
0
5 0 1 0 0
I n p u t [ n M J
GGATAG,
mGATA-1
0
I L
o
0 . 0 4
-
0 . 0 3
-
0 . 0 2
-
0 . 0
0 . 5
1 . 0
1 . 5
[ B o u n d ]
n M
F I G . 4 . M e a s u r e m e n t
o f
t h e
D N A - b i n d i n g
a f f i n i t y
o f mGATA-1
p r o t e i n
f o r t h e GGATAG
s i t e .
T h e
d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t
( K d )
f o r
t h i s
i n t e r a c t i o n w a s e s t i m a t e d
a s
d e s c r i b e d
i n M a t e r i a l s
a n d M e t h o d s
b y
q u a n t i t a t i n g
EMSA.
T o p
T h e a m o u n t
o f b o u n d
p r o b e
i s
p l o t t e d
a s
a
f u n c t i o n o f t h e
t o t a l
i n p u t .
( B o t t o m )
S c a t c h a r d
p l o t
f o r
t h e
s a t u r a t i o n
c u r v e
s h o w n
i n
t h e
t o p
p a n n e l .
Kd
=
- 1 / s l o p e .
f i n g e r e d
GATA-1
a n d
( i i )
i t m o r e
c l o s e l y
r e s e m b l e s t h a t o f
GATA-1 t h a n G A T A - 3 .
T r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v a t i o n t h r o u g h
n o n c o n s e n s u s GATA
s i t e s
p a r a l l e l s
i n
v i t r o b i n d i n g .
GATA
p r o t e i n s a c t i v a t e
t r a n s c r i p t i o n
u p o n
DNA
b i n d i n g ( 6 ,
9 , 1 3 - 1 5 ,
1 8 ,
2 0 ) .
GATA-1
i s a
p a r t i c u l a r l y s t r o n g
a c t i v a t o r i n
c o t r a n s f e c t i o n
a s s a y s .
I n d i r e c t d a t a
s u g g e s t t h a t ,
a t l e a s t w i t h a s u b s e t o f
b i n d i n g
s i t e s c o n t a i n i n g o v e r l a p p i n g o r d o u b l e
GATA m o -
t i f s ,
t r a n s a c t i v a t i o n
b y GATA-1 ma y d e p e n d
o n t h e p r e c i s e
s e q u e n c e
t o
w h i c h i t
i s
b o u n d ( 2 0 , 4 1 ) . I n
a d d i t i o n , i t
h a s
b e e n
p r o p o s e d
t h a t t h e a m i n o f i n g e r o f cGATA-1
ma y i t s e l f
TA B L E 2 .
D i f f e r e n t i a l
a f f i n i t y
o f G A T A - b i n d i n g
p r o t e i n s f o r
d i f f e r e n t
n a t u r a l l y
e x i s t i n g
o r
r a n d o m l y
s e l e c t e d GATA s i t e s
Kd ( n M ) a
S i t e
GATA-1 GATA-3
GATA-2
C f m G A T A - 1
AGATAA
( E p o R )
1 1
2 5 1 5 3 0
TGATTG 2 9 7 ND ND
GGATAG 5 2
-
ND ND
TGATTA
3 3 8
ND
ND
a
T h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s
( K d s ) w e r e d e t e r m i n e d
a s d e s c r i b e d i n
M a t e -
r i a l s
a n d
M e t h o d s b y q u a n t i t a t i n g
EMSA w i t h
a P h o s p h o r I m a g e r .
ND , n o t
d e t e r m i n e d ; - ,
n o
d e t e c t a b l e
b i n d i n g .
c o n t a i n
a n a c t i v a t i o n
d o m a i n
( 4 1 ) .
W e ,
t h e r e f o r e ,
s o u g h t
t o
d e t e r m i n e
w h e t h e r t r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v a t i o n
b y
GATA-1
a n d
t w o
c h i m e r a s , m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 )
a n d mGATA-
1 ( f a r e A ) , p a r a l l e l e d
t h e i r D N A - b i n d i n g s p e c i f i c i t i e s
o r o t h e r
p r o p e r t i e s o f t h e r e s p e c t i v e
m o l e c u l e s .
T h e u s e o f s u c h
c h i m e r i c
m o l e c u l e s
c o n t r o l s f o r
d i f f e r e n c e s i n
a c t i v a t i o n
p r o p e r t i e s
o f
GATA f a m i l y
m e m b e r s
t h a t
w o u l d
o b s c u r e
d i r e c t
c o m p a r i s o n s .
F o r
e x a m p l e ,
GATA-3
i s a n
a p p r e c i a b l y
w e a k e r
t r a n s a c t i v a t o r
t h a n GATA-1
i n c o t r a n s f e c t i o n
a s s a y s
( 6 , 1 4 ) .
cDNAs
f o r
t h e
r e s p e c t i v e p r o t e i n s
were
e x p r e s s e d
t r a n s i e n t l y i n
NIH
3 T 3
c e l l s
w i t h t h e m a m m a l i a n
e x p r e s s i o n
v e c t o r pCDNA1 ( I n v i t r o g e n ) .
As
r e p o r t e r s ,
w e u s e d
p l a s -
m i d s
b e a r i n g
t h e
h GH
g e n e
d r i v e n
b y
a
m i n i m a l
p r o m o t e r
i n t o
w h i c h
s i n g l e
s e l e c t e d GATA
b i n d i n g
s i t e s
were
c l o n e d
( s e e
M a t e r i a l s a n d
M e t h o d s ) .
As s h o w n
i n F i g .
7 , b y u s i n g s a t u r a t i n g
l e v e l s
o f
e f f e c t o r
p l a s m i d s , we o b s e r v e d
a
s t r i c t
c o r r e l a t i o n
b e t w e e n
i n
v i t r o
DNA
b i n d i n g
a n d
t r a n s a c t i v a t i o n
i n
t h e
c o t r a n s f e c t i o n a s -
s a y .
F o r
e x a m p l e , G A T A - 1 ,
m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 ) ,
a n d
m G A T A - 1 ( f a r e A )
a l l b i n d
T / G A T T / G
a n d
T / G A T T / A
m o t i f s
a n d
a c t i v a t e r e p o r t e r p l a s m i d s b e a r i n g
t h e s e
e l e m e n t s .
T r a n s a c t i v a t i o n b y
t h e
c h i m e r a
w i t h t h e
f i n g e r
d o m a i n o f
GATA-3 i s
r e d u c e d
i n
r e p o r t e r s
b e a r i n g
C / G A T T / A ,
T / G A T G / G ,
C / G A T A I T ,
a n d
G / G A T A / G
m o t i f s .
I n
a g r e e -
m e n t
w i t h o u r
i n
v i t r o b i n d i n g d a t a , o n l y
GATA-1
i t s e l f b i n d s
a n d a c t i v a t e s t r a n s c r i p t i o n t h r o u g h
t h e
T / G A T G / G
m o t i f ;
h o w e v e r ,
i t d o e s
s o
a t
a
l o w l e v e l
c o m p a r e d
w i t h
o t h e r
r e p o r t e r s .
To c o n f i r m
t h e s e
o b s e r v a t i o n s ,
w e h a v e
a l s o
e x a m i n e d
t r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v a t i o n
b y
GATA-1
a n d
m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 )
o n t h r e e
d i f f e r e n t
t a r g e t s
w i t h
a c o n -
s t a n t i n p u t
o f
r e p o r t e r
a n d
v a r i a b l e
a m o u n t s
( 0
t o 1 2
, u g )
o f
e f f e c t o r p l a s m i d
( F i g . 8 ) . A g a i n ,
t r a n s a c t i v a t i o n
d i r e c t l y
p a r a l l e l s
DNA
b i n d i n g
b y
t h e s e a c t i v a t o r s . D i f f e r e n t i a l
p r o -
t e i n a c c u m u l a t i o n
c a n b e
e x c l u d e d a s
a n
e x p l a n a t i o n
f o r t h e
d i f f e r e n c e s b e t w e e n
t r a n s a c t i v a t i o n
b y
mGATA-1 o r
m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 )
p r o t e i n s
t h r o u g h
t h e
G/GATA/G
a n d
C / G A T T / A
s i t e s ,
s i n c e a c t i v a t i o n
b y
t h e t w o e f f e c t o r m o l e -
c u l e s
i s
e q u i v a l e n t
when
a h i g h - a f f i n i t y
b i n d i n g
s i t e
f o r
b o t h
p r o t e i n s i s
i n c l u d e d i n t h e r e p o r t e r c o n s t r u c t ( F i g . 8 , u p p e r
p a n e l ,
Mla-GH
r e p o r t e r ) .
T h u s ,
GATA-1
i s
c a p a b l e
o f
a c t i v a t i n g t r a n s c r i p t i o n t h r o u g h
n o n c o n s e n s u s
b i n d i n g
s i t e s .
I n t h e s e
e x p e r i m e n t s ,
we h a v e n o t
o b s e r v e d a c t i v a t i o n
d i f f e r e n c e s r e f e r a b l e
t o
p r o p e r t i e s
o f
t h e
f i n g e r d o m a i n
u n r e l a t e d t o
DNA
b i n d i n g
p e r
s e .
DISCUSSION
G A T A - b i n d i n g p r o t e i n s
c o n s t i t u t e
a
f a m i l y
o f
t r a n s c r i p -
t i o n f a c t o r s t h a t
r e c o g n i z e
a d i s c r e t e t a r g e t s i t e , h i t h e r t o
c o n f o r m i n g
t o
t h e c o n s e n s u s WGATAR ( 1 0 , 3 8 ) . Members
o f t h i s
f a m i l y
h a v e b e e n f o u n d
i n
f u n g i ,
C .
e l e g a n s ,
D r o -
s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ( 7 a ) ,
b i r d s ,
a m p h i b i a n s ,
a n d
mammals
( f o r
a
r e v i e w ,
s e e
r e f e r e n c e
2 5 ) .
DNA
r e c o g n i t i o n
i s
a c h i e v e d
t h r o u g h
n o v e l z i n c
f i n g e r s
t h a t a r e
p r e s e n t
e i t h e r
o n c e
( a s
i n
a r e A )
( 1 6 )
o r t w i c e
( a s
i n
C . e l e g a n s a n d
v e r t e b r a t e s )
i n
t h e p r o t e i n ( 2 0 , 3 1 , 4 1 ) . I n
m a m m a l s , t h e f o u r
known
m e m b e r s
( G A T A - 1 ,
- 2 ,
- 3 ,
a n d - 4 )
a r e
e x p r e s s e d
i n
d i s t i n c t ,
y e t
o f t e n
o v e r l a p p i n g ,
c e l l t y p e s a n d a r e
r e g u l a t e d
d e v e l o p m e n t a l l y ( f o r a r e v i e w , s e e r e f e r e n c e
2 5 ) . T h o u g h t h e
r o l e s o f t h e s e
p r o t e i n s
i n
v a r i o u s c e l l u l a r p r o g r a m s a r e
s t i l l
u n d e r
a c t i v e s t u d y , a r e q u i r e m e n t f o r GATA-1
i n e r y t h r o i d
d e v e l o p m e n t
h a s
b e e n e s t a b l i s h e d
( 2 6 ) .
F l e x i b i l i t y
o f b i n d i n g s i t e s f o r GATA
f a m i l y
m e m b e r s
r e v e a l e d b y PC R r a n d o m s i t e s e l e c t i o n . I n
t h i s s t u d y ,
we
h a v e
a d d r e s s e d
t h e
D N A - b i n d i n g s p e c i f i c i t i e s
o f
d i f f e r e n t GATA
f a m i l y
p r o t e i n s .
I n
p a r t i c u l a r ,
we
h a v e
u s e d t h e t e c h n i q u e o f
V O L .
1 3 ,
1 9 9 3
7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 8/12
4 0 0 6
MERIKA
AND
ORKIN
d d 0 d 0 d I t ~ ~
G ' 4 K
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I.,
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--
1
2
3 4
5
6
7 8
9 1 0
1 1
1 2 1 3 1 4 1 5
1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1
I L
_
_
I L t
_ _
mGATA-1
( f h G A T A - 3 )
mGATA-1
hGATA-3
F I G .
5 . T h e r e s t r i c t e d
b i n d i n g p o t e n t i a l o f hGATA-3
p r o t e i n
i s
l o c a l i z e d t o t h e
z i n c f i n g e r r e g i o n .
EMSA
was p e r f o r m e d f o r t h e
b i n d i n g
i n t e r a c t i o n s
b e t w e e n
p r o b e s
c o n t a i n i n g
t h e i n d i c a t e d
GATA m o t i f s
( i n d i c a t e d a t
t h e t o p s
o f
t h e
l a n e s ) a n d t h e
c h i m e r i c
m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 )
( l a n e s
1
t o
7 ) , mGATA-1
( l a n e s 8
t o 1 4 ) ,
a n d
hGATA-3
( l a n e s 1 5
t o
2 1 ) b a c t e r i a l l y
e x p r e s s e d
p r o t e i n s . I n t e r a c t i o n s
o f
t h e r e s p e c t i v e p r o t e i n s
w i t h t h e
EpoR
o l i g o n u c l e o t i d e c o n t a i n i n g
t h e A/GATA/A
m o t i f ( 4 2 ) a r e
s h o w n i n l a n e s 1 , 8 ,
a n d
1 5 . T h e b r a c k e t
i n d i c a t e s mGATA-
1 ( f h G A T A - 3 ) -
a n d
m G A T A - 1 - s p e c i f i c
c o m p l e x e s ,
w h e r e a s
t h e a r r o w i n d i c a t e s
hGATA-3
p r o t e i n c o m p l e x e d
w i t h
DNA.
F ,
f r e e p r o b e .
P C R - m e d i a t e d
r a n d o m
b i n d i n g
s i t e
s e l e c t i o n t o
i s o l a t e i n
a n
u n b i a s e d m a n n e r
s e q u e n c e s
b o u n d
b y r e c o m b i n a n t
G A T A - 1 ,
- 2 ,
a n d
- 3 ,
a s w e l l
a s
t h e
f u n g a l p r o t e i n
A r e A .
I n
c o n t r a s t t o
e x p e c t a t i o n s
b a s e d o n
p r e v i o u s
s t u d i e s ,
w e
h a v e
d e t e c t e d d i s t i n c t
p r e f e r e n c e s
i n t h e
b i n d i n g
o f t h e s e
p r o t e i n s
t o
s p e c i f i c
t a r g e t s e q u e n c e s .
S e v e r a l
i n t e r e s t i n g
c o n c l u s i o n s
c a n
b e
d e r i v e d f r o m
t h e s e
r e s u l t s .
A
p r i n c i p a l
f i n d i n g
o f
t h i s
s t u d y
i s t h e
a p p r e c i a b l y g r e a t e r
f l e x i b i l i t y
o f
t h e
r e c o g n i t i o n
s i t e s
f o r t h e s e
p r o t e i n s .
A l -
t h o u g h s e q u e n c e s
c o n s i s t e n t
w i t h t h e
p r i o r
c o n s e n s u s s i t e
a r e
r e p r e s e n t e d
i n
t h e
s e l e c t e d
b i n d i n g
s i t e s , many o t h e r s
t h a t
d e v i a t e
b o t h i n t h e
c o r e
a n d / o r f l a n k i n g
s e q u e n c e s
w e r e
i d e n t i f i e d .
By
EMSA a n d
m e a s u r e m e n t o f
d i s s o c i a t i o n c o n -
s t a n t s
( K d s ) ,
w e h a v e
s h o w n t h a t
many o f t h e
n o n c o n s e n s u s
s e q u e n c e s
b i n d
p r o t e i n
w i t h
a
h i g h
a f f i n i t y e q u i v a l e n t t o
t h a t
o f c o n v e n t i o n a l GATA
m o t i f s .
H e n c e , d e s p i t e t h e
e x t e n t
t o
w h i c h v a r i o u s
e x p e r i m e n t a l
p a r a m e t e r s , p a r t i c u l a r l y
t h e
p r e p a r a t i o n
o f r e c o m b i n a n t
p r o t e i n , t h e r a t i o o f
p r o t e i n t o
I a g g
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( f a r e A ) ( 2 p u )
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F I G .
6 . P r o t e i n - D N A i n t e r a c t i o n s
o f
t h e
a r e A Zn
f i n g e r
d o m a i n .
( A )
C o m p i l a t i o n
o f
t h e
s e q u e n c e s
s e l e c t e d
b y
t h e
b a c t e r i a l l y
e x p r e s s e d
a r e A i f i n g e r
r e g i o n ( 1 6 ) .
S e q u e n c e s
a r e
a l i g n e d
a n d
g r o u p e d
a s d e f i n e d
i n
t h e
l e g e n d
t o
F i g .
1 . T h e d e d u c e d consensus
s e q u e n c e
i s
shown a t
t h e
b o t t o m o f
t h e
p a n e l .
( B ) A n a l y s i s
o f
t h e
D N A - b i n d i n g
i n t e r a c t i o n s o f
m G A T A - 1 / a r e A
c h i m e r i c
p r o t e i n s .
EMSA
was
p e r f o r m e d
w i t h
r e s t r i c t i o n
f r a g m e n t s
o f
d i f f e r e n t
r a n d o m l y
s e l e c t e d c l o n e s a s
p r o b e s
a n d
b a c t e r i a l l y e x p r e s s e d
m G A T A - 1 ( N f / f a r e A )
( l a n e s
4 ,
6 ,
8 , 1 0 , 1 2 ,
a n d
1 4 )
a n d
m G A T A - 1 ( f a r e A )
( l a n e s
3 , 5 ,
7 , 9 ,
1 1 ,
a n d
1 3 )
p r o t e i n s .
T h e
i n t e r a c t i o n s o f
t h e
tw o c h i m e r i c
p r o t e i n s
w i t h
t h e c o n t r o l
E p o R
o l i g o n u c l e o t i d e
a r e
s h o w n
i n l a n e s 1
a n d
2 . T h e d i f f e r e n t
GATA
m o t i f s
i n
e a c h
p r o b e
a r e i n d i c a t e d
o n
t h e
t o p
o f t h e l a n e s . B r a c k e t i n d i c a t e s
s p e c i f i c
p r o t e i n - D N A c o m p l e x e s .
F ,
f r e e
p r o b e .
' a
:. ,
iE .
- . 4 1 -I L . -
MOL.
C E L L .
B I O L .
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4 s :
0 -
l a
m
-
1 1
.:
i,
v
7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 9/12
DNA-BINDING
SPECIFICITY
O F GATA
PROTEINS
4 0 0 7
+ + + T I G A T T / G
+ + +
T / G A T T / A
C / G A T T / A
4 7 . .
T / G A T G / G
+ ( + )
C / G A T A I T
+ + +
G / G A T A / G
Mla
m G A T A - 1
( f a r e A )
m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 )
*
m G A T A - 1
F o l d a c t i v a t i o n
F I G . 7 .
T r a n s a c t i v a t i o n t h r o u g h
n a t u r a l l y e x i s t i n g
a n d
r a n d o m l y
s e l e c t e d
GATA
m o t i f s
b y
d i f f e r e n t
G A T A - b i n d i n g p r o t e i n s .
C o t r a n s f e c -
t i o n
e x p e r i m e n t s
i n NIH
3 T 3 c e l l s
were
p e r f o r m e d
w i t h
r e p o r t e r
p l a s m i d s ( 2 , u g )
c o n t a i n i n g
a
s i n g l e c o p y
o f a n
o l i g o n u c l e o t i d e
i n c l u d i n g
a
g i v e n GATA m o t i f ( s i t e )
c l o n e d
u p s t r e a m
o f a
TATA-hGH
c a s s e t t e
( s e e
M a t e r i a l s
a n d
M e t h o d s )
a n d
1 2
, u g
o f
p c D N A I - d e r i v e d e x p r e s s i o n
v e c t o r s e n c o d i n g
f o r
mGATA-1, m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 ) ,
o r
m G A T A - 1 ( f a r e A ) p r o t e i n s .
A t o t a l o f
1
p g
o f C M V I 3 a c Z
p l a s m i d
was i n c l u d e d
i n
e a c h c a s e t o c o r r e c t f o r
t r a n s f e c t i o n
e f f i c i e n c y .
M l a :
c o n t r o l
r e p o r t e r
c o n s t r u c t d e r i v e d
f r o m
c l o n i n g
o f
a n
o l i g o n u c l e o t i d e
f r o m t h e mouse
a l - g l o b i n
p r o m o t e r
( i n c l u d i n g
a
T / G A T A / A
s i t e )
u p s t r e a m
o f
a
TATA-hGH
c a s s e t t e
( 2 0 ) .
T h e
f o l d
o f
a c t i v a t i o n
i s
g i v e n
r e l a t i v e
t o
t h a t
o f
a
c o n t r o l t r a n s f e c t i o n
p e r f o r m e d
w i t h
e x p r e s s i o n
v e c t o r
a l o n e . I n
v i t r o
b i n d i n g
d a t a
f o r
t h e
r e s p e c t i v e p r o t e i n - D N A
i n t e r a c t i o n s a r e
s u m m a r i z e d
a t
t h e l e f t . D i f f e r e n t
d e g r e e s
o f
b i n d i n g
a r e
s c o r e d
a s
+ / -
t o + + + .
- ,
no
d e t e c t a b l e
b i n d i n g .
i n p u t o l i g o n u c l e o t i d e s
f o r t h e
b i n d i n g
a s s a y ,
o r
t h e
n u m b e r
o f
c y c l e s
o f s e l e c t i o n e m p l o y e d ,
m i g h t
i n f l u e n c e t h e
s p e c -
t r u m
o f
b i n d i n g
s i t e s
o b t a i n e d ,
t h e
v a r i a n t s i t e s w e
h a v e
i d e n t i f i e d
t h r o u g h
t h i s
p r o c e d u r e
a r e b o n a
f i d e , h i g h - a f f i n i t y
i n
v i t r o
t a r g e t s .
I n
f a c t , c h i - s q u a r e a n a l y s i s
o f
i n d i v i d u a l
m o t i f s
s u g g e s t s
t h a t
t h e s e l e c t e d
s e q u e n c e s
w e r e o b t a i n e d
f a r
i n
e x c e s s
( P
<
0 . 0 0 2 i n m o s t
i n s t a n c e s )
o f w h a t w o u l d b e
a n t i c i p a t e d a t r a n d o m .
T h u s ,
t h e
GATA
p r o t e i n s a p p e a r
t o
t o l e r a t e
a g r e a t e r
d e g r e e
o f
f l e x i b i l i t y
i n t h e i r
DNA
t a r g e t s
t h a n w e h a d
p r e v i o u s l y a p p r e c i a t e d .
I n t e r e s t i n g l y ,
o u r
s e l e c t i o n
s c h e m e
i d e n t i f i e d
a
f e w
s i t e s
s e l e c t e d
b y
a
g i v e n
GATA
p r o t e i n
( n o t a b l y ,
G A T A - 3 )
w h i c h
b i n d
p o o r l y
t o
t h e
r e s p e c t i v e p r o t e i n
i n
EMSA.
I n
c o n t r a s t ,
t h e s a m e s i t e s b i n d
m o r e
s t r o n g l y
t o o t h e r GATA
f a m i l y
m e m b e r s . As a n
e x a m p l e ,
t h e
A/GTTA/G
m o t i f
s e l e c t e d
b y
hGATA-3
d o e s n o t
e x h i b i t
d e t e c t a b l e b i n d i n g
w i t h t h i s
p r o t e i n
i n
EMSA. H o w e v e r , u p o n
i n c u b a t i o n w i t h
G A T A - 1 ,
b i n d i n g
i s
d e t e c t e d .
F u r t h e r m o r e ,
when t h e
C / G A T A F T
m o t i f
s e l e c t e d
b y hGATA-3
was
t e s t e d
f o r hGATA-3
o r
m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 )
p r o t e i n b i n d i n g , i t a l s o
a p p e a r e d
t o
r e p r e s e n t
a l o w - a f f i n i t y b i n d i n g
s i t e .
N o n e t h e l e s s ,
e f f i c i e n t
b i n d i n g
was o b t a i n e d w i t h a l l t h e
o t h e r
p r o t e i n s
t e s t e d
( T a b l e
1 ) . T h e s e
o b s e r v a t i o n s s u g g e s t
t h a t DNA
m o t i f s o f t h i s
t y p e
d o n o t
r e p r e s e n t
i r r e l e v a n t
b a c k g r o u n d
o f
t h e
r a n d o m PC R
s i t e
s e l e c t i o n ,
b u t
r a t h e r
l o w - a f f i n i t y s i t e s
r e v e a l e d
b y
r e -
p e a t e d
a m p l i c a t i o n s t e p s .
W h e t h e r s u c h
l o w - a f f i n i t y s i t e s
w o u l d b e
f u n c t i o n a l l y
s i g n i f i c a n t
i n
v i v o
i s
s p e c u l a t i v e .
D i f f e r e n c e s i n
D N A - b i n d i n g
s p e c i f i c i t y
r e s i d e i n t h e
f i n g e r
d o m a i n .
A
n o v e l
f i n d i n g
t o
e m e r g e
f r o m t h e s e
s t u d i e s i s
t h e
s u b t l e
d i f f e r e n c e s i n
b i n d i n g s i t e
s p e c i f i c i t i e s
t h a t
e x i s t
among t h e
f a m i l y
m e m b e r s . I n t h i s
r e g a r d ,
t h e m o r e r e -
s t r i c t e d s p e c i f i c i t y
o f
GATA-3 c o m p a r e d w i t h t h a t o f
GATA-1
i s m o s t i l l u s t r a t i v e .
S o m e w h a t f i n e r d i s t i n c t i o n s
i n
b i n d i n g s p e c i f i c i t i e s
w e r e
a p p a r e n t among GA TA -1,
G A T A - 2 ,
a n d a r e A
p r o t e i n s .
D i f f e r e n t
d e g r e e s
o f
p u r i t y
o f
t h e v a r i o u s
GATA
p r o t e i n p r e p a r a t i o n s c a n n o t a c c o u n t
f o r
t h e s e
o b s e r v a t i o n s ,
a s i n d i v i d u a l
m o t i f s
( s u c h a s
G / G A T A / G )
p e r m i t
a
c l e a r c u t
d i s c r i m i n a t i o n b e t w e e n
mGATA-1
a n d
hGATA-3 p r o t e i n s f r o m c r u d e b a c t e r i a l
e x t r a c t s ,
a s w e l l a s f r o m
p u r i f i e d
m a t e r i a l
( T a b l e 2 ) .
By
r e p l a c e m e n t o f
GATA-1
f i n g e r
w i t h
t h o s e
o f
G A T A - 3 ,
we
h a v e
d e m o n s t r a t e d
t h a t
t h e i r
d i f f e r e n t i a l
s p e c i f i c i t i e s
r e f l e c t
p r o p e r t i e s
o f t h e
r e s p e c t i v e f i n g e r d o m a i n s
r a t h e r
t h a n o t h e r
p o r t i o n s
o f t h e
p r o t e i n s .
A c c o r d i n g l y ,
t h e
s p e c i f i c i t y
w e
h a v e o b s e r v e d
f o r t h e
hGATA-2
f i n g e r r e g i o n
s h o u l d
c l o s e l y
a p p r o x i m a t e
t h a t
o f t h e
n a t i v e
p r o t e i n .
S i n c e
l i m i t e d
a m i n o
a c i d s u b s t i t u t i o n s
i n
t h e
f i n g e r
d o m a i n s
c h a r a c t e r i z e
t h e
v e r t e b r a t e
G A T A - 1 ,
- 2 ,
a n d
- 3
p r o t e i n s ( 4 5 ) ,
w e i n f e r t h a t
s p e c i f i c a m i n o
a c i d
d i f f e r e n c e s
i n
t h e o t h e r w i s e
h i g h l y
c o n -
s e r v e d
f i n g e r s
d i r e c t s u b t l e v a r i a t i o n
i n t a r g e t
s i t e
r e c o g n i -
t i o n
f o r
t h e s e
p r o t e i n s .
O u r
d a t a
f r o m
u s i n g
s e l e c t e d
b i n d i n g
s i t e s
a l s o
p r o v i d e
a d d i t i o n a l
s u p p o r t f o r
t h e i n t e r a c t i o n o f t h e a m i n o
a n d
c a r b o x y f i n g e r
d o m a i n s o f
GATA-1
i n
r e f i n i n g
t h e
b i n d i n g
s i t e
( 2 0 , 4 1 ) .
S p e c i f i c a l l y , we
h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t t h e
b i n d i n g s p e c i f i c i t y
o f t h e
c a r b o x y
f i n g e r
a l o n e
i s
s u b t l y
d i f f e r e n t f r o m t h a t o f
t h e
t w o - f i n g e r e d
p r o t e i n .
A m o r e
r e f i n e d
v i e w
o f ho w p r i m a r y s e q u e n c e
d i f f e r e n c e s
e x e r t
t h e i r e f f e c t s o n
b i n d i n g
s p e c i f i c i t y
w i l l
r e q u i r e
k n o w l -
e d g e
o f t h r ee - d im e n s i o n a l
s t r u c t u r e
o f t h e GATA f i n g e r
d o m a i n s .
S i n g l e - f i n g e r
GATA
p r o t e i n s
b i n d c o n s e n s u s a n d n o n c o n -
s e n s u s GATA
m o t i f s . T h e
a b i l i t y
o f
s i n g l e - f i n g e r
p r o t e i n s
t o
i n t e r a c t
w i t h
a
v a r i e t y
o f
GATA m o t i f s r a i s e s a n i n t e r e s t i n g
q u e s t i o n :
d o
t w o - f i n g e r p r o t e i n s
h a v e
a d v a n t a g e s
o v e r
s i n -
g l e - f i n g e r
p r o t e i n s
i n
DNA
r e c o g n i t i o n
o r
t r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v a t i o n ?
O u r
a n a l y s i s s u g g e s t s t h a t t h e f i n g e r
o f
a r e A
o r
t h e
c a r b o x y
f i n g e r
o f
GATA-1
h a v e
s l i g h t l y
m o r e
r e s t r i c t e d
s e q u e n c e s p e c i f i c i t y c o m p a r e d
w i t h t h o s e o f
s o m e
o f t h e
t w o - f i n g e r p r o t e i n s
e x a m i n e d
( T a b l e 1 ) . One
may
s p e c u l a t e ,
t h e r e f o r e ,
t h a t t h e a d d i t i o n o f
a s e c o n d f i n g e r m i g h t p e r m i t a
w i d e r
r a n g e
o f
D N A - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s ,
a s
m i g h t b e
r e -
q u i r e d
f o r
d e v e l o p m e n t a l
a n d
t i s s u e - s p e c i f i c
r e g u l a t i o n i n
h i g h e r
e u k a r y o t i c o r g a n i s m s .
P o t e n t i a l
i n
v i v o r o l e ( s ) o f n o n c o n s e n s u s GATA s i t e s .
O u r
o b s e r v a t i o n
t h a t
many
v a r i a n t
s e q u e n c e s b i n d t o
GATA
p r o t e i n s
w i t h
h i g h a f f i n i t y
i s
i n t r i g u i n g o n s e v e r a l g r o u n d s .
A m o n g
t a r g e t c i s - r e g u l a t o r y
e l e m e n t s
t h r o u g h w h i c h
t h e s e
V O L .
1 3 ,
1 9 9 3
I n
v i t r g
b i n d i n g
im
+++
+++
+++
7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 10/12
4 0 0 8
MERIKA A ND ORKIN
R e p o r t e r :
Mla-GH
:
/ ~ - U
,
,
.
.
.
I
I
I
.
.
O u g
0 . 5 u g
l u g
2 u g
4 u g
8 u g
1 2 u g
u g
o t t r a n a f e c t e d
a c t i v a t o r
m G A T A - 1
m G A T A - l ( f h G A T A - 3 )
R e p o r t e r : G/GATA/G-GH
m G A T A - 1
m G A T A - 1 ( f h G A T A - 3 )
I
I
I
I
.
I
.
I
O u g 0 . 5
l u g
2 u g
4 u g
8 u g
1 2 u g
u g
o f
t r a n s f e c t e d
a c t i v a t o r
R e p o r t e r :
C / G A T T / A - G H
m G A T A - 1
m G A T A - l ( f h G A T A - 3 )
O ug
o . s u g
1
ug
2 u g
4 u g 8 u g 1 2 u g
ug
o f t r a n s f e c t e d a c t i v a t o r
F I G .
8 . T r a n s a c t i v a t i o n
t h r o u g h
GATA
s i t e s b y i n c r e a s i n g
a m o u n t s
o f d i f f e r e n t GATA-binding p r o t e i n s p a r a l l e l s t h e i r i n
v i t r o
b i n d i n g a f f i n i t i e s . NIH 3T3 c e l l s were
c o t r a n s f e c t e d
w i t h a
c o n s t a n t
a m o u n t ( 2
p . g )
o f t he
r e p o r t e r p l a s m i d i n d i c a t e d
on
t h e
top
o f
e a c h
p a n e l
an d i n c r e a s i n g
a m o u n t s
O t o
1 2
p . g ) o f e x p r e s s i o n
p l a s m i d s
e n c o d i n g
f o r
mGATA-1
o r
mGATA-1(fhGATA-3)
p r o t e i n s .
A
t o t a l
o f 1
p g
o f
p C M V p l a c Z
p l a s m i d was
i n c l u d e d i n a l l cases
t o
c o r r e c t
f o r t r a n s f e c t i o n
e f f i c i e n c y .
Th e f o l d
o f
a c t i v a t i o n
i s g i v e n
r e l a t i v e
t o
t h a t
o f a c o n t r o l t r a n s f e c t i on
p e r f o r m e d
w i t h
e x p r e s s i o n vector
a l o n e .
Th e i n
v i t r o
b i n d i n g d a t a f o r t h e r e s p e c t i v e s i t e s i n c l u d e d
i n
t h e r e p o r t e r s
e x a m i n e d
h e r e
a re
shown
i n F i g . 7 .
p r o t e i n s are t h o u g h t
t o a c t , n e a r l y a l l e x h i b i t s i t e s
t h a t
c o n f o r m t o t h e
p r i o r
consensus
m o t i f .
I n p a r t , one
m i g h t
argue t h a t
t h e
i d e n t i f i c a t i o n
o f
p o t e n t i a l
b i n d i n g m o t i f s
i n
c i s - r e g u l a t o r y elements
has been b i a s e d and t h a t
nonconsen-
sus
s i t e s
h ave b ee n o v e r l o o k e d
i n many s t u d i e s . S e v e r a l
e x a m p l e s o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g n o n c o n s e n s u s
GATA
s i t e s
h a v e b e e n r e p o r t e d , a s i n t h e
3 ' h u m a n 3 - g l o b i n
g e n e
e n h a n c e r ( 3 8 ) a n d h y p e r s e n s i t i v e s i t e
2
o f t h e
, - g l o b i n
l o c u s
c o n t r o l
r e g i o n
( 2 7 ) .
I n
t h e s e i n s t a n c e s ,
m o t i f s d e v i a t i n g
f r o m
t h e WGATAR
c o n s e n s u s w e r e
r e p o r t e d
t o
b i n d
GATA-1
p r o t e i n f r o m
c r u d e
n u c l e a r
e x t r a c t s .
W i t h
t h e m e t h o d
o f
r a n d o m s i t e
s e l e c t i o n , we h a v e
s h o w n
t h a t t h e s e
a l s o
r e p r e -
s e n t a u t h e n t i c
b i n d i n g
s i t e s
f o r
r e c o m b i n a n t
GATA p r o t e i n s .
M o r e o v e r ,
we h a v e c o n f i r m e d t h a t
b a c t e r i a l l y e x p r e s s e d
GATA-1 b i n d s t h e p r o m o t e r o f t h e h u m a n
0 - g l o b i n
g e n e
a t
a n a t y p i c a l
A / G A T T / G
m o t i f
w h i c h o v e r l a p s a
C C A A T
b o x
( 5 ) . A s
s h o w n
i n F i g . 1 , t h i s m o t i f
e m e r g e d
s e v e r a l
t i m e s
f r o m t h e
p o o l
o f o u r s e l e c t e d
s e q u e n c e s .
F i n a l l y ,
a
n a t u r a l l y
o c c u r r i n g
n o n c o n s e n s u s s i t e ( T / G A T J / A )
f o u n d i n t h e h u -
man a - g l o b i n
l o c u s
c o n t r o l r e g i o n
e x h i b i t s a
s t r o n g
i n
v i v o
d i m e t h y l s u l f a t e f o o t p r i n t
a n d f l a n k s a
r e g i o n o f
s t r o n g
h y p e r s e n s i t i v i t y i n e r y t h r o i d c h r o m a t i n ( 3 3 ) . T h i s
s i t e
h a s
b e e n
s e l e c t e d
a n d a l s o
s h o w n t o b e
a
h i g h - a f f i n i t y
b i n d i n g
s i t e
f o r r e c o m b i n a n t
GATA
p r o t e i n s . A s a
c o n s e q u e n c e
o f
o u r e x p e r i m e n t s , i t
may
b e
n e c e s s a r y t o
c o n s i d e r
m o r e
b r o a d l y
w h e r e
GATA p r o t e i n s
m i g h t a c t
w i t h i n
d e f i n e d
p r o m o t e r s
o r e n h a n c e r s .
We
c a n
o n l y
s p e c u l a t e
a t t h i s
t i m e
a s
t o
w h e t h e r
t h e
u s e o f
s u c h
n o n c o n s e n s u s
b i n d i n g
s i t e s
i s
l i m i t e d
t o
a
s u b s e t
o f c i s e l e m e n t s , p e r h a p s
t h o s e
w i t h
s p e c i a l
f u n c t i o n a l
a c t i v i t y .
T h e
f i n d i n g t h a t m e m b e r s
o f
t h e GATA f a m i l y
e x h i b i t
o v e r l a p p i n g ,
b u t d i s t i n c t , s e q u e n c e
s p e c i f i c i t i e s i s
n o t a
u n i q u e p r o p e r t y o f t h i s
c l a s s o f t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r s .
Mem-
b e r s
o f
t h e e t s , r e l , h o m e o d o m a i n , a n d
SR F
f a m i l i e s
a l s o
d i s p l a y
common a n d
d i s t i n c t s e q u e n c e
r e q u i r e m e n t s
( 7 ,
1 7 ,
2 4 ,
2 8 ) .
A
q u e s t i o n
f o r
f u r t h e r s t u d y
i s t h e
e x t e n t
t o
w h i c h
t h e d i f f e r e n c e s
i n
b i n d i n g s p e c i f i c i t i e s
d e m o n s t r a t e d
h e r e
f o r
t h e m a m m a l i a n
GATA
p r o t e i n s
i n f l u e n c e
t h e
s p e c t r u m
o f
p o t e n t i a l t a r g e t g e n e s i n v i v o .
I n
c e l l s
i n
w h i c h
m e m b e r s
o f
t h e f a m i l y a r e c o e x p r e s s e d, d o b i n d i n g
d i f f e r e n c e s
c o n t r i b -
u t e
t o
t h e
s e l e c t i o n
o f g e n e s
o n
w h i c h
e a c h a c t s ?
I n
e f f e c t ,
s e l e c t i o n
o f t a r g e t s b y
t h i s m e c h a n i s m
w o u l d
r e d u c e
a p p a r -
e n t
r e d u n d a n c y
o f
D N A - b i n d i n g
f a c t o r s .
A l t e r n a t i v e l y ,
i f
t h e
m a j o r i t y o f c r i t i c a l b i n d i n g s i t e s
c o n f o r m
t o
s e q u e n c e s
r e c o g n i z e d
b y
s e v e r a l
f a m i l y m e m b e r s ,
s e l e c t i v e
b i n d i n g
w o u l d p l a y
l i t t l e r o l e i n c h o o s i n g w h i c h
p r o t e i n
p a r t i c i p a t e s
i n
t r a n s c r i p t i o n a l
r e g u l a t i o n
o f p o t e n t i a l
t a r g e t s .
I n v i v o ,
many p a r a m e t e r s a r e
i m p o r t a n t
i n
d e f i n i n g
t h e
f u n c t i o n a l
r o l e
( i f
a n y )
o f
a g i v e n t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r
b i n d i n g
s i t e ,
p a r t i c u l a r l y
s i n c e
s u c h s h o r t
r e c o g n i t i o n
s e q u e n c e s ( g e n e r -
a l l y o n t h e
o r d e r
o f
6
t o 8 b p ) a r e
r e p r e s e n t e d f a r
t o o
f r e q u e n t l y
i n g e n o m i c DNA. H e n c e , t h e
c o n t e x t
i n
w h i c h a
p o t e n t i a l b i n d i n g s i t e i s e m b e d d e d ,
l o c a l
c h r o m a t i n s t r u c -
t u r e , a n d p o s s i b l e s y n e r g i s t i c
i n t e r a c t i o n s
w i t h
o t h e r
t r a n -
s c r i p t i o n
f a c t o r s
r e c o g n i z i n g n e i g h b o r i n g
s i t e s
may b e
t h e
p r i m a r y
d e t e r m i n a n t s o f
t r a n s c r i p t i o n a l o u t c o m e .
S p e c i f i c
i n
v i v o e x p e r i m e n t s w i l l b e
r e q u i r e d
t o
a d d r e s s
t h e s e
i m p o r t a n t
b i o l o g i c a l
i s s u e s .
ACKNOWLEDGMENTS
We t h a n k
D a v i d W i l s o n
a n d
N a n c y
A n d r e w s f o r
n u c l e a r
e x t r a c t s ,
H e r b
A r s t
f o r
t h e a r e A c l o n e ,
a n d
E l l i s
N e u f e l d f o r
a s s i s t a n c e i n
s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e s e l e c t e d
s e q u e n c e s .
T h i s
w o r k w a s
s u p p o r t e d
i n p a r t
b y
a
g r a n t
f r o m
t h e NIH t o
S . H . O . , w h o i s a n
I n v e s t i g a t o r o f
t h e
H o w a r d H u g h e s
M e d i c a l
I n s t i t u t e .
R E F E R E N C E S
1 . A r c e c i ,
R .
J . , A . A .
J . K i n g , M . C .
S i m o n ,
S . H .
O r k i n ,
a n d D .
B .
W i l s o n . 1 9 9 3 .
M o u s e
G A T A - 4 :
a
r e t i n o i c
a c i d - i n d u c i b l e GATA-
b i n d i n g t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r e x p r e s s e d
i n
e n d o d e r m a l l y
d e r i v e d
t i s s u e s
a n d
h e a r t . M o l . C e l l . B i o l .
1 3 : 2 2 3 5 - 2 2 4 6 .
3 0
-
2 0
1 0
c
0
a
L L
0 -
2 0
c
0
a
1 0
U
L0
U .
0
3 0
C B
9
2 0
: 0
1 0
I L
M O L .
C E L L .
B I O L .
I 2 0
7/21/2019 DNA-Binding Specificity of GATA Family
http://slidepdf.com/reader/full/dna-binding-specificity-of-gata-family 11/12
DNA-BINDING
S P E C I F I C I T Y O F GATA
PROTEINS
4 0 0 9
l a . B l a c k w e l l ,
T . K . ,
a n d H . W e i n t r a u b.
1 9 9 0 .
D i f f e r e n c e s a n d
s i m i l a r i t i e s
i n
D N A - b i n d i n g p r e f e r e n c e s
o f
M y o D
a n d
E 2A
p r o t e i n
c o m p l e x e s
r e v e a l e d
b y b i n d i n g
s i t e s e l e c t i o n . S c i e n c e
2 5 0 : 1 1 0 5 - 1 1 1 0 .
2 .
C h e n ,
C .
A . ,
a n d
H .
O k a y a m a .
1 9 8 8 .
C a l c i u m
p h o s p h a t e -
m e d i a t e d
g e n e
t r a n s f e r :
a h i g h l y
e f f i c i e n t
t r a n s f e c t i o n s y s t e m
f o r
s t a b l y
t r a n s f o r m i n g
c e l l s
w i t h
p l a s m i d
DNA.
B i o T e c h n i q u e s
6 : 6 3 2 - 6 3 8 .
3 .
C r o t t a ,
S . ,
S .
N i c o l i s ,
A .
R o n c h i ,
S .
O t t o l e n g h i ,
L .
R u z z i ,
Y .
S h i m a d a ,
A .
R .
M i g l i a c c i o ,
a n d G .
M i g l i a c c i o .
1 9 9 0 .
P r o g r e s s i v e
i n a c t i v a t i o n
o f t h e
e x p r e s s i o n
o f a n e r y t h r o i d
t r a n s c r i p t i o n a l
f a c t o r
i n
GM-
a n d
G - C S F - d e p e n d e n t
m y e l o i d
c e l l l i n e s .
N u c l e i c
A c i d s R e s . 1 8 : 6 8 6 3 - 6 8 6 9 .
4 .
C u n n i n g h a m ,
T .
S . ,
a n d
T . G . C o o p e r .
1 9 9 1 .
E x p r e s s i o n o f t h e
DAL80
g e n e ,
w h o s e
p r o d u c t i s
h o m o l o g o u s
t o
t h e GATA
f a c t o r s
a n d
i s
a
n e g a t i v e
r e g u l a t o r o f
m u l t i p l e n i t r o g e n c a t a b o l i c
g e n e s
i n
S a c c h a r o m y c e s
c e r e v i s i a e , i s s e n s i t i v e
t o
n i t r o g e n
c a t a b o l i t e
r e p r e s s i o n .
M o l .
C e l l .
B i o l . 1 1 : 6 2 0 5 - 6 2 1 5 .
5 .
d e B o e r , E . ,
M.
A n t o n i o u ,
V .
M i g n o t t e ,
L .
W a l l ,
a n d F .
G r o s v e l d .
1 9 8 8 . T h e h u m a n
, B - g l o b i n
p r o m o t e r :
n u c l e a r
p r o t e i n f a c t o r s
a n d
e r y t h r o i d
s p e c i f i c
i n d u c t i o n
o f
t r a n s c r i p t i o n . EMBO J .
7 : 4 2 0 3 -
4 2 1 2 .
6 .
D o r f m a n ,
D .
M . ,
D . B . W i l s o n , G . A .
P .
B r u n s ,
a n d
S . H .
O r l d n .
1 9 9 2 . Human
t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r
G A T A - 2 .
J .
B i o l .
C h e m .
2 6 7 : 1 2 7 9 - 1 2 8 5 .
7 .
E k k e r ,
S .
C . ,
K . E . Y o u n g , D .
P . v o n K e s s l e r ,
a n d
P . A .
B e a c h y .
1 9 9 1 .
O p t i m a l
DNA
s e q u e n c e
r e c o g n i t i o n
b y t h e U l t r a b i t h o r a x
h o m e o d o m a i n
o f
D r o s o p h i l a .
EMBO J .
1 0 : 1 1 7 9 - 1 1 8 6 .
7 a . E n g e l , J .
D . ,
a n d S . - F . T s a i . P e r s o n a l
c o m m u n i c a t i o n .
8 .
E v a n s ,
T . ,
a n d G .
F e l s e n f e l d .
1 9 8 9 .
T h e e r y t h r o i d - s p e c i f i c t r a n -
s c r i p t i o n
f a c t o r
E r y f l :
a new
f i n g e r
p r o t e i n .
C e l l 5 8 : 8 7 7 - 8 8 5 .
9 .
E v a n s , T . ,
a n d
G .
F e l s e n f e l d .
1 9 9 1 . t r a n s - a c t i v a t i o n
o f
a
g l o b i n
p r o m o t e r
i n
n o n e r y t h r o i d
c e l l s .
M o l . C e l l . B i o l .
1 1 : 8 4 3 - 8 5 3 .
1 0 .
E v a n s ,
T . ,
M.
R e i t m a n ,
a n d
G .
F e l s e n f e l d .
1 9 8 8 . An
e r y t h r o c y t e -
s p e c i f i c
D N A - b i n d i n g
f a c t o r r e c o g n i z e s
a r e g u l a t o r y s e q u e n c e
c o m m o n t o a l l c h i c k e n
g l o b i n
g e n e s .
P r o c . N a t l .
A c a d .
S c i .
U SA
8 5 : 5 9 7 6 - 5 9 8 0 .
1 1 .
F u , Y . - H . ,
a n d G . A .
M a r z l u f .
1 9 9 0 .
n i t - 2 , t h e
m a j o r n i t r o g e n
r e g u l a t o r y
g e n e
o f
N e u r o s p o r a c r a s s a ,
e n c o d e s a
p r o t e i n w i t h a
p u t a t i v e
z i n c
f i n g e r
D N A - b i n d i n g d o m a i n .
M o l . C e l l . B i o l .
1 0 : 1 0 5 6 - 1 0 6 5 .
1 2 .
F u ,
Y . - H . ,
a n d
G .
A .
M a r z l u f .
1 9 9 0 .
n i t - 2 ,
t h e
m a j o r
p o s i t i v e -
a c t i n g
n i t r o g e n r e g u l a t o r y
g e n e o f N e u r o s p o r a
c r a s s a ,
e n c o d e s
a
s e q u e n c e - s p e c i f i c
D N A - b i n d i n g p r o t e i n .
P r o c .
N a t l .
A c a d .
S c i .
U SA
8 7 : 5 3 3 1 - 5 3 3 5 .
1 3 .
H o ,
I . - C . ,
P .
V o r h e e s ,
N . M a r i n ,
B . K . O a k l e y , S . - F .
T s a i ,
S .
H .
O r k i n ,
a n d
J .
M.
L e i d e n . 1 9 9 1 .
H u m a n G A T A - 3 :
a
l i n e a g e -
r e s t r i c t e d
t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r
t h a t
r e g u l a t e s t h e
e x p r e s s i o n o f
t h e T c e l l
r e c e p t o r
a
g e n e . EMBO
J . 1 0 : 1 1 8 7 - 1 1 9 2 .
1 4 .
J o u l i n , V . ,
D .
B o r i e s ,
J . - F . E l e o u e t ,
M . - C . L a b a s t i e ,
S .
C h r e t i e n ,
M . - G .
M a t t e i ,
a n d
P . - H . R o m e o .
1 9 9 1 . A
T - c e l l s p e c i f i c
TC R 8
b i n d i n g p r o t e i n
i s a member
o f
t h e human
GATA f a m i l y .
EMBO
J . 1 0 : 1 8 0 9 - 1 8 1 6 .
1 5 .
K o ,
L .
J . ,
M.
Y a m a m o t o ,
M. W. L e o n a r d ,
K . M .
G e o r g e , P .
T i n g ,
a n d
J .
D .
E n g e l .
1 9 9 1 . M u r i n e
a n d human
T - l y m p h o c y t e
GATA-3
f a c t o r s
m e d i a t e t r a n s c r i p t i o n
t h r o u g h a
c i s - r e g u l a t o r y
e l e m e n t w i t h i n
t h e
human T - c e l l
r e c e p t o r
8
g e n e
e n h a n c e r . M o l .
C e l l . B i o l .
1 1 : 2 7 7 8 - 2 7 8 4 .
1 6 .
K u d l a ,
B . ,
M.
X . C a d d i c k ,
T .
L a n g d o n ,
N .
M .
M a r t i n e z - R o s s i ,
C . F .
B e n n e t t ,
S .
S i b l e y ,
R . W. D a v i e s ,
a n d
H . N .
A r s t ,
J r . 1 9 9 0 .
T h e
r e g u l a t o r y g e n e
a r e A
m e d i a t i n g
n i t r o g e n
m e t a b o l i t e
r e p r e s -
s i o n i n
A s p e r g i l l u s
n i d u l a n s .
M u t a t i o n s
a f f e c t i n g
s p e c i f i c i t y
o f
g e n e
a c t i v a t i o n
a l t e r a
l o o p
r e s i d u e
o f
a
p u t a t i v e
z i n c f i n g e r .
EMBO
J .
9 : 1 3 5 5 - 1 3 6 4 .
1 7 .
K u n s c h ,
C . ,
S . M.
R u b e n ,
a n d
C .
A . R o s e n .
1 9 9 2 .
S e l e c t i o n
o f
o p t i m a l
K B / R e l
D N A - b i n d i n g
m o t i f s :
i n t e r a c t i o n o f b o t h
s u b -
u n i t s o f
NF-KB
w i t h DNA i s
r e q u i r e d f o r
t r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v a -
t i o n . M o l .
C e l l . B i o l . 1 2 : 4 4 1 2 - 4 4 2 1 .
1 8 .
L e e ,
M . - E . ,
D .
H .
T e m i z e r , J . A .
C l i f f o r d ,
a n d T .
Q u e r t e r m o u s .
1 9 9 1 .
C l o n i n g o f
t h e
G A T A - b i n d i n g
p r o t e i n
t h a t
r e g u l a t e s
e n d o -
t h e l i n - 1
g e n e
e x p r e s s i o n
i n
e n d o t h e l i a l
c e l l s .
J . B i o l .
Chem.
2 6 6 : 1 6 1 8 8 - 1 6 1 9 2 .
1 9 .
M a c G r e g o r ,
G .
R . , a n d C . T . C a s k e y .
1 9 8 9 . C o n s t r u c t i o n
o f
p l a s m i d s
t h a t
e x p r e s s
E . c o l i b e t a
g a l a c t o s i d a s e
i n
m a m m a l i a n
c e l l s . N u c l e i c A c i d s
R e s .
1 7 : 2 3 6 5 .
2 0 .
M a r t i n , D .
I .
K . ,
a n d
S .
H .
O r k i n .
1 9 9 0 .
T r a n s c r i p t i o n a l
a c t i v a t i o n
a n d
DNA
b i n d i n g
b y
t h e
e r y t h r o i d
f a c t o r G F - 1 / N F -
E l / E r y f l .
G e n e s D e v . 4 : 1 8 8 6 - 1 8 9 8 .
2 1 .
M a r t i n ,
D . I .
K . ,
S . - F .
T s a i ,
a n d S . H .
O r k i n .
1 9 8 9 . I n c r e a s e d
- y - g l o b i n
e x p r e s s i o n
i n
a n o n d e l e t i o n HPFH m e d i a t e d
b y
a n
e r y t h r o i d - s p e c i f i c
D N A - b i n d i n g
f a c t o r . N a t u r e
( L o n d o n )
3 3 8 :
4 3 5 - 4 3 8 .
2 2 . M a r t i n , D .
I .
K . ,
L . I .
Z o n ,
G .
M u t t e r ,
a n d
S . H . O r k i n .
1 9 9 0 .
E x p r e s s i o n
o f
a n
e r y t h r o i d t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r i n
m e g a k a r y o -
c y t i c
a n d m a s t c e l l l i n e a g e s . N a t u r e
( L o n d o n ) 3 4 4 : 4 4 4 4 4 7 .
2 3 . M i n e h a r t , P . L . , a n d
B .
M a g a s a n i k . 1 9 9 1 .
S e q u e n c e
a n d
e x p r e s -
s i o n
o f
G L N 3 ,
a p o s i t i v e
n i t r o g e n r e g u l a t o r y
g e n e
o f
S a c c h a r o -
m y c e s
c e r e v i s i a e
e n c o d i n g
a
p r o t e i n
w i t h a
p u t a t i v e
z i n c
f i n g e r
D N A - b i n d i n g
d om a i n . M o l .
C e l l . B i o l . 1 1 : 6 2 1 6 - 6 2 2 8 .
2 4 .
N y e ,
J . A . ,
J .
M . P e t e r s e n , C . V .
G u n t h e r , M.
D .
J o n s e n ,
a n d
B .
J .
G r a v e s .
1 9 9 2 .
I n t e r a c t i o n
o f m u r i n e
E t s - 1
w i t h
GGA-
b i n d i n g
s i t e s
e s t a b l i s h e s
t h e ETS d o m a i n
a s a
new D N A - b i n d i n g
m o t i f . G e n e s D e v .
6 : 9 7 5 - 9 9 0 .
2 5 . O r k i n ,
S . H . 1 9 9 2 .
G A T A - b i n d i n g
t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r s
i n
h e -
m a t o p o i e t i c c e l l s .
B l o o d
8 0 : 5 7 5 - 5 8 1 .
2 6 . P e v n y , L . , M . C . S i m o n ,
E .
R o b e r t s o n , W. H . K l e i n , S . - F .
T s a i ,
V .
D ' A g a t i ,
S .
H .
O r k i n ,
a n d F . C o s t a n t i n i . 1 9 9 1 .
E r y t h r o i d
d i f f e r e n t i a t i o n i n
c h i m a e r i c
m i c e
b l o c k e d
b y
a
t a r g e t e d m u t a t i o n
i n
t h e g e n e f o r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r G A T A - 1 . N a t u r e
( L o n d o n )
3 4 9 : 2 5 7 - 2 6 0 .
2 7 .
P h i l i p s e n ,
S . , D . T a l b o t , P . F r a s e r , a n d F .
G r o s v e l d . 1 9 9 0 .
T h e
3 - g l o b i n
d o m i n a n t
c o n t r o l
r e g i o n :
h y p e r s e n s i t i v e
s i t e 2 .
EMBO
J .
9 : 2 1 5 9 - 2 1 6 7 .
2 8 .
P o l l o c k ,
R . , a n d R .
T r e i s m a n .
1 9 9 1 .
Human S R F - r e l a t e d
p r o -
t e i n s :
D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s
a n d
p o t e n t i a l
r e g u l a t o r y
t a r g e t s .
G e n e s
D e v .
5 : 2 3 2 7 - 2 3 4 1 .
2 9 . R o m e o ,
P . - H . , M . - H .
P r a n d i n i ,
V . J o u l i n , V . M i g n o t t e ,
M .
P r e n a n t , W.
V a i n c h e n k e r , G . M a r gu e r i e , a n d G . U z a n .
1 9 9 0 .
M e g a c a r y o c y t i c
a n d e r y t h r o c y t i c l i n e a g e s
s h a r e s p e c i f i c
t r a n -
s c r i p t i o n
f a c t o r s . N a t ur e ( Lo n d o n )
2 4 4 : 4 4 7 - 4 4 9 .
3 0 .
S a m b r o o k ,
J . ,
E . F . F r i t s c h , a n d T .
M a n i a t i s .
1 9 8 9 .
M o l e c u l a r
c l o n i n g :
a
l a b o r a t o r y
m a n u a l , 2 n d e d . C o l d
S p r i n g H a r b o r
L a b o r a t o r y P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r ,
N . Y .
3 1 . S p i e t h , J . , Y . - H . S h i m , K .
L e a ,
R .
C o n r a d ,
a n d T .
B l u m e n t h a l .
1 9 9 1 .
e l t - 1 ,
a n
e m b r y o n i c a l l y e x p r e s s e d C a e n o r h a b di t i s
e l e g a n s
g e n e h o m o l o g o u s t o t h e GATA t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r f a m i l y .
M o l .
C e l l .
B i o l .
1 1 : 4 6 5 1 - 4 6 5 9 .
3 2 . S p o s i ,
N .
M . , L . I . Z o n ,
A . C a r e , M.
V a l t i e r i ,
U . T e s t a ,
M.
G a b b i a n e l l i , G . M a n a n i ,
L .
B o t t e r o ,
C .
M a t h e r ,
S . H .
O r k i n ,
a n d C .
P e s c h l e . 1 9 9 2 .
C e l l c y c l e - d e p e n d e n t
i n i t i a t i o n a n d
l i n -
e a g e - d e p e n d e n t a b r o ga t i on o f GATA-1
e x p r e s s i o n
i n p u r e
d i f -
f e r e n t i a t i n g h e m a t o p o i e t i c p r o g e n i t o r s .
P r o c . N a t l . A c a d .
S c i .
U SA
8 9 : 6 3 5 3 - 6 3 5 7 .
3 3 . S t r a u s s , E . C . ,
N . C . A n d r e w s , D . R .
H i g g s ,
a n d
S .
H .
O r k i n .
1 9 9 2 . I n v i v o f o o t p r i n t i n g
o f t h e
human
a - gl o b in l o c u s
u p s t r e a m
r e g u l a t o r y e l e m e n t b y g u a n i n e
a n d a d e n i n e
l i g a t i o n - m e d i a t e d
p o l y m e r a s e
r e a c t i o n . M o l .
C e l l .
B i o l .
1 2 : 2 1 3 5 - 2 1 4 2 .
3 4 .
S t u d i e r ,
F . W . , a n d B . M o f f a t . 1 9 8 6 .
U s e
o f
b a c t e r i o p h a g e
T 7
p o l y m e r a s e
t o d i r e c t s e l e c t i v e
h i g h l e v e l e x p r e s s i o n o f
c l o n e d
g e n e s . J . M o l . B i o l .
1 8 9 : 1 1 3 - 1 3 0 .
3 5 .
S t u d i e r ,
F . W . ,
A .
H . R o s e n b e r g ,
J . J .
D u n n ,
a n d
J . W.
D u b e n d o r f f .
1 9 9 0 .
U s e
o f
T 7
RNA p o l y m e r a s e
t o d i r e c t
e x p r e s -
s i o n o f
c l o n e d g e n e s . M e t h o d s
E n z y m o l .
1 8 5 : 6 0 - 8 9 .
3 6 .
S u n ,
X . - H . , a n d
D .
B a l t i m o r e . 1 9 9 1 .
An
i n h i b i t o r y
d o m a i n
o f
E 1 2
t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r
p r e v e n t s DNA b i n d i n g
i n
E 1 2
h o -
m o d i m e r s b u t n o t i n E 1 2 h e t e r o d i m e r s . C e l l
6 4 : 4 5 9 - 4 7 0 .
3 7 . T s a i ,
S . - F . , D . I . K . M a r t i n , L . I . Z o n , A . D . D ' An d r e a ,
G .
G .
W o n g , a n d
S .
H .
O r k i n . 1 9 8 9 . C l o n i n g o f
cDNA
f o r t h e
m a j o r
D N A - b i n d i n g p r o t e i n
o f
t h e
e r y t h r o i d
l i n e a g e
t h r o u g h
e x p r e s -
s i o n i n m a m m a l i a n
c e l l s .
N a t u r e ( Lo n d o n )
3 3 9 : 4 4 6 - 4 5 1 .
3 8 .
W a l l ,
L . ,
E . d e B o e r , a n d F . G r o s v e l d . 1 9 8 8 . T h e
human
3 - g l o b i n
g e n e
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b i n d i n g
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p r o t e i n . G e n e s
D e v .
2 : 1 0 8 9 - 1 1 0 0 .
3 9 .
W i ls o n , D . B . , D . M.
D o r f i a n ,
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S .
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1 9 9 0 .
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human
p r e p r o e n d o t h e l i n - 1
p r o m o t e r
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G e n e s
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D i s t i n c t r o l e s f o r t h e tw o
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f i n g e r
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C e l l . B i o l .
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D ' A n d r e a , a n d
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mouse
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D N A - b i n d i n g
d o m a i n .
M o l . C e l l . B i o l .
1 1 : 5 7 3 5 - 5 7 4 5 .
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Z o n ,
L .
I . , M. F . G u r i s h ,
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S t e v e n s , C .
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O r l d n .
1 9 9 1 . G A T A - b i n d i n g
t r a n s c r i p t i o n
f a c t o r s i n
m a s t c e l l s r e g u l a t e
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c a r b o x y p e p t i d a s e A
g e n e . J . B i o l . C h e m .
2 6 6 : 2 2 9 4 8 -
2 2 9 5 3 .
4 5 .
Z o n ,
L .
I . ,
C . M a t he r ,
S .
B u r g e s s ,
M.
E .
B o l c e ,
R .
M.
H a r l a n d ,
a n d S . H . O r k i n .
1 9 9 1 .
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o f G A T A - b i n d i n g
p r o t e i n s
d u r i n g
e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t
i n X e n o p u s l a e v i s .
P r o c .
N a t l .
A c a d . S c i . U SA
8 8 : 1 0 6 4 2 - 1 0 6 4 6 .