DNA diagnostikaDNA diagnostika

Co se detekuje ?

• Monogenní a polygenní dědičné choroby• Některé typy nádorů• Progrese choroby během léčby• Identifikace lidí ve forenzní medicíně• HLA-typizace v případě transplantace• Prevence - vyšetření: - preimplantační

- prenatální - presymtomatické

DNA polymorfizmus

Variabilita sekvence DNAmezi rozdílnými jedinci téhož druhu

• Alelový polymorfizmus fyziologická funkce, s frekvencí > 1%predispozice k polygenním chorobám

• Mutace patologická funkce, s frekvencí < 1%

příčina monogenních chorob

Zdroje nukleových kyselin

DNA určitého genu – všechny jaderné buňky

RNA určitého genu- jenom ty buňky, kde se daný gen

exprimuje

Princip testování

izolace DNA

PCR (namnožení části DNA)+ další analýzy

vizualizace výsledku v gelu

Náplň třítýdenních praktik

1. praktikum: Izolace vlastní DNA

2. praktikum: PCR - namnožení genů CFTR a HFE

3. praktikum: RFLP - restrikční štěpení genu HFE

Nejčastější mutace

Cystické fibrózy :•gen CFTR, na 7. chromozomu

mutace delta F508Hemochromatózy :•gen HFE, na 6. chromozomu

mutace C282Y

Mutace delta F508Normální sekvenceDNA 5 ´ … AAT ATC ATC TTT GGT GIT … 3´

Protein Asn Ile Ile Phe Gly ValPozice 505 506 507 508 509 510

Mutovaná DNADNA 5 ´ … AAT ATC AT - - - T GGT GIT …

3´

Protein Asn Ile Ile - Gly ValPozice 505 506 507 508 509 510

Mutace C282YNormální DNA5 ´......G / TGC….. 3´

3´…. C / ACG….. 5´

C – Cys – Cystein (TGC) na pozici 282 v proteinu

Mutovaná DNA5 ´......G / TAC….. 3´

3´…. C / ATG….. 5´

Y – Tyr – Tyrosin (TAC) na pozici 282 v proteinu

CharakteristikaDNA diagnostiky

• Detekce určitého polymorfizmudaného predispozičního genu

• CÍLENÉ ANALÝZY• KOMPLETNÍ ANALÝZY

Cílené analýzy

• Lokalizace a celá sekvence genu je známá

• Mutace genu je známá

Vyšetření členů rodiny není nutné

Kompletní analýzy

• Lokalizace a celá sekvence genu je známá

• Mutace genu jsou neznámé

Vyšetření členů rodiny je nezbytné

Detekce polymorfizmu určitého genu

Cílené analýzy:• PCR se sekvenčně specifickými primery (CFTR delta F508)• PCR s obecnými primery

+ 1) RFLP s restrikčními enzymy(Restriction Fragment Length

Polymorphism)(HFE C282Y)

+ 2) hybridizace s DNA próbami

• Kompletní analýzy:

PCR s obecnými primeryDNA sekvenování