UNIVERZA V NOVI GORICI

FAKULTETA ZA ZNANOSTI O OKOLJU

DOLOČEVANJE SREBROVIH ZVRSTI V TEKOČIH VZORCIH

DIPLOMSKO DELO

Aleš Grahovac

Mentor: doc. dr. Dorota Korte

Nova Gorica, 2016

II

IZJAVA Izjavljam, da je diplomsko delo rezultat lastnega raziskovalnega dela. Rezultati, ki so nastali v okviru skupnega raziskovanja z drugimi raziskovalci ali so jih prispevali drugi raziskovalci (strokovnjaki), so eksplicitno prikazani oziroma navedeni (citirani) v diplomskem delu.

Aleš Grahovac

III

ZAHVALA Zahvaljujem se mentorici doc. dr. Doroti Korte za vodenje in pomoč pri izdelavi diplomskega dela, Fakulteti za znanosti o okolju in Kemijskemu inštitutu za uporabo opreme ter dobaviteljem koloidnega srebra za pridobitev vzorcev.

IV

V

NASLOV

Določevanje srebrovih zvrsti v tekočih vzorcih

IZVLEČEK

Srebro ima dolgo zgodovino uporabe zaradi svojega antibakterijskega učinka, vendar ga v moderni

medicini srečamo predvsem pri lokalnem zdravljenju ožganin. V alternativni medicini se je za

razliko prijela uporaba koloidnega srebra, to je nanodelcev srebra v vodnem koloidu, kot naravnega

antibiotika. Odvisno od doze, se z uporabo lahko pojavijo tudi negativni stranski učinki, predvsem

argirija, ki zaradi nalaganja srebra v tkivih povzroča sivo obarvanje kože. Zaradi tega je

pomembno, da natančno nadziramo koncentracije koloidnega srebra v uporabi. V diplomskem delu

smo z uporabo kemijske redukcije pripravili vzorce koloidnega srebra, katere smo uporabili za

izračun meje detekcije (LOD) metod UV-VIS spektrofotometrije ter spektroskopije s toplotno lečo

(TLS), tako v serijski (BM) kot pretočni (FIA) postavitvi. Sledilo je preverjanje koncentracije

koloidnega in celotnega srebra v 5 komercialno dostopnih vzorcih, ter z uporabo splakovanja s

kislino še možnosti nalaganja srebrovih nanodelcev na stene posode v katerih je bilo koloidno

srebro shranjevano. Kot najobčutljivejša od preverjenih merilnih metod se je izkazala TLS-BM,

katere LOD je bila več kot 350-krat nižji od UV-VIS spektrofotometrije (LOD (UV-VIS) = 32,00

ppb; LOD (TLS-BM) = 0,09 ppb; LOD (TLS-FIA) = 0,45 ppb). Vseh 5 preizkušenih vzorcev je

imelo koncentracije koloidnega srebra nižje od navedenih na embalaži (od 32- do 283-krat nižje),

koncentracije celotnega srebra pa večinoma višje od navedenih za koloidno srebro (20 % – 107 %

več od navedene), po čemer lahko sklepamo, da je večina srebra v ionski obliki. Delci koloidnega

srebra so se bolj nalagali na stene posod v katerih je bilo koloidno srebro hranjeno iz stekla kot iz

plastike (155-317 ppb za steklo, 11-15 ppb za plastiko). TLS-BM je preprosta in učinkovita metoda

za merjenje koncentracije nanosrebra v vodnem koloidu. Koncentracija srebra v testiranih vzorcih

koloidnega srebra ne ustrezajo navedenim, zato velja pri nakupu večja pozornost.

KLJUČNE BESEDE

koloidno srebro, spektrofotometrija, TLS, antibiotiki

VI

TITLE

Determination of silver species in liquid samples

ABSTRACT

Silver has a long history of use due to its antibacterial properties, yet in modern medicine we

encounter it mainly in topical burn treatment. In alternative medicine the use of colloidal silver,

which is silver nanoparticles in an aqueous solution, has caught on as a natural antibiotic. Dose

dependent negative side effects can arise, mainly argyria which causes grey skin pigmentation due

to silver deposits in tissues. Because of this it's important to closely monitor the concentration of

the colloidal silver in use. In the thesis we used chemical reduction to prepare samples of colloidal

silver, with which we then calculated the limit of detection (LOD) of the UV-VIS

spectrophotometric method and thermal lens spectroscopy (TLS), both in batch mode (BM) and

flow injection (FIA) configurations. Afterwards we verified the concentration of colloidal and total

silver in five commercially available samples and using rinsing with acid checked for possible

silver nanoparticle deposits on the walls of the containers in which the colloidal silver was kept.

The most sensitive of the verified methods turned out to be TLS-BM, with its LOD being over 350-

times lower than that of UV-VIS spectrophotometry (LOD (UV-VIS) = 32.00 ppb; LOD (TLS-

BM) = 0.09 ppb; LOD (TLS-FIA) = 0.45 ppb). All 5 tested samples had concentrations of colloidal

silver lower than stated on the packaging (32- to 283-times lower) and contained concentrations of

total silver mostly higher than stated for colloidal silver (20 % - 107 % higher than stated), so we

can assume the majority of silver was in ionic form. Colloidal silver particles were deposited in

greater quantities on the walls of containers in which colloidal silver was kept made out of glass

compared to those made of plastic. (155-317 ppb for glass, 11-15 ppb for plastic). The TLS-BM

method is a facile and effective method for measuring the concentration of nanosilver in an aqueous

colloid. The concentration of silver in the real samples of colloidal silver do not correspond to

statements, thus greater care is required when buying it.

KEY WORDS

colloidal silver, spectrophotometry, TLS, antibiotics

VII

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ....................................................................................................................................... 1

2 TEORETIČNE OSNOVE .......................................................................................................... 2

2.1 Osnovne lastnosti srebra ................................................................................................... 2

2.2 Zgodovine uporabe srebra ................................................................................................. 2

2.3 Moderna uporaba sreba ..................................................................................................... 4

2.4 Koloidno srebro .................................................................................................................. 4

2.4.1 Osnovne lastnosti koloidnega srebra ........................................................................... 4 2.4.2 Nanodelci .................................................................................................................... 5 2.4.3 Stranski učinki ............................................................................................................. 6 2.4.4 Pridobivanje ................................................................................................................ 6

2.5 Antimikrobijsko delovanje srebra ....................................................................................... 9

2.6 Merilne metode ................................................................................................................ 12

2.6.1 Spektrofotometrija z ultravijolično in vidno svetlobo (UV-VIS) .................................... 12 2.6.2 Spektroskopija s toplotno lečo (TLS) ......................................................................... 12 2.6.3 Atomska emisijska spektroskopija z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-OES)........... 14 2.6.4 Atomska absorpcijska spektroskopija (AAS) ............................................................. 14 2.6.5 Kolorimetrična ekstrakcija na trdni fazi (C-SPE) ........................................................ 15 2.6.6 Voltametrične metode ............................................................................................... 16 2.6.7 Masna spektrometrija (MS) ....................................................................................... 17

3 MATERIALI IN METODE ........................................................................................................ 18

3.1 Priprava vzorcev .............................................................................................................. 18

3.1.1 Uporabljene kemikalije in reagenti: ............................................................................ 18 3.1.2 Priprava raztopine reducenta .................................................................................... 18 3.1.3 Priprava osnovne raztopine koloidnega srebra .......................................................... 18 3.1.4 Priprava raztopine dušikove kisline ........................................................................... 19 3.1.5 Priprava raztopine fosfatnega pufra ........................................................................... 19 3.1.6 Priprava delovnih raztopin ......................................................................................... 19 3.1.7 Priprava poizkusnih vzorcev ...................................................................................... 19 3.1.8 Določevanje koncentracije srebra prilepljenega na stene stekleničk v katerih je bilo koloidno srebro shranjevano .............................................................................................. 20 3.1.9 Priprava delovnih raztopin za UV-VIS spektrofotometrijo .......................................... 20 3.1.10 Priprava delovnih raztopin za spektroskopijo s toplotno lečo v serijski postavitvi (TLS-BM) .................................................................................................................................... 20 3.1.11 Priprava delovnih raztopin za spektroskopijo s toplotno lečo v pretočni postavitvi (TLS-FIA) .................................................................................................................................... 21 3.1.12 Priprava poizkusnih vzorcev za UV-VIS spektrofotometrijo ..................................... 21 3.1.13 Priprava poizkusnih vzorcev za spektroskopijo s toplotno lečo v pretočni postavitvi (TLS-FIA) ........................................................................................................................... 21

3.2 Določevanje spodnje meje detekcije metod ..................................................................... 21

3.3 Določanje koncentracije srebra v vzorcu .......................................................................... 22

3.4 Določanje intervalov zaupanja za TLS-BM ....................................................................... 22

3.5 Izvajanje meritev .............................................................................................................. 23

3.5.1 Ultraviolično – vidno spektroskopija (UV-VIS)............................................................ 23 3.5.2 Spektroskopija s toplotno lečo – serijska postavitev (TLS-BM) .................................. 24

VIII

3.5.3 Spektroskopija s toplotno lečo – pretočna postavitev (TLS-FIA) ................................ 25

4 REZULTATI IN RAZPRAVA ................................................................................................... 27

4.1 Optični pregled raztopin ................................................................................................... 27

4.2 UV-VIS spektrofotometrija ............................................................................................... 31

4.3 TLS – postavitev BM ........................................................................................................ 32

4.4 TLS – postavitev FIA........................................................................................................ 35

4.5 ICP OES .......................................................................................................................... 38

4.6 Določevanje količine srebrovih zvrsti odloženih na stenah steklenic, v katerih je bilo koloidno srebro hranjeno ..................................................................................................................... 38

5 ZAKLJUČEK .......................................................................................................................... 40

6 VIRI ........................................................................................................................................ 43

IX

SEZNAM TABEL Tabela 1: Študentova t porazdelitev .......................................................................................... 23 Tabela 2: Izračunane koncentracije koloidnega in celotnega srebra v poizkusnih vzorcih, merjene z UV-VIS spektrofotometrom ..................................................................................................... 32 Tabela 3: Izračunane koncentracije koloidnega in celotnega srebra v poizkusnih vzorcih, merjene s TLS v BM postavitvi ................................................................................................................ 34 Tabela 4: 99 % intervali zaupanja za določevanje koloidnega in celotnega srebra .................... 34 Tabela 5: Izračunane koncentracije koloidnega in celotnega srebra v vzorcih, merjene s TLS v FIA postavitvi ............................................................................................................................. 37 Tabela 6: Koncentracije srebra po ICP OES metodi .................................................................. 38 Tabela 7: Koncentracije srebrovih zvrsti naloženih na stenah posode po TLS-BM .................... 39 Tabela 8: Koncentracije srebrovih zvrsti naloženih na stenah posode po TLS-FIA .................... 39 Tabela 9: Primerjava mej detekcije za posamezne metode ....................................................... 40 Tabela 10: Izračunane koncentracije koloidnega in celotnega srebra v poizkusnih vzorcih ....... 41 Tabela 11: Relativna odstopanja izmerjenih koncentracij od pričakovanih ................................ 41

X

SEZNAM SLIK Slika 1: Shema pridobivanja srebrovih nanodelcev z lasersko ablacijo ....................................... 7 Slika 2: Generator srebrovih nanodelcev .................................................................................... 8 Slika 3: Shema delovanja generatorja srebrovih nanodelcev z elektrolizo................................... 8 Slika 4: Shema delovanja srebrovih nanodelcev (AgNP), ionov (Ag+) in reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) srebra na celico .............................................................................................................. 11 Slika 5: Shema delovanja UV-VIS spektrofotometra ................................................................. 12 Slika 6: Shema pojava toplotne leče v vzorcu skozi katerega potekata vzbujevalni in poskusni žarek. ........................................................................................................................................ 13 Slika 7: Shema delovanja ICP-OES sistema ............................................................................. 14 Slika 8: Shema delovanja GFAAS sistema ............................................................................... 15 Slika 9: Shema delovanja C-SPE sistema................................................................................. 16 Slika 10: Shema 3-elektrodne celice uporabljane v voltametričnih metodah ............................. 17 Slika 11: Shema delovanja masnega spektrometra .................................................................. 18 Slika 12: UV-VIS spektrofotometer PerkinElmer Lambda 650S ................................................ 24 Slika 13: Shema postavitve TLS sistema v BM postavitvi. ........................................................ 25 Slika 14: Shema postavitve TLS sistema v FIA postavitvi (teoretično). ..................................... 26 Slika 15: Postavitev TLS sistema s FIA injektorjem (v praksi). .................................................. 27 Slika 16: Od level proti desni: vzorec Vz1, vzorec 15 ppm, vzorec Vz1 z dodanim borohidridom. .................................................................................................................................................. 28 Slika 17: Od leve prot desni: vzorec Vz2, vzorec 20 ppm, vzorec Vz2 z dodanim borohidridom. .................................................................................................................................................. 29 Slika 18: Od leve proti desni: vzorec Vz3, vzorec 25 ppm, vzorec 30 ppm, vzorec Vz3 z dodanim borohidridom. ............................................................................................................................ 29 Slika 19: Od leve proti desni: vzorec Vz4, vzorec 5 ppm, vzorec Vz4 z dodanim borohidridom. 30 Slika 20: Od leve proti desni: vzorec Vz5, vzorec 15 ppm, vzorec Vz5 z dodanim borohidridom. .................................................................................................................................................. 30 Slika 21: Odvisnost absorbance standardnih raztopin različnih koncentracij koloidnega srebra od valovne dolžine ......................................................................................................................... 31 Slika 22: Umeritvena premica za določevanje koncentracije koloidnega srebra v tekočih vzorcih pri uporabi UV-VIS spektrofotometrije ....................................................................................... 32 Slika 23: Odvisnost TLS-BM signala od koncentracije koloidnega srebra v vzorcu ................... 33 Slika 24: Umeritvena premica za določevanje koncentracije koloidnega srebra v tekočih vzorcih pri uporabi TLS v BM postavitvi poizkusnega sistema ............................................................... 33 Slika 25: Odvisnost TLS-FIA signala od koncentracije koloidnega srebra v vzorcu. .................. 35 Slika 26: TLS signal za merjenje koncentracije koloidnega srebra v FIA postavitvi ................... 35 Slika 27: Umeritvena premica za določevanje koncentracije koloidnega in celotnega srebra v tekočih vzorcih pri uporabi TLS v FIA postavitvi ........................................................................ 36 Slika 28: TLS signal za koloidno in celotno srebro v poizkusnih vzorcih (a) .............................. 36 Slika 29: TLS signal za koloidno in celotno srebro v poizkusnih vzorcih (b) .............................. 37 Slika 30: Meritve TLS signala za določevanje količine srebrovih zvrsti odstranjenih s sten posod v katerih je bilo koloidno srebro hranjeno v BM postavitvi .......................................................... 38 Slika 31: Meritve TLS signala za določevanje srebrovih zvrsti odstranjenih s sten posod v katerih je bilo koloidno srebro hranjeno v FIA postavitvi ........................................................................ 39

XI

KRATICE IN OKRAJŠAVE AAS – atomic absorption spectrometry – spektroskopija z atomsko absorpcijo ATSDR – Agency for Toxic Substances and Disease Registry – Agencija za strupene snovi in register bolezni BM – batch mode – serijska postavitev CDDEP - Center for Disease Dynamics, Economics & Policy – Center za dinamiko, ekonomijo in politiko bolezni C-SPE – colorimetric solid phase extraction – kolorimetrična ekstrakcija na trdni fazi diH2O – deionizirana voda DMABR – 5-(4-Dimetilaminobenziliden)-rodanin DNK – dezoksiribonukleinska kislina FAAS – flame atomic absorption spectrometry – plamenska atomska absorpcijska spektroskopija FIA – flow injection analysis – pretočna postavitev GFAAS – graphite furnace atomic absorption spectrometry – atomska absorpcijska spektroskopija z grafitno pečjo ICP-OES – inductively coupled plasma optical emission spectrometry – atomski emisijska spektroskopija z induktivno sklopljeno plazmo LOD – limit of detection – spodnja meja zaznavnosti NADH – nikotinamid adenin dinukleotid ppb – parts-per-billion – delcev na milijardo ppm – parts-per-million – delcev na milijon PVA – polivinil alkohol PVP – polivinilpirolidon ROS – reactive oxygen species – reaktivne kisikove zvrsti TLS – thermal lens spectroscopy – spektroskopija s toplotno lečo UV-VIS – Ultraviolet-visible spectrum – ultravijolični-vidni spekter WHO – World Health Organization – Svetovna zdravstvena organizacija

1

1 UVOD Človeštvo se že od začetka svojega obstoja spopada z boleznimi, ki jih prinašajo mikroorganizmi. Eno najbolj učinkovitih metod proti le-tem so antibiotiki. V začetku kot zdravilne rastline, v današnjem času pa kot ciljni odstranjevalci bakterij, antibiotiki predstavljajo enega stebrov moderne medicine. Z uporabo, ki sega v desetine milijard enot letno po celem svetu, predvsem v obliki tablet, lahko predvidimo nešteto število življenj, ki so jih rešili (Aminov, 2010). S tako široko in dolgotrajno uporabo antibiotikov pa so se pokazale tudi njihove slabe strani. Skozi evolucijo se lahko mikroorganizmi po več generacijah prilagodijo na mehanizme, ki jih antibiotiki izrabljajo za svojo toksičnost proti bakterijam in tako postanejo odporni nanje (CDDEP, 2015; Durán idr., 2016). Kot posledica tega se lahko pojavijo že »premagane« bolezni, ki so odporne na standardno zdravljenje in tako zahtevajo vedno nove metode. V boju proti temu se izdelujejo vedno nove in nove vrste antibiotikov, vendar je to »Sizifovo delo«, saj je sposobnost prilagajanja mikroorganizmov neomejena. Po nekaterih ocenah naj bi na antibiotike odporne bakterije v Evropi zakrivile 25.000 smrti na letni ravni. Kot uporabniki antibiotikov lahko doprinesemo k njihovi učinkovitosti s smotrno uporabo. Uporaba antibiotikov naj bi bila neustrezna v 20 do 50% primerov. To lahko pomeni uporabo za virusna obolenja, na katere antibiotiki nimajo vpliva, uporabo antibiotikov z delovanjem nepotrebno širokega spektra, neustrezno odmerjanje ali trajanje terapije ali neupoštevanje navodil za uporabo s strani potrošnika (CDDEP, 2015). Zaradi težavnosti izdelovanja vedno novih vrst antibiotikov v zadnjem času prihajajo v ponovno uporabo tudi antibiotiki iz preteklosti, za katere bakterije še niso razvile odpornosti. Eden izmed teh je srebro (Ag), katerega baktericidno delovanje je znano zelo dolgo. Uporablja se predvsem za dezinfekcijo ali kot material, ki zavira nastanek bakterij (Marx in Barillo, 2014). V zadnjih nekaj desetletjih lahko zasledimo tudi reklame za koloidno srebro, katerega proizvajalci navajajo širok nabor prednosti pred klasičnimi antibiotiki (koloidnosrebro.net, 2016):

delovanje proti bakterijam, virusom in glivam

brez stranskih učinkov

mikroorganizmi ne razvijajo odpornosti nanj

uporabno kot razkužilo, zdravilo ali prehransko dopolnilo

ne vplivajo na delovanje drugih antibiotikov in zdravil Srebro deluje oligodinamično (v zelo majhnih količinah), s sproščanjem ionov, ki potem reagirajo z mikroorganizmi. Srebro v koloidni obliki izrablja ta učinek, tako da so učinkovite že nizke koncentracije le nekaj ppm. Nanodelci povečujejo učinkovitost srebra s svojo veliko relativno površino. Učinkovitost samega koloidnega srebra je tako odvisna od koncentracije nanodelcev, njihove velikosti in oblike (Lokina idr., 2014). Človeško telo ni sposobno izločati vnesenega srebra, zato se to nalaga v tkivih. Prekomerna uporaba koloidnega srebra lahko vodi do zapletov, ki so posledica tega nalaganja. Pride lahko do obarvanja kože (argirija), pa tudi do resnejših napak pri delovanju organov, kot so jetra, pljuča, ledvice, srce in možgani (Fewtrell, 2014). V tem diplomskem delu smo proučevali pet vzorcev na trgu dostopnih oblik koloidnega srebra, katerim smo preverili dejanske koncentracije koloidnega ter ionskega srebra, ki jih vsebujejo. Za meritve smo uporabili že preverjene metode z UV-VIS spektrofotometrijo ter spektroskopijo s toplotno lečo (TLS). Predvsem slednja ima nizko spodnjo mejo detekcije (LOD), tako da lahko zazna že sledove koloidnega srebra. Laserske tehnike TLS, ki jih proizvajalci analiznih orodij ne

2

ponujajo, omogočajo meritve koncentracije kovin v tekočih vzorcih z LOD v območju 10-7 absorpcijskih enot. To je 100-krat nižje od absorbanc, ki jih lahko zaznamo z običajnimi spektrometrijskimi metodami in je posledica direktne odvisnosti signala TLS od moči vzbujevalnega laserja. TLS zagotavlja učinkovito in občutljivo zaznavo ter kemijsko analizo tudi v pretočnih sistemih injekcijske analize (FIA). Preverili smo tudi morebitno nalaganje srebra na same stene stekleničk, v katerih je koloidno srebro shranjevano. Le-te so bile dveh tipov: plastične ali steklene. Cilj diplomskega dela je na podlagi predlaganih raziskav določiti speciacije in koncentracije srebrovih zvrsti v tekočih vzorcih za splošno uporabo (med njimi so npr. razkužilo, kapljice za nos, razpršilec za usta ipd.), ter razviti visoko občutljive metode za določevanje srebrovih zvrsti v tekočih vzorcih v laboratorijskih preiskavah.

2 TEORETIČNE OSNOVE

2.1 Osnovne lastnosti srebra Srebro je 47. element periodnega sistema, z oznako »Ag« in masnim številom 107,87. V naravi se pojavlja tudi kot čisti element, pogosteje pa v obliki srebrove rude, kot npr. argentit (srebrov sulfid, Ag2S), klorargirit (srebrov klorid, AgCl) ali v kombinaciji s svincem, cinkom, bakrom ali zlatom. Čisto srebro je svetleče bele kovinske barve, rahlo trše od zlata, vendar visoko kovno. Tališče ima pri 961,87 oC, vrelišče pa pri 2162 oC. Njegova specifična teža je 10,5. Ima največjo električno prevodnost in najnižjo kontaktno upornost med elementi, ter največjo toplotno prevodnost med kovinami (Haynes idr., 2016). Poznamo 59 izotopov srebra, vendar sta stabilna in v naravi obstoječa le dva (Ag107, Ag109). Elementarno srebro (Ag0) ima tri oksidativna stanja (Ag1+, Ag2+, Ag3+), od katerih sta slednji dve visoko reaktivni in nestabilni, ter tako manj uporabni (Lansdown, 2006). Srebrove spojine se ionizirajo v prisotnosti vode ali bioloških tekočin v obliko Ag1+ (Marx idr., 2014). Visoke koncentracije srebra so lahko toksične za žive organizme. Smrtna doza za laboratorijske miši za oralno uporabo je 13,9 ppm, za zajce 20 ppm in pse 50 ppm glede na telesno maso, za podgane pa 1586 ppm z obdobjem izpostavljenosti 37 tednov (Fewtrell, 2014).

2.2 Zgodovine uporabe srebra Barillo in Marx sta leta 2014 uporabo srebra skozi zgodovino razdelila na pet obdobij:

starodavno

18. stoletje in germinativna teorija bolezni

srebrna renesansa 1960-ih let

druga generacija srebrovih povojev v poznem 20. stoletju

trenutna uporaba Čeprav sega uporaba srebra daleč v preteklost (predvsem kot drage kovine ali denarja) pa lahko zasledimo prvo medicinsko rabo nekje v antiki. Bolj kot razumevanje njegovega delovanja je bila uporaba srebra predmet tradicije in folklore. Aleksander Veliki (335 pr. n. š.) naj bi shranjeval in

3

pil vodo iz srebrnih posod na svojih vojaških pohodih. Tudi Grki in Rimljani naj bi pitno vodo shranjevali v srebrnih posodah. Razne mediteranske in azijske kulture so uporabljale srebrne steklenice in rezervoarje za ohranjanje svežine tekočin. V tem času se tudi pojavlja uporaba srebrne folije na ranah, za preprečitev infekcij. Rimljani so vključili srebro kot zdravilo v svoje uradne medicinske knjige, kot zdravilo pa so uporabljali tudi srebrov nitrat (Melaiye in Youngs, 2005; Barillo in Marx, 2014). Ambrose Pare (1510–1590) je bil pionir kirurgije na bojiščih in je služil kot kraljevi kirurg Henryju IV, Francisu II, Charlesu IX in Henryju III. Med drugimi inovacijami se je zavzemal tudi za uporabo srebrnih sponk pri obraznih rekonstrukcijah (Lansdown, 2006). Germinativna teorija bolezni je za nekatere od le-teh krivila mikroorganizme. V tem obdobju se je pojavilo veliko raziskav v podporo tej teoriji, ki so dokazovale obstoj patogenih bakterij na podlagi njihovih učinkov ali z izolacijo same bakterije: Sammelweis v letu 1847 (umivanje rok), John Snow v 1854 (epidemiologija izbruha kolere), Davaine v 1865 (identifikacije bakterije antraksa v krvi), Louis Pasteur v 1880 (izolacija in kultura bakterije kurje kolere), Robert Koch v 1876 (izolacija Bacillus anthracis in Kochove domneve) (Barillo in Marx, 2014). Leta 1890 je dr. Georgia Arbucle Fix izvedla kranioplastijo odprte rane glave nekega kmeta s pomočjo tanke srebrne plošče, ki naj bi jo izdelala iz srebrnega kovanca (Rollings, 1985). V 1880-ih je nemški ginekolog in porodničar Carl Siegmund Franz Credé uvedel uporabo raztopine srebrovega nitrata za oči novorojenčkov, za preprečevanje infekcije oftalmije novorojenčkov (ophthalmia neonatorum). Raztopina je incidenco te bolezni zmanjšala iz 10,8 % na manj kot 2 % in postala obvezna v ZDA v poznih 1800-ih (Credé, 1884). Uporaba se je obdržala vse do 1970-ih let, ko jo zamenjali drugi pripravki, kot je eritromicin. Dr. William Stewart Halsted je od leta 1889, ko je postal glavni kirurg v Bolnišnici Johna Hopkinsa uvedel uporabo srebrne žice pri šivanju hernij ter srebrne folije za preprečevanje infekcije post operativnih ran (Barillo in Marx, 2014). V 1960-ih letih je prišlo do revolucije uporabe srebra za negovanje opeklin. Leta 1964 so s poskusi na ljudeh dokazali učinkovitost mafenida za lokalno zdravljenje opeklin. Sledeče leto so Moyer idr. uspešno uvedli uporabo 0,5 % srebrovega nitrata kot lokalne terapije za opekline. Dr. Charles Fox iz univerze v Kolumbiji je združil ideje uporabe srebrovega nitrata in do tedaj uporabljanega mafenida v srebrov sulfadiazin. V njegovih poizkusih je uporabljal ožgane miši okužene s Pseudomonas aeruginosa, katerih 80 % smrtnost je z dnevno aplikacijo srebrovega sulfadiazina zmanjšal na le 5-20 %. Fox in Modiak sta raziskovala mehanizme delovanja nove terapije in ugotavljala, da srebrov sulfadiazin v telesu počasi in vzdrževano sprošča srebrove ione, ki se potem vežejo na bakterije in jih uničijo (Barillo in Marx, 2014). Leta 1977 so Fox idr. ovrednotili uporabo cerijevih soli s srebrovim sulfadiazinom in ugotovili še boljše zaviranje rasti bakterij. Kljub vse novejšim preparatom za negovanje opeklin, srebrov nitrat in sulfadiazin ostajata v široki uporabi še danes (Barillo in Marx, 2014). Istočasno je prihajalo tudi do razvoja uporabe srebra kot razkužila za pitno vodo v vesoljskih plovilih. Medtem ko so misije Mercury uporabljale vodo iz pipe in Gemini dodajale še klor, so za misije Apollo raziskali uporabo ionskega srebra. V 1960-ih letih so tako ugotavljali, da je za dezinfekcijo vodo na teh misijah dovolj koncentracija srebrovih ionov 50 ppb. Iznašli so preprosto

4

napravo, ki je prehajala enosmerni tok skozi srebrno anodo ter tako oddajala srebrove ione v vodi (Barillo in Marx, 2014). Tudi sovjetska plovila so uporabljala ionsko srebro. V Vostok, Voshod in Sojuz so pred poletom prekuhani vodi dodajali preparat srebra, Saljut in Mir pa sta uporabljala 200 ppb ionskega srebra za čiščenje vode. Ionsko srebro se še danes uporablja na mednarodni vesoljski postaji (Daues, 2006; Birmele idr., 2011).

2.3 Moderna uporaba sreba Moderna uporaba srebra je široka in zajema ne le medicinske pripomočke, marveč tudi prosto dobavljive uporabniške izdelke, kot so na primer pralni stroji ali hladilniki. Največja prisotnost srebra je še vedno v negi opeklin. Krema s srebrovim sulfadiazinom je v seznamu WHO bistvenih zdravil (WHO, 2015). Flammacerium je v široku uporabi po Evropi. Odkrivajo se tudi novi materiali, ki vsebujejo srebro; najlon z vsebnostjo srebra se je pokazal za zelo baktericidnega, in nizek enosmerni električni tok skozenj naj bi pripomogel k hitrejšemu celjenju ran. Antibakterijske lastnosti se tudi dobro podajajo uporabi v razni medicinski opremi, ki je v neposrednem stiku s telesom. Katetri so podvrženi nastajanju biofilmov in so pogosti povzročitelj infekcij. Centralni venski katetri premazani s kloroheksidinom in srebrovim sulfadiazinom so pripomogli k petkrat nižji stopnji okužbe krvi v primerjavi z običajnimi katetri. Okužbe urinarnega trakta so tudi najpogostejša oblika bolnišničnih okužb, zajemajoč 40 % vseh. Po nekaterih raziskavah so s srebrovo spojino ali zlitino obdelani katetri zmanjšali obolevnost do 45 %. Endotrahealne cevi so še en pripomoček, katerih obdelava s srebrom zniža incidenco in zakasni nastajanje pljučnic povezanih z dihalnim aparatom (Barillo in Marx, 2014). Srebro se uporablja pri dezinfekciji vode tudi v domačem okolju, z dobavljivostjo raznih filtrov za vodo, ki oddajajo ionsko srebro z namenom uničenja bakterij (Barillo in Marx, 2014). V zadnjem času prihaja tudi do ponovnega pojava koloidnega srebra. To je suspenzija delcev srebra nanometerskih velikosti v vodi. Proizvajalci navajajo blagodejne učinke pri mnogih boleznih, od kožnih obolenj, vnetij, virusnih obolenj, celo raku in AIDSu, ter uporabo kot naravni antibiotik brez stranskih učinkov (koloidnosrebro.net, 2016). Raziskav na tem področju ni veliko in imajo nasprotujoče si rezultate, kar pripomore k šibkosti trditev proizvajalcev.

2.4 Koloidno srebro

2.4.1 Osnovne lastnosti koloidnega srebra Koloidno srebro je, kot že omenjeno, suspenzija nanodelcev srebra v vodi. Delci v koloidu niso raztopljeni, temveč prosto lebdijo. Običajno gre za delce elementarnega srebra Ag0 velikosti 1-100 nm, ki so lahko različnih oblik. Delci nosijo električni naboj, vendar se sčasoma naravno ionizirajo v Ag+. Ta proces je pospešen s strani svetlobe ali elektromagnetnega sevanja, zato se koloidno srebro shranjuje v zatemnjenih prostorih in proč od elektronskih naprav. Tudi pri proizvajanju koloidnega srebra dobimo iz procesov večinoma ionizirano obliko in le 10-25 % koloidne (Pies, 2012). Zaradi splošne nestabilnosti in občutljivosti koloidnega srebra na svetlobo

5

in elektromagnetna valovanja, se lahko vanj dodajajo stabilizacijske spojine, ki se šibko vežejo na koloidne delce (Lee idr., 2011).

2.4.2 Nanodelci Za nanodelce veljajo tisti, ki so manjši od 100 nm. Gre za vmesno stopnjo med atomom ali molekulo ter masivnimi delci. Imajo lastnosti, ki so pogosto drugačne od tistih, ki jih imajo večje enote. To je predvsem posledica velike površine glede na volumen, ki ga nanodelci imajo. Zaradi te so zelo reaktivni, tako z drugimi snovmi, kakor sami s seboj. Tako lahko pride do neželenega pojava aglomeracije, kjer se nanodelci »zlepijo« skupaj v večje enote in s tem izgubijo lastnosti nanodelcev. Do tega prihaja zaradi Brownovega gibanja delcev, pri katerem se delci naključno gibljejo v prostoru in trkajo med seboj (Čebulj, 2007). Nanodelci se široko uporabljajo na različnih področjih industrije, kot so kozmetika, prehrambna, tekstilna, športna in računalniška industrija. Nanopremazi se uporabljajo za dodajanje posebnih lastnosti materialov, tako da lahko dobimo npr. vodoodporne tkanine, samočistilne objekte, hrano odporno na oksidacijo ipd. Urejanje struktur materialov na nanometerskem nivoju lahko vodi v večjo trdnost ali zmanjšano maso materiala, kar je uporabno v gradbeništvu ali za športno opremo. Nanotehnologija se uveljavlja v računalništvu, kjer so zahteve po miniaturizaciji vsako leto višje, saj se za enako velikost pričakuje večja moč (Bilban, 2013). Izjemen potencial so pokazali tudi v medicini, kot npr. v medicinskem slikanju in dostavi zdravil, kot tako imenovane kvantne točke (Quantum dots)(Murthy, 2007). To so nanodelci anorganskih polprevodnikov, ki se uporabljajo kot alternativa organskim barvilom, uporabljanim v medicinskem slikanju. Organska barvila so navadno vezana na biomolekule, ki se selektivno vežejo na določene celice ali dele celic. Zaradi te interakcije nastajajo dva problema, ki nižajo učinkovitost barvilom in s tem metodi slikanja: lahko pride do nezadostne fluorescence oz. lahko pride do fotobeljenja (photobleaching), ko barvilo izgubi fluorescentne lastnosti zaradi sprememb v molekulski strukturi skozi čas. Kvantne točke imajo to lastnost, da se ob vzbujanju elektroni prestavijo v višje energijsko stanje (vzbujeno stanje). To stanje ni stabilno; elektroni so v višji orbitali le kratek čas in se nato ob prenehanju dovajanja energije spet vrnejo v osnovno energijsko stanje, ter ob tem oddajo energijo v obliki svetlobe. Na ta način po osvetljevanju z UV svetlobo kvantne točke postanejo fluorescentne. Frekvenca oddane svetlobe je tudi odvisna od njihovih velikosti. Svetloba oddana na ta način je dosti močnejša in ima zmanjšan učinek fotobeljenja, tako da lahko dobimo veliko jasnejšo sliko. Anorganski polprevodniki niso vodotopni, tako da morajo biti obdani z organsko komponento, ki pa je lahko pripravljena tako, da cilja točno določeno tkivo. To je na primer uporabno za zgodnje odkrivanje rakavih in drugih obolenj ali kartiranju telesnih poti brez kirurških posegov (Murthy, 2007). Nanodelce lahko uporabljamo tudi za napredno dostavljanje zdravil po telesu, z zmanjšanimi stranskimi učinki, večjo učinkovitostjo zdravil, ter višjim terapevtski indeksom (tj. količnik med toksično dozo in učinkovitostno dozo). Temelj delovanja je ovitje ali drugačno hranjenje zdravila v nanodelcu, tako da lahko to pride do svoje tarče brez degradacije ali vplivov na netarčne organe. Za dosego tega cilja poznamo že več vrst nanodelcev. V uporabi so liposomi, ki so krogle sestavljene iz zdravila ovitega v dvoplastni ovoj iz lipidov. Sposobni so prenašati tako hidrofobna kot hidrofilna terapevtska sredstva in jim lahko z različnimi ligandi določimo tarčne celice, organe ali tkiva. Še ena široko uporabljana verzija so konjugati polimerov in zdravil, kjer je zdravilna učinkovina vezana na polimer. Uporablja se predvsem za kemoterapijo, kjer ti konjugati podaljšajo cirkulacijo zdravila iz nekaj minut na nekaj ur in zavirajo absorpcijo s strani zdravih celic. V stopnji razvoja velja omeniti še dendrite, ki so zaradi svoje razvejane strukture sposobni obenem hraniti

6

hidrofobna in hidrofilna sredstva, ter polimerske micelije, ki sredico z zdravilom obdajo z lupino iz amfifilnih kopolimerov. Delujejo podobno kot liposomi, vendar omogočajo transport večjih količin zdravila (5-25 % mase), so stabilnejši v krvnem obtoku in omogočajo različne vrste sproščanja zdravila, glede na zunanje dejavnike. Skupna lastnost vsem vrstam nanodelcev za transport zdravil je njihova velika prilagodljivost našim potrebam, tako da predvidevamo vedno večjo uporabo (Zhang idr., 2008).

2.4.3 Stranski učinki Srebro ni sestavni del človeškega telesa in nima nobene poznane fiziološke ali hranilne vrednosti (Lansdown, 2006). Po priporočilih WHO je doza za nivo brez stranskih učinkov za oralno jemanje srebra skozi življenjsko dobo človeka 10 g. V primeru za dodajanje vodi pa je mejna koncentracija 100 ppb (WHO, 2006). Edina bolezen neposredno povezana z izpostavljenostjo srebru je argirija. To je nalaganje srebrovih soli v telesu, ki se kaže z značilno modro-sivo obarvanostjo in se izraža predvsem na soncu izpostavljenih delih, kot so oči, koža ali nohti. Pojav je redek in bolj povezan z izpostavljenostjo srebru na delovnem mestu ali lokalni izpostavitvi, npr. obkladkom s srebrovim sulfadiazinom (Pies, 2012; Marx in Barillo, 2014). Izpostavljenost prahu, ki vsebuje večje koncentracije srebra ali srebrovih spojin lahko povzroči več učinkov, kot dihalne težave, vnetja dihalnih poti in pljuč, bolečine v trebuhu ali blage alergične reakcije na koži (ATSDR, 1990). Kljub reaktivnosti srebrovih nanodelcev z bakterijami, nima velikega vpliva na organe rib, ki so bile izpostavljene koloidnemu srebru. Večina nanodelcev se veže na delce v vodi (Bruneau idr., 2016). Testi z vdihavanjem ali uživanjem srebrovih nanodelcev na podganah so za razliko pokazali nalaganje srebra v številnih organih. Največje koncentracije so bile določene v jetrih in ledvicah, s prisotnostjo tudi v srcu, možganih, pljučih in krvi. Opazovana je bila tudi sposobnost prehajanja nanodelcev srebra skozi krvno-možgansko pregrado ter skozi placento. Absorpcija nanodelcev srebra je odvisna tako od koncentracije izpostavitve, kot tudi od velikosti samih nanodelcev, pri čemer manjši delci vodijo k višji koncentraciji srebra v organih. Toksičnost srebrovih nanodelcev za celice je bila dokazana v in-vitro poizkusih na različnih tkivih, kjer se je viabilnost celic drastično zmanjšala. Izpostavljenost različnim koncentracijam nanodelcev je pokazala vplive tudi in-vivo: podganam so nastale poškodbe na ledvicah, miši so postale lenobne, morskim prašičkom pa se je znižala rast (Fewtrell, 2014).

2.4.4 Pridobivanje Načine pridobivanja srebrovih nanodelcev lahko razdelimo na dva sklopa: fizični in kemični. V prvem primeru gre predvsem za proces evaporacije/kondenzacije ali laserske ablacije. Srebro se lahko v laboratoriju uplini v nosilni plin z uporabo cevaste peči. Z ohlajanjem pride do procesa kondenzacije, pri katerem se srebro strne v nanodelce. Do podobnega rezultata lahko pridemo tudi z uporabo keramičnega grelca, kar ima za prednost precejšen prihranek časa in potrebne energije. Tako velikost kot oblika nanodelcev so odvisni od temperature grelnika. Pri laserski ablaciji nanodelci nastajajo ob obstreljevanju večjih kosov srebra z laserjem v raztopini (Slika 1). Tako frekvenca kot pogostost udarcev vplivata na lastnosti nanodelcev pridobljenih s to metodo. Fizične metode so uporabne predvsem zaradi velike koncentracije in količine nanodelcev, ki jih

7

lahko proizvedejo ter odpornosti na kontaminacije, zaradi odsotnosti drugih kemikalij (Abou El-Nour idr., 2010; Iravani idr., 2014).

Slika 1: Shema pridobivanja srebrovih nanodelcev z lasersko ablacijo. Povzeto po Hamad idr., 2015. Najbolj razširjen in komercialno dostopen način pridobivanja koloidnega srebra je s pomočjo t.i. »generatorjev«. Ti elektrokemično proizvajajo koloidno srebro z elektrolizo. Gre za dve srebrni diodi potopljeni v destilirano vodo, skozi kateri teče električni tok (Slika 2). Na anodi se srebro ionizira in nastaja kisik, medtem ko se na katodi srebro spet reducira v elementarno obliko in nastajajo molekule vodika. Molekule elementarnega srebra se pri tem zaradi Van der Waalsove sile povežejo v nanodelce. Za ta proces se ne porabi veliko energije, je pa odvisen od čistosti srebra ter od odsotnosti mineralov v vodi, ki bi lahko tvorili srebrove soli (Pies, 2012).

Laserski Žarek

Leča

Topilo

Nanodelci srebra

Tarča is srebra

8

Slika 2: Generator srebrovih nanodelcev (Vir: EA Elektronika d.o.o., http://www.eaelektronika.com/files/ionic2.jpg).

Slika 3: Shema delovanja generatorja srebrovih nanodelcev z elektrolizo. Povzeto po Hussein, 2016.

Srebrni elektrodi

Srebrovi ioni

Srebrovi nanodelci

Destilirana voda

Ionizacija srebra z anode

𝐴𝑔0 − 𝑒− → 𝐴𝑔+

Redukcija srebrovih ionov v nanodelce

𝐴𝑔+ + 𝑒− → 𝐴𝑔0

9

Za laboratorijsko pridobivanje nanodelcev je predvsem uporabna redukcija, pri kateri s pomočjo reducenta srebrove ione v raztopini reduciramo v elementarno obliko, ki se nato oligomerično vežejo v nanodelce (Iravani idr., 2014). Kot reducent lahko uporabimo vrsto organskih ali anorganskih spojin; natrijev citrat, askorbat, natrijev borohidrid, elementarni vodik, poliolni proces, Tollensov reagent, N,N-dimetilformamid in poli(etilen glikol)ni kopolimeri so vsi lahko uporabljani kot reducenti ionskega srebra v vodnih ali nevodnih raztopinah (Abou El-Nour idr., 2010). V zadnjem času se tudi pojavljajo biosintetične metode iz »zelene« kemije, kjer se uporabljajo za okolje nenevarne spojine ter se izkorišča delovanje mikroorganizmov. Za reducent in stabilizator se že uporablja glukoza, želatina, ekstrakt zelenega čaja ter celo izločki bakterije Bacillus licheniformis (Abou El-Nour idr., 2010). Ob pridobivanju srebrovih nanodelcev je pomembno, da uporabimo tudi stabilizatorje. Ti zavirajo aglomeracijo ali sedimentacijo delcev v raztopini, ter tako omogočajo bolj enakomerno nastajanje in velikost nanodelcev. Za to lahko uporabljamo surfaktante, kot so npr. tioli, amini, kisline in alkoholi (Hussein, 2016). Druga oblika je elektrostatična stabilizacija. Do tega pridemo s koordinacijo anionskih zvrsti, kot npr. halidi, karboksilati, polioksoanioni na kovinsko površino. Ustvari se električni dvosloj, tako da se delci med seboj odbijajo. Še ena oblika stabilizacije je sterična, pri kateri z velikimi molekulami (navadno organskimi) preprečujemo stik med delci preko difuzije. Kot sterični stabilizatorji se večinoma uporabljajo polimeri. Za učinkovita sta bila pokazana polivinilnilalkohol (PVA) ali polivinilpirolidon (PVP) (Abou El-Nour idr., 2010; Petica idr., 2008).

2.5 Antimikrobno delovanje srebra Antimikrobno delovanje srebra je znano že dalj časa, vendar so natančni mehanizmi še predmet raziskav. Po Marx in Barillo (2014) jih lahko razdelimo na štiri kategorije:

inhibicija delovanja encimov

uničenje celične membrane

interakcija z DNK

uničenje celice s strani prostih srebrovih radikalov Opažano je, da se ionsko srebro lahko veže na tiolne skupine encimov, tj. encimov, ki vsebujejo aminokislino cistein. Vezava povzroči deaktivacijo encima in posledično celično smrt (Marx in Barillo, 2014). Srebrovi ioni tudi porušijo prenos elektronov v dihalni verigi celice (Slika 4). Vežejo se med citokroma b in d in med vstopom substrata v dihalno verigo in flavoproteinom v regiji NADH in sukcinat dehidrogenaze (Marx in Barillo, 2014). Ionsko srebro lahko ovira delovanje ali celo poškoduje celične membrane mikroorganizmov. Elektrostatsko se veže na anionske dele membrane. Tudi srebrovi nanodelci interagirajo s celično membrano in imajo lahko še močnejši učinek. Vežejo se lahko na proteine na zunanji strani celične membrane in tvorijo komplekse z darovalci elektronov, ki vsebujejo atome kisika, fosforja, dušika ali žvepla (Slika 4). Najpogostejše so interakcije s tiolnimi skupinami (Slawson idr., 1990; Marx in Barillo, 2014; Durán idr., 2016). Obstajajo tudi dokazi za interakcije koloidnega srebra z lipidnim delom membrane celice, saj so s koloidnim srebrom obdelane celice kazale spremembe v sestavi maščobnih kislin. Te spremembe lahko spremenijo sestavo in s tem prepustnost membrane, ter tako povzročijo luknje v sami

10

membrani. Skozi te luknje lahko nanodelci tudi vstopajo v samo citoplazmo. Tako ioni, kakor nanodelci srebra imajo torej podoben vpliv na celično membrano, vendar je razmerje pomembnosti še vprašljivo (Durán idr., 2016). Po raziskavi Agnihotri idr. leta 2013, so nanodelci zavirali razvoj Escherichia coli trikrat bolj, kakor ionsko srebro. Evkariontske celice imajo DNK zaščiten v celičnem jedru, vendar pri prokariontih DNK prosto plava po citoplazmi, ter je tako ranljiva za srebrove ione in nanodelce, ki bi lahko vdrli v celico. Ionsko srebro interagira s pari adenin-citozin ter adenin-timin, ter tako povzroči mutacije, ki navadno privedejo do smrti celice. Pri vstopu srebra v celico imajo pomembno vlogo tudi porini, skozi katere lahko prosto prehaja ionizirano srebro (Slika 4). Nanodelci so za ta prehod preveliki, zato naj bi za vpliv na notranje strukture celice bila kriva predvsem ionska oblika srebra (Marx in Barillo, 2014). Srebro se lahko veže na aminokisline, ter tako tvori organokovinske komplekse. Če se vez s srebrom kasneje prelomi, to tvori proste radikale sreba, ki lahko interagirajo z encimi ali DNK v celici (Slika 4). Ti prosti radikali lahko nastajajo tudi na površini nanodelcev srebra, ter tudi tako poškodujejo celično membrano. Raziskave so tudi pokazale na tvorjenje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Antimikrobne lastnosti nanodelcev srebra so se pokazale za višje ob prisotnosti kisika, ter nižje v anaerobnih razmerah (Durán idr., 2016). Pri antibakterijskem delovanju srebra gre verjetno za več od teh mehanizmov, zaradi česar so tudi bakterije odporne na srebro redke. Najdejo se lahko v območjih z naravno prisotnostjo srebra. Najbolj poznan mehanizem odpornosti na srebro je najden na plazmidu pMG101 serotipa Typhimurium bakterije Salmonella enterica (Marx idr., 2014). Kljub večstranskem delovanju srebra in redkosti odpornosti nanj pa lahko bakterije še vedno razvijejo le-to. Graves idr. so ugotovili, da se ob prisotnosti srebrovih nanodelcev na genomu E. coli pojavijo spremembe, ki so povezane z odpornostjo na srebro po 100 generacijah in postanejo pogoste po 200 generacijah (Durán idr., 2016).

11

Slika 4: Shema delovanja srebrovih nanodelcev (AgNP), ionov (Ag+) in reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) srebra na celico. Povzeto po Durán idr., 2016.

= AgNP

Vstop nanodelcev z endocitozo

Ag+ Ag+

Vstop ionov skozi porine

Adsorpcija na in interakcija s celično membrano

Ag+

Ag+ Ag+

Ag+

Ag+

Generacija srebrovih

ionov

Ag+

Ag+

ROS

Generacija ROS

Oksidacija proteinov

Inhibicija delovanja

mitohondrijev

Oksidacija DNK

Vezava na encime

12

2.6 Merilne metode

2.6.1 Spektrofotometrija z ultravijolično in vidno svetlobo (UV-VIS) UV-VIS (Ultraviolet-visible) spektrofotometer izkorišča sipanje UV in vidne svetlobe ob prehodu skozi vzorec za merjenje koncentracij. Obstajajo dve vrsti spektrofotometrov: enožarčni, ki direktno merijo motnost vzorca, ter dvožarčni, pri katerih se primerja žarek, ki gre skozi vzorec z izhodiščnim žarkom (Csuros in Csuros, 2002). Žarnica v spektrofotometru proizvede žarek bele svetlobe, ki potem potuje do monokromatorja, Ta žarek lomi v spekter, ki naprej potuje do zaklopke. Dvožarčni sistemi imajo tu tudi sekalec žarka, ki izmenjuje vzorčni žarek z referenčnim. Zaklopka deluje kot reža, skozi katero prehaja samo ena izbrana valovna dolžina svetlobe. Omogoča izbor le tistih valovnih dolžin, ki jih želimo vključiti v meritev. Žarek izbrane valovne dolžine nato potuje skozi kiveto, ki vsebuje vzorec, ter naprej do detektorja (Slika 5). Ta s pomočjo fotoupornika svetlobni žarek spremeni v električni tok, ki je direktno odvisen od absorbance vzorca, ter nam ga kot signal pokaže na računalniku priključenem na spektrofotometer (Csuros in Csuros, 2002). Absorbanca (A) je logaritemsko sorazmerna s količnikom intenzitete žarka, ki prehaja skozi vzorec (I) in izhodiščne intenzitete žarka pred vzorcem (I0) po enačbi (Haynes, 2016):

𝐴 = log𝐼0

𝐼 (1)

Postopek se ponovi za vsako izbrano valovno dolžino, tako da dobimo graf, ki nam nazorno kvalitativno (valovna dolžina svetlobe) in kvantitativno (moč signala) karakterizira absorbanco vzorca, ki je odvisna od koncentracije koloidnega srebra v vzorcu.

Slika 5: Shema delovanja UV-VIS spektrofotometra. Povzeto po Csuros in Csuros, 2002.

2.6.2 Spektroskopija s toplotno lečo (TLS) Spektroskopija s toplotno lečo (Thermal Lens Spectroscopy) temelji na pojavu fototermičnega učinka. Ob obsevanju vzorca z laserjem določene valovne dolžine (vzbujevalni žarek) se nekaj energije absorbira v sam vzorec, kar povzroči dvig temperature. Oddajanje energije v središču žarka je večje kot ob obodu, zato se vzorec neenakomerno segreva. Ob stalni osvetlitvi se tako v vzorcu vzpostavi temperaturni gradient, ki v večini tekočin povzroči spremembe lomnega količnika vzorca. Dobimo tako imenovani učinek optične leče, ki je konkavne oblike. Ta učinek lahko zaznamo s še enim laserskim žarkom (poskusni žarek) in je direktno odvisen od absorbance

Žarnica Monokromator Zaklopka Vzorec Detektor Računalnik

13

vzorca, zato je ta metoda primerna za merjenje koncentracije določene snovi v vzorcu (Carter in Harris, 1984) (Slika 6).

Slika 6: Shema pojava toplotne leče v vzorcu skozi katerega potekata vzbujevalni in poskusni žarek. Položaj vzorca za največji možen signal TLS je bil poizkusno določen kot 3,5 konfokalne razdalje za pasom poskusnega žarka. Spremembo intenzitete poskusnega žarka ob prehodu skozi vzorec lahko opišemo z enačbo:

∆𝐼

𝐼= 2,303𝐸𝐴 +

(2,303𝐸𝐴)2

2+⋯ (2)

kjer je A absorbanca vzorca, faktor E pa je opisan z enačbo:

𝐸 = −𝑃 (𝑑𝑛

𝑑𝑇) 1,91𝜆𝑘 (3)

P je moč vzbujevalnega laserja,

(𝑑𝑛

𝑑𝑇) je temperaturni gradient lomnega količnika vzorca,

λ je valovna dolžina poskusnega žarka,

k je toplotna prevodnost vzorca.

Če je absorbanca vzorca majhna (A<0,1) lahko drugi del in ostanek enačbe (2) zanemarimo. Ta metoda je tako primerna za merjenje majhnih koncentracij snovi v vzorcu, kar se je izkazalo za idealno za določevanje nanodelcev koloidnega srebra v vodi (Carter in Harris, 1984).

Vzbujevalni žarek

Poskusni žarek

Toplotna leča

14

2.6.3 Atomska emisijska spektroskopija z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-OES) ICP-OES sistem je sestavljen iz dveh sklopov: plazemskega gorilnika in detektorja. Skozi gorilnik navadno teče plin argon, ki je vžgan in poteka skozi močno električno polje. Zaradi trkov med atomi argona in nabitimi elektroni nastane curek vroče plazme (temperatura je lahko tudi do 10.000 K). V plazmo je nato v obliki razpršila spuščen vzorec. Delci plazme razbijejo molekule v vzorcu na posamezne atome in jih vzbudijo v višja energijska stanja. Vzbujeni atomi ob vrnitvi v osnovno stanje oddajajo emisijske žarke, ki jih kot svetlobo lahko zaznamo s fotodetektorjem (Slika 7). Na podlagi valovne dolžine oddanih žarkov lahko določimo element v vzorcu, na podlagi intenzitete pa koncentracijo danega elementa. V našem primeru lahko izmerimo samo celotno koncentracijo srebra v vzorcu, saj zaradi procesa ionizacije ne moremo ločiti med koloidno in ionsko obliko srebra (Csuros in Csuros, 2002).

Slika 7: Shema delovanja ICP-OES sistema. Povzeto po Csuros in Csuros, 2002.

2.6.4 Atomska absorpcijska spektroskopija (AAS) AAS za svoje delovanje izkorišča sevanje, ki ga atomi oddajo ob prehodu iz vzbujenega stanja nazaj v osnovno stanje. Vzorec se najprej atomizira, tako da dobimo proste atome v obliki plina. Te nato obsevamo z določeno frekvenco svetlobe, ki je odvisna od iskanega elementa. Atomi iskanega elementa nekaj te svetlobe absorbirajo in preidejo v višje energijsko stanje. Ob prehodu nazaj v osnovno stanje

Vzorec

Razpršilec

Plazemski gorilnik

Monokromator

Detektor povezan z

računalnikom

Oddana svetloba

Plamen

15

atomi oddajo sevanje v obliki svetlobe enake frekvence in količine, kot so jo prejeli. Ta svetloba potuje skozi monokromator, ki spusti skozi samo iskano frekvenco. Z detektorjem nato izmerimo koliko svetlobe je bilo oddane s strani iskanega elementa (Slika 8). Oddana svetloba je premo sorazmerna s koncentracijo elementa v vzorcu. Različne AAS metode se razlikujejo predvsem po načinu atomizacije vzorca. Najpogosteje se za to uporabljata plamen ali grafitna peč, ki vzorec atomizirata z visoko temperaturo (>2000 °C). Pri plamenski atomski absorpcijski spektroskopiji (FAAS) se vzorec najprej uplini in nato atomizira, kar vodi do izgube učinkovitosti in posledično višje meje zaznavnosti. Atomska absorpcijska spektroskopija z grafitno pečjo (GFAAS) celoten vzorec atomizira v električno greti grafitni cevi, tako da je meja zaznavnosti veliko nižja in za analizo potrebujemo veliko manj vzorca (Welz in Sperling, 1999; Csuros in Csuros, 2002).

Slika 8: Shema delovanja GFAAS sistema. Povzeto po Csuros in Csuros, 2002.

2.6.5 Kolorimetrična ekstrakcija na trdni fazi (C-SPE) Ta metoda temelji na obarvanju in ločitvi delcev v vodni raztopini. Vzorec poteka skozi membrano, ki je impregnirana s kolorimetričnim reagentom. Za meritve vsebnosti srebra je ta 5-(4-dimetilaminobenziliden)rodanin (DMABR), ki je obenem odporen na vrsto motenj. DMABR se veže na ionsko, ne pa koloidno srebro, tako da je za merjenje koloidnega srebra potrebna predpriprava vzorca z dodatkom oksidanta, ki srebro ionizira. Kot oksidant se uporabi kalijev peroksimonosulfat. Zaradi kislosti oksidanta se pH uravna še z dodatkom natrijevega karbonata, kar preprečuje reakcijo oksidanta z DMABR in posledično razbarvanje srebra. Obarvano srebro se nato analizira s spektroskopijo difuzne odbojnosti (DRS), pri kateri delce v vzorcu obsevamo s svetlobo, in merimo razpršeno svetlobo, ki je potovala skozi delce (Slika 9). S C-SPE lahko merimo koncentracije 100-1000 ppb v zelo kratkem času (2min) in z obema postopkoma je metoda uporabna za merjenje koloidnega in ionskega srebra (Hill idr., 2009).

Vir svetlobe Grafitna celica z vzorcem

Monokromator

Detektor Ojačevalec signala

Računalnik

16

Slika 9: Shema delovanja C-SPE sistema. Povzeto po Hill idr., 2009; Berne in Pecora, 2000.

2.6.6 Voltametrične metode Voltametrične metode temeljijo na vzpostavitvi električnega potenciala v elektrokemični celici in merjenju električnega toka ki ob tem teče. Elektrokemična celica je navadno sestavljena iz treh elektrod: referenčne, delovne in števne. Med delovno in referenčno elektrodo je vzpostavljen električni potencial, med delovno in števno elektrodo pa je merjen električni tok. Ker električni tok ne poteka skozi referenčno elektrodo je potencial na njej konstanten. Voltametričnih metod za merjenje koncentracij v vzorcu je več, najbolj uporabljane pa so ciklična voltametrija in t.i. stripping voltametrija. Gre za dvostopenjski metodi. Pri ciklični voltametriji se v prvem delu viša električno napetost na delovni elektrodi, tako da ta postane vedno bolj negativna, dokler se srebrovi ioni v vzorcu ne reducirajo. Takrat steče električni tok med delovno in števno elektrodo, ki ga izmerimo. V drugem delu se potencial obrne, tako da se srebrovi atomi oksidirajo. Ta cikel lahko večkrat ponovimo, koncentracijo v vzorcu pa določimo s pomočjo izmerjenega električnega toka, kateri je sorazmerno odvisen od koncentracije. Pri stripping metodi srebro najprej elektrolitsko odlagamo na delovno elektrodo (Slika 10). Količina odloženega srebra je odvisna od koncentracije v vzorcu. Nato se veča napetost na elektrodi, dokler se srebro ne začne »trgati« z elektrode nazaj v vzorec. Steče električni tok, s pomočjo katerega lahko izračunamo koncentracijo v vzorcu (Pašti idr., 2014; March idr., 2015).

Vzorec

Odpad

Membrana impregnirana z

DMABR

Vir svetlobe

Detektor

Obarvani nanodelci

17

Slika 10: Shema 3-elektrodne celice uporabljane v voltametričnih metodah. Povzeto po Cardoso idr., 2014.

2.6.7 Masna spektrometrija (MS) Z masno spektrometrijo lahko določimo koncentracije v vzorcu glede na njihovo razmerje med maso in nabojem. V masnem spektrometru se vzorec najprej uplini. Vir elektronov nato delce v plinu ionizira. Pospeševalec z uporabo električnega polja delce pospeši in napelje v magnetno polje. Žarek nabitih delcev v magnetnem polju potuje po krogu s polmerom, ki je odvisen od količnika naboja in mase delca (Slika 11). Zaradi tega se žarek delcev razdeli na spekter, razdeljen po razmerju med maso in nabojem delcev. Delci z večjo maso potujejo po delu kroga z manjšim polmerom, delci z manjšo maso pa z večjim polmerom. Detektor meri količine prispelih delcev. V našem specifičnem primeru ima metoda masne spektrometrije to slabost, da lahko z njo zaradi procesa ionizacije merimo le celotno srebro v vzorcu in ne le koloidnega.

Referenčna elektroda

Delovna elektroda

Števna elektroda

Vzorec

Uravnavan potencial Teče tok

18

Slika 11: Shema delovanja masnega spektrometra. Povzeto po Csuros in Csuros, 2002.

3 MATERIALI IN METODE

3.1 Priprava vzorcev

3.1.1 Uporabljene kemikalije in reagenti: NaBH4 (99 %, Acros organics) AgNO3 (99,8 %, Carlo Erba) NaOH (99 %, VWR) diH2O (2x deionizirana, 18 MΩ x m⁻¹, Nanopure) HNO3 (65 %, BAKER, VLSI grade) Na2HPO4 (99 %, Acros organics)

3.1.2 Priprava raztopine reducenta Pripravili smo 5 % vodno raztopino NaOH z raztopitvijo 5,02 g NaOH v 100 mL H2O. Zaradi eksotermnosti reakcije smo v 100 mL bučki NaOH raztopili postopoma, zrno po zrno. V 500 mL čašo smo nalili deionizirano vodo (diH2O) in pod pH metrom s plastično kapalko po kapljicah dodajali 5 % raztopino NaOH, dokler pH nove vodne raztopine ni dosegel vrednosti 12,5. 1 M Raztopino NaBH4 smo pripravili z raztapljanjem 0,096 g NaBH4 v 25 mL vodne raztopine NaOH s pH 12,5. 30 µL te raztopine smo nadalje razredčili v 50 mL vodne raztopine NaOH s pH 12,5 tako, da smo dobili 0,6 mM raztopino NaBH4 s pH 12,5. Raztopina na svetlobi hitreje razpada, zato smo jo shranili ovito v aluminijasto folijo.

3.1.3 Priprava osnovne raztopine koloidnega srebra Za pripravo osnovne raztopine srebra smo v 10 mL merilni bučki v diH2O raztopili 15,7 mg AgNO3, ter jo napolnili do označbe. 100 µL te raztopine smo potem nadalje razredčili v 100 mL bučki, ter

Vzorec Ionizator

Pospeševalnik

Magnetno polje

Detektor

19

tako pridobili 1000 ppb delovno raztopino. To smo shranili ovito v alu-folijo. Za potrebe poizkusov, smo to nadalje redčili v ustrezne koncentracije v 10 mL merilnih bučkah.

3.1.4 Priprava raztopine dušikove kisline V 100 mL merilno bučko smo nalili nekaj diH2O. Odmerili smo 0,697 mL 65 % HNO3 in jo zaradi burnosti reakcije med kislino in vodo počasi dodajali v merilno bučko z vodo. Bučko smo nato do označbe napolnili z diH2O, tako da smo dobili 0,1 M raztopino dušikove kisline.

3.1.5 Priprava raztopine fosfatnega pufra V 100 mL merilni bučki smo raztopili 70 mg Na2HPO4 in do označbe napolnili z diH2O. V drugi bučki smo v vodi raztopili 0,40 g NaOH in do označbe napolnili z diH2O. Za pripravo 5 mM pufra s pH 12,5 za nevtralizacijo kisline smo zmešali 54 mL raztopine natrijevega hidroksida in 100 mL raztopine dinatrijevega fosfata.

Na2HPO4 + NaOH → Na3PO4 + H2O (4)

3.1.6 Priprava delovnih raztopin Vzorce za pripravo umeritvene premice smo pripravili v 10 mL merilnih bučkah in sicer z izbrano količino raztopine srebra, 1 mL 0,6 mM raztopine NaBH4 s pH 12,5 in do označbe napolnjeno z diH2O (Formula (5)). Tudi te vzorce smo shranili ovite v alu-folijo. Generacija koloidnega srebra temelji na kemični redukciji srebrovih ionov z uporabo borohidrida in sledi enačbi:

2AgNO3 + 2NaBH4 + 6H2O → 2Ag + 7H2 + 2NaNO3 + 2H3BO3 (5)

V diplomski nalogi smo za pridobivanje koloidnega srebra kot vir srebrovih ionov uporabili srebrov nitrat v vodni raztopini, za reducent in stabilizator pa natrijev borohidrid. Potreben je velik presežek natrijevega borohidrida nad srebrovim nitratom ([NaBH4]/[AgNO3] = vsaj 2) tako za redukcijo ionskega srebra v koloidno obliko kot za stabilizacijo nastalih nanodelcev (Mulfinger idr., 2007).

3.1.7 Priprava poizkusnih vzorcev

Vzorec 1 (Vz1): Koloidno srebro, 50 mL razpršilo za razkuževanje ran. Sestavine: voda, koloidno srebro (15 ppm).

Vzorec 2 (Vz2): Koloidno srebro, 50 mL razpršilo za nos, za razkuževanje dihalnih poti. Sestavine: voda, koloidno srebro (20 ppm).

Vzorec 3 (Vz3): Koloidno srebro, 50 mL kapljice za nos. Sestavine: voda, koloidno srebro (25-30 ppm).

Vzorec 4 (Vz4): Koloidno srebro, 200 mL za notranjo uporabo kot antibakterijsko sredstvo. Sestavine: voda, koloidno srebro (5 ppm).

20

Vzorec 5 (Vz5): Koloidno srebro, 200 mL za notranjo uporabo za splošno izboljšanje stanja telesa. Sestavine: voda, koloidno srebro (15 ppm).

Za določevanje koncentracije koloidnega srebra v vzorcih smo uporabili čiste poizkusne vzorce brez predhodne obdelave, za merjenje celotnega srebra pa smo v 10 mL bučke dodali 1 mL 0,6 mM raztopine borohidrida in do označbe napolnili z vzorcem, ter primerno razredčili.

3.1.8 Določevanje koncentracije srebra prilepljenega na stene stekleničk v katerih je bilo

koloidno srebro shranjevano Pripravili smo 0,1 M raztopino dušikove kisline, namenjeno raztopitvi srebra prilepljenega na stene posod v katerih je bilo koloidno srebro hranjeno in fosfatni pufer, namenjen nevtralizaciji te kisline. V posode, v katerih je bilo koloidno srebro hranjeno smo odmerili 5 mL (vzorci Vz1, Vz2, Vz3) oz. 10 mL (vzorci Vz4, Vz5) 0,1 M dušikove kisline in splaknjevali 10 min, tako da se je srebro raztopilo v kislini. 5 mL vzorcev smo prelili v 10 mL bučke in dodali 5 mL fosfatnega pufra, ki je nevtraliziral kislino in sprostil ionsko srebro v vzorcu. Nato smo vzorcem dodali po 1 mL 0,06 mM borohidrida, da smo reducirali ionsko srebro v koloidno obliko.

3.1.9 Priprava delovnih raztopin za UV-VIS spektrofotometrijo Pripravili smo vzorce koloidnega srebra koncentracij: slepi signal (samo diH2O in NaBH4); 0,1 ppm; 0,3 ppm; 0,5 ppm; 1,0 ppm; 1,2 ppm in 1,4 ppm. Osnovno raztopino 1000 ppm smo razredčili na 10 ppm: v merilno bučko volumna 100 mL smo s pipeto nalili 1 mL delovne raztopine 1000 ppm in jo nato do označbe napolnili z diH2O. Nato smo v 10 mL merilno bučko s pipeto odmerili 100 µL 10 ppm raztopine, dodali 1 mL 0,06 mM borohidrida in do označbe napolnili z diH2O. Tako smo dobili standardno raztopino koncentracije 0,1 ppm. Postopek smo ponovili v novih merilnih bučkah, le da smo odmerili po 300 µL, 500 µL, 1,0 mL, 1,2 mL ali 1,4 mL razredčene osnovne raztopine 10 ppm, take da smo dobili standardne raztopine navedenih koncentracij.

3.1.10 Priprava delovnih raztopin za spektroskopijo s toplotno lečo v serijski postavitvi

(TLS-BM) Za TLS meritve smo za umeritveno krivuljo poleg slepega pripravili vzorce sledečih koncentracij: 20, 40, 60, 80 in 100 ppb. S pipeto smo v 100 mL merilno bučko odmerili 100 µL 1000 ppm osnovne raztopine in jo do označbe napolnili z diH2O, tako da smo dobili razredčeno osnovno raztopino 1000 ppb. V 10 mL merilno bučko smo nato odmerili 200 µL te 1000 ppb raztopine, dodali 1 mL 0,06 mM borohidrida in do označbe napolnili z diH2O. Tako smo dobili standardni vzorec koncentracije 20 ppb. Postopek smo ponovili v novih merilnih bučkah, le da smo odmerili 400 µL, 600 µL, 800 µL ali 1 mL 1000 ppb raztopine, tako da smo dobili standardne vzorce ustreznih koncentracij.

21

3.1.11 Priprava delovnih raztopin za spektroskopijo s toploto lečo v pretočni postavitvi

(TLS-FIA) Pri TLS v FIA postavitvi smo za umeritveno krivuljo pripravili vzorce s koncentracijami 0 (slepi vzorec), 20, 40, 60, 80, 100, 120 in 150 ppb. S pipeto smo v 100 mL merilno bučko odmerili 100 µL osnovne raztopine koloidnega srebra 1000 ppm in jo napolnili do označbe z diH2O, tako da smo dobili razredčeno osnovno raztopino s koncentracijo 1000 ppb. V 10 mL merilno bučko smo nato odmerili 200 µL te razredčene osnovne raztopine, dodali 1 mL 0,06 mM borohidrida in do označbe napolnili z diH2O, tako da smo dobili standardni vzorec koncentracije 20 ppb. Postopek smo ponovili v novih merilnih bučkah volumna 10 mL, le da smo vanje odmerili 400 µL, 600 µL, 800 µL, 1 mL, 1,2 mL ali 1,5 mL razredčene osnovne raztopine koncentracije 1000 ppb, tako da smo dobili standardne vzorce ustreznih koncentracij.

3.1.12 Priprava poizkusnih vzorcev za UV-VIS spektrofotometrijo Pri meritvah koloidnega srebra so poizkusni vzorci nerazredčeni, za meritve celotnega srebra pa smo vzorce razredčili, tako da so dobljeni rezultati bili na linearnem območje umeritvene premice (Vz1 – 1:100, Vz2 – 1:100, Vz3 – 1:40, Vz4 – 1:10, Vz5 – 1:30). Razredčitve smo izvajali v 10 mL merilnih bučkah: vanje smo odmerili ustrezno količino koloidnega srebra in jih do označbe napolnili z diH2O.

3.1.13 Priprava poizkusnih vzorcev za spektroskopijo s toplotno lečo v pretočni postavitvi

(TLS-FIA) Poizkusne vzorce smo razredčili v 10 mL merilnih bučkah, tako da smo odmerili ustrezen volumen vzorca in bučko napolnili do označbe z diH2O. Za meritev celotnega srebra smo pred dodajanjem vode v bučke odmerili še po 1 mL 0,06 mM borohidrida. Vzorce smo razredčili zato, da bi odmerjen TLS signal bil v linearnem intervalu umeritvene premice (Sliki 28 in 29).

3.2 Določevanje spodnje meje detekcije metod Meritev slepega vzorca smo izvajali trikrat, tako da smo lahko izračunali povprečje in standardno deviacijo. Signal slepega vzorca smo nato odšteli od ostalih meritev in dobili točke za umeritveno premico. Zaradi zahteve Beer-Lambertovega zakona po linearnosti krivulje nismo upoštevali vseh točk. Mejo detekcije smo izračunali z enačbo:

𝐿𝑂𝐷 =3𝜎

𝑘 (6)

σ je standardna deviacija slepega vzorca k je smerni koeficient umeritvene krivulje

22

Standardna deviacija je bila izračunana po enačbi:

𝜎 = √∑ (𝑥𝑖−�̅�)2𝑁

𝑖=1

𝑁−1 (7)

𝑥𝑖 je posamezna meritev slepega vzorca �̅� je povprečna vrednost slepega vzorca

𝑁 je število meritev slepega vzorca

3.3 Določanje koncentracije srebra v vzorcu Enačba umeritvene krivulje je opisana z uporabo standardne enačbe za linearne funkcije

𝑦 = 𝑘𝑥 + 𝑛 (8)

v katero vstavimo naše parametre: 𝑦 je absorbanca, 𝑥 je koncentracija in 𝑘 smerni koeficient. Konstanta 𝑛 je 0, ker smo že odšteli slepe vzorce in krivulja poteka skozi izhodišče koordinatnega sistema. Iz tega lahko dobimo končno enačbo za izračun koncentracije srebra (bodisi koloidnega bodisi celotnega) v poizkusnih vzorcih, ki je:

𝑐 =𝐴

𝑘 (9)

A je izmerjena absorbanca k je smerni koeficient umeritvene krivulje c je dobljena izračunana koncentracija

3.4 Določanje intervalov zaupanja za TLS-BM Za oceno natančnosti metode smo izračunali interval zaupanja, ki nam pove na kakšnem realnem intervalu leži prava vrednost parametra ob dani verjetnosti. Meritve koncentracije koloidnega ali celotnega srebra v vzorcih smo izrazili kot normalno porazdeljene slučajne spremenljivke s parametroma µ (matematično upanje spremenljivke) in σ (standardni odklon). Matematično upanje smo izrazili kot aritmetično sredino vzorca podatkov (�̅�):

�̅� =∑ 𝑥𝑖𝑛𝑖=1

𝑛 (10)

Ker standardnega odklona nimamo, smo izračunali nepristransko oceno zanj (𝑠):

𝑠2 =∑ (𝑥𝑖−�̅�)

2𝑛𝑖=1

𝑛−1 (11)

23

Interval zaupanja to interval na realni osi, na katerem z določeno, v naprej predpisano verjetnostjo leži prava vrednost proučevanega parametra. Predpisano verjetnost imenujemo stopnja zaupanja

in se jo označi z 1 – imenujemo tveganje. Pri tem parametru pravimo stopnja značilnosti. Za stopnjo značilnosti smo izbrali vrednost 0,01, tako da smo dobili interval za 99 % stopnjo

zaupanja. V našem primeru ne poznamo vrednosti parametrov in , tako da se z verjetnostjo

(1 – ) nahaja na intervalu:

𝐼𝑍 = �̅� ∓ 𝑡1−𝛼2(𝑛 − 1)

𝑠

√𝑛 (12)

Kjer:

�̅� je aritmetična sredina vzorca podatkov izračunana po enačbi 10 𝑡1−𝛼

2(𝑛 − 1) je vrednost dobljena iz tabele Študentove t porazdelitve (tabela 1) za stopnjo

značilnosti α in (𝑛 − 1) prostostne stopinje.

𝑠 je točkovna ocena disperzije dobljena po enačbi 11. 𝑛 je velikost vzorca Tabela 1: Študentova t porazdelitev

Stopinje prostosti (n) Stopnja značilnosti (α)

0,01

1 31,821

2 6,965

3 4,541

4 3,747

5 3,365

6 3,143

7 2,998

8 2,896

9 2,821

10 2,764

3.5 Izvajanje meritev

3.5.1 Ultravijolično – vidno spektroskopija (UV-VIS) UV-VIS meritve so bile izvajane s PerkinElmer Lambda 650 spektrofotometrom z dvožarčnim sistemom. Izbran interval valovnih dolžin je bil 300-500 nm. Kot slepi signal smo uporabili diH2O z dodanim borohidridom (1 mL borohidrida v 10 mL merilno bučko in do črte napolnili z diH2O). Meritve slepega signala smo izvajali trikrat ter iz njih izračunali standardno deviacijo za pridobitev LOD merilne metode.

24

S plastično kapalko smo najprej z vzorcem sprali kiveto za meritve (10 mm, kvarc, Hellma Analytics). To tekočino smo nato zavrgli in kiveto ponovno napolnili z istim vzorcem. Ta postopek smo izvajali za vsak vzorce posebej in sicer za vsakega s svojo plastično kapalko.

Slika 12: UV-VIS spektrofotometer PerkinElmer Lambda 650S.

3.5.2 Spektroskopija s toplotno lečo – serijska postavitev (TLS-BM) Pri serijski postavitvi merilnega sistema (Batch Mode, BM) gre za meritev koncentracije koloidnega ali celotnega srebra v vzorcih v stacionarnem (ne pretočnem) sistemu. Za meritve smo uporabili postavitev v laserskem laboratoriju UNG v Rožni Dolini (Sliki 13 in 15). Vzbujevalni žarek je bil s kriptonskega laserja (Innova 300C, Coherent), delujoč pri 407-413 nm valovne dolžine z močjo 120 mW. Koloidno srebro ima pri tej valovni dolžini višek absorpcije svetlobe, zato je ta primerna za vzbujanje srebrovih nanodelcev. Ta žarek je bil moduliran s pomočjo mehanskega sekalca žarka (Scientic instruments) pri frekvenci 40 Hz. Ta frekvenca je bila poizkusno določena za optimalno razmerje signal/šum (S/N). Poskusni žarek je bil proizveden s pomočjo He-Ne laserja (Uniphase, Model 1103P) pri 632,8 nm in močjo 2 mW. Oba žarka sta bila osredotočena z lečo z goriščno razdaljo 100 mm in premerom 25 mm (Edmund Optics), ter z ogledali (Thorlabs) usmerjena na dikroično ogledalo (LASER COMPONENTS) - To je križno prekrilo žarka, ter jih usmerilo v merilno celico z optično potjo 1 cm in prostornino 3 mL. Poskusni žarek je potekal skozi interferenčni filter in režo (Melles Griot) do fotodiode (Thorlabs) priključene na merilnik napetosti z ojačevalnikom (Stanford research instruments, model SR830 DSP) in

25

računalnik. Z merilnikom napetosti je bil nato preko ojačevalca povezan z računalnikom. Z merilnikom napetosti je povezan tudi sekalec žarka. Merjeni so bili samo signali enake frekvence, kot jo je imel sekalec žarka.

Vzorce smo podobno kot za UV-VIS metodo s plastičnimi kapalkami nalivali v kiveto, katero smo z vzorcem predhodno splaknili.

3.5.3 Spektroskopija s toplotno lečo – pretočna postavitev (TLS-FIA) Uporabljen je bil isti sistem za TLS kot v primeru BM postavitve, vendar je bil dodan injekcijski ventil za vbrizgavanje vzorca s pomočjo nosilne raztopine, ter črpalka, ki je nosilno raztopino in vzorec pretakala skozi merilno kiveto (Sliki 14 in 15). Vsi elementi FIA sistema so bili brezkovinski. Pri pretočni postavitvi merilnega sistema (Flow Injection Analysis, FIA) vzorec potuje do meritvenega mesta po nosilni raztopini. Ta stalno teče s pomočjo črpalke po sistemu, skozi pretočno kiveto v odpad. Ob naložitvi vzorca v injektor se ta steče v vzorčno zanko, višek odteče

Ogledalo

Vzbujevalni žarek

Merilnik napetosti z

ojačevalcem

Sekalec žarka

Dikroično ogledalo

Celica z vzorcem

Leči

Poskusni žarek

Fotodioda z režo in interferenčnim filtrom

Slika 13: Shema postavitve TLS sistema v BM postavitvi.

26

v odpad. Ob premiku ročice na injekcijskem ventilu nosilna raztopina steče skozi vzorčno zanko in s seboj odnese vzorec v merilno kiveto in odteče naprej v odpad. Stekleno injekcijo smo napolnili z vzorcem in ga zavrgli, tako da je bila injekcija splaknjena z vzorcem. Ponovno smo jo napolnili, ter vzorec počasi vbrizgali skozi injekcijski ventil (Rheodyne, model 7725, brezkovinski ventil) v vzorčno zanko (100 µL, Cheminert, VICI) . Nato smo premaknili ventil ter injekcijo odstranili od vhoda za vzorec, tako da je lahko vzorec preko nosilca stekel v vzorčno kiveto in nato ven v odpad. Kot nosilec je bila izbrana diH2O, poganjala pa ga je HPLC črpalka (Shimadzu LC10Ai) s pretokom 0,6 mL/min.

Črpalka z nosilno

raztopino

Vzorec

Odpad

Ogledalo

Vzbujevalni žarek

Sekalec žarka

Merilnik napetosti z

ojačevalcem

Dikroično ogledalo

Celica z vzorcem

Poskusni žarek

Fotodioda z režo in interferenčnim filtrom

Leči

Slika 14: Shema postavitve TLS sistema v FIA postavitvi (teoretično).

27

Slika 15: Postavitev TLS sistema s FIA injektorjem (v praksi).

Slika 15 predstavlja poizkusni sistem TLS v FIA postavitvi v laserskem laboratoriju UNG v Novi Gorici . Na njej so vidne vse posamezne komponente: oba laserja (1 za vzbujevalni žarek, 2 za poskusni žarek), ogledala, leče, sekalec žarka (3), celica z vzorcem (4) in injekcijski ventil (5) priklopljen na črpalko (6).

4 REZULTATI IN RAZPRAVA

4.1 Optični pregled raztopin Po postopku opisanem v 3. poglavju smo pripravili delovne vzorce s koncentracijo koloidnega srebra enako testiranim vzorcem (5 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 25ppm, 30ppm). Delci koloidnega srebra absorbirajo večino svetlobe v modrem delu vidnega spektra in odbijajo ostalo, zaradi česar je koloid rumeno obarvan (slike 16-20). Višanje koncentracije srebrovih nanodelcev v koloidu viša tudi jakost obarvanosti. Opaziti je bilo mogoče tudi pojav aglomeracije – nanodelci so se sčasoma zaradi trkanja povezali v večje enote, zaradi česar se je tudi premaknil absorpcijski spekter in koloid obarval sivo. Skozi čas je bilo moč opaziti tudi usedanje delcev srebra, kar je vodilo v razpad koloidne strukture vzorcev. To kaže na neobstojnost koloidnega srebra.

1

2

4

3

5

6

28

Ob optični primerjavi delovnih vzorcev s poizkusnimi lahko vidimo razliko v jakosti obarvanosti. Medtem ko so delovni vzorci očitno rumeno obarvani, so poizkusni vzorci skoraj popolnoma prozorni (slike 16-20). Po tem lahko sklepamo, da je koncentracija srebrovih nanodelcev v njih zelo nizka. Poizkusnim vzorcem smo dodali borohidrid, ki je prisotno ionsko srebro zreduciral v elementarno obliko. Po mnogo močnejši obarvanosti lahko vidimo, da je koncentracija celotnega srebra veliko višja v primerjavi s koloidnim. Temu sledi, da je večina srebra v poizkusnih vzorcih dejansko v ionski obliki in ne nanodelcih.

Slika 16: Od level proti desni: vzorec Vz1, vzorec 15 ppm, vzorec Vz1 z dodanim borohidridom.

29

Slika 17: Od leve prot desni: vzorec Vz2, vzorec 20 ppm, vzorec Vz2 z dodanim borohidridom.

Slika 18: Od leve proti desni: vzorec Vz3, vzorec 25 ppm, vzorec 30 ppm, vzorec Vz3 z dodanim borohidridom.

30

Slika 19: Od leve proti desni: vzorec Vz4, vzorec 5 ppm, vzorec Vz4 z dodanim borohidridom.

Slika 20: Od leve proti desni: vzorec Vz5, vzorec 15 ppm, vzorec Vz5 z dodanim borohidridom.

31

4.2 UV-VIS spektrofotometrija Rezultate UV-VIS spektrofotometra za koncentracije vzorcev 0,1 ppm; 0,3 ppm in 0,5 ppm smo zbrali v graf, ki nazorno kaže odvisnost absorbance od valovne dolžine:

Slika 21: Odvisnost absorbance standardnih raztopin različnih koncentracij koloidnega srebra od valovne dolžine. Vrhovi absorbance so okrog valovne dolžine 410 nm, kar je v modrem spektru vidne svetlobe in je tudi razlog za rumeno obarvanost raztopine. Z višanjem koncentracije vrhovi absorbance postajajo višji in širši. Po tem lahko sklepamo, da so pri višjih koncentracijah delci na splošno večji, prav tako pa je njihova velikost bolj raznolika. Za sestavo umeritvene premice smo izbrali meritve do 1,2 ppm, ker naraščanje absorbance z višjimi koncentracijami ni bilo več linearno. Dobili smo premico z enačbo 𝑦 = 0,0731𝑥 in

korelacijskim koeficientom 𝑅2 = 0,9962 (Slika 22). S pomočjo enačb (6) in (7) smo izračunali spodnjo mejo detekcije, ki je znašala LOD = 32 ppb. Z uporabo enačbe (9) smo izračunali koncentracije koloidnega in celotnega srebra v poizkusnih vzorcih in jih zbrali v tabelo 2.

0,030

0,035

0,040

0,045

0,050

0,055

0,060

0,065

0,07030

030

931

832

733

634

535

436

337

238

139

039

940

841

742

643

544

445

346

247

148

048

949

850

751

652

553

454

355

256

157

057

958

859

7

Ab

so

rban

ca [

a.u

.]

Valovna dolžina [nm]

blank

0,1ppm

0,3ppm

0,5ppm

32

Slika 22: Umeritvena premica za določevanje koncentracije koloidnega srebra v tekočih vzorcih pri uporabi UV-VIS spektrofotometrije. Tabela 2: Izračunane koncentracije koloidnega in celotnega srebra v poizkusnih vzorcih, merjene z UV-VIS spektrofotometrom.

Vzorec Koloidno srebro [ppb] Celotno srebro [ppm]

Vz1 <LOD 26±2

Vz2 <LOD 35±2

Vz3 711±3 22±1

Vz4 <LOD 20±1

Vz5 284±2 30±2

Izkazalo se je, da imata le dva vzorca (Vz3 in Vz5) koncentracijo koloidnega srebra preko LOD metode. Nasprotno so bile koncentracije celotnega srebra precej visoke, kar kaže na to, da je večina srebra resnično v ionski obliki.

4.3 TLS – postavitev BM Meja detekcije se je pri UV-VIS spektrofotometriji izkazala kot previsoka za meritev nizkih koncentracij koloidnega srebra v poizkusnih vzorcih, zato smo za nadaljnje meritve uporabili TLS metodo. Rezultate meritev smo zbrali v graf odvisnosti TLS signala od koncentracije srebra v vzorcu:

y = 0,0731xR² = 0,9962

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6

Ab

so

rban

ca

[a.u

.]

Koncentracija [ppm]

33

Slika 23: Odvisnost TLS-BM signala od koncentracije koloidnega srebra v vzorcu. Splošno gledano razmerje med TLS signalom in koncentracijo ni linearno (enačba 2, slika 23) in je odvisno od absorbance vzorca. Kljub temu ga lahko za nizke absorbance (A < 0,1) zadovoljivo opišemo z linearnim približkom. Za naše vzorce to velja za koncentracije nižje od 80 ppb (slika 24). Na krivulji smo izvedli linearno regresijo po metodi najmanjših kvadratov, na osnovi katere je mogoče določiti parametre prilagojene krivulje in izračunati LOD metode.

Slika 24: Umeritvena premica za določevanje koncentracije koloidnega srebra v tekočih vzorcih pri uporabi TLS v BM postavitvi poizkusnega sistema.

y = 0,0092x2 + 0,4006xR² = 0,9701

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

TL

S s

ign

al

[m

V]

Koncentracija [ppb]

y = 0,9469xR² = 0,9944

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

TL

Ssig

nal

[mV

]

Koncentracija [ppb]

34

Iz slike 24 lahko vidimo, da imajo signali standardno deviacijo nižjo od 5 %. LOD je bil izračunan za razmerje med signalom in šumom vrednosti 3 in znaša 0,09 ppb (y = 0.947x; R2 = 0.99) Metoda TLS je tako več kot 300-krat občutljivejša od UV-VIS spektrofotometrije, po čemer lahko sklepamo, da bomo iz poizkusnih vzorcev dobili berljive rezultate kljub nizkim koncentracijam. Za izračun koloidnega srebra smo poizkusne vzorce pripravili nerazredčene, ob dodatku borohidrida pa smo vzorce 10-700-krat razredčili, tako da so pričakovani rezultati v mejah linearnega območja umeritvene premice. Tabela 3: Izračunane koncentracije koloidnega in celotnega srebra v poizkusnih vzorcih, merjene s TLS v BM postavitvi.

Vzorec Koloidno srebro [ppb] Celotno srebro [ppm]

Vz1 54±1 18±1

Vz2 114±5 24±1

Vz3 777±17 17±2

Vz4 117±5 20±1

Vz5 266±10 31±2

Vidimo lahko, da imajo vsi vzorci koncentracijo koloidnega srebra pod 1 ppm, kar podpira rezultate dobljene pri uporabi metode UV-VIS spektrofotometrije. S pomočjo podatkov metode TLS-BM smo tudi izračunali 99 % intervali zaupanja za koncentracije koloidnega in celotnega srebra in jih zbrali v tabeli 4: Tabela 4: 99 % intervali zaupanja za določevanje koloidnega in celotnega srebra.

Vzorec Koloidno srebro [ppb] Celotno srebro [ppm]

Vz1 [50, 58] [10, 26]

Vz2 [94, 134] [13, 35]

Vz3 [708, 846] [12, 22]

Vz4 [98, 137] [16, 24]

Vz5 [226, 306] [26, 35]

Rezultati kažejo, da so podatki pridobljeni z uporabo UV-VIS spektrofotometrije in TLS v BM postavitvi in z 99 % stopnjo zaupljivosti zadovoljivi, saj se realne vrednosti z 99 % verjetnostjo nahajajo znotraj teh intervalov, v katere padejo tudi merjene vrednosti.

35

4.4 TLS – postavitev FIA Vsako meritev smo trikrat ponovili, tako da smo koncentracijo koloidnega srebra obtežili s povprečno vrednostjo višine vrhov TLS signala (sliki 25 in 26).

Slika 25: Odvisnost TLS-FIA signala od koncentracije koloidnega srebra v vzorcu.

Slika 26: TLS signal za merjenje koncentracije koloidnega srebra v FIA postavitvi. Po slikah 25 in 26 vidimo, da TLS signal linearno narašča do koncentracije vzorca 80 ppb (Slika 27).

y = 0,0002x2 + 0,1139xR² = 0,9952

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

TL

S s

ign

al

[mV

]

Koncentracija [ppb]

0

5

10

15

20

25

30

35

0 500 1000 1500 2000 2500

TL

S s

ign

al

[mV

]

Čas [s]

36

Slika 27: Umeritvena premica za določevanje koncentracije koloidnega in celotnega srebra v tekočih vzorcih pri uporabi TLS v FIA postavitvi. Enačba linearizirane umeritvene premice je y = 0.148x (R2 = 0.99). Mejo detekcije smo izračunali kot 0,45 ppb, kar je 60-krat nižje kot v primeru z UV-VIS spektrofotometrijo.

Slika 28: TLS signal za koloidno in celotno srebro v poizkusnih vzorcih (a)(1 - Vz1 (10x razredčen), 2 - Vz2 (10x razredčen), 3 – Vz3 (10x razredčen): 1, 2, 3 – koloidno srebro; 1a –

y = 0,147466xR² = 0,994026

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

TL

S s

ign

al

[mV

]

Koncentracija [ppb]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

TL

S s

ign

al

[mV

]

Čas [s]

2

3

1a

2a

3a

1

37

Vz1 (500x razredčen), 2a – Vz2 (700x razredčen), 3a – Vz3 (500x razredčen): 1a, 2a, 3a – celotno srebro).

Slika 29: TLS signal za koloidno in celotno srebro v poizkusnih vzorcih (b)(4 – Vz4 (nerazredčen), 5 – Vz5 (4x razredčen): 4, 5 – koloidno srebro; 4a – Vz4 (200x razredčen), 5a – Vz5 (400x razredčen): 4a, 5a – celotno srebro). Rezultati so povzeti v tabeli 5. Opazimo, da so dobljene vrednosti koloidnega in celotnega srebra znotraj 99 % intervala zaupanja, ki smo ga izračunali pri postavitvi BM. Iz tega lahko sklepamo na visoko točnost TLS. Natančnost metode, opisana kot relativna standardna deviacija (RSD) je bila manjša od 5,6 % (slika 28 in 29). Ta rezultat kaže na dobro ponovljivost metode. Tabela 5: Izračunane koncentracije koloidnega in celotnega srebra v vzorcih, merjene s TLS v FIA postavitvi.

Vzorec Koloidno srebro [ppb] Celotno srebro [ppm]

Vz1 53±3 25±2

Vz2 132±6 33±2

Vz3 772±6 20±1

Vz4 96±4 23±2

Vz5 252±6 26±1

Končni rezultati so primerljivi z vrednostmi pridobljenimi s TLS-BM metodo in UV-VIS spektrofotometrijo. Statistično značilne razlike med njimi ni, tako da ugotavljamo, da je TLS tehnika, tako v BM kot FIA postavitvi, uporabna za analizo široke palete vzorcev. Kaže tudi boljše statistične lastnosti, kot je npr. najnižja meja zaznavnosti.

0

2

4

6

8

10

12

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

TL

S s

ign

al

[mV

]

Čas [s]

4 5

4a

5a

38

4.5 ICP OES Za preveritev točnosti TLS metode smo izvajali meritev koncentracije celotnega srebra tudi po ICP-OES metodi. Rezultati so povzeti v tabeli 6. Tabela 6: Koncentracije srebra po ICP OES metodi.

Vzorec Celotno srebro [ppm]

Vz1 23

Vz2 28

Vz3 18

Rezultati se dobro ujemajo z dobljenimi pri uporabi TLS metode, kar še dodatno dokazuje prednosti TLS sistema kot visoko občutljive in selektivne tehnike.

4.6 Določevanje količine srebrovih zvrsti odloženih na stenah steklenic, v katerih je

bilo koloidno srebro hranjeno Zaradi zelo majhnih koncentracij koloidnega srebra v izmerjenih vzorcih smo predvidevali, da se nekaj nanodelcev elektrostatsko veže na stene posode, v kateri je koloidno srebro hranjeno. Po postopku opisanem v poglavju 3.1.8 smo pripravili vzorce z morebitnim srebrom s sten teh posod. Na teh vzorcih smo nato izvedli meritve TLS signala v BM in FIA postavitvi in jih zbrali v graf:

Slika 30: Meritve TLS signala za določevanje količine srebrovih zvrsti odstranjenih s sten posod v katerih je bilo koloidno srebro hranjeno v BM postavitvi (1 – Vz1+HNO3+pufer, 2 – Vz2+HNO3+pufer, 3 – Vz3+HNO3+pufer, 4 – Vz4+HNO3+pufer, 5 – Vz5+HNO3+pufer: 1, 2, 3, 4, 5 – koloidno srebro; 1a – Vz1+HNO3+pufer+borohidrid, 2a – Vz2+HNO3+pufer+borohidrid, 3a – Vz3+HNO3+pufer+borohidrid, 4a – Vz4+HNO3+pufer+borohidrid, 5a – Vz5+HNO3+pufer+borohidrid: 1a, 2a, 3a, 4a, 5a – celotno srebro).

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 1a 2a 3a 4a 5a

TL

S s

ign

al

[mV

]

Vzorec

39

Za vzorce 4 in 5 smo iste meritve izvedli tudi po TLS-FIA metodi:

Slika 31: Meritve TLS signala za določevanje srebrovih zvrsti odstranjenih s sten posod v katerih je bilo koloidno srebro hranjeno v FIA postavitvi (1 – Vz4+HNO3+pufer, 2 – Vz5+HNO3+pufer: 1, 2 – koloidno srebro; 1a – Vz4+HNO3+pufer+borohidrid, 2a – Vz5+HNO3+pufer+borohidrid: 1a, 2a – celotno srebro). Upoštevajoč razredčitve ob raztapljanju in nevtralizaciji vzorcev smo določili koncentracije srebrovih zvrsti naloženih na stene posode v katerih je bilo koloidno srebro hranjeno (tabeli 7 in 8). Tabela 7: Koncentracije srebrovih zvrsti naloženih na stenah posode po TLS-BM.

Vzorec Koncentracija [ppb] Material posode

Vz1 155±1

Steklo Vz2 161±1

Vz3 317±2

Vz4 13±1 Plastika

Vz5 11±1

Tabela 8: Koncentracije srebrovih zvrsti naloženih na stenah posode po TLS-FIA.

Vzorec Koncentracija [ppb] Material posode

Vz4 13±1 Plastika

Vz5 15±1

Iz dobljenih rezultatov lahko sklepamo, da se je nekaj koloidnega srebra naložilo na stene posode v katerih je bilo hranjeno. Opazimo tudi razliko med steklenimi in plastičnimi posodami; Na stene steklenih posod se je naložilo več kot desetkrat več srebrovih nanodelcev kot na stene plastičnih.

0

2

4

6

8

10

12

14

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

TL

S s

ign

al

[mV

]

Čas [s]

1

1a

2

2a

40

5 ZAKLJUČEK V diplomski nalogi smo v prvem delu pripravili delovne vzorce z različnimi znanimi koncentracijami koloidnega srebra. S strani proizvajalcev smo tudi pridobili 5 poizkusnih vzorcev koloidnega srebra, ki so prosto dostopni v prodaji: razkužila, kapljice za nos in antibakterijska sredstva za notranjo uporabo. Z UV-VIS spektrofotometrom, TLS spektroskopijo v BM in FIA postavitvi, ter po ICP-OES metodi (samo celotno srebro) smo nato z uporabo delovnih vzorcev določili koncentracije tako koloidnega kot celotnega srebra v poizkusnih vzorcih. Določili smo LOD posameznih metod, s primerjavo katerih smo tako lahko ugotavljali njihovo natančnost. LOD-je posameznih metod smo zbrali v tabelo: Tabela 9: Primerjava mej detekcije za posamezne metode.

Metoda LOD [ppb]

UV-VIS spektrofotometrija 32

TLS-BM 0,09

TLS-FIA 0,45

V drugem delu diplomske naloge smo z enakimi metodami določili še koncentracije koloidnega in celotnega srebra, ki se je prilepil na stene posod v katerih je bilo koloidno srebro shranjevano. UV-VIS spektrofotometrija ni dovolj občutljiva za določevanje nizkih koncentracij koloidnega srebra v vzorcih. Izkazala se je za uporabno le pri merjenju koncentracij celotnega srebra, ki so bile dovolj visoke, da so absorbirale opazno večji del žarka usmerjenega skozi poizkusne vzorce, v primerjavi s slepim vzorcem. Linearno območje za merjenje koncentracij srebrovih zvrsti je bilo do koncentracije okrog 1 ppm, kamor smo tudi umestili umeritvene vzorce. UV-VIS spektrofotometrija bi bila uporabna tudi za naše vzorce, če bi koncentracije koloidnega srebra v njih bile enake navedenim na embalaži (nekaj ppm). Obe TLS metodi sta bili veliko občutljivejši od UV-VIS spektrofotometrije. V BM postavitvi gre za več kot 350-krat in pri FIA postavitvi za več kot 70-krat višjo občutljivost metode. S TLS metodami smo tako bili sposobni izmeriti koncentracije srebrovih nanodelcev le nekaj ppb v vzorcih. Priprava vzorcev je bila enako preprosta kot pri UV-VIS spektrofotometriji, prav tako je bila primerljiva hitrost meritev, ki je bila celo hitrejše pri BM postavitvi. Za naše potrebe se je v praksi TLS metoda v BM postavitvi izkazala za najboljšo od uporabljenih, tako po hitrosti in preprostosti, predvsem pa po občutljivosti. Določene koncentracije koloidnega in celotnega srebra v poizkusnih vzorcih smo razvrstili po merilnih metodah in jih prikazali v tabeli 10:

41

Tabela 10: Izračunane koncentracije koloidnega in celotnega srebra v poizkusnih vzorcih (K - koloidno srebro, C - celotno srebro, vrednosti v oklepaju so deklarirane koncentracije s strani proizvajalca)

Metoda

Vz1 (15ppm) Vz2 (20ppm) Vz3 (25-30ppm) Vz4 (5ppm) Vz5 (15ppm)

K [ppb]

C [ppm]

K [ppb]

C [ppm]

K [ppb]

C [ppm]

K [ppb]

C [ppm]

K [ppb]

C [ppm]

UV-VIS spektrofotometrija

<LOD 26±2 <LOD 35±2 711±3 22±1 <LOD 20±1 284±2 30±2

TLS-BM 54±1 18±1 114±5 24±1 777±17 17±2 117±5 20±1 266±10 31±2

TLS-FIA 53±3 25±2 132±6 33±2 772±6 20±1 96±4 23±2 252±6 26±1

ICP-OES 23 28 18

Tabela 11: Relativna odstopanja izmerjenih koncentracij od pričakovanih (K - koloidno srebro, C - celotno srebro, vrednosti v oklepaju so deklarirane koncentracije s strani proizvajalca). Odstopanja celotnega srebra veljajo ob predpostavki, da je v navedbah proizvajalcev ionsko srebro zmotno šteto kot koloidno.

Metoda

Vz1 (15ppm) Vz2 (20ppm) Vz3 (25-30ppm) Vz4 (5ppm) Vz5 (15ppm)

K [%] C [%] K [%] C [%] K [%] C [%] K [%] C [%] K [%] C [%]

UV-VIS spektrofotometrija

<LOD 73,3 <LOD 75,0 -97,2 -12,0 <LOD 300,0 -98,1 100,0

TLS-BM -99,7 20,0 -99,4 20,0 -96,9 -32,0 -97,7 300,0 -98,2 106,7

TLS-FIA -99,7 66,7 -99,3 65,0 -96,9 -20,0 -98,1 360,0 -98,3 73,3

ICP-OES 53,3 40,0 -28,0

Kot rezultat meritev najprej opazimo veliko razliko med izmerjeno količino koloidnega srebra, ter koncentracijo navedeno na embalaži. Kot razlog za to lahko imamo dejstvo, da se je nekaj koloidnega srebra prilepilo na stene posode. Po naših meritvah to zadostuje za 150-300 ppb pri steklenih posodah in 13-15 ppb pri plastičnih. To ni dovolj da bi zaobjelo celotno odstopanje. Druga možnost za neustreznost koncentracij bi lahko bila neobstojnost koloida. Kljub skrbi za pravilno shranjevanje se koloidni delci naravno ionizirajo, kar bi povzročilo nižje izmerjene koncentracije koloidnega srebra in višje izmerjene koncentracije ionskega. Razlika med navedenimi in izmerjenimi koncentracijami pa je vendarle tako velika, da najverjetneje gre za napako že pri izdelavi: bodisi navajanje nepravilne koncentracije, bodisi štetje celotnega srebra namesto koloidnega. Menimo, da je večja verjetnost, da proizvajalci pri navajanju vsebnosti koloidnega srebra štejejo tako koloidno, kakor tudi ionsko obliko. Ob tej predpostavki so naši rezultati meritev dosti bližje pričakovanim. V tabeli 11 lahko vidimo relativna odstopanja od pričakovanih koncentracij v odstotkih. Najmanjša odstopanja so bila pri vzorcu Vz3, največja pa pri vzorcu Vz4. Vzorec Vz3 je tudi imel splošno najnižjo koncentracijo celotnega srebra. V medicini velja načelo motenja na strani previdnosti, tako da je ta vzorec, kljub možni nižji učinkovitosti, edini ki zadostuje temu nenapisanemu pravilu. V vsakem primeru pa so navedene koncentracije napačne – vedno veliko prenizke za koloidno srebro in navadno previsoke za celotno (izjema vzorec 3). Zaradi tega velja previdnost ob uporabi proizvodov koloidnega srebra, saj so po našem pregledu literature možni stranski učinki, ki imajo lahko trajne posledice za telo.

42

Delovanje nanodelcev srebra je že kar dobro znano in opisano, vendar gre predvsem za in vitro poizkuse. Predvsem za notranjo uporabo kot antibiotik v živih evkariontskih organizmih ne obstaja veliko raziskav. Srebro deluje antibakterijsko in je oligodinamično že pri nizkih koncentracijah, tako da bi večje ali preventivno uživanje delcev srebra odsvetovali. Neselektivno delovanje bi lahko škodovalo tudi mikrobiomu človeka, ki je pomemben predvsem za prebavo in preprečevanje razvoja patogenih bakterij.

43

6 VIRI Abou El-Nour K. M. M., Eftaiha A., Al-Warthan A., Ammar R. A. A., 2010. Synthesis and applications of silver nanoparticles. Arabian Journal of Chemistry, 3, 3: 135-140 Agnihotri S., Mukherji S., Mukherji S., 2015. Immobilized silver nanoparticles enhance contact killing and show highest efficacy: elucidation of the mechanism of bactericidal action of silver. Nanoscale, 2013, 5: 7328-7340 Aminov R. I., 2010. A Brief History of the Antibiotic Era: Lessons Learned and Challenges for the Future. Frontiers in Microbiology, 1, 134: 1 ATSDR, 1990. Toxicology report for silver. U.S. Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry. http://www.atsdr.cdc.gov/ToxProfiles/tp146.pdf (21.6.2016) Barillo D. J., Marx D. E., 2014. Silver in medicine: A brief history BC 335 to present. Burns, 40, 1: 3-8 Berne B. J., Pecora R., 2000. Dynamic Light Scattering: With Applications to Chemistry, Biology, and Physics. Mineola, Dover Publications Inc.: 384 str. Bilban M., 2013. Nanodelci. Delo in varnost LVII, 2013, 4: 42-54 Birmele M. N., McCoy L. E., Roberts M. S., 2011. Disinfection of spacecraft potable water systems by passivation with ionic silver. American institute of Aeronautics and Astronautics http://ntrs.nasa.gov/archive/nasa/casi.ntrs.nasa.gov/20110014435.pdf (28.5.2016) Bruneau A., Turcotte P., Pilote M., Cagné F., Cagnon C., 2016. Fate of silver nanoparticles in wastewater and immunotoxic effects on rainbow trout. Aquatic Toxicology, 174: 70-81 Bruzzoniti M. C., Kobylinska D. K., Franko M., Sarzaninia C., 2010. Flow injection method for the determination of silver concentration in drinking water for spacecrafts. Analytica Chimica Acta, 665, 1: 69-73 Carter C. A., Harris J. M., 1984. Thermal Lens Absorption Measurements on Small Volume Samples. Analytical Chemistry 56, 6: 922-925 Cardoso L. M., Mainier F. B., Itabirano J. A. P., 2014. Analysis Voltammetry of Cyanide and Process Electrolytic Removal of Cyanide in Effluents. American Journal of Environmental Engineering, 4, 6: 182-188 CDDEP, 2015. The State of the World’s Antibiotics 2015. Washington, D.C., CDDEP: 80 str. https://cddep.org/sites/default/files/swa_2015_final.pdf (28.05.2016) Credé C. S. F., 1884. Die Verhütung der Augenentzündung der Neugeborenen, der häufigsten und wichtigsten Ursache der Blindheit. Berlin, Hirschwald, 63 str. https://archive.org/details/b22370675 (28.05.2016) Csuros M., Csuros C., 2002. Environmental Sampling and Analysis for Metals. Boca Raton, FL, CRC Press/Lewis Publishers, 372 str.

44

Čebulj M., 2007. Posebne lastnosti nanodelcev. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za matematiko in fiziko, Oddelek za fiziko, 16 str. Daues K., 2006. A History of Spacecraft Environmental Control and Life Support Systems. Houston, NASA Johnson Space Center. http://ntrs.nasa.gov/archive/nasa/casi.ntrs.nasa.gov/20080031131.pdf (28.5.2016) Durán N., Durán M., de Jesus M. B., Seabra A. B., Fávaro W. J., Nakazato G., 2016. Silver nanoparticles: A new view on mechanistic aspects on antimicrobial activity. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 12, 3: 789-799 Fewtrell L., 2014. Silver: water disinfection and toxicity. WHO, Centre for Research into Environment and Health http://www.who.int/water_sanitation_health/dwq/chemicals/Silver_water_disinfection_toxicity_2014V2.pdf (21.06.2016) Graves J. L. Jr., Tajkarimi M., Cunningham Q., Campbell A., Nonga H., Harrison S. H., Barrick J. E., 2015. Rapid evolution of silver nanoparticle resistance in Escherichia coli. Frontiers in Genetics, 6: 42 Hamad A., Li L., Liu Z., Zhong X. L., Liu H., Wang T., 2015. Generation of silver titania nanoparticles from an Ag–Ti alloy via picosecond laser ablation and their antibacterial activities. RCS Advances 89: 72981-72994 Haynes W. M., 2016. CRC Handbook of Chemistry and Physics, 96th edition (Internet Version 2016), Boca Raton, FL, CRC Press/Taylor and Francis, 2652 str. Hill A. A., Lipert R. J., Porter M. D., 2009. Determination of colloidal and dissolved silver in water samples using colorimetric solid-phase extraction. Talanta 80: 1606-1610 Hussein A. M., 2016. Synthesis of silver nanoparticles. Mansoura university, Faculty of dentistry, Dental biomaterials department, 76 str. http://www.slideshare.net/ahmedmostafahussein/synthesis-of-silver-nanoparticles-presentation (21.6.2016) Iravani S., Korbekandi H., Mirmohammadi S. V., Zolfaghari B., 2014. Synthesis of silver nanoparticles: chemical, physical and biological methods. Research in Pharmaceutical Sciences, 9, 6: 385-406 Koloidnosrebro.net, 2016. http://www.koloidnosrebro.net/seznam-bolezni-za-zdravljenje-s-ks.html (28.05.2016) Korte D., Bruzzoniti M. C., Sarzanini C., Franko M., 2011a. Influence of Foreign Ions on Determination of Ionic Ag in Water by Formation of Nanoparticles in a FIA-TLS System. Analytical Letters, 44, 18: 2901-2910 Korte D., Bruzzoniti M. C., Sarzanini C., Franko M., 2011b. Thermal Lens Spectrometric Determination of Colloidal and Ionic Silver in Water. International Journal of Thermophysics, 32, 4: 818-827

45

Lansdown A., 2006. Silver in Health Care: Antimicrobial Effects and Safety in Use. Biofunctional textiles and the skin, 33: 17-34 Lee H. J., Lee S. G., Oh E. J., Chung H. Y., Han S. I., Kim E. J., Seo S. Y., Ghim H. D., Yeumd J. H., Choi J. H., 2011. Antimicrobial polyethyleneimine-silver nanoparticles in a stable colloidal dispersion. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 88, 1: 505-511 Lokina S., Stephen A., Kaviyarasan V., Arulvasu C., Narayanan V., 2014. Cytotoxicity and antimicrobial activities of green synthesized silver nanoparticles. European Journal of Medicinal Chemistry 76: 256-263 March G., Nguyen T. D., Piro B., 2015. Modified Electrodes Used for Electrochemical Detection of Metal Ions in Environmental Analysis. Biosensors 2015, 5: 241-275 Marx D. E., Barillo D. J., 2014. Silver in medicine: The basic science. Burns, 40, 1: 9-18 Melaiye A., Youngs W. J., 2005. Silver and its application as an antimicrobial agent. Expert Opinion on Therapeutic Patents 15, 2:125–130 Moyer C.A., Brentano l., Gravens D.l., Margraf H.W., Monafo W.W., 1965. Treatment of large human burns with 0.5 per cent silver nitrate solution. Arch Surg, 90: 812–86 Mulfinger L., Solomon S. D., Bahadory M., Jeyarajasingam A. V., Rutkowsky S. A., Borizt C., 2007. Synthesis and study of silver nanoparticles. Journal of chemical education, 84, 2: 322 Murthy S. K., 2007. Nanoparticles in modern medicine: State of the art and future challenges. International Journal of nanomedicine, 2(2): 129-141 Pašti I. A., Gavrilov N. M., Mentus S. V., 2014. Voltammetric Techniques in Electrocatalytic Studies. Voltammetry: Theory, Types and Applications. New York, Nova Publishers, 349 str.: 1-41 Petica A., Gavriliu S., Lungu M., Buruntea N., Panzaru C., 2008. Colloidal silver solutions with antimicrobial properties, Materials Science and Engineering B, 152: 22–27 Pies J., 2012. Zdravilni učinki koloidnega srebra. Ljubljana, ARA založba, 160 str. Rollings N. B., 1985. Silver Dollar Surgeon. American History Illustrated, 20, 5: 20 Slawson R. M., Lee H., Trevors J. T., 1990. Bacterial interactions with silver. Biology of Metals, 3, 3: 151-154 WHO, 2006. Silver in Drinking-water, Background document for development of WHO Guidelines for Drinking-water Quality, Guidelines for drinking-water quality, 2nd ed., 2, Ženeva, WHO: 4 str. http://www.who.int/water_sanitation_health/dwq/chemicals/silver.pdf (28.05.2016) WHO, 2015. Model List of Essential Medicines 19th List. http://www.who.int/selection_medicines/committees/expert/20/EML_2015_FINAL_amended_AUG2015.pdf (28.05.2016)

46

Welz B., Sperling M., 1999. Atomic Absorption Spectrometry (3rd ed.). Weinheim, WILEY-VCH: 941 str. Zhang L., Gu F. X., Chan J. M., Wang A. Z., Langer R. S., Farokhzad O. C., 2008. Nanoparticles in Medicine: Therapeutic Applications and Developments. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 83, 5: 761-769