Dr Etienne ROULEAU Génétique et Pathologie moléculaire · WGS Digital karyotyping 0,001% Leary, R. J. et al. T (2012). Validation de la méthode et contrôle de qualité Assurer

BIOPSIE LIQUIDE :

UN NOUVEL OUTIL DE

RECHERCHE ET DE SOINS

EN CANCÉROLOGIE

Dr Etienne ROULEAU

Génétique et Pathologie moléculaire

QUELLES ATTENTES POUR UN

MARQUEUR BIOLOGIQUE DU

CANCER ?

Valeur Normale

ChirurgieChimiothérapie

Pic

Rechute

Concentrationsérique /plasmatique

temps

Traitement

métastases

Traitement

« non-spécifique »

Cancer

« in situ »

Dissémination

métastatique

Efficacité

Idéal du marqueur biologique

Marqueurs sériques vs biopsie liquide

TITRE DU DIAPORAMA Général

DEPISTAGE

DIAGNOSTIC

SUIVI

BILAN INITIAL

MALADIE RESIDUELLE

RESISTANCES

En cours

d’évaluation

Utilisation validée

En l’absence de

biopsie solide


Apport potentiel


Aucune application

Défaut de spécificité

Apport limité

Pronostic

Utilisation

Utilisation

ADN circulantMarqueurs sériques

Côlon ACE

Sein CA15.3

Prostate PSA

Ovaire CA125

Testicule hCG

Thyroïde Tg

PERIMETRE DE LA BIOPSIE

LIQUIDE

Biopsie liquide

Toute analyse permettant d’obtenir une information

sur une tumeur solide à partir d’un prélèvement

liquide

Prélèvement sanguin

> Cellules tumorales circulantes : 1-5 cellules / mL

Application : CellSearch® - application pronostique

> Acide nucléique circulant (ARN / ADN) : 1 à 100 ng/mL

(3,6pg/génome)

Autres prélèvements

> urine, liquide pleural, salive, LCR…

Janni, W. J. et al. Pooled analysis of the prognostic relevance of circulating tumor

cells in primary breast cancer. Clin. Cancer Res. 22, 2583–2593 (2016).

Historique du développement

Mandel, P. & Metais, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme. C. R. Seances

Soc. Biol. Fil. 142, 241–243 (1948).

Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M. & Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients

and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646–650 (1977).

Stroun, M. et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients.

Oncology 46, 318–322 (1989)

1948

Mandel et Metais

Identification ADN circulant

Indvidus sains

1977

Leon et al

ADN circulant

Patients atteints de cancers

1989

Stroun et al

ADN circulant

Miroir de la tumeur

2003

Séquençage du génome

humain

> 2013

Développement

du séquençage

haut débit

1994

Sorenson et al

Application au

cancer du pancréas

8

Application au cancer

3 patients avec un cancer du pancréas

ASA PCR et séquençage

ADN circulant

ADN circulant dans du liquide acellulaire

ADN fragmenté

> 180 à 200 paires de bases

> Implication de l’apoptose

> ADN de taille supérieure est non tumoral

Concentration d’ADN circulant

> Individu sain : 15 ng/mL (0 to 128 ng/ml)

> Individu avec un cancer : 137 ng/mL (0 to 4738 ng/ml)

Fraction allélique : 0.01% à plus de 90%

van der Vaart et al. Is the role of circulating DNA as a biomarker of cancer being

prematurely overrated? Clinical Biochemistry 43 (2010) 26–36.

ADN circulant

Exemple de la distribution de la fraction allélique sur 97 patients porteurs

d’une mutation TP53 analysés en ADN tumoral circulant (données GR).

Précautions

Confusions dans la littérature

> Condition de pré-analytique

> Condition analytique

> Selection des patients

Implication des technologies de séquençage

Homogénéisation de la phase pré-analytique

> Exemple du serum / plasma :

ADNc : 2 à 24x plus élevé dans le sérumJung, M., Klotzek, S., Lewandowski, M., Fleischhacker, M. & Jung, K. Changes in concentration of

DNA in serum and plasma during storage of blood samples. Clin. Chem. 49, 1028–1029 (2003).

Vallée A. et al. Lung Cancer 2013

ADN circulant

11/04/2017 TITRE DU DIAPORAMA Général

Nécrose

Apoptose

Sécretion

Exosome

ADN tumoral

ADN

constitutionnel

Sécrétion physiologique

Inflammation

Traumatisme…

TISSU TUMORAL TISSU NORMAL

Nécrose

Apoptose

Sécretion

Exosome

Durée de demi-vie

2h (114 min)

Diehl, F. et al. Circulating mutant DNA

to assess tumor dynamics. Nat. Med.

14, 985–990 (2008).

Métabolisation multiple (foie, rein, rate)

1-cm = un milliard de cellules.

ADN extrait du plasma


ADN tumoral circulant

ADN constitutionnel

circulant

ADN constitutionnelContamination pré-analytique

SOMATIQUE CONSTITUTIONNEL

AD

N c

ircula

nt

Quelles anomalies ?

11/04/2017 TITRE DU DIAPORAMA Général 14

PLASMA

ADN circulant libre

Mutations somatiques et

constitutionnelles

SANG – CELLULES NUCLEES

Mutations constitutionnelles

TUMEUR SOLIDE

Mutations somatiques et

constitutionnelles

Hétérogénéité des ADN circulants

Variations

> Nature du cancer

> Stade de la maladie

> Maladie métastatique

Bettegowda et al ScTranMed2014Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M. & Yaros, M. J.

Free DNA in the serum of cancer patients and the

effect of therapy. Cancer Res. 37, 646–650 (1977).

DE LA PRISE DE SANG AU

RESULTAT


Lemoine A, Couraud S, Fina F, Lantuejoul S, Lamy PJ, Denis M, Rouleau É. Recommandations du GFCO pour

l’utilisation diagnostique des analyses génétiques somatiques sur l’ADN tumoral circulant. Innov Ther Oncol 2016 ;

2 : 225-232.

Enjeux de l’analyse de l’ADN circulant

Pré-analytique

Sécrétion ADNtc

Analytique

ADN sain

Défaut

Limite de

détection

-

-

Bruit

de fonds

VN : vrais négatifs

FN : faux négatifs

VP : vrais positifs

FP : faux positifs

Limiter la contamination par de l’ADN sain

11/04/2017

CE

NT

RIF

UG

AT

ION

PR

EL

EV

EM

EN

T

PLA

SM

AC

EN

TR

IFU

GA

TIO

N

Sto

ckag

e à

-80ºc

AD

NE

XT

RA

CT

ION

Sto

ckag

e à

-80ºc

ANALYSE NGS

ANALYSE ddPCR

< 4h

1200-1

600g p

endant

10 m

inute

s

3000-

16000g p

endant

10 m

inute

s

Limiter la contamination par l’ADN sain

• >2 mL

• Specific tubes (Streck/Roche/Qiagen) >>plasma-EDTA >>> serum

• Première Centrifugation

• Seconde Centrifugation

Impact de la seconde centrifugation – données GR – C. Jovelet.

Extraction de l’ADN plasmatique

Kits commerciaux pour l’extraction d’ADN circulant.

Consensus sur le volume minimal de plasma pour

l’extraction de l’ADN est de 2 ml.

Diminution du volume d’élution <50µL.

Quantité initiale d’ADN par une technique appropriée

(de préférence PCR digitale ou qPCR).

Déterminer la présence d’ADN tumoral

Identification d’une mutation somatique

Information sur les altérations chromosomiques

Identification de méthylation (défaut de spécificité)

Exemple résulat Oncoscan sur ADN circulant (concentration >80 ng/mL)

Positionnement des techniques

Séquençage Sanger à proscrire

Erreur intrinsèque de l’ADN polymérase 0,1%

Gain majeur de sensibilité des techniques de séquençage

Oxnard al. JNCI 2014

Next Generation Sequencing

Bettegowda et al ScTranMed2014 D’après Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrating liquid

biopsies into the management of cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2017 Mar 2.

qPCR PNA clamp-PCR 0,10%

LNA/DNA-PCR 0,10%

ARMS 0,05-0,1%

Cold-PCR 0,1-0,01%

Digital PCR BEAMing 0,01% Diehl, F. et al. (2006).

ddPCR 0,001%

Hindson, B. J. (2011).

Taly, V. et al. (2013).

Mouliere, F. et al. (2013).

NGS ciblé AmpliSeq <2%Rothé, F. et al. (2014).

Jovelet C et al (2016).

Tam-Seq >2% Forshew, T. et al. (2012).

SAFE-SeqS 0,1% Kinde, I., Wu, J., (2011).

Guardiant test <0,1% Lanman, R. B. et al. (2015).

CAPP Seq 0,01% Newman, A. M. et al. (2014).

iDES <0,01% Newman, A. M. et al. (2016).

WES 1-3% Murtaza et al. (2013).

WGS Digital karyotyping 0,001% Leary, R. J. et al. T (2012).

Validation de la méthode et contrôle de

qualité

Assurer une limite de détection suffisante à la détection des cibles

d’intérêt.

Cette validation technique de la phase pré-analytique à l’analytique

Contrôle interne de qualité

« Il est nécessaire de prévoir un contrôle de qualité interne avec des

mutations ayant des fréquences alléliques proche de 1%. »

Contrôle externe de qualité

> 10 échantillons plasmatiques – coordination Pr Marc Denis

> Ajout d’ADN fragmenté à du plasma humain

> 43 participants sur toute la France

> Finalisation des résultats en mars 2017

Technique de PCR digitale

26

BEAMing

Diehl F et al. PNAS 2005

Diehl F et al. Nat Res 2008


3 à 5 couleurs

Jovelet et al. 2017 submitted

Technique de séquençage haut débit

Adaptation technique ou bioinformatique Approche bioinformatique

« Une validation de la variabilité et du bruit de fond base à

base doit être conduite pour réduire le risque de faux positif

(Accord d’expert) »

Limite de détection : 0.003 SNP et 0.001 indel

Approche technique

Ex. Safe-SeqS 14 random bare code / seuil de diversité à

200 séquences différentes


Tie J et al. Circulating tumor DNA analysis detects minimal residual disease and

predicts recurrence in patients with stage II colon cancer : Sci Transl Med. 2016

July 06; 8(346): 346ra92. doi

Pécuchet N, et al. Analysis of Base-Position Error Rate of Next-Generation Sequencing to

Detect Tumor Mutations in Circulating DNA. Clin Chem. 2016 Nov;62(11):1492-1503.

Technique de séquençage haut débit

WES / WGS

Preuve de concept

Limitation sur la quantité d’ADN

Problème de la limite de détection

> Faible profondeur ?

> Sensibilité rattrapée par la diversité ?

> Confirmation de la présence d’ADN tumoral



WGS/Chr alterations

Leary et al Sci Transl Med 2012

Personalized Analysis

of Rearranged Ends

(PARE)

Compare WGS for advanced cancer & healthy patient

(4 to 18mL plasma)

N

T

Pl. bl

Pl. m4

Pl.m62

Application de la détection des

anomalies chromosomiques sur

l’ADN circulant

Leary et al. Sc Trans Res 2012

Sensibilité

30 à 60% lorsque la mutation est présente dans la

tumeur

Etude tout cancer > cfDNA : 334 patients.

> Panel de 50 cancer genes / ddPCR

> 283 patients avec résultat de la biopsie

> Sensibilité : 55.0% (95%CI, 48.4%-61.6%)

> Association d’un score clinique pour la détection de l’ADN circulant

• Sensitivité à 83% avec un score ≥ 8

Jovelet, Cecile, et al. « Circulating Cell-Free Tumor DNA (cfDNA) Analysis of 50-Genes by next-Generation

Sequencing (NGS) in the Prospective MOSCATO Trial ». Clinical Cancer Research, 12 janvier 2016,

clincanres.2470.2015.


stages IA–IIIA

sensitivity 22.2%

(11.5%–38.3%)

stages IIIB–IV

sensitivity 72.7%

(60.9%–82.1%)

exon 19 del.

Sens. 50.9% (95% CI 37.9%–63.9%)

Spe. 98.0% (88.5%–100%)

L858R,

Sens. 51.9% (38.7%– 64.9%)

Spe. 94.1% (83.5%–98.6%)

« Because sensitivity

was low in early-stage

NSCLC, the detection

system is preferred for

stage IIIB–IV NSCLC”

Sensibilité

Diversité des altérations

Etude ciblée ou criblage étendu


Jovelet, Cecile, et al. « Circulating Cell-Free Tumor DNA (cfDNA) Analysis of 50-Genes by next-Generation

Sequencing (NGS) in the Prospective MOSCATO Trial ». Clinical Cancer Research, 12 janvier 2016,

clincanres.2470.2015.

Bilan 197 cas ADN circulants porteur d’au moins une mutation

sur 417 analyses d’un panel NGS – AmpliSeq / PGM-S5

Echec 10

Présence d'une mutation 197

Aucune mutation 210

Total 417

Spécificité

90 à 97%

Importance de prendre en compte le bruit de fonds

dans la validation de méthode

Adaptation du pipeline bioinformatique


APPLICATIONS

Applications

Dépistage de cancer

Détection des mutations KRAS

> Détection de 13 cas sur 1098 volontaires sains

> 6/13 dans les 25 mois : cancer de la vessie / voies respiratoires

Limites :

> Risque de faux positif ? Implication sur la prise en charge ?

> Formes pré-cancéreuses / implication de l’âge

Gormally, E. et al. TP53 and KRAS2 mutations in plasma DNA of healthy

subjects and subsequent cancer occurrence: a prospective study. Cancer Res.

66, 6871–6876 (2006).

Applications

Dépistage de cancer

Circulating Cell- Free Genome Atlas (CCGA)

(clinicaltrials. gov identifier: NCT02889978) :

initiative pour décrire les mutations sur ADN

circulant

GRAIL : séquençage de l’ADN tumoral circulant de

sujets sains pour détecter précocement des cancers


Aravanis AM, Lee M,

Klausner RD. Next-

Generation Sequencing of

Circulating Tumor DNA for

Early Cancer Detection.

Cell. 2017 Feb

9;168(4):571-574.

Application

Diagnostic de cancer

Application dans le cancer du poumon chez les patients

non biopsiable

Présence d’ADNtc chez 75% des 640 patients avec des

formes avancées de différents cancers, et plus de 50%

des patients avec un cancer précoce.

Bettegowda C, et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-

stage human malignancies. Sci Transl Med. 2014 Feb 19;6(224):224ra24

Application

Diagnostic de cancer

Détection des mutations KRAS chez les patients

atteints d’un cancer pancréatique – 30% de détection

Takai, E. et al. Clinical utility of circulating tumor DNA for molecular assessment in

pancreatic cancer. Sci. Rep. 5, 18425 (2015).

Application

Diagnostic de suivi

de maladie résiduelle

Suivi de la maladie résiduel et risque de rechute

dans les cancers colorectaux

Détection et lien avec la rechute dans les cancers

colorectaux stade II sur une étude prospective

> Risque de récurrence chez les patients post

chimiothérapie : 11 (1,8-68)

Apport dans la désescalade thérapeutique

Diehl, F. et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics.

Nat. Med. 14, 985–990 (2008).

Tie, J. et al. Circulating tumor DNA as an early marker of therapeutic

response in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 26,

1715–1722 (2015).

42Diehl F et al. Nat Res 2008

cfDNA pour le suivi dans le cancer du colon

18 cas

162 plasma

11/04/2017 43FASTAC2 Mok et al. CCR 2015

Application

Diagnostic de résistance

Apparition de mutations KRAS circulantes chez les

patients avec un cancer colorectal métastatique sous

traitement antiEGFR Bettegowda C, et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-

stage human malignancies. Sci Transl Med. 2014 Feb 19;6(224):224ra24

Bettegowda et al ScTranMed2014Siravegna G, et al. Clonal evolution and resistance to EGFR blockade in the blood

of colorectal cancer patients. Nat Med. 2015 Jul;21(7):795-801.

Application


Identification de la mutation ESR1 montrant l’évolution

de la résistance chez 171 patients avec un cancer du

sein avancé

Détection des mutations ESR1 chez les patients avec

une tumeur ER+ et ayant reçu des antiaromatase ;

réduction de la PFSSchiavon, G. et al. Analysis of ESR1 mutation in circulating tumor DNA

demonstrates evolution during therapy for metastatic breast cancer. Sci. Transl

Med. 7, 313ra182 (2015).

Application


Inhibiteur EGFR : Osimertinib…

Apparition de la mutation p.T790M

Apparition de la résistance tertiaire p.C797S

Autres résistances : HER2, MET, BRAF…


48

%Thress – Nat Med 2015 * Oxnard – WCLC 2015 * Niederst – CCR 2015

Accueil

GR

Questionnaire

Consultation*

Hôpital du jour

Technique**

Jour 1= lundi Jour 3Jour 2 Jour 4

Résultat***

Consultation ORACLE (mOleculaR Alterations in Cancer Liquid biopsiEs)

Pr Benjamin BESSE

Jour 5

***entre 5 -7 jours**préparation, analyse et validation du résultats

20ml

*signature consentement éclairé

EXTENSIONS A VENIR…

Extension – autres liquides

Salive

Prélèvement pleural

LCR

Importance de la prise en charge et

du circuit pré-analytique

Kimura H et al EGFR mutation status in tumour-derived DNA from pleural

effusion fluid is a practical basis for predicting the response

to gefitinib British Journal of Cancer (2006) 95, 1390 – 1395

De Mattos-Arruda L Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better

represents the genomic alterations of brain tumours than plasma

NATURE COMMUNICATIONS | 6:8839

Wang, Y. et al. Detection of somatic mutations and HPV in the saliva and

plasma of patients with head and neck squamous cell carcinomas. Sci.

Transl Med. 7, 293ra104 (2015).

Extension - urine

ADN transrénal (tr-DNA)

Concentration par filtration glomérulaire

Molécules <6.4 nm et de poids moléculaire <70 kDa soit

100-pb d’ADN

Deux groupes d’ADN

> Haut poids moléculaire (≥1 kbp)

> Bas poids moléculaire (<100 bp)

Application – EGFR poumon

Sensitivité 72%T790M, 75% L858R, et 67% del exon19

Amélioration volume > 90mL


Reckamp K et al. A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for

Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and

Plasma Journal of Thoracic Oncology Vol. 11 No. 10: 1690-1700. (2016)

Extension - ARN

1996 : détection mRNA dans le mélanome

Détection de miARN - +++ 20–25 nt

Origines

> Exosomes / corps apoptotiques / complexe protéique

> Plaquettes (TEP)

Applications :

> Recherche de translocation

> Développement de signature d’expression

> miR-375 et miR-141 : cancer de la prostate

Nguyen HC et al. Expression differences of circulating microRNAs in metastatic castration

resistant prostate cancer and low-risk, localized prostate cancer. Prostate. 2013

Mar;73(4):346-54.

Stevens, G. L., Scheer, W. D. & Levine, E. A. Detection of tyrosinase mRNA from

the blood of melanoma patients. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 5, 293–296

Extension - ARN

Exemple d‘expression miR10b, miR34a, miR141,miR155

Roth et al. Screening for circulating nucleic acids and caspase activity in the peripheral blood as

potential diagnostic tools in lung cancer M O L E C U L A R ON C O L O G Y 5 (2011) 281 e2 9

1

Extension – suivi de la méthylation

Suivi de la méthylation dans l’ADN circulant

> Homogénisation des protocoles / faible quantité d’ADN

> methyl-BEAMing et bisulfite pyrosequencing >> PCR

methylation-specifique

Application

> Méthylation du gène MGMT dans le glioblastome

> Méthylation du gène SEPT9 dans le cancer colorectal

Song L, Li Y.SEPT9: A Specific Circulating Biomarker for Colorectal Cancer.

Adv Clin Chem. 2015;72:171-204.

Essai PRESEPT - alternative pour la

détection précoce de cancer colorectal

Sensitivité 63.9% et Spécificité 88.4%

(Warren et al., 2011; Church et al., 2014)

Barault L, et al. Digital PCR quantification of MGMT methylation refines prediction of clinical benefit from alkylating agents in glioblastoma and

metastatic colorectal cancer. Ann Oncol. 2015 Sep;26(9):1994-9.

CONCLUSION

Conclusion sur la biopsie liquide

Applications concrètes en cancérologie

Besoin de validation clinique

Extensions

> Dépistage précoce

> Suivi de la maladie résiduelle

> Suivi clonal de la maladie

> Autres liquides

> Autres analytes (ARN, méthylation)

Enjeux majeurs de la standardisation des protocoles

DEPISTAGE

DIAGNOSTIC

SUIVI

BILAN INITIAL

MALADIE RESIDUELLE

RESISTANCES

Remerciements

Service de pathologie moléculaireLudovic LacroixSophie CotteretNathalie AugerBirama Ndiaye

Laboratoire de Recherche TranslationnelleCécile JoveletCatherine RichonAurélie Honoré

Service de pathologieJean-Yves ScoazecJulien AdamCatherine GenestieCatherine Regnier

Service d’oncologie cliniqueJean-Charles SoriaBenjamin BesseAlexandra Leary

Recommandation GFCO

Antoinette Lemoine

Sébastien Couraud

Frédéric Fina

Sylvie Lantuejoul

Pierre-Jean Lamy

Marc Denis

Documents

Dr Etienne ROULEAU Génétique et Pathologie moléculaire · WGS Digital karyotyping 0,001% Leary, R. J. et al. T (2012). Validation de la méthode et contrôle de qualité Assurer