Dr. Gonzalo Álvarez Vergara Laboratorio de Producción Primaria y Fitoplancton

Universidad Católica del Norte

Gira de la Inocuidad Alimentaria - INOFOOD 2010 La Serena - 8 de noviembre 2010

Sistemas de detección de biotoxinas marinas, el cambio a la aplicación de técnicas de alta

sensibilidad

Biotoxinas marinas

• Son productos naturales de origen algal que actúan como metabolitos tóxicos.

• Sintetizadas principalmente por:– Dinoflagelados

– Diatomeas

– Cianobacterias

– Bacterias.

• Pueden ser transferidas a traves de la cadena trófica.

NH

NH

N

N

NH2

H2N

CH2

H

OHOH

R3

R1

+

+

R2

R4

Pyrodinium bahamense

AlexandriumGymnodinium

catenatum

Saxitoxina y análogos (VPM)

Principales biotoxinas marinas

Acido domoico (VAM)

Pseudo-nitzschia

Interrupción de la transmisión neuromuscular → Parálisis

Despolarización neuronal y daños en tejidos del hipocampo→ Amnesia temporal

Principales biotoxinas marinas

Acido okadaico y análogos (VDM) Pectenotoxinas

Dinophysis

Actúan sobre fosfatasas PP1 yPP2A → inflamación tractointestinal → diarreas

No actúan sobre fosfatasas PP1y PP2A → no producen diarreasSon hepatotóxicas para el ratón

Principales biotoxinas marinas

Azadinium spinosum

Azaspirácidos (AZP)

Afecta interacción célula - célula delos tejidos intestinales → afectabarrera intestinal → diarreas

Lingulodinium polyedrum

Protoceratium reticulatum

Yesotoxinas

Gonyaulax spinifera

No actúan sobre fosfatasas PP1 yPP2A → no producen diarreasSon cardiotóxicas para el ratón

Alexandrium ostenfeldii - peruvianum

Kareniaselliformis

Principales biotoxinas marinas

Gymnodimina Espirólidos

Neurotoxina Daño tejidos cerebrales

Marco legislativo para el control de toxinas en la UE

Reglamento (CE) Nº 853/2004: Establece los límites regulatorios

• Toxinas PSP (saxitoxina y análogos) → 800 µg STX eq kg-1

• Toxinas ASP (ácido domoico) → 20 mg DA kg-1

• Toxinas lipofílicas:• Ácido okadaico y análogos; pectenotoxinas: 160 µg OA eq kg-1

• Azaspirácidos: 160 µg AZA eq kg -1

• Yesotoxinas: 1 mg YTX eq kg-1

Reglamento (CE) Nº 2074/2005: Establece los métodos oficiales de análisis

•Toxinas VAMHPLC-UV ó Test ELISA

•Toxinas VPM:Bioensayo ó HPLC-RP - FLD (Método Lawrence)

•Lipofílicas:Bioensayo

Últimos años se han generado discusiones, especialmente en estos

dos reglamentos

Control de toxinas – Método biológico

El bioensayo es una herramientaeficaz para la protección delconsumidor.

En UE existen conflictos éticos por la utilización de animales delaboratorio

Directiva UE 86/609/EEC (1986): Artículo 7.2: “No deberá realizarse un experimento si sedispone de otro método científicamente satisfactorio, razonable y factible para obtener elresultado perseguido, y que no implique la utilización de un animal”.

Poca especificidad debido a que no discrimina los diferentesgrupos de toxinas en una muestra. ej. toxinas lipofílicas yparalizantes.

Recomendación de EFSA para disminuir los limites regulatorios

Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain on a request from the European Commission on MarineBiotoxins in Shellfish – Summary on regulated marine biotoxins. The EFSA Journal (2009) 1306: 1-23.

Dosis aguda de referencia (ARfD): cantidad de toxina por unidad de peso que puedeser ingerida en un periodo de 24 h sin producir daño al consumidor.

1. La Unión Europea exigirá la utilización de métodosquímicos para la determinación de toxinas lipofílicas →2 años.

2. EFSA sugiere la utilización de técnicas cromatográficaspara determinar toxinas paralizantes.

3. Es necesario preparar y automatizar los métodoscromatográficos para disminuir el tiempo y los costosde los análisis.

4. Se debe considerar una posible modificación a loslimites regulatorios.

¿Cuál es el nuevo escenario?

¿Cuáles son las técnicas de alta sensibilidad disponibles?

Toxinas lipofílicas:

Acido okadaico y análogos

Ensayos con fosfatasas (color y fluorimétrico)

HPLC-FLD

Acido okadaico y análogos

Azaspirácidos

Pectenotoxinas

Yesotoxinas

Iminas cíclicas

Toxinas paralizantes

HPLC-RP-FLD

LC-MS

Toxinas amnésicas

HPLC-UV

LC-MS

ELISA

→ LC-MS - multidetección

Mejores perspectivas

técnicas cromatográficas

Toxinas paralizantes (HPLC – RP – FLD)

NH

NH

N

N

NH2

H2N

CH2

H

OHOH

R3

R1

+

+

R2

R4

1. Toxinas no se retienen en fase reversa →apareador iónico

2. No tienen cromóforos3. Oxidación alcalina → productos fluorescentes

• Oxidación post-columna• Oxidación pre-columnaSaxitoxina y análogos

Post-columna:Oshima, Y., Machida, M., Sasaki, K., Tamaoki, Y., Yasumoto, T., 1984. Liquid chromatographic-fluorometric analysis of paralytic shellfish toxins. Agric. Biol. Chem. 48, 1707-1711.

Franco, J.M., Fernández-Vila, P., 1993. Separation of paralytic shelfish toxins by reversed phase highperformance liquid chromatography, with postcolumn reaction and fluorimetric detection.Chromatographia 35, 613-620

Pre-columna (técnica oficial AOAC):Lawrence, J.F., Niedzwiadek, B., Menard, C., 2004. Quantitative determination of paralytic shellfish poisoningtoxins in shellfish using prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence detection:Interlaboratory study. Journal of AOAC International 87, 83-100.

Falta de automatización y poco especifica → no separa epímeros

Autosampler inyector

Bomba

Reactor

DetectorFluorescencia

ColumnaFase reversa

Acido- acético- nítrico

Oxidante-periodato

Toxinas paralizantes (HPLC – RP – FLD)

Fase móvilA: heptano sulfónico y acido fosfórico en aguaB: heptano sulfónico y acido fosfórico en MeCN

Toxinas paralizantes – Método post-columna

Isocrático 1 Isocrático 2 Isocrático 3

M. referencia M. referencia M. referencia

A. p

urp

ura

tus

A. p

urp

ura

tus

A. p

urp

ura

tus

Álvarez, G., Uribe, E., Vidal, A., Ávalos, P., González, F., Mariño, C., Blanco, J., 2009. Paralytic shellfish toxins in Argopecten purpuratusand Semimytilus algosus from northern Chile. Aquatic Living Resources 22:341-47.

1. Identifica todas las toxinas presentes en la muestra

2. Se necesitan 3 análisis por muestra →Isocráticos

3. Pueden ser 2 análisis con una hidrólisis previa

4. ¡¡Demasiado tiempo por análisis!!

¿Cuál es la solución?

Ostión Bahía Guanaqueros

Toxinas paralizantes – Método Rourke

Rourke, W. A., Murphy, C. J., Pitcher, G., van de Riet, J. M., Burns, B. G., Thomas K.M., et al. (2008). Rapid Postcolumn Methodologyfor Determination of Paralytic Shellfish Toxins in Shellfish Tissue. Journal AOAC, 91(3), 589–597.

1. Utilización de gradiente para la elución de las toxinas2. Disminuye el tiempo del análisis → automatización3. En validación para ser incluido como método oficial AOAC

GTX

4

GTX

1

dcG

TX3

GTX

5

GTX

3

dcG

TX2

GTX

2

ne

oST

X

dcS

TX

STX

Isocrático 1

Isocrático 2

Toxinas lipofílicas - HPLC y espectrometría de masas

Detector de masas triple cuadrupolo

Autosampler

Bomba UHPLC

Interfase HESI

Interfase HESI

Interfase HESI

Q1 Q2

Q3

Detector

1. Desolvatación de la muestra que genera iones moleculares2. Skimmer y Tube lens → permite enfocar los iones3. Primer cuadrupolo (Q1) → selecciona el ion molecular parental4. Segundo cuadrupolo (Q2) → es la celda de colisión que permite fragmentar

el ion parental, generando iones producto (hijos)5. Tercer cuadrupolo (Q3) → selecciona los iones producto (hijos)

1

2

43

5

Toxinas lipofílicas - HPLC y espectrometría de masas

RT: 0.00 - 6.50 SM: 3B

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

Time (min)

0

50

100

0

50

100

0

50

100

0

50

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

0

50

100

0

50

100

RT: 2.71

AA: 212890

RT: 2.89

AA: 20816

RT: 3.70

AA: 626763

RT: 5.11

AA: 75748956

RT: 5.52

AA: 18038281

RT: 5.55

AA: 2813287

NL: 6.90E4

TIC F: - c ESI SRM ms2

803.432

[255.149-255.151] MS

Genesis

MixDSPB2_SRM_Neg_01

NL: 6.82E3

TIC F: - c ESI SRM ms2

1141.449

[1061.499-1061.501] MS

Genesis

MixDSPB2_SRM_Neg_01

NL: 1.67E5

TIC F: + c ESI SRM ms2

842.457

[654.399-654.401] MS

Genesis

MixDSPB2_SRM_Neg_01

NL: 2.11E7

TIC F: + c ESI SRM ms2

508.329

[490.199-490.201] MS

Genesis

MixDSPB2_SRM_Neg_01

NL: 4.73E6

TIC F: + c ESI SRM ms2

692.414

[674.399-674.401] MS

Genesis

MixDSPB2_SRM_Neg_01

NL: 7.66E5

TIC F: + c ESI SRM ms2

876.458

[805.499-805.501] MS

Genesis

MixDSPB2_SRM_Neg_01

Acido okadaico: m/z 803 → 255

Toxinas lipofílicas - HPLC y espectrometría de masas (MRM)

Yesotoxina: m/z 1141 → 1061

Azaspirácido 1: m/z 842 → 654

Gymnodimina A: m/z 508 → 490

Espirólido (SPX1):m/z 692 → 674

Pectenotoxina: m/z 876 → 805

Toxinas lipofílicas - HPLC y espectrometría de masas

RT: 0.00 - 7.00 SM: 5B

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0

Time (min)

0

50

100

0

50

100

0

50

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

0

50

100

RT: 2.79AA: 388

RT: 2.80AA: 3648

RT: 5.81AA: 25312

RT: 5.82AA: 53480

NL: 1.26E2

TIC F: - c ESI SRM ms2 875.400 [179.199-179.201] MS ICIS Macha_120509

NL: 1.10E3

TIC F: - c ESI SRM ms2 875.401 [137.199-137.201] MS ICIS Macha_120509

NL: 6.30E3

TIC F: + c ESI SRM ms2 876.458 [805.499-805.501] MS ICIS Macha_120509

NL: 1.18E4

TIC F: + c ESI SRM ms2 876.459 [823.499-823.501] MS ICIS Macha_120509

PTX2sa: 875 → 137 m/z

PTX2: 876 → 823 m/z

Machas Bahía Coquimbo

Azaspirácido - 1842 m/z

13- desmetil-C (SPX- 1) 692 m/z

Álvarez, G., Uribe, E., Ávalos, P., Mariño, C., Blanco, J., 2010. First identification of azaspiracid and spirolides in Mesodesma donacium and Mulinia edulis from northernChile. Toxicon 55:638-41.

Toxinas lipofílicas – HPLC y espectrometría de masasMachas y almejas Bahía Coquimbo

Toxinas lipofílicas – técnicas de multidetección

Mcnabb, P., Selwood, A.I., Holland, P.T., 2005. Multiresidue Method for Determination ofAlgal Toxins in Shellfish: Single-Laboratory Validation and Interlaboratory Study. Journal ofAOAC International 88, 761-772.

Stobo, L.A., Lacaze, J., Scott, A.C., Gallacher, S., Smith, E.A., Quilliam, M.A., 2005. Liquidchromatography with mass spectrometry - detection of lipophilic shellfish toxins. Journalof AOAC International 88, 1371-1382.

Fux, E., Mcmillan, D., Bire, R., Hess, P., 2007. Development of an Ultra-Performance LiquidChromatography-Mass Spectrometry Method for the Detection of Lipophilic MarineToxins. Journal of Chromatography a 1157, 273-280.

Gerssen, A., Mulder, P.P.J., McElhinney, M., Boer, J., 2009. Liquid chromatography-tandemmass spectrometry method for the detection of marine lipophilic toxins under alkalineconditions Journal of Chromatography A 9, 1421 - 1430.

Toxinas amnésicas - HPLC y espectrometría de masas

Autosampler

Detector (PDA)

Bomba HPLC

Detector de masas de trampa iónica

Válvula 10 vías

C:\Xcalibur\...\australisC41Conc10x 4/27/2006 3:37:08 PM

RT: 6.00 - 15.00

6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0

Time (min)

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

uA

U11.58

14.1913.5112.49 13.0810.478.08 8.757.02 9.676.49 9.216.06 7.63

NL:

4.09E4

nm=240.0-

245.0

PDA

australisC4

1Conc10x

RT: 6.00 - 15.00 SM: 7B

6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0

Time (min)

0

20

40

60

80

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

11.71

11.09

9.588.70 14.9510.92 12.766.44 9.28 9.907.02 7.67 13.567.90 13.3110.338.21

NL: 3.71E7

TIC F: + c ESI Full

ms2

312.20@34.00 [

85.00-320.00] MS

australisC41Conc10

x

australisC41Conc10x #466 RT: 11.70 AV: 1 NL: 1.57E7

F: + c ESI Full ms2 312.20@34.00 [ 85.00-320.00]

240 245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295

m/z

10

20

30

40

Rela

tive A

bundance

266.0

294.0248.1

276.1

265.3249.1 295.0267.1

242 nm

312 m/z

Álvarez, G., Uribe, E., Quijano-Scheggia, S., López-Rivera, A., Mariño, C., Blanco, J. 2009. Domoic acid production by Pseudo-nitzschia australis and Pseudo-nitzschiacalliantha isolated from North Chile. Harmful Algae 8:938-945

Toxinas amnésicas - HPLC y espectrometría de masasMétodo NRC (Quilliam et al., 1989)

Pseudo-nitzschia australis Bahía Tongoy

C:\Xcalibur\...\SP02_liquido_02 4/9/2010 3:47:58 PM

RT: 2.81 - 5.50 SM: 7B

3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4

Time (min)

0

20

40

60

80

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

4.26

4.61

3.953.60 3.823.653.21 3.26 3.375.365.19 5.28

NL: 3.14E7

TIC F: + c ESI Full

ms2

312.10@cid30.00

[150.00-312.00] MS

SP02_liquido_02

150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310

m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

265.98

294.03

248.08

202.96 229.99220.06175.12 198.15 275.95267.04249.23 294.98258.79189.92178.94151.95 160.80 283.92241.91165.06 215.01 292.85 311.74

150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310

m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

265.96

293.96248.00202.98

220.98 276.00265.18193.04 230.01175.05 295.05292.98202.02 311.18184.21 213.06 266.87238.05 249.09160.95152.04 284.14204.08164.91 247.30

Acido domoico Acido Epi-domoico

Toxinas amnésicas - HPLC y espectrometría de masas

Utilización de nuevas técnicas cromatográficas permiten disminuir los tiempos de análisis

Machas Bahía Coquimbo

Conclusiones

• La aplicación de técnicas cromatográficas para determinar toxinaslipofílicas en la UE, conllevará la aplicación de estas técnicas enpaíses no comunitarios.

• Chile deberá actualizar su sistema de control de toxinas marinaspara cumplir con los futuros cambios en la regulación.

• Chile debe considerar la sugerencia de EFSA de disminuir loslimites regulatorios. Esto incrementará los cierres cautelaresdurante la presencia de toxinas.

• La presencia de toxinas lipofílicas en el norte de Chile hacenecesario disponer de técnicas de LC-MS.

• La presencia de toxinas paralizantes en el norte de Chile hacenecesario disponer de técnicas de HPLC-FLD.

• La utilización de estas técnicas incrementaran los costos de losanálisis.

Parte de la información relacionada con los análisis de toxinasmarinas ha sido generada en el Centro de Investigacións Mariñasen el marco de un convenio de cooperación entre la Consellería delMar de la Xunta de Galicia y la Universidad Católica del Norte,Chile.