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신진연구자 칼럼
NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 35, No. 1, 2017 … 41
1. 서론
식중독은 오염된 물이나 음식물 섭취로 인해 발생
하는 전염성 질병으로 한국에서는 매년 약 300건 이
상 발생하며 6,000명 이상의 환자가 생겨난다. 뿐만
아니라 세계 여러 나라에서 식중독으로 인한 피해가
꾸준히 발생하며 그로 인한 사회, 경제적 비용이 적
지 않다. 식중독의 원인 중 가장 높은 비율을 차지하
는 것은 병원성 미생물로 세포나 독소 등을 이용하
여 식중독 질병을 일으킨다[1-3]. 병원성 미생물에 인
해 발생하는 식중독의 증상은 보통 설사, 구토, 고열,
구역질 등으로 경미한 편이나 유아나 노인, 면역손상
환자의 경우, 위중한 증세를 동반하기도 하며 심한
경우 사망에 이르기도 한다. 따라서 매년 꾸준히 일
어나는 식중독 발생건수 및 환자수를 줄이고 공공 위
생 및 보건 증진, 식품 안전성 보장 등을 위해서는 정
확하고 빠르게 병원성 미생물을 검출하여 식중독을
예방하는 것이 무엇보다 중요하다.
현재 식품공전에서 주로 사용되는 전통적 미생
물 검출법은 배양 기반 방법으로 미생물 각각을 개
별적으로 진단해야하며 노동집약적이고 시간이 많
이 소요된다(2~7일). 이를 해결하기 위해 도입된 분
자생물학적 검출법에는 항원-항체 반응과 같은 면역
학적 원리를 이용하는 fluorescent antibody나 ELISA,
genetic assay인 polymerase chain reaction(PCR), in situ
hybridization assay 등이 있다. 이 기술들은 기존 검출
법보다 빠르지만 역시 미생물에 따른 개별 검출이 필
요하며 비용이나 정확성, 그리고 동시 진단에 제약을
가지고 있다.
그에 반해 oligonucleotide(ON) microarray 기술은
여러 개의 capture probe를 좁은 면적의 기판 위에 집
적할 수 있어 한 실험으로 여러 개의 식품 유래 병원
성 미생물을 동시 검출할 수 있으며 또한 정확성과
민감도가 높고 빠르게 미생물 검출에 있어 새로운 대
체 기술로 제안되어 왔다[4, 5]. ON microarray를 이용
하기 위해 ribosomal DNA를 비롯하여 house keeping
gene, virulence factor-related gene, antibiotic resistance-
related gene과 같은 미생물별 특이적 유전자 등이
biomarker로써 사용되고 있다. 미생물을 정확하게 구
분 검출하기 위해서는 적절한 biomarker gene을 찾
아 특이적 capture probe를 디자인하는 것이 무엇보
다 중요하다. 본 칼럼에서는 병원성 미생물을 특이적
으로 검출하기 위한 여러 biomarker gene 기반의 ON
microarray 기술들을 소개하고자 한다.
병원성 미생물 검출을 위한
Oligonucleotide Microarrays의 개발
신화희
포항공과대학교 화학공학과 박사후 연구원
분자생명공학연구실(MAGIC Lab.)
2009 서강대학교 화공생명공학과, 공학사
2016 포항공과대학교 화학공학과, 공학박사
현재 포항공과대학교 화학공학과, 박사후 연구원
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2. 본론
2-1. 16S rDNA 기반 ON microarray 개발
Ribosomal DNA를 기반으로 한 ON microarray를
이용하여 병원성 미생물을 검출하고자 하는 시도들
이 많이 있어 왔다. 특히, ribosomal rRNA (rRNA) 중
에서 16S rRNA 유전자(16S rDNA)를 이용한 연구들
이 많이 있는데 이는 16S rRNA가 모든 미생물에 있으
며 미생물 계통학 분류(phylogenetic discrimination)에
주로 사용되는 유전자이기 때문이다[6-11]. 또, 16S
rDNA는 유전자 내에 conserved sequences와 variable
sequences가 있어 미생물 특이적 capture probe와 PCR
증폭을 위한 universal primer, 미생물 공통의 positive
capture probe 디자인이 용이하다는 장점이 있다. 이
러한 16S rDNA의 장점을 기반으로 많은 수의 병원성
미생물을 검출할 수 있는 ON microarray를 개발하고
자 하였다[그림1].
식품 공전에서 자주 발생하는 16종의 병원성 미
생물(B. cereus, C. jejuni, C. perfringens, E. coli, E.
coli O157:H7, L. monocytogenes, S. enterica subsp.
enterica serotype Choleraesuis, S. Enteritidis, S. boydii, S.
dysenteriae, S. aureus, V. cholerae, V. parahaemolyticus,
V. vulnificus,and Y. enterocolitica)을 위한 28개 특이적
capture probes를 디자인하였으며 이를 이용하여 16종
의 병원성 미생물을 특이적으로 검출할 수 있음을 확
인할 수 있었다[12]. Salmonella spp., E. coli, Shigella
spp.와 같은 몇몇 병원성 미생물은 매우 유사한 16S
rDNA 유전자 서열을 공유하고 있어 비특이적 신호가
비록 같이 검출되지만 각각 병원성 미생물이 가지는
신호 코드가 달라 이를 이용하여 충분히 구분할 수
있다. 개발한 16S rDNA 기반 ON microarray의 민감도
를 S. boydii를 대표균주로 사용하여 측정하였으며 민
감도는 PCR amplicon의 0.25-2.5 nM 농도 수준으로
이는 10-100 fmoles에 해당한다(12).
또한, 16S rDNA 기반 ON microarray의 실용적인
활용을 위해 식품으로부터 병원성 미생물 세포를 간
단한 전처리 과정을 통해 얻고 추가적인 증폭이나 정
제 과정 없이 세포 파쇄물을 바로 microarray 기판에
사용하여 검출 할 수 있는 방법을 개발하고자 하였
다. 식품 전처리는 미생물에 오염된 8종의 식품 매트
릭스별(육류, 채소류, 곡류, 유제품류, 육류 가공품,
수산물 가공품 등)로 적절한 rpm의 centrifugation을 통
하여 간단하게 식품 부유물을 제거하고 미생물 세포
를 얻을 수 있었다. 전처리를 통해 얻어진 세포 파쇄
그림 1. 16S rRNA 기반 ON microarray[12].
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물을 microarray 기판에 바로 사용하여 병원성 미생물
을 충분히 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다. 그 신
호 세기는 증폭한 DNA를 사용할 때보다는 낮은 편인
데 이는 RNA가 DNA보다 실험 환경에서 더 불안정
하기 때문일 것으로 추측된다[12].
16S rDNA 기반 ON microarray 검출법은 빈번히 발
생되는 여러 종류의 병원성 미생물을 특이적이고 빠
르게 검출할 수 있으며 세포를 직접 사용하여 간단하
면서 좀 더 실용적으로 검출에 적용할 수 있을 것이
라 생각된다.
2-2. Double biomolecular marker(DBM)
기반 microarray 개발
Vibrio cholerae와 같은 미생물의 경우 virulence
factors를 생산함으로써 심각한 전염성의 집단 감염
을 일으킬 수가 있어 미생물의 병원성(pathogenecity)
을 분석하고 모니터링하는 것이 필수적이다. 이를 위
해 toxin gene을 포함한 virulence factor-related genes을
기반으로 하여 미생물을 검출하는 DNA microarray가
연구되어 왔다[13, 14]. 하지만 이런 DNA microarray
는 미생물 검출을 하는데 꽤 효과적이긴 하지만
genotype 분석으로 한정되어 있어 실질적인 virulence
factors 생산 여부나 정확한 병원 인자(etiology)를 파
악하기에는 한계가 있다. Virulence factors를 검출하
는 방법들이 또한 여러 가지 있는데 동물을 이용하는
bioassays, tissue culture, coagglutination, ELISA 등으로
이 방법들은 virulence factors를 직접 표적하지만 어떤
미생물이 존재 혹은 관련되어 있는지 알 수 없다. 따
라서 하나의 검출법으로 미생물과 virulence factors를
동시에 검출 및 분석을 할 수 있는 방법이 필요하다.
이를 위해서 DNA와 당, 두 개의 biomolecular
marker로 구성된 새로운 하이브리드 형태의
microarray인 Double Biomolecular Markers(DBM)
microarray를 제안하였다[15]. DBM microarray는 콜레
라 전염병을 일으키는 V. cholerae와 virulence factor
인 cholera toxin(CT)를 동시 검출하는데 적용하고
자 하였으며 16S rRNA 기반의 DNA capture probe
는 V. cholerae 미생물 자체를, CT와 interaction하는
당으로 알려진 GM1 pentasaccharide를 carbohydrate
capture probe로 사용하여 분비된 CT를 검출하고자
하였다[그림2]. V. cholerae 세포로부터 직접 genomic
DNA(gDNA)와 분비된 CT를 얻어 이를 검출 표적 물
질로 사용하였으며 이는 DNA 증폭이나 물질 정제
과정을 생략할 수 있어 표적 물질들을 간단하게 얻
을 수 있고 검출 시간을 단축시킬 수 있다. 세포로부
터 직접 얻어진 gDNA와 CT를 이용하여 서로 다른
두개의 interactions(DNA-DNA, toxin-carbohydrate)
이 간섭 없이 특이적 신호를 각각 보이며 성공적으
로 검출됨을 확인하였다. DBM microarray의 limit of
detection(LOD)는 1.7x106-1.7x107 cells로 추산하였
그림 2. Double Biomolecular marker microarray[15].
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으며 이는 V. cholerae의 infectios dose인 108 cells 보
다 적은 수이지만 효과적인 검출을 위해서는 pre-
enrichment가 불가피함을 알 수 있었다[15].
새롭게 제안된 하이브리드 형태의 DBM microarray
는 oligonucleotide capture probes를 이용하여 미생
물을 검출할 수 있으며 GM1 pentasaccharide capture
probe를 이용해서는 분비된 CT를 검출함과 동시에
병원성을 분석할 수 있다. 이는 V. cholerae 이외에도
virulence factor 분석이 필요한 다른 병원성 미생물에
도 추후 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
2-3. 살모넬라 혈청형 검출을 위한 carB 기반
oligonucleotide microarray 개발
Salmonella는 한국이나 미국 등 여러 나라에서 빈
번히 발생하는 병원성 미생물로 salmonellosis라고 통
칭되는 감염병을 일으킨다. Salmonella는 다른 병원
성 미생물과 다르게 독특한 분류체계를 가지고 있는
데 그 중 S. enterica subsp. enterica는 species 중에서 유
일하게 온혈동물에 서식하여 식중독의 대부분의 원
인을 차지한다. 특히, S. enterica subsp. enterica는 약
1,500개 이상의 혈청형(serotype)으로 구성되어 있고
혈청형 각각이 가지는 병원성, 항생제 내성, 병의 경
중, 숙주 특이성(host-specificity)이 달라 혈청형 수준
으로 구분 검출하는 것이 중요하다. 또한, 역학 조사
를 위해서도 필요하다[16, 17].
앞서 언급했듯이 Salmonella serotypes과 가까운
미생물인 E. coli, Shigella spp.는 서로 16S rRNA 유
전자 서열이 매우 유사하여 16S rDNA 기반 capture
probes만으로는 혈청형 수준까지의 구분 검출이 현
실적으로 어렵다. Salmonella serotypes을 특이적이고
신뢰성 높게 구분 검출할 수 있는 새로운 biomarker
gene가 필요한데 이를 위해 carbamoyl-phosphate
synthetase(CPS) large subunit (carB) gene을 새로
운 biomarker gene으로 선정하였다[18]. 이는 미생
물 생존에 필수적인 효소를 인코딩하고 있어 모든
Salmoenlla 혈청형이 가지고 있으며 capture probe 디
자인에 용이하게 conserved and variable sequences를
가지고 있기 때문이다. 또한 이 유전자를 이용하여
Salmonella 분류학 연구(phylogenetic analysis)에 사용
된 전례들이 있어 Salmonella 혈청형을 구분할 수 있
는 충분한 sequence variability를 가졌을 것이라고 추
측하였다[19-22].
CarB 유전자를 기반으로 Salmonella 혈청형 중 빈
번히 발생하는 주요 세 균주, Salmonella serotypes,
Choleraesuis, Enteritidis, Typhimurium를 구분 검출하
고자 하였으며 이를 위해 각각 혈청형에 특이적인
capture probes를 총 6개 디자인하여 ON microarray를
제작하였다[그림3]. Universal primer를 이용하여 증
폭시킨 carB-amplicons을 이용하여 세 혈청형을 특
이적으로 구분 검출할 수 있음을 확인하였으며 LOD
는 1.6~3.1 nM로 측정되었다[18]. 또한, 계통학적으로
Salmonella spp.와 가깝다고 알려진 E. coli나 Shigella
spp.를 포함한 다른 병원성 미생물의 PCR amplicons
을 사용하였을 때에도 비특이적 신호가 생성되지 않
았다. 또한 다른 미생물들 속에 Salmonella가 섞여 있
을 때에도 혼선 없이 성공적으로 검출되는 것 또한
확인하였다.
3. 결론
본 컬럼에서 병원성 미생물을 효과적, 선택적이며
정확하게 병원성 미생물을 검출할 수 있는 여러 가
지 detecton biomarker를 사용한 ON microarray 검출법
을 소개하였다. 16S rDNA 기반 ON microarray 검출
법은 흔하게 발생하는 여러 개의 병원성 미생물을 오
염된 음식물로부터 효과적으로 검출할 수 있었으며
실용적 적용을 위해 오염된 음식물의 간단한 전처리
과정을 통해 미생물 세포를 얻어 바로 검출법에 적
용할 수 있었다. DNA 기반 그리고 당 기반의 capture
probes를 같이 도입하여 병원성 미생물과 미생물이
분비하는 독소를 검출하고 미생물의 병원성을 동시
에 분석할 수 있는 DBM microarray를 새롭게 제안
했다. 또한, Salmonella enterica subsp. enterica의 주요
세 혈청형을 구분 검출하기 위해서 새로운 detection
biomarker gene으로 carB를 선정하고 이를 기반으로
한 ON microarray가 혈청형을 정확하게 구분 검출할
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수 있음을 확인하였다. 이 유전자는 또한 16S rDNA
유전자 서열만으로는 구분하기 어려운 미생물 species
나 strain 검출에도 확장되어 사용할 수 있을 것으로
기대된다.
ON microarray를 병원성 미생물 검출에 적용하기
위해서는 소개된 연구들에서처럼 적절한 biomarker
gene을 선정하여 정확한 미생물 구분 검출을 하는 것
이 중요하다. 이 뿐만 아니라, 충분히 낮은 수의 미
생물을 검출할 수 있어야하기 때문에 ON microarray
의 민감도를 좀 더 증가시킬 수 있는 연구와 음식물
이나 감염된 환자의 혈액 샘플 등에서부터 효과적으
로 미생물을 샘플링하거나 획득할 수 있는 방법에 관
한 연구 또한 필요하다. 이런 연구들을 바탕으로 ON
microarray 검출 기술이 좀 더 향상되면 정확하고 민
감하게 병원성 미생물을 검출할 수 있을 것이며 실제
검출 현장에 적용할 수 있을 것으로 기대한다.
참고문헌
1. Korean Ministry of Food and Drug Safety. The statistic system for foodborne disease. Available from http://www.foodsafetykorea.go.kr/portal/healthyfood-life/foodPoisoningStat.do?menu_no=519&menu_ grp=MENU_GRP02 (2015).
2. Centers for Disease Control and Prevetion. Surveillance for foodborne disease outbreaks, United States, Annual report. US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta, Georgia, USA (2012).
3. A. J. Linscott, Clin Microbiol Newsl 33, 41 (2011).4. V. Chizhikov, A. Rasooly, K. Chumakov, and D. Levy,
Appl Environ Microbiol 67, 3258 (2011).
5. D. R. Call, M. K. Borucki, and F. J. Loge, J Microbiol Methods 53, 235 (2003).
6. K. Rudi, O. M. Skulberg, R. Skulberg, and K. S. Jakobsen, Appl Environ Microbiol 66, 4004 (2000).
7. H. S. Eom, B. H. Hwang, D. H. Kim, I. B. Lee, Y. H. Kim, and H. J. Cha, Biosens Bioelectron 22, 845 (2007).
8. X. W. Wang, L. Zhang, L. Q. Jin, M. Jin, Z. Q. Shen, S. An, F. H. Chao, and J. W. Li, Appl Microbiol Biotechnol 76, 225 (2007).
9. P. Cremonesi, G. Pisoni, M. Severgnini, C. Consolandi, P. Moroni, M. Raschetti, and B. Castiglioni, J Dairy Sci 92, 3027 (2009)
10. B. H. Hwang, and H. J. Cha, Biotechnol Bioeng 106, 183 (2010).
11. B. H. Hwang, H. H. Shin, J. H. Seo, and H. J. Cha, Anal Chem 84, 4873 (2012).
12. H. H. Shin, B. H. Hwang, and H. J. Cha, Biotechnol J 11, 1405 (2016).
13. D. Jin, H. Qi, S. Chen, T. Zeng, Q. Liu, and S. J. Wang, J Microbiol Methods 75, 365 (2008).
14. Y. You, C. Fu, X. Zeng, D. Fang, X. Yan, B. Sun, D. Xiao, J. Zhang, J Microbiol Methods 75, 566 (2008).
15. H. H. Shin, J. H. Seo, C. S. Kim, B. H. Hwang, and H. J. Cha, Biosens Bioelectron 79, 398 (2016).
16. K. Chan, S. Baker, C. C. Kim, C. S. Detweiler, G. Dougan, S. Falkow, J Bacteriol 185, 553 (2003).
17. G. A. Grassl and B. B. Finlay, Curr Opin Gastroen-terol 24, 22 (2008).
18. H. H. Shin, B. H. Hwang, J. H. Seo, and H. J. Cha, Appl Environ Microbiol 80, 366 (2014).
19. H. Nyunoya and C. J. Lusty, Proc Natl Acad Sci USA 80, 4629 (1983).
20. J. Hong, W. L. Salo, C. J. Lusty, and P. M. Anderson, J Mol Biol 243, 131(1994).
21. F. S. Lawson, R. L. Charlebois, and J. A. Dillon, Mol Biol Evol 13, 970 (1996).
22. F. Javid-Majd, L. S. Mullins, F. M. Raushel, and M. A. Stapleton, J Biol Chem 275, 5073 (2000).
그림 3. 살모넬라 혈청형 검출을 위한 carB 기반 ON microarray[18].
