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목 차
Ⅰ. Polymerase Chain Reaction (PCR)의 개요 ..............................................1
1. 서론 .........................................................................................................................1
2. PCR 반응에 필수적인 성분......................................................................................1
3. PCR 과정.................................................................................................................1
4. PCR 반응의 예 ........................................................................................................3
5. PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점.......................................................................5
6. PCR 기기 (Thermal cycler) ....................................................................................7
Ⅱ. PCR 산물의 전기영동 (electrophoresis)..................................................8
1. 전기영동(electrophoresis)의 원리..............................................................................8
2. Electrophoresis buffer solution .................................................................................8
3. Gel loading buffer ......................................................................................................9
4. Agarose gel 만들기....................................................................................................9
5. 전기영동...................................................................................................................11
Ⅲ. Primer를 디자인할 때의 고려사항..........................................................13
Ⅳ. PCR의 응용............................................................................................18
1. RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) ..............................18
2. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)/PCR-SSCP..............................19
3. RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) .............................................................20
4. ISPCR (In Situ Polymerase Chain Reaction) ............................................................20
5. DDRT-PCR (Differential Display Reverse Transcriptase PCR) ..............................21
6. Inverse PCR.............................................................................................................22
7. Degenerate PCR법...................................................................................................22
Ⅴ. 실험 시 주의사항...................................................................................24
Ⅵ. 마이크로 파이펫의 사용법......................................................................25
Ⅶ. 실험 프로토콜........................................................................................27
Ⅷ. Trouble shooting...................................................................................34
부록.............................................................................................................36
1. Primer3 program 사용 설명.....................................................................................36
2. Primer3 program을 이용한 Human β–actin 검출용 PCR primer 디자인 결과..........40
Ⅰ. Polymerase Chain Reaction (PCR)의 개요
1. 서론
Polymerase Chain Reaction (PCR, 중합효소 연쇄반응)은 특정 DNA 부위를 특이적으로
반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의
DNA 를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의
발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 즉 genomic DNA 와 같은 아주 큰 DNA 로부터
원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel 이나
polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band 로 가시화할 수가 있다.
PCR 기법은 1985 년 Kary Mullis 에 의해 고안된 방법으로, 처음에는 대장균(E. coli)에서
분리한 DNA polymerase I 을 사용하였으므로 cycle 이 지날 때마다 효소를 첨가해야 하는
불편 때문에 널리 이용되지 못하였다. 그러나, 1987 년 Saiki 박사에 의해 thermostable
Taq DNA polymerase 가 발견된 후 실험방법이 보편화되었다. Kary Mullis 는 PCR 기법을
고안한 공적을 인정받아 1993 년 노벨 화학상을 수상했다.
2. PCR 반응에 필수적인 성분
1) Template DNA : 증폭 대상이 되는 DNA
2) Primer : 증폭할 부분을 결정하며 template DNA 에 상보적으로 결합하는 짧은
oligonucleotide
3) dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : 유전자를 합성하는 재료가 되는 nucleotides
4) Thermostable DNA polymerase : 열에 특별히 강한 DNA 합성효소. eg) Taq DNA
polymerase
* PCR 반응 각 성분에 대한 상세한 설명은 다음의 PCR 과정에서 다룬다.
3. PCR 과정
1) DNA 의 변성(denaturation)
90°C~96°C 로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로
분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase 도
온도가 아주 높은 상태에서는 활성이 낮아질 수 있으므로 보통 94°C 로 실시한다. 첫
cycle 에서는 확실한 변성을 위하여 약 5 분간 지속시킨다.
2) Primer 의 결합(annealing)
Primer 를 template DNA 에 결합하는 과정으로, 50°C~65°C 에서 진행된다. PCR
반응에 사용하는 두 primer 의 annealing 온도 (Tm 값)는 비슷하여야 한다.
1
염기간의 결합은 G 와 C 는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A 와 T 는 두 군데에서
결합이 일어나므로 primer 의 염기구성에 따라 annealing 온도 (Tm 값)가 달라진다.
따라서 primer 를 디자인할 때 Tm 값을 고려하여 합성해야 한다. (Primer 디자인은
Ⅲ장에서 설명)
3) DNA의 합성(polymerization)
Taq DNA polymerase 의 활성에 의해 DNA 를 합성하는 과정으로, 70°C~74°C (보통
72°C)에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을
때에는 시간을 연장시킬 수도 있다. Taq DNA polymerase 는 보통 1 분에 2,000-4,000
nucleotides 를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb 마다 1 분 정도의
시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle 에는 약 10 분 정도로 시간을
충분히 주는 것이 좋다.
2
위 과정이 25∼35 회 계속 반복하여 진행되면서 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이
PCR 의 원리이다. 쉽게 설명하면 튜브에 재료를 집어넣고 뜨겁게 덥혔다 식혔다 하면
Taq DNA polymerase 가 유전자를 합성해주는 것이다.
PCR을 통하여 in vitro상에서 특정 부위의 DNA를 105∼108배까지 수시간 내에 증폭시킬
수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 다음과 같이 여러 가지 실험에 이용할 수 있고, 실험
결과를 토대로 여러 의학적인 연구에 응용할 수가 있다.
PCR이 이용되는 실험
1) Probe 로 사용할 목적으로 cloning 된 이중가닥 DNA 의 증폭
2) 적은 양의 mRNA 로부터 특정 cDNA 의 cloning
3) DNA sequencing
4) 돌연변이 검사
5) 병인성 바이러스 및 박테리아 검출
6) 유전자의 footprinting
7) 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis)
PCR의 의학적 응용
1) HLA 형의 결정
2) 법의학: 특정인의 유전자 검출
3) 암유전자의 검출: ras, myc, fos 등
4) 유전성 질병의 진단: Progressive muscular dystrophy (Duchenne type)등
5) 감염성 질병의 진단: Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등
4. PCR 반응의 예
1) 통상적인 반응 예시
Example of PCR mix
Template DNA 1 ㎕
Primer, upstream (or forward) (~10 pmoles/㎕) 1 ㎕
Primer, downstream (or reverse) (~10 pmoles/㎕) 1 ㎕
dNTP Mixture (각 2.5 mM) 4 ㎕
10x Taq DNA polymerase buffer 5 ㎕
Taq DNA polymerase(1 u/㎕) 1 ㎕
DW (50 ㎕ 가 되도록 첨가) 37 ㎕
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Example of PCR cycle
94°C 5 분
94°C 30 초 - 60°C 30 초 - 72°C 30 초 (30 cycle)
72°C 5 분
2) Genomic DNA 로부터 특정 유전자 부위의 증폭
실험방법
(1) 실험에 이용할 PCR tube 에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하고
pipette 으로 잘 섞는다. (총 부피 50 ㎕)
Template DNA(100 ng/㎕) 1 ㎕
Forward primer(12.5 pmole/㎕) 1 ㎕
Reverse primer(12.5 pmole/㎕) 1 ㎕
dNTP Mixture (2.5 mM each) 2 ㎕
10x Ex Taq buffer 5 ㎕
DW 39.75 ㎕
TaKaRa Ex Taq DNA (5 unit/㎕) 0.25 ㎕
* 10x Ex Taq buffer는 효소와 함께 들어있는 것을 사용하면 되지만, MgCl2의 농도를
변화시킬 필요가 있는 경우에는 Mg2+ free buffer를 사용해야 한다.
* 여러 개의 다른 sample (조직 등)에서 분리한 template 를 같은 primer 로 증폭하는 경우,
template 를 제외한 다른 성분을 모두 섞은 PCR master mix 를 만들어서 쓰면 좋다.
* 위 반응은 단지 예일 뿐이며 모든 성분은 PCR 반응마다 여러 번 실험을 반복하면서
최적 조건을 결정하여 사용해야 한다. 각 조성마다 고려해야 할 점과 주의사항을 아래에
따로 정리하였다.
* PCR 은 대단히 민감한 반응이다. 위의 여러 가지 시약들이 조금이라도 다른 물질에
오염되거나 더러운 tip 을 쓰는 경우 false positive 반응이 나오는 확률이 아주 높으므로
반드시 깨끗한 시약을 조금씩 덜어서 쓰도록 하고 오염이 의심되면 버려야 한다.
(2) 혼합한 시료를 PCR machine 에 넣고 다음과 같은 프로그램으로 PCR을 시작한다.
Denature Annealing Polymerization Cycle 수
Cycle 1 94°C 5 min 60°C 30 sec 72°C 30 sec 1 cycle
Cycle 2 94°C 30 sec 60°C 30 sec 72°C 30 sec 30 cycles
Cycle 3 94°C 30 sec 60°C 30 sec 72°C 10 min 1 cycle
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* 위 반응은 단지 예일 뿐이며 annealing 온도와 각 시간은 PCR 반응마다 여러번 실험을
반복하면서 최적 조건을 결정하여 사용해야 한다.
* 예전에는 혼합액 위에 증발을 방지하기 위해서 mineral oil 을 첨가해야 했지만, 최근의
많은 기계와 tube 는 mineral oil 의 첨가가 필요 없도록 뚜껑 쪽에서 가열하게 되어있다.
(3) 반응이 끝나면 3∼5 ㎕ 정도 반응액으로 전기영동을 실시하여 반응산물을 확인한다.
* 반응산물을 확인하기 위해서는 acrylamide gel 보다 사용하기 편리한 agarose gel 을 더
많이 이용한다. 반응산물의 크기에 따라 정확한 분리가 가능하도록 다양한 agarose 가
판매되고 있으므로, 원하는 분리 범위를 결정하여 agarose 취급사에 문의하도록 한다.
(자세한 내용은 전기영동 편에서 설명)
* 반응산물의 크기를 확인하기 위하여, agarose gel 전기영동용 DNA ladder marker 를
한쪽 끝에 걸어주어야 한다.
5. PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점
1) Template DNA
선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal
DNA 나 전염성 병원체의 DNA 또는 RNA 로부터 제조한 complementary DNA(cDNA),
plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로 가능한
한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안된 경우에는 양이 적을 때 반응이 충분히
일어나지 않고 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의해야 한다.
Chromosomal DNA 인 경우 1 μg 이내, plasmid DNA 의 경우 100 pg∼100 ng 정도를
일반적으로 사용하지만 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA 의 copy
수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동상에서 비 특이 DNA 가 나타나거나 끌린 모양이
나타나면 맨 먼저 template DNA양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다.
2) Primer
Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서
안쪽으로 약 20 bp 내외의 염기서열에 대응하는 oligonucleotide 를 DNA 합성기로
합성하여 이용한다.
G+C 비율이 반 정도 되게 디자인하는 것이 primer 와 template 간의 결합력을 강하게
유지하는데 도움이 되며 G+C 함량이 높을 경우에는 annealing 온도를 높이면 되지만,
무엇보다도 양쪽 primer 의 annealing 온도를 비슷하게 만들어야 한다. 또한 양쪽
primer 가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 가능하면 반응산물 내에 있는
DNA 염기서열을 분석하여 비특이 DNA 가 생성되지 않도록 고안해야 한다. Primer 의
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디자인이 PCR 반응의 성공 유무의 90%를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합성하기 전에
신중히 고려해야 할 것이다. Primer 합성은 염기서열을 적어 다카라코리아에 의뢰할 수
있으며, 일반적인 PCR 에 사용할 목적이라면 50nmol scale 합성/PCR grade 정제를
선택하면 무난하다.
PCR 반응 시 primer 의 양은 각 0.1~0.5 μM (20 ㎕ 반응 시 2~10pmole)로 사용한다.
3) dNTP (deoxynucleotide triphosphate)
dATP, dCTP, dGTP 와 dTTP(각각 100 mM stock)을 구입한 후 혼합하여 사용하거나
각각이 2.5mM 씩 들어있는 dNTP mixture 를 구입하여 사용한다. 양은 target DNA 의
길이에 따라 다를 수 있으나 각각 20∼250 μM 정도를 사용한다.
4) 10x PCR 완충용액
* 대개 효소와 함께 들어있으므로 그것을 이용하면 좋은 결과를 얻을 수 있다.
① Magnesium ion (Mg2+)
다음과 같은 여러 가지에 영향을 주는 중요한 요소이다.
A. Primer 가 template DNA 에 결합하는 능력
B. Template 및 PCR 산물의 변성온도
C. Product specificity
D. dNTP와의 결합
E. Taq DNA polymerase 의 활동성
F. Primer-dimer artifact 의 형성
a) 반응물 내에 EDTA와 같은 chelator가 포함되면 농도를 올려 주어야 하고, dNTP나
template의 농도가 높으면 MgCl2의 농도를 높게 변화시켜야 한다.
b) 위에 나열한 Mg2+의 기능 중 A, B, C, D는 Mg2+ 농도가 높을수록 실험에 유익하고
E, F는 Mg2+ 농도가 낮을수록 실험에 유익하므로 최적 농도를 유지할 수 있도록
노력해야 한다.
c) 반응이 잘 일어나지 않으면 0.5 mM 부터 2.5 mM(때로는 8 mM 까지)사이에서
농도를 변화시켜 가면서 최적조건을 찾도록 한다.
② KCl
Primer 가 target DNA 에 결합하는 것을 도와주며, Taq DNA polymerase 의 반응율을
높여준다.
③ Gelatin 또는 bovine serum albumin(BSA)
Taq DNA polymerase 를 안정화한다.
* 일부 보고에 의하면 반응 buffer 내에 KCl 이나 gelatin, BSA 등을 첨가하지 않는
것이 더 좋다는 주장도 있다.
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5) Taq DNA polymerase
Taq 는 온천에서 사는 Thermus aquaticus 라는 균주에서 따온 이름이다. 이 균의 활동
적정온도는 70°C∼74°C 이며 95°C 에서 40 분이 지나도 50% 정도의 활성은 남아 있다.
이 효소가 발견되기 전에는 Klenow 효소를 이용하여 매 cycle 마다 효소를 첨가해
주면서 반응을 시켜야만 했다.
DNA 합성의 오차율은 1.1×10-4 bp로 DNA polymerase I의 오차율(1.0×10-5)보다
높은데 이는 일반적인 Taq DNA polymerase에는 잘못 들어간 nucleotide를 삭제하고
다시 합성하는 proofreading 기능(3'→5' exonuclease activity)이 없기 때문이다. 따라서
PCR 산물에서 유전자의 변이가 발견되는지 반드시 확인과정을 거쳐야 한다. (단지 특정
DNA 영역이 존재하는지 여부를 확인하고자 할 때는 변이 유무를 확인할 필요는 없다)
Taq DNA polymerase를 판매하는 회사에서는 대개 proofreading 기능을 포함하는
제품도 판매하고 있으며 위 실험방법에서 TaKaRa Ex Taq이 여기에 해당한다.
한번의 반응에 사용하는 효소의 양은 보통 0.5-5 unit 정도인데 양이 너무 많으면
비특이적인 DNA 가 형성될 가능성이 많고, 너무 적으면 증폭 산물이 부족하게 되므로
최적 조건을 찾도록 노력해야 한다.
6. PCR 기기 (Thermal cycler)
PCR 은 PCR tube 라고도 부르는 아주 작은 0.2 ml tube 를 이용하며, thermal cycler 로
통칭되는 기계를 사용한다 (아래). Thermal cycler 의 기본원리는 입력된 시간에 입력된
온도를 유지하는 것이다.
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Ⅱ. PCR 산물의 전기영동 (electrophoresis)
PCR 반응산물을 확인하기 위해서는 acrylamide gel 보다 사용하기 편리한 agarose gel 을
더 많이 이용한다. 반응산물의 크기에 따라 정확한 분리가 가능하도록 다양한 agarose 가
판매되고 있으므로, 원하는 분리 범위를 결정하여 agarose 취급사에 문의하도록 한다.
표. Agarose gel의 종류에 따른 사용농도 및 분석범위
Agarose 종류 사용농도 분석범위
SeaKem Gold 0.3~2% 500 b~10 Mb
SeaKem GTG 0.5~2% 500 b~20 kb
SeaPlaque GTG 0.75~2% 500 b~20 kb
SeaKem LE, ME, HE 0.5~2% 500 b~20 kb
SeaKem HGT 0.3~2% 500 b~20 kb
Agarose L03, H14 0.5~2% 500 b~20 kb
NuSieve GTG 2~10% 10 b~1 kb
NuSieve 3:1 2~8% 10 b~2 kb
Metaphor 1.8~5.0% 40 b~1 kb
I. D. NA 1.0~1.5% 1 kb~23.4 kb
1. 전기영동(electrophoresis)의 원리
전기영동(electrophoresis)의 원리는 시료를 gel 의 한쪽 끝에 담은 후 전기를 걸어서
크기에 따라 시료가 다른 속도로 이동하는 성질의 차이로 분리하는 것이다.
2. Electrophoresis buffer solution
Electrophoresis 를 할 때 gel 이 잠기는 buffer solution 에는 여러 가지가 있으나 주로
TAE 와 TBE 가 많이 사용된다. TAE 는 주로 agarose gel electrophoresis 에, TBE 는
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DNA sequencing 에 사용된다. 조성은 다음과 같으며 대량을 쓰므로 미리 고농도로
만들어놓고 사용하는 농도로 대량 희석해둔 후 사용한다.
Commonly used electrophoresis buffers
Buffer Concentrated stock solution (per liter)
Tris-acetate
(TAE)
50x (→ 0.5~1X 로 사용)
242 g Tris base
57.1 ml glacial acetic acid
100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
Generally used for agarose EP
Tris-borate
(TBE)
20x (→ 0.5X 로 사용)
121.1 g Tris base
61.7 g boric acid
7.44 g Na2EDTA-2H2O
Generally used for DNA sequencing
3. Gel loading buffer
Gel loading buffer 는 분자량이 큰 glycerol 등 무거운 물질이 함유되어 있어서 DNA 가
든 시료를 gel 속에 잘 가라앉히고, 파란색의 bromophenol blue 가 들어 있어서
전기영동하는 동안에 현재 어느 정도 진행되고 있는지 눈으로 보아 알 수 있게 해 준다.
다음과 같은 조성으로 만들어 사용하거나 효소와 함께 동봉된 것을 사용할 수 있다.
Gel loading buffers (6x)
I. 0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
40%(w/v) sucrose in water
II. 0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
15% Ficoll(Type 400) in water
III. 0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
30% glycerol in water
IV. 0.25% bromophenol blue
40%(w/v) sucrose in water
4. Agarose gel 만들기
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Agarose gel 은 1%(w/v) 전후로 만들어 사용하는데, gel 이 만들어지는 gel cast 의
용량을 기준으로 양을 결정한다 (1 g% = 1 g/100 ml).
표. SeaKem GTG, SeaKem LE
Agarose 의 분리 단편크기별 권장 농도
표. BPB(Bromophenol Blue) 및 XC(Xylene Cyanol)의
SeaKem GTG, SeaKem LE Agarose 의 각 농도에서의
이동도(bp)
Size Range
(bp) 권장농도 (%, W/V)
1× TAE
Buffer
1× TBE
Buffer
1,000-23,000
800-10,000
400-8,000
300-7,000
200-4,000
100-3,000
0.60
0.80
1.00
1.20
1.50
2.00
0.50
0.70
0.85
1.00
1.25
1.75
1× TAE 1× TBE
XC BPB % Agarose XC BPB
24,800
11,000
10,200
6,100
3,560
2,800
1,800
1,300
2,900
1,650
1,000
500
370
300
200
150
0.30
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
19,400
12,000
9,200
4,100
2,500
1,800
1,100
850
2,850
1,350
720
400
260
200
110
70
*12,000 bp 보다 큰 길이의 분리에 TBE Buffer 의 사용은 적합치 않다.
■ 권장 전기영동 조건
· 12,000 bp 이상일 때는 전극간의 거리에 대해 1~2 V/㎝ 이하.
· 1,000 bp 미만일 때는 같은 5~6 V/㎝.
· 이들의 중간 길이일 때는 1~6 V/㎝ 전압이 바람직하다.
Gel cast 가 100 ml 용량이라면 1 g 의 agarose 를 100 ml 의 TAE buffer 에 녹인다.
Chemical balance 에서 잰 다음 buffer 를 넣고 플라스크나 고온에 깨지지 않는 유리병에
넣고 가정에서 사용하는 것과 같은 전자렌지(microwave oven)에서 녹인다. Agarose 는
우리말로 한천으로 가루로 되어 있고 물에 녹지 않는다. 그러나 buffer solution 속에
넣어서 전자렌지로 가열하면 오른쪽 사진처럼 녹아서 투명하게 된다. 몹시 뜨거워지므로
반드시 장갑을 끼고 플라스크를 잡도록 한다.
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녹은 agarose 은 실온에 10~20 분간 방치하여 gel 의 온도를 60℃ 정도로 식힌 다음
틀(gel cast)에 부어 넣는다. Gel 은 cast 높이의 1/2~2/3 정도가 되도록 부은 후 바로
comb 을 꽂는다 (시료를 넣을 공간, well). 약 15 분 정도 지나면 gel 은 굳어서
불투명해진다.
5. 전기영동
왼쪽 사진과 같이 PCR product 와 6x gel loading buffer 를 섞은 후 조심스럽게 well 에
넣는다 (loading). 오른쪽 사진은 electrophoresis 에 필요한 직류전류를 걸어주는 장치
(power supply)이다. 붉은 색이 양극, 검은 색이 음극이므로 well 에 가까운 쪽에 음극을
연결한다 (거꾸로 꽂지 않도록 유의).
Bromophenol blue dye를 보면서 전기영동이 얼마나 되었는지를 판단하고, 이것이 gel
중간쯤 갈 정도면 대개 적당한 정도가 되므로 gel을 꺼내서 Etidium Bromide* 염색
buffer에 5~10 분간 담그어 염색한다 (staining). 염색이 끝나면 깨끗한 DW에 gel을
옮기고 shaker를 이용하여 10 분간 탈색 (destaining)한다.
* Etidium Bromide 는 모식도와 같이 DNA 이중나선의 사이에 끼어들어서 (intercalating)
나중에 gel 에 자외선을 쬐면 DNA 에서 형광이 나와 눈에 보이도록 해 주는 역할을 한다.
Etidium Bromide 가 끼어들면 염기간의 거리를 멀어져 돌연변이 유발의 원인이 되므로
매우 위험한 발암물질로 인식되고 있으며 취급 시 반드시 polyglove 등을 착용하여 직접
피부에 접촉하지 않도록 한다. 염색 buffer 는 agarose gel 을 만들 때 사용한 것과
동일한 buffer 100ml 당 Etidium Bromide 용액 5 ㎕를 넣은 후 어두운 곳에 두고
사용한다.
11
그림. Etidium Bromide 의 구조와 돌연변이 유발 기작
탈색이 끝난 gel 은 UV transilluminator 에 옮겨 자외선을 쬐면 Etidium Bromide 와
결합한 DNA가 있는 부분이 형광을 발하여 붉게 관찰된다.
아래 왼쪽은 UV transilluminator 에서 보이는 gel 의 모습이며, 오른쪽은 폴라로이드
카메라 혹은 gel document system 으로 사진을 찍은 것이다 (같은 gel 사진은 아님)
PCR 결과가 좋지 않을 경우, 30 쪽의 문제해결 (Trouble shooting)편을 확인해 보도록
한다.
12
Ⅲ. Primer 를 디자인할 때의 고려사항
1. 표적 부위가 포함되어야 한다
필요한 부분이 ORF 일 경우, 대개 단백질의 expression 을 위해서는 ORF 전체가
필요하므로, 이 경우 표적 부위는 ATG initiation codon 으로부터 TGA termination
codon 이 된다. 따라서 primer 는 두 codon 을 포함하든지 아니면 그보다 바깥 쪽에서
선정되어야 하는데, PCR 에서 증폭되는 부분은 두 primer 를 포함한 가운데 부분이기
때문이다. 한편, 표적 부위가 돌연변이가 잘 발생한다고 알려진 부분이라면 그 부분을
중심으로 하여 바깥쪽으로 primer 를 선정한다.
2. 증폭하려는 부위의 크기를 고려해야 한다
RT-PCR 에서는 위에서 말한 것처럼 단백질의 expression 을 위해서 ORF 전체가 필요한
경우도 있지만, 대개는 어떤 mRNA 가 존재하는지의 조사를 위해서 하는 경우가 많다.
이렇게 존재 유무를 검사하는 경우는 길게 PCR 할 필요가 없으므로 ORF 의 일부만
detection 할 경우라면 대개 200~400 bp 정도를 PCR 하는 것이 좋다.
3. GC content 와 primer length
표적 부위와 길이가 결정되었다면 염기서열을 살펴가면서 primer 를 선정해본다. 이때
중요한 것은 G 와 C의 비율, 그리고 primer 의 길이이다.
염기간의 결합에서 G 와 C 는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A 와 T 는 두 군데에서
결합이 일어난다. 즉 primer 의 길이가 길수록, 같은 길이라면 GC 가 많을수록 primer 와
template 사이에 형성되는 수소결합의 수가 많아진다. 따라서 template 를 denature 시킨
후에 온도를 낮추어 annealing 이 되는 온도 시점은 수소결합의 수가 많을수록 높아지게
된다.
그러므로 primer 의 선정 시에 두 primer 사이에서 GC content 와 길이는 일치시키는
것이 좋다. 두 primer 의 annealing temperature (Tm 값)가 다르면 반응에 지장을 줄 수
있다.
물론 아무리 일치시키려고 해도 안되는 경우도 있지만 그런 경우를 제외하면 선정할
부분을 앞 뒤로 움직여가면서 GC content 가 50% 내외, primer length 가 20mer (20
base) 정도인 부분을 고르는 것이 좋다.
4. 이상한 염기서열은 피하라
5’-GGGGCCCCGGTTTTAATTAA 와 같이 눈으로 살펴서라도 너무 이상한 염기서열은
피한다. 또한 눈으로 확인하기는 어렵지만, primer 간에 annealing 이 일어날 수 있는
염기서열도 피해야 한다. 예를 들어 5’-GGCAATT......AATTGCC 라는 primer 는
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primer 끼리 붙을 수도 있고 primer 내부에서 hairpin 처럼 annealing 될 수도 있다. 이런
이유 때문에 가능하다면 상용 프로그램이나 온라인 프로그램을 이용하여 primer 를
선정하는 편이 좋다. 하지만 프로그램으로 디자인하는 것도 위와 같은 원칙에 의한
것이므로 이러한 내용을 잘 숙지하고 있어야 한다.
5. 합성될 때의 사정을 고려하라
Primer 에 포함되지는 않았어도 증폭되는 부위에 너무 GC content 가 높다거나 다른
secondary structure 를 형성할 수 있는 부위가 있으면 증폭이 어려울 수 있다. 특히
primer 의 바로 downstream 에 GGGGCCCCGGGCC... 와 같은 부위가 있지 않도록
디자인해야 한다.
또한 수고스럽지만, 선정된 primer 와 유사한 염기서열이 template DNA 의 다른 부분에
존재하는지 유사성 검색을 해 볼 필요가 있다. 이것은 눈으로는 하기 힘들고 상용
프로그램이나 NCBI 의 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) 등을 이용해야 한다.
6. Primer 의 주문
Primer 부위가 선정되었으면, 올바른 염기서열을 적어서 합성 서비스를 하는 회사에
주문하면 된다. 해외 또는 국내 업체에 주문할 수 있으며 요즘은 주로 염기서열을 고객이
직접 온라인 상에서 입력하여 주문하도록 되어 있다.
염기서열은 항상 5' 에서 3' 방향으로 쓰게 되어 있으므로 forward 과 reverse primer
의 방향을 잘 확인하고 입력한다. 보통의 PCR 용 primer 라면 합성 scale 은 50 nmol,
정제 수준은 PCR grade (또는 SEP-PAK 등 기본 정제)로 결정하면 무리가 없다. 다만
다량으로 사용할 예정이라면 합성 scale 을 200 nmol 이상으로 하고, PCR 산물을
cloning 하거나 primer 를 sequencing 에 사용할 예정이라면 sequencing grade (PAGE
또는 HPLC 정제)를 선택해야 한다. Sequencing grade 주문 시에는 정제과정에서의
loss 를 감안하여 보통 200 nmol scale 의 합성이 기준이 된다.
합성된 primer 는, OD 값으로 표시된 양과 순도가 어느 정도인지 표시된 insert sheet 와
함께 배송된다. Primer 는 tube 속에 말려진 상태, 즉 lyophilized 된 상태로 들어있으며,
이를 TE buffer (pH 8.0)나 distilled water 에 녹여서 사용한다. Primer 는 보통 100
pmole/㎕ 농도로 녹인 후 이로부터 다른 tube 에 원하는 농도로 다시 희석하여 사용한다.
사용 후 남은 primer 는 얼려서 보관하며, 자주 사용하는 경우 며칠 동안은 4℃에
보관하여도 좋다.
7. Primer 디자인 프로그램의 이용
비용을 들이지 않고도 primer를 선택해볼 수 있는 primer3 프로그램의 온라인 버전을 이
용하여 human β–actin 유전자를 검출할 수 있는 primer를 디자인해 본다.
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Primer3는 Whitehead Institude/MT Center for Genome Research에서 개발된 것으로
nucleotide sequence로부터 PCR용 primer를 디자인해주는 Program이다. 그리고,
Primer Design 결과 제공되는 Tm value는 Rychlik의 %GC method에 의한 것으로서 여
타 algorithm을 사용하여 계산한 Tm value와 차이가 있을 수 있다.
1) Primer3 프로그램에 접속한다.
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
2) Primer를 선발할 target sequence를 입력한다.
Target sequence는 미리 확보하고 있어야 한다. 이번 예시의 경우, NCBI의 reference
sequence (RefSeq) DB에서 정보를 얻었다. Sequence는 Pimer3 프로그램에서 인식할
수 있는 ‘FASTA’ 형식으로 확보해 두는 것이 좋다. FASTA 형식은 첫 줄에 꺽쇠 표시
(>)로 시작되고 sequence의 정보가 표시되며, 다음 줄부터는 sequence로 표시되는 형
식이다.
그림. NCBI에서 FASTA 형식의 sequence를 표시하기
다음은 Primer3 프로그램의 sequence 입력창에 sequence만 따서 붙여 넣고
mispriming library를 Human으로 선택한다.
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3) 각종 변수를 입력한다.
Sequence Id는 sequence 이름을 뜻하며 임의로 입력해도 좋다. 이 경우에는 b-actin으
로 입력하였다. 나머지는 그대로 두고 Product size ranges에 증폭될 PCR 산물의 크기
를 정하여 입력한다. 401-500 (bp)로 입력하였다.
다음으로, primer를 선정할 조건을 입력한다. Primer size는 사용할 primer의 염기수
(base 또는 mer)이며, 18~22 mer 사이에서 선택하되 최적 염기수는 20 mer로 하였다.
Primer Tm은 58.0~62.0℃ 사이에서 선택하되 최적 온도는 60.0℃로 하였다. CG
clamp는 primer의 3’ end로부터 연속적으로 존재하는 CG의 수를 뜻하며 (최소) 1개로
하였고, 나머지 조건은 그대로 두었다.
4) Pick primers 버튼을 선택한다. (다음 창으로 넘어감)
5) 제시된 primer 쌍 중, 적절한 것을 선택한다.
조건이 적절하였으면 선택된 primer가 출력된다. 제시되는 primer의 수는 기본으로 설
정된 5개이며 ‘Number to return’ option에서 조정할 수 있다. 가장 적절한 primer가
위에 표시되며 화면 아래쪽에 나머지 primer 쌍을 확인할 수 있다. Primer의 sequence
는 일반적인 표시 기준을 따라 왼쪽이 5’이고 오른쪽이 3’이므로, sequence를 그대로
따서 primer 합성을 의뢰하면 된다.
제시된 primer로 합성된 PCR 산물의 크기는 primer 정보 아래에 product size로 표시
되며, 아래에는 전체 sequence에서 primer의 위치를 보여준다. Left (forward) primer
는 ‘>’로, right (reverse) primer는 ‘<’로 표시된다.
Primer의 선택은 처음 설정한 최적 조건에 가까운지, PCR 산물의 크기는 적절한지를
판단하여 가장 적합한 것을 선택해야 한다. 대개의 경우, 처음에 제시된 primer를 선택
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하면 큰 문제는 없다고 볼 수 있다.
참고로, primer sequence 를 알고 있으나 Tm 정보가 없는 경우에는 아래 계산식에 따라
Tm 을 계산할 수 있다.
Tm = 81.5 + 16.6 • (log10[Na+]) + 0.41 • (%G+C) – 675/n
[Na+] monovalent cations의 몰농도 ( [Na+] = [K+] )
n =primer의 base 수
예를 들어 22mer oligonucleotide with 60% G+C in 50mM KCl 의 조건이라면,
Tm = 81.5 + 16.6 • (log10[0.05]) + 0.41 • (60) – 675/22
= 81.5 + 16.6 • (–1.30) + 24.60 –30.68 = 53.84°C
웹 프로그램을 통해 자동으로 계산할 수도 있다.
Oligonucleotide Calculator: http://micro.nwfsc.noaa.gov/protocols/oligoTMcalc.html
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Ⅳ. PCR의 응용
PCR 을 처음 고안해 낸 Kary Mullis 가 이 방법의 발표 후 17 년만인 지난 1993 년 노벨
화학상 수상자로 선정되었는데, 선정 사유는 특정 DNA 의 증폭 방법을 고안함으로써
과학발전의 획기적인 계기가 되었다는 것이었다. 이를 구체적으로 설명하자면 연구하고
싶은 유전자는 무엇이든 대량 생산이 가능하게 되었다고 할 수 있으며, PCR 방법을
응용하면 새로운 여러가지 기술개발이 가능해졌다는 이야기가 된다. 새로 개발된
실험방법이 소개되는 Nucleic acid research 와 같은 잡지에는 PCR 을 응용한 새로운
실험방법이 매회 거의 빠짐없이 발표되고 있다. 많이 사용되는 방법 중에는 RT-
PCR(reverse transcriptase PCR), SSCP(single strand conformation polymorphism),
RACE (rapid amplification of cDNA ends), ISPCR(in situ PCR), DDRT-PCR(differential
display reverse transcriptase PCR) 등이 있는데, 본 장에서는 간단한 원리만 소개하기로
하겠다. (보다 자세한 내용과 응용사례는 백전백승 PCR 가이드 참조)
1. RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)
특정 부위의 RNA 를 template 로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를
합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 1)
역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA 로부터 cDNA 를 제조하는 과정과 2)
cDNA 를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며, (2) 과정은 genomic
DNA 로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 Northern blot
hybridization 과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐
아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA 의 염기서열 및 전사량을
연구할 때 크게 도움이 된다. 염기서열이 알려진 유전자의 경우 RT-PCR 을 통해서 전체
길이의 cDNA 를 간단하게 합성하여 cloning 할 수 있다. (백전백승 PCR 가이드, 76 쪽)
실험방법
1) 다음과 같이 시료를 혼합한다.
RNA 11 ㎕
(RNA 의 농도가 높을 경우, 사용할 만큼의 RNA 를 넣고 나머지 부피는 RNase-free
water 로 채운다)
Random nomamer 1 ㎕
* Total RNA 는 1~5 μg, mRNA 는 50~500 ng 을 쓰면 되는데, 보통 1 μg 의 total
RNA 로 충분하다. RNA 의 분리는 이 책의 다른 장에 기술되어 있는데, 요즘에는 간단히
RNA 를 분리할 수 있는 kit 가 많다. 어떤 kit 로 분리하든 관계없으나, RT-PCR 에
이용할 경우 DNA 의 contamination 이 있지 않도록 주의하여야 한다. 실험자에 따라서
RNase-free DNase I 을 처리하여 사용하는 사람도 많다.
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* Primer 는 oligo(dT) primer, random primer, 또는 gene specific primer 를 사용할 수
있다. Random primer 의 경우, Random nomamer (N9 개, 5'-NNNNNNNNN) 또는
random hexamer (N6 개, 5'-NNNNNN)를 사용할 수 있으며 제품으로 나와있으므로
구매할 수 있다. Primer 는 50~250 ng 을 이용하면 되는데, 대개 100 ng/㎕로 희석해
놓고 1 ㎕ 씩 반응에 이용한다. 사용 전 25°C 또는 상온에 10 분 두었다가 쓴다.
2) 70°C 에 10 분 두었다가 곧바로 얼음에 옮긴다. 간단히 원심분리 (spin-down)하여
바닥에 시료를 모으고 다음과 같이 시약을 첨가한다.
5x first strand buffer 4 ㎕
0.1 M DTT 2 ㎕
10 mM-each dNTP 1 ㎕
Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) (200 units/㎕) 1 ㎕
* 이 과정은 첫번째 가닥의 cDNA를 만드는 역전사 과정으로 reverse
transcriptase(RTase)를 이용한다. 이 효소는 AMV-RTase, MMLV-RTase 등이 있는데,
Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)는 RNase H활성이 없는 RTase로서
cDNA의 합성을 보다 길게 효율적으로 할 수 있고 TaKaRa에서 구입할 수 있다.
3) 42°C 에서 50~60 분 반응시키고 70°C 에서 15 분 두어 효소를 불활성화 시킨다.
대부분의 경우 이 반응물을 2~10 ㎕ template 로 하여 직접 PCR 반응에 이용할 수 있다.
그러나 PCR 하고자 하는 gene 의 크기가 1 kb 이상인 경우에는 다음 과정을 첨가하는
것이 좋다.
4) E. coli RNase H(2 units/㎕) 1 ㎕를 첨가하고 37°C 에서 20 분 반응시킨 후
phenol/chloroform extraction 법 등을 이용하여 cDNA 를 정제한다.
5) 과정 3 또는 과정 4 의 반응물을 template 로 하여 PCR 반응을 시행한다.
2. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)/PCR-SSCP
어떤 입자들의 전기장 내에서의 이동속도는 그 입자의 크기와 형태에 영향을 받는다.
Single strand DNA 는 non-denaturing 조건하에서 분자내의 상호작용에 의하여 2 차
구조를 형성하게 되는데 이 2 차 구조는 DNA 의 염기서열에 의하여 결정돤다. 그러므로
DNA 염기서열중 하나의 염기서열의 변화(point mutation, deletion 또는 insertion)에
의해서도 전기영동상 전개되는 속도에 영향을 받으므로 이동거리에 차이가 발생하게 된다.
이와 같은 원리를 바탕으로 1989 년 Orita 등에 의하여 고안된 SSCP 는 유전자의
돌연변이를 검색하는 유용한 도구로서 사용되고 있다.
최초의 SSCP 방법은 genomic DNA 를 적당한 제한효소로 절단하고 alkali 로
denaturation 시킨 후 non-denaturing polyacrylamide gel 에서 전기영동한 다음 이를
nylon membrane 에 transfer 하여 fragment DNA 를 옮겨 놓은 후 방사성 동위원소로
표지된(radiolabeled) RNA 혹은 DNA probe 를 이용하여 autoradiography 를
실시함으로써 X-ray film 에 나타나는 정상 유전자와 변이된 유전자와의 전개거리의
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차이를 확인하여 돌연변이를 검색하였다. 그러나 그 후 PCR 산물을 SSCP 로 분석하는
방법이 소개되었고, 이 방법이 대중화됨에 따라 요즘은 PCR-SSCP 라는 용어로 많이
불리어지고 있다. 최근까지는 PCR-SSCP 를 할 경우 PCR 산물에 직접 동위원소를
표지하여 autoradiography 를 통해 결과를 얻는 방법이 많이 이용되었으나 최근에는
silver staining 으로 polyacrylamide gel 을 검색하는 방법이 소개되어 현재 이 방법이
유용하게 이용되고 있다. Silver staining 방법은 방사성 동위원소를 사용하지 않고도 훨씬
더 빠른 시간에 PCR 산물을 분석할 수 있는 장점이 있으며 민감도(sensitivity)에는
방사성 동위원소를 이용한 방법과 별 차이가 없으므로 더욱 편리하고 안전하게 실험을
진행할 수가 있게 되었다. (백전백승 PCR 가이드, 162 쪽)
3. RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
cDNA 를 cloning 하기 위해서는 cDNA library 를 screening 하는 방법이 현재 가장
일반적이라 할 수있지만, 이 방법으로 처음 screening 을 하여 찾아낸 clone 은 대개 전체
cDNA 의 일부이며 계속 반복하여 screening 을 하여야만 완전한 cDNA 를 얻어낼 수
있다. 그러나 이런 과정은 대단히 많은 시간과 노력이 소모되는 작업이며 유전자 자체가
cDNA library 에 적은 양으로 존재하는 경우는 더더욱 힘든 일이 될 것이다. 또한
initiation codon 부터 termination codon 까지 open reading frame(ORF)을 완전히 결정한
경우에도 cDNA 의 5'과 3'-끝의 non-coding region 일부는 library screening 에서
얻기가 어렵다. 이러한 문제를 해결하고자, 1988 년 Frohmann 등은 다음과 같은 방법을
소개하고, 이를 RACE(rapid amplification of cDNA ends)라 이름하였다. 즉, cDNA 의
일부 염기서열을 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer 를 합성하고 PCR
reaction 을 통해 5' 혹은 3'-end 까지의 DNA 를 증폭하는 것이다. 3'-RACE 에서는
mRNA 의 3'-end 에 존재하는 poly(A) tail 을 이용할 수 있으므로, down stream
primer 로 oligo-(dT) primer 를 쓴다. 그러나, 5'-RACE 의 경우는 gene specific
primer 로 합성한 1st single strand cDNA 의 끝에 TdT(terminal deoxynucleotidyl
transferase)를 사용하여 poly(A) 혹은 poly(C) tail 을 인위적으로 만들어 주어야만 한다.
(백전백승 PCR 가이드, 69 쪽, 146 쪽, 155 쪽)
4. ISPCR (In Situ Polymerase Chain Reaction)
PCR 은 원하는 DNA 를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은
세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA 를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는
유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR 은 이 두 가지 방법의 장점을
혼합하여 응용한 방법으로서 PCR 의 sensitivity 와 ISH 의 specificity 를 고루 갖추고
있다. ISPCR 의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, slide glass 등을 사용해야
하므로 이의 사용에 적합한 ISPCR 용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는
방법들이 다양하게 제시되어 있다.
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ISPCR 은 세포내의 target sequence 를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며
세포막을 통해 여러 물질(예: PCR 용액에 들어 있는 salt 등)들이 쉽게 이동할 수 있도록
세포막을 HCl, proteinase K 또는 Triton X-100 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다.
이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 PCR 이 끝난 후에
세포 안에서 증폭된 PCR 산물이 세포 밖으로 빠져나오는 원인이 되기도 한다. 그러므로
detergent 의 적절한 선택과 사용이 무엇보다 중요하며 PCR 산물이 세포 밖으로
유출되는 것을 막기 위해서는 single primer pair with complementary tail, biotinylated
dNTPs, multiple overlapping primer pair 등을 이용한 방법이 소개되어 있다.
현재까지 ISPCR 방법의 효율은 그다지 높지 못한 것으로 알려져 있으며 specificity 를
증가시키기 위해서는 DNA probe 를 이용한 in situ hybridization 을 시행하거나 Southern
blot hybridization 을 시행하는 것이 좋은 방법이 된다. 효율이 별로 높지 못한
방법임에도 불구하고 ISPCR 에 대한 관심이 최근 크게 증가하고 있는 것은 여러 가지
질병들의 조기 발견에 큰 도움을 받을 수 있을 것으로 기대되기 때문이며, 지금도 여러
회사에서 ISPCR 에 유용한 기구들을 제작, 판매하고 있으나 더 좋은 기구의 개발이
이루어져 효율을 더욱 높일 수 있다면 ISPCR 이 더욱 유용하게 사용될 수 있을 것으로
기대된다. (백전백승 PCR 가이드, 138 쪽)
5. DDRT-PCR (Differential Display Reverse Transcriptase PCR)
일반적으로 고등동물에서는 약 100,000 가지 정도의 서로 다른 유전자가 발현되고 있으며
각각의 세포 한 개에서는 이중 약 15%만이 발현되고 있다. 발생, 분화, homeostasis,
세포주기 조절, 노화, 발암과정 및 세포의 퇴화 등의 과정에서 표현되어 나타나는
유전자들은 전체 유전자들 중에서 일부가 선택되어 나타나는 것이라고 할 수가 있다.
특정 세포에서 발현되는 특정 유전자들을 찾아내기 위하여 주로 사용되는 방법은
subtractive hybridization 또는 differential hybridization 방법이었으나 최근 PCR 을
이용하여 유전자를 찾아내는 방법(DDRT-PCR)이 개발되었다.
DDRT-PCR 이란 서로 다른 세포로부터 RNA 를 분리한 후 특정하게 발현되는 mRNA 를
찾아내기 위하여 T 염기 10 개와 비특정염기 2 개가 연결된 oligonucleotide 를 primer 로
이용하여 cDNA 를 합성한 후 이 primer 와 비특정 염기서열을 지닌 oligonucleotide 를
primer 로 이용하여 PCR 하였을 때 나타나는 여러가지 PCR 산물을 비교함으로써 서로
다른 세포로부터 증폭된 PCR 산물에 차이가 있는지 없는지를 확인하는 방법이다. 서로
다르게 증폭된 PCR 산물을 선택하여 이와 같이 증폭된 DNA 가 특정 세포에서
특징적으로 발현되는 유전자인지를 보는 것으로 subtractive hybridization 보다 방법이
훨씬 간단한 것이 장점이지만, 실험의 sensitivity 와 specificity 가 낮은 것이 단점이다.
최근 이 방법에 대한 연구가 많이 진행되면서 새로운 더 좋은 방법들이 계속 발표되고
있으므로 최신 논문을 참고로 적절한 조건을 찾아내어 실험을 시행하면 좋은 결과를 얻을
수 있을 것으로 기대된다. (백전백승 PCR 가이드, 71 쪽, 152 쪽)
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6. Inverse PCR
상식적으로 생각하는 방향과 반대 방향으로 PCR 을 실시하는 방법이다. 예를 들어
2.7kb 크기의 vector 에 1kb 크기의 insert DNA 가 삽입되어 있다고 한다. Insert DNA
내에서 100 번과 900 번 염기 부위에 위치한 한 쌍의 primer 로 PCR 을 한다고 하면
상식적으로는 800bp 크기의 PCR 산물이 증폭되는 것이 당연하지만 이 때 사용하는 한
쌍의 primer 모두 반대 방향의 것을 사용하면 전체 DNA (2.7 +1.0=3.7kb)에서 800
bp 만 소실된 2.9 kb 크기의 PCR 산물을 얻을 수 있다.
이 방법은 deletion mutant 를 제조하거나 미지의 DNA 를 제한효소 절단부위에 따라
subcloning 한 후 그 염기서열을 추적하기 위한 용도 등에 사용될 수 있는 유용한
방법이다. 실험 방법은 일반적인 PCR 과 동일하며 primer 의 방향만 반대의 것을
사용한다.
7. Degenerate PCR법
“Degeneracy”는 한 종류의 아미노산이 복수의 codon 에 대응하는 현상을 말한다.
Degeneracy 로 인하여 어떤 특이한 아미노산 서열을 코드하는 유전자의 염기서열은
결정할 수 없지만 가능성이 있는 염기서열 모두를 포함하는 oligonucleotide 를 합성할 수
있다. 예를 들어, proline-cystein-arginine(Pro-Cys-Arg)의 tripeptide 를 생각해 보자.
이 아미노산 서열에 대응하는 codon 은 아래 표와 같이 proline 이 4 종류, cystein 이
2 종류, arginine 이 6 종류로 4×2×6=48 종류이다.
아미노산 Pro Cys Arg
codon CCA TGC AGA
CCC TCT AGG
CCG CGA
CCT CGC
CGG
CGT
종류 4 2 6 → 4×2×6=48 종류
nucleotide CCN TGY MGN
종류 4 2 2 4 → 4×2×2×4=64 종류
(Nucleotides 혼합염기는 IUPAC 에 따라 표기하였다.)
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실제로 48 종류의 codon 의 조합으로 degenerate oligonucleotide 를 합성할 때는 복수의
nucleotide 에 대응하는 위치에서는 해당 amidite 를 혼합하여 합성한다. 따라서
degenerate oligonucleotide 의 조합의 종류는 codon 의 조합보다 많아질 수도
있지만(64 종류) 이 oligonucleotide 혼합물 중 한 종류는 tripeptide 를 코드하는 유전자와
완전히 일치한다. 만일 조합의 수가 그다지 많지 않고 적당한 길이의 degenerate
oligonucleotide 를 디자인할 수 있다면 이 oligonucleotide 는 비교적 특이성 높은
primer 로서 작용할 것이다. 이 같은 degenerate oligonucleotide 를 primer 로 사용하여
PCR 을 하면 아미노산 서열정보를 바탕으로 그 단백질을 코드하는 유전자의 DNA 단편이
얻어질 가능성이 있다. 이와 같은 목적으로 디자인된 primer 를 degenerate primer, PCR 을
degenerate PCR 이라고 한다. 이 방법은 기지의 아미노산 서열로부터 그 유전자를
cloning 하는 기술이지만 현재는 풍부하게 축적된 핵산의 일차구조(염기서열) 정보를 기초로
유전자군을 검색할 때 널리 이용된다.
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Ⅴ. 실험 시 주의사항
1) 시약의 동결 융해 반복은 피하도록 한다.
2) 검체, PCR 반응액에 기존증폭산물이 혼입되지 않도록 특히 주의한다.
3) 최소한 PCR 반응 전과 반응 후를 별도의 정해진 장소에서 시행한다.
4) 비닐장갑, pipette, tips, tube, rack 등도 PCR 반응 전후를 구분하여 전용의 것을
사용한다.
5) PCR 증폭물을 다루었던 tip, tube, gel, 반응액, 비닐장갑 등은 PCR 후 작업영역
내에서 폐기한다.
6) 실험작업 후 실험대, 기구(pipette) 등을 1% NaClO, RNase away 등으로 닦아주거나
자외선 조사를 실시한다.
7) PCR 반응액은 시행직전에 조제한다.
8) PCR 증폭산물은 반드시 spin down한 후 cap을 열도록 한다.
9) RNA를 취급할 경우, 실험을 위한 기구, 용기, 소모품 등은 다른 용도의 것과
구분하여 사용한다.
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Ⅵ. 마이크로 파이펫의 사용법
마이크로파이펫(micropipette)은 분자생물학 실험을 하는 사람들의 주된 도구로서,
마이크로파이펫을 얼마나 능숙하게 쓰느냐에 따라서 실험의 결과가 크게 달라진다.
마이크로파이펫은 용량에 따라서 여러 가지가 있지만, 주로 네 가지 종류를 사용한다.
용량의 단위는 microliter 이며, 이 용량은 마이크로파이펫 손잡이에 붙어있는 라벨로 알 수
있다. 아래 그림의 왼쪽으로부터 최대 사용부피가 1000 microliter (P1000, 이것만
파란색이고 나머지는 노랑색), 200 microliter (P200), 100 microliter (P100), 20 microliter
(P20) 용이다. PCR 연수 실험에 주로 사용할 파이펫은 10 microliter (P10) 용으로서, 각종
효소나 적은 부피를 다룰 때 많이 사용된다.
파이펫 옆을 보면 숫자눈금이 있는데, 붉은색 글씨가 소수점 아래 또는 1000 단위
(microliter) 를 나타내며 다른 숫자는 그냥 읽는다. 따라서 왼쪽으로부터 가리키는 숫자는
각각 1000 microliter(즉, 1 ml) , 200 microliter, 100 microliter, 20.0 microliter 가 된다.
실험할 때는 사용하는 용량과 비슷한 범위의 마이크로파이펫을 사용한다.
이렇게 한 번에 파이펫으로 취하는 용량은 파이펫 머리부분의 돌리는 손잡이로 조절한다.
마이크로파이펫은 disposible tip 을 사용한다. 파이펫의 용량 라벨의 색과 같은 tip 을
사용한다. P1000 파이펫은 blue tip, P200/P100/P20 파이펫은 yellow tip, P10 파이펫은
white tip 을 사용한다.
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아래의 마이크로파이펫의 사용법과 주의점을 반드시 숙지하여 사용한다.
1. 각 파이펫의 눈금 범위 밖으로 돌리지 않는다.
2. 파이펫 위의 단추를 누르면 걸리는 곳까지가 정확한 용량이며, 더 눌러지는 것은
남아있는 잔류 용량을 불어내려고 하는 것이다. (따라서 용액을 빨아들이 전에는 한 번 딸깍
걸리는 곳까지만 단추를 누르고 용액을 취하고, 용액을 불어낼 때에는 한 번 딸깍 걸린
후에 좀 더 밀어내서 tip 안에 남아있는 용액을 모두 불어낸다).
3. 용액을 취할 때와 옮길 때는 천천히 버튼을 조작한다.
4. 용액이 담긴 상태로 파이펫을 거꾸로 세우지 않는다. (이러다가 용액 속의 DNA 가
파이펫에 묻거나 하면 그 파이펫을 닦는데 많은 수고를 들여야 한다). 유기 용매를 다룰
때는 특히 조심한다.
5. 파이펫팅은 원칙적으로 눈 앞 가까이에서 바로 보면서 하도록 한다.
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Ⅶ. 실험 프로토콜
PCR 기초연수
실험 방법
1. PCR 반응
(1) 재료
주형 DNA (template) : λDNA(2.5 ng/㎕)
Primer (forward, reverse primer) : 100S(forward), 500R(reverse)
2.5 mM dNTP
10ｘPCR buffer
TaKaRa Taq polymerase (TaKaRa, R001A)
(2) 반응 과정
① 얼음을 준비하여 위의 재료들(TaKaRa Taq polymerase 제외)을 녹여 얼음에 꽂아둔다.
② 0.2 ㎖ PCR tube 를 PCR tube rack 에 꽂아 얼음위에 놓는다.
③ 반응지(Table 1)에 따라 PCR tube 에 재료들을 넣는다.
- 재료들을 첨가하는 순서는 첨가량이 많은 것부터 넣는 것이 일반적이다.
- 아래 반응지에서는 7번부터 거꾸로 넣으면 된다.
[Table 1]
: 재료 1~6까지는 10 P pipette을 사용하며, 재료 7번은 100 P pipette을 사용한다.
재 료 첨가량 비 고
1.TaKaRa Taq Polymerase(5U/
㎕) 0.25 ㎕
다른 재료를 다 tube에 넣은 후에 -
20 ℃ 냉동고에서 꺼내온다.
2. λDNA(2.5 ng/㎕) 1 ㎕
3. 100S primer (10 pmol/㎕) 1 ㎕
4. 500R primer (10 pmol/㎕) 1 ㎕
5. dNTP (2.5 mM) 4 ㎕
6. 10 X PCR buffer 5 ㎕
7. 3’ D.W. 37.75 ㎕ up to 50 ㎕
Total 50 ㎕
※ Control (negative control) : 반응액에서 template만 제외
27
④ 반응액을 모두 넣은 후에 vortex를 이용하여 섞어준다.
⑤ PCR tube 전용 원심분리기를 이용하여 spin down한다.
(벽에 묻은 용액을 모두 아래로 모음.)
⑥ PCR 기계에 넣기전까지 얼음에 박아둔다.
(3) PCR 기계에 Program 입력 (TaKaRa Dice, TP 650)
① PCR 전원을 켠다.
② Program 을 만들고자 하는 folder 를 커서를 움직여 선택한다. (User name)
③ Menu -> OK -> Enter
④ New -> Enter
⑤ Program 대로 커서를 움직여가면서 수정한다.
⑥ Menu -> Save -> Enter
⑦ Program name -> Menu -> Save As -> Enter
⑧ Run -> Enter
⑨ 전에 입력한 program 을 찾는다 -> Menu -> Start -> Enter
⑩ Mode 1, Container 1. tube, Volume 50 ㎕ 입력 -> Menu -> OK -> Enter
⑪ Program 이 나오고 그 위에 Start 에 커서가 나타난다. -> Enter
⑫ Program 위에 반응소요 시간이 표시되면서 PCR 반응이 진행된다.
Program 1 ( 반응 1, 주형 DNA :λDNA )
Temp
Time
94 ℃ 94 ℃ 72 ℃ 4 ℃
01:00 00:30 00:30 ∞
1 Temp 3 Temp 30 Cyc 1 Temp
60 ℃
00:30
Temp
Time
94 ℃ 94 ℃ 72 ℃ 4 ℃
01:00 00:30 00:30 ∞
1 Temp 3 Temp 30 Cyc 1 Temp
60 ℃
00:30
94 ℃ 1 min 1 cycles
94 ℃ 30 sec
60 ℃ 30 sec 30 cycels
72 ℃ 30 sec
4 ℃ soak
28
2. RT- PCR
[1] RT 반응 (cDNA 합성)
(1) 재료
주형 RNA (template) : Human lung cancer RNA
Primer : Oligo dT primer
10 mM dNTP
5ｘReverse Transcriptase buffer
M-MLV RTase (TaKaRa, 2640A)
DEPC D.W.
(2) 반응 과정 (요약 : 아래 Program 그림 참조)
① 얼음을 준비하여 위의 재료들을 녹여 얼음에 꽂아둔다.
② 0.2 ㎖ PCR tube 를 PCR tube rack 에 꽂아 얼음위에 놓는다.
③ 반응지(Table2)에 따라 PCR tube 에 재료들을 넣는다.
[Table 2]
재 료 첨가량 비 고
Human RNA 5 ㎕ degradation되기 쉬우므로 주의!
Oligo dT primer 1 ㎕
DEPC D.W. 4 ㎕
Total 10 ㎕
④ 반응액을 모두 넣은 후에 vortex 를 이용하여 섞어준다.
⑤ PCR tube 전용 원심분리기를 이용하여 spin down 한다.
(벽에 묻은 용액을 모두 아래로 모음.)
⑥ Incubation : 65 ℃ 5 min (pause) - PCR 기기 이용
⑦ Chill on ice (3 min)
⑧ 반응지(Table3)에 따라 Template RNA/primer mixture 가 들어있는 PCR tube 에 위
재료들을 넣는다.
⑨ 반응액을 모두 넣은 후에 vortex 를 이용하여 섞어준다.
⑩ PCR tube 전용 원심분리기를 이용하여 spin down 한다.
⑪ Incubation : 42 ℃ 1 hr – PCR 기기 이용
⑫ Incubation : 70 ℃ 10 min – PCR 기기 이용
⑬ Chill on ice 10 min (cDNA 완성)
29
[Table 3]
재 료 첨가량 비 고
Template RNA/primer mixture 10 ㎕ 위 step 반응용액
5ｘ Reverse Transcriptase buffer 4 ㎕
10 mM dNTP 1 ㎕
M-MLV RTase 1 ㎕
DEPC D.W. 4 ㎕
Total 20 ㎕
참조 : RT program (Program 2)
Temp
Time
65 ℃ 42 ℃ 72 ℃ 4 ℃
05:00 60:00 10:00 ∞
1 Temp 2 Temp 1 Cyc 1 Temp
Temp
Time
65 ℃ 42 ℃ 72 ℃ 4 ℃
05:00 60:00 10:00 ∞
1 Temp 2 Temp 1 Cyc 1 Temp
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[2] PCR 반응
(1) 재료
주형 DNA (template) : 위 RT 반응에서 합성한 cDNA
Primer : GAPDH F, GAPDH R
Perfect PreMix ver2.1 (TaKaRa Code R532A)
3’ D.W.
(2) 반응 과정
[Table 4]
재 료 첨가량 비 고
cDNA(template) 3 ㎕ RT 반응용액
Primer (GAPDH F) 1 ㎕ Stock 10 pmol/㎕
Primer (GAPDH R) 1 ㎕ Stock 10 pmol/㎕
Perfect PreMix ver2.1 10 ㎕ TaKaRa R532A
3’D.W. 5 ㎕
Total 20 ㎕
※ Control (negative control) : 반응액에서 template만 제외
① 반응지(Table4)에 따라 PCR tube에 재료들을 넣는다
② 반응액을 모두 넣은 후에 vortex를 이용하여 섞어준다.
③ PCR tube 전용 원심분리기를 이용하여 spin down한다.
(벽에 묻은 용액을 모두 아래로 모음)
④ PCR 기계에 넣기전까지 얼음에 박아둔다.
(3) PCR 반응
- 앞의 일반적인 PCR 반응과 일치
31
(4) PCR 반응물 확인 – Agarose gel 만들기 (2 % agarose gel )
① Mupid gel caster(maker)를 준비한다.(작은 gel 하나를 만들려면 보통 20 ㎖을
만든다.)
② 전자저울을 이용하여 0.4 g agarose(SeaKem LE Agarose, TaKaRa F50004)를 잰다.
③ 준비해둔 100 ㎖ 삼각 플라스크에 넣는다.
④ 0.5 X TAE buffer 20 ㎖을 메스실린더로 측정하여 agarose 가 담겨있는 삼각
플라스크에 넣는다.
⑤ 삼각플라스크에 0.5 X TAE buffer 가 담겨있는 부분을 marker pen 을 이용하여
표시한다.
⑥ 삼각플라스크 입구를 wrap 을 이용하여 덮는다. 이 때 덮은 후에 wrap 에 구멍을 뚫어
뜨거운 기체가 빠져나갈 수 있도록 한다.
⑦ 전자레인지에 넣고 시간을 맞춘다.
⑧ 중간중간 꺼내서 흔들어주면서 녹지 않은 agarose 가 있는지 확인한다.
⑨ 다 녹은 것을 확인한 후, 실온에서 잠깐 두어 열을 식힌 후 굳기 전에 Mupid gel
caster(maker)에 붇는다. 이 때 공기방울이 생기지 않게 주의해야 한다.
⑩ 조심스레 comb 을 꽂는다. 이 때에도 공기방울이 생길 수 있으니 주의해야 한다.
* 실온에 방치하는 시간이 길어지면 녹여놓은 gel이 굳을 수도 있으므로 식히기 위해
50~60 ℃ 오븐에 잠시 넣어두어 온도를 낮추는 것도 좋다.
(5) 전기영동용 sample 준비
① PCR 반응이 끝난 반응산물을 얼음에 꽂아둔다.
② 각 PCR 반응액(50 ㎕)에 6 X loading buffer 10 ㎕를 넣는다.
- RT-PCR 반응액은 그대로 얼음에 꽂아둔다.(Perfect PreMix 이용시 바로 전기영동 가능)
③ Vortex 를 이용하여 잘 섞어준 후 PCR tube 전용 원심분리기를 이용하여 spin
down 한다.
④ 100 bp DNA Ladder(TaKaRa, 3407A)를 준비한다. ( loading buffer 가 첨가된 상태, 6
㎕ loading(5 ㎕ 100 bp DNA Ladder+ 1 ㎕ 6 X loading buffer)하면 각 band 는 50
ng 이며 500 bp 는 150 ng 을 나타내는 정량 marker 이다. )
32
(6) PCR 반응물 확인 – 전기영동 (2 % agarose gel electrophoresis)
① 위에 만들어 놓은 gel 이 굳었는지 확인한다. : gel 이 완전히 굳지 않은 상태에서
전기영동을 하면 band 의 분리가 잘 되지 않으므로 주의한다.
② 먼저 comb 을 뽑고, 그 다음에 gel caster 위에 gel 을 놓여져 있는 상태로 Mupid
chamber 에 놓는다. 이 때 well 이 전극 (-) 쪽으로 오도록 하여야 한다.
③ 0.5 X TAE로 Mupid chamber 에 gel 이 잠길 때까지 채운다.
④ Well 에 앞서 준비한 sample 6 ㎕를 loading 한다.
- RT- PCR 반응액은 5 ㎕를 loading한다.
⑤ Sample 의 옆 lane 에 100 bp DNA Ladder(TaKaRa, 3407A)를 loading 한다.
⑥ Mupid chamber 의 뚜껑을 닫고, power supply 를 ON 시킨다.
⑦ 100 V, 25 분동안 전기영동한다.
⑧ (-)극 쪽에서 올라오는 기포 양이 (+)극에서 올라오는 기포양보다 많은 것을 확인한다.
(7) PCR 반응물 확인 – EtBr Staining/ gel 확인
① 전기영동이 끝난 gel 을 caster 로부터 분리한다.
② 1 ㎍/㎖ EtBr solution 에 10 분 동안 담근다.
※ Ethidium Bromide(EtBr)는 강한 발암물질이므로 반드시 polyglove를 착용해야 한다.
③ Staining 이 끝난 gel 을 꺼내 3’D.W에 담가 destaining 한다. ( 이 과정은 DNA 이외의
부분에 염색이 되어 있는 것을 제거한다.)
④ Illuminator 을 이용하여 UV 상에서 band 를 확인한다.
33
Ⅷ. Trouble shooting
(1) 증폭되지 않는다
① 저분자로 primer dimer 같은 형태가 보인다. → (2)로
② 잘 보면 이상한 band가 있다. → (2)로
③ 반응의 positive control이 증폭되지 않는다.
ⅰ) 동결하였던 stock 용액은 해동 후 잘 혼합하였는가?
ⅱ) Mg2+의 농도는 적절한가? → 10× buffer에 Mg2+가 들어있는지의 여부를 확인
ⅲ) dNTP의 농도는 적절한가? → Stock 농도 확인
ⅳ) 반응용기와 heat block의 밀착성은 좋은가? → Mineral oil이나 glycerol을 heat
block과 tube 사이에 넣어 본다.
v) Taq polymerase는 실활되지 않았는가?
④ 시료의 positive control이 증폭되지 않는다.
ⅰ) (1)-③의 모든 고려사항에 적당한가? → 그렇지 않은 경우는 우선 (1)-③으로
ⅱ) 주형 DNA는 적절하게 조제하였는가? → DNA 재 조제
ⅲ) RT-PCR의 경우, 역전사반응을 확인한다.
⑤ Primer의 positive control이 증폭되지 않는다.
ⅰ) (1)-④의 모든 고려사항에 적당한가? → 그렇지 않은 경우는 우선 (1)-③으로
ⅱ) PCR 횟수를 늘려 본다.
ⅲ) Primer의 농도측정은 정확하였나? → Primer 용액의 O.D.값을 구한 후 mol 농
도를 계산한다.
ⅳ) Annealing 온도는 정확하였나? → Tm을 계산하여 본다.
v) 열변성은 충분하였나? → 94℃ × 1분을 우선 시험해 본다.
ⅵ) Annealing 온도를 낮추어 본다.
ⅶ) 신장반응 시간을 늘려 본다.
ⅷ) Mg2+의 농도를 바꾸어 본다.
ⅸ) Primer를 다시 디자인한다. 비용은 드나 확실한 방법임.
(2) 비특이적 증폭이 일어난다.
① Primer의 농도측정은 정확하였나? (0.5 μM이 표준) → 정확한 경우 (2)로
② Primer의 농도를 낮추어 본다. (0.2 μM 정도까지)
③ 과량의 주형 DNA를 사용하지 않았나? → 주형 DNA의 양을 줄여 본다.
④ 과량의 효소를 사용하지 않았나? (2.5 U / 100 ㎕가 표준)
⑤ Annealing 온도를 높여 본다.
⑥ 신장반응 시간을 줄여 본다.
⑦ Cycle 수를 줄여 본다.
⑧ Mg2+의 농도를 바꾸어 본다.
34
⑨ Hot start법으로 실시한다.
⑩ Primer를 다시 디자인한다. 비용은 드나 확실한 방법임.
⑪ Nested PCR을 실시한다.
(3) 재현성이 없다.
① 동결하였던 stock 용액은 해동 후 잘 혼합하였는가?
② 반응용기와 heat block의 밀착성은 좋은가? → Mineral oil이나 glycerol을 heat
block과 tube 사이에 넣어 본다.
③ 오염이 일어나지는 않았는가? → (4)로
(4) Negative control이 증폭한다.
① RT-PCR에서 negative control이 증폭하였다. → 역전사 반응 전에 RNase-free
DNase를 처리한다. DNA 오염을 제거.
② 시약에 DNA가 오염되었을 가능성이 있다.
ⅰ) Aerosol 방지 filter를 부착한 tip을 사용한다.
ⅱ) Stock 용액을 넣은 후 DNA 시료를 취급한다(주형 DNA는 마지막에 넣는다).
ⅲ) Polyglove를 사용한다.
ⅳ) Hood 속에서 작업한다. → UV를 15분간 조사하면 hood내의 오염된 DNA는 분
해되므로 오염을 방지할 수 있다.
v) Non-disposable 기구를 세정한다. → 0.1 N 정도의 염산에 적시거나 산화작용을
하는 세정제로 씻는 등 DNA를 분해하는 조작을 추가로 한다. DNA는 약간의 열
처리로는 분해되지 않음에 유의 할 것.
ⅵ) PCR 산물을 분석(전기영동)하는 장소를 격리한다. → PCR 산물은 가장 확실한
주형으로 작용하며 그 mol 수도 막대하다 Micropipette을 구분하여 사용하는
것도 좋다.
35
부록
1. Primer3 program 사용 설명
Mispriming Library
목록에 나열된 mispriming library 를 선택하면 해당하는 repeat sequence 를 피해서
primer 를 디자인해줌
Sequence
Sequence 는 디자인하고자 하는 유전자를 Genbank 등에서 sequence 내용 부분만
block 으로 설정하여 복사 (ctrl+c)한 후 위의 입력박스 안에 커서를 클릭하여 붙여넣기
(ctrl+v)를 하고 숫자는 모두 제거한다. (숫자나 gatc 이외의 문자는 모두 N으로 처리된다.)
또 다른 입력방법으로 직접 keyboard 로 입력하는 방법도 있다. (대소문자는 상관없다.)
sequence 는 반드시 5'→3'방향으로 입력해야 한다.
Sequence Id
Output file 에서 선택된 primer 가 어떤 sequence 에서 디자인된 것인지를 사용자가
알아보기 위해 입력하는 란
Product Size Range
원하는 PCR product 의 크기(bp)를 입력한다. 입력방법은 아래와 같다.
최소크기(bp)-최대크기(bp)
예로 200-300 으로 입력하면 200bp 에서 300bp 사이의 PCR product 가 생성되도록
primer 를 디자인한다. 여러 범위를 입력할 수 있으며, 처음 조건부터 검색하여 찾을 수
없으면 다음 조건으로 검색한다.
CG Clamp
왼쪽과 오른쪽 primer 의 3end 에 연속적인 G 와 C 의 특정수 (기본값 0)
Optimum Primer Size
디자인 할 primer 의 적정 길이
Minimum Primer Size
디자인 할 primer 의 최소 길이
Maximum Primer Size
디자인 할 primer 의 최대 길이 (35 이상은 안됨)
36
Optimum Tm
Primer 의 최적 melting temperature. primer3 는 최대한 이 값에 맞추어 디자인된다.
Minimum Tm
Primer 의 최소 melting temperature
Maximum Tm
Primer 의 최대 melting temperature
Minimum GC Content
디자인 하는 primer 의 최소한의 GC percentage
Maximum GC Content
디자인 하는 primer 의 최대한의 GC percentage
Salt Concentration
Salt (일반적으로 KCl)의 mM 농도 (기본값 50mM).
Annealing Oligo Concentration
PCR 에 사용되는 primer 의 nM 농도. 기본값은 50nM 로서 기본적인 방법에 사용되는
농도이다.
Maximum Poly-X
mononucleotide 의 최대 반복 갯수, 예로 AAAAA...
Included Region
주어진 sequence 에서 vector 부분이 있을 경우, 또는 필요없는 부분이 있을 경우, 이를
제거하기 위해 parameter 를 아래와 같이 넣어주면 된다.
시작되는 위치(bp), 길이(bp)
만일 20, 100 으로 입력했을 경우 20bp - 120bp 안에서 primer 를 디자인한다. (필요없다면
비워둔다.)
Target
하나 이상의 target 지역이 있다면 이를 입력하여 적어도 1개 이상의 target 이 포함되도록
primer 가 디자인된다.
시작위치(bp), 길이(bp), 시작위치(bp), 길이(bp), 시작위치(bp), 길이(bp), ...
37
예로 20,5,30,10 이라고 입력하면 target 은 20-24bp 위치, 30-39bp 위치가 target 으로
인식된다.
Excluded Region
included region 과 반대로 입력된 위치를 제거하고 디자인 한다. 사용법은 Included
Region 용법과 같다.
Max Mispriming
mispriming library 에서 어떤 sequence 에 대한 최대로 허용된 유사성 가중치. (기본값 12)
Pair Max Mispriming
mispriming library 에서 어떤 sequence 에 대한 최대로 허용된 primer pair 에 대한 유사성
가중치. (기본값 24)
Maximum Ns Accepted
디자인 하는 primer 안에 unknown base(N) 갯수의 최대 수.
Maximum Complementarity
왼쪽과 오른쪽 primer 간에 상보성을 검사할 때 최대 허용하는 local alignment score 와 한
개의 primer 에 대한 자기 자신에 대한 상보성을 검사할 때 최대 허용 local alignment
score. Scoring system은 상보적인 base 에 대해 1 의 값을 주어지며, 어떤 base 가 N과
결합할 때는 -0.25,mismatch 는 -1, gap 에 대해서는 -2 값이 주어진다. 이 때 오직
single-base-pair gap 만 허용한다.
5' ATCGNA 3' || | | 3' TA-CGT 5'
만 허용하고,
5' ATCCGNA 3' || | | 3' TA--CGT 5'
는 허용되지 않는다.
score 는 -값이 될 수 없으며, score 가 0 이면 두 primer 상에 alignment 는 없음을 뜻한다.
Maximum 3' Complementarity
왼쪽과 오른쪽 primer 간에 최대 허용 가능한 3' end 끼리 결합 가능한 alignment score.
그리고 1 개 primer 가 3' end 끼리 결합가능한 alignment score. 이 같은 조건은 PCR이
일어날 때 primer-dimer 발생을 예측하기 위해서이다.
5' ATGCCCTAGCTTCCGGATG 3' ||| ||||| 3' AAGTCCTACATTTAGCCTAGT 5'
or
5` AGGCTATGGGCCTCGCGA 3' |||||| 3' AGCGCTCCGGGTATCGGA 5'
38
위의 score 는 각각 위쪽부터 7과 6 이다. score 는 음수가 될 수 없으며, 0 은 3' end 끼리
결합하지 않는다는 것을 의미한다.
Liberal Base
Number To Return
디자인 되는 primer 쌍의 최대수
Maximum Tm Difference
디자인 되는 primer 간에 Tm 값의 최대차이 한계
First Base Index
input sequence 의 첫 base 의 index 값 (www interface 는 기본값이 1 로 처리된다.
바꾸지 않는 것이 좋다.)
Max End Stability
왼쪽과 오른쪽 primer 의 3'에 5 개 base 에 대한 최대 stability
Primer 가 선택되지 않는다면?
여러 가지 parameter값을 완화시켜주면서 다시 실행해 본다. self-complementarity,
max그리고 min primer melting temperature 등의 값을 변화시켜서 입력한다. 예로, A-T가
많은 지역이라면 maximum primer size를 증가시키거나, minimum melting temperature
값을 낮춘다. 만일 mammalian genome과 같은 복잡성이 높은 template를 사용한다면,
minimum primer size는 감소시키지 않는 것이 좋다. 왜냐하면, 작은 크기의 primer는
non-specific band를 많이 만들어 낼 것이기 때문이다.
기타 자세한 도움말은 아래 주소를 참조한다.
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www_help.cgi
39
2. Primer3 program을 이용한 Human β–actin 검출용 PCR primer 디자인 결과
Primer3 Output
PRIMER PICKING RESULTS FOR b-actin
Using mispriming library humrep_and_simple.txt
Using 1-based sequence positions
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq
LEFT PRIMER 321 20 59.97 50.00 4.00 0.00 11.00 AGAAAATCTGGCACCACACC
RIGHT PRIMER 755 20 59.95 55.00 4.00 1.00 11.00 CCATCTCTTGCTCGAAGTCC
SEQUENCE SIZE: 1793
INCLUDED REGION SIZE: 1793
PRODUCT SIZE: 435, PAIR ANY COMPL: 3.00, PAIR 3' COMPL: 0.00
1 CGCGTCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATCCGCCGCCCGTCCACACCCG 61 CCGCCAGCTCACCATGGATGATGATATCGCCGCGCTCGTCGTCGACAACGGCTCCGGCAT 121 GTGCAAGGCCGGCTTCGCGGGCGACGATGCCCCCCGGGCCGTCTTCCCCTCCATCGTGGG 181 GCGCCCCAGGCACCAGGGCGTGATGGTGGGCATGGGTCAGAAGGATTCCTATGTGGGCGA 241 CGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCATCCTCACCCTGAAGTACCCCATCGAGCACGGCATCGT 301 CACCAACTGGGACGACATGGAGAAAATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCGTGT >>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 361 GGCTCCCGAGGAGCACCCCGTGCTGCTGACCGAGGCCCCCCTGAACCCCAAGGCCAACCG 421 CGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTTGCTAT 481 CCAGGCTGTGCTATCCCTGTACGCCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATGGACTCCGG 541 TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACGAGGGGTATGCCCTCCCCCATGCCATCCT 601 GCGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCG 661 CGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAGCT 721 GTGCTACGTCGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGATGGCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTCCCT <<<<<<<<<<<<<<<<<<<< 781 GGAGAAGAGCTACGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATCACCATTGGCAATGAGCGGTTCCG
⋮ (중략)
1681 GTCCCCCAACTTGAGATGTATGAAGGCTTTTGGTCTCCCTGGGAGTGGGTGGAGGCAGCC 1741 AGGGCTTACCTGTACACTGACTTGAGACCAGTTGAATAAAAGTGCACACCTTA
40
KEYS (in order of precedence):
>>>>>> left primer
<<<<<< right primer
ADDITIONAL OLIGOS
start len tm gc% any 3' rep seq
1 LEFT PRIMER 324 20 59.97 50.00 4.00 0.00 10.00 AAATCTGGCACCACACCTTC
RIGHT PRIMER 755 20 59.95 55.00 4.00 1.00 11.00 CCATCTCTTGCTCGAAGTCC
PRODUCT SIZE: 432, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 1.00
2 LEFT PRIMER 786 20 59.92 60.00 6.00 1.00 10.00 AGAGCTACGAGCTGCCTGAC
RIGHT PRIMER 1284 20 60.04 45.00 4.00 1.00 12.00 AAAGCCATGCCAATCTCATC
PRODUCT SIZE: 499, PAIR ANY COMPL: 3.00, PAIR 3' COMPL: 1.00
3 LEFT PRIMER 321 20 59.97 50.00 4.00 0.00 11.00 AGAAAATCTGGCACCACACC
RIGHT PRIMER 756 20 60.10 55.00 4.00 2.00 12.00 GCCATCTCTTGCTCGAAGTC
PRODUCT SIZE: 436, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 0.00
4 LEFT PRIMER 324 20 59.97 50.00 4.00 0.00 10.00 AAATCTGGCACCACACCTTC
RIGHT PRIMER 756 20 60.10 55.00 4.00 2.00 12.00 GCCATCTCTTGCTCGAAGTC
PRODUCT SIZE: 433, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 2.00
Statistics
con too in in no tm tm high high high high
sid many tar excl bad GC too too any 3' lib poly end
ered Ns get reg GC% clamp low high compl compl sim X stab ok
Left 4253 0 0 0 260 569 685 2183 1 11 3 25 126 390
Right 4004 0 0 0 298 621 905 1594 0 1 1 41 135 408
Pair Stats:
considered 745, unacceptable product size 723, high any compl 2, high end compl 5, ok 15
primer3 release 1.0
(primer3_www_results.cgi v 0.4)
41
