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ANÁLISE MICROTOMOGRÁFICA DOS EFEITOS DA ADMNISTRAÇÃO DE Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 SOBRE A MICROARQUITETURA ÓSSEA
DE RATOS SUBMETIDOS A QUIMIOTERAPIA E PERIODONTITE EXPERIMENTAL
ALUNOS: LÍVIA PIZZO PITTELI LUANA CARLA WONS
YARA LOYANNE DE ALMEIDA SILVA LEVIRESPONSÁVEL: PROFA. DRA. LUCIANA PRADO MAIA
Presidente Prudente – SP2018
MESTRADO EM ODONTOLOGIAMANTIDA PELA ASSOCIAÇÃO PRUDENTINA DE EDUCAÇÃO E CULTURAFone: (18) 3229-1000Campus I - Rua José Bongiovani, 700 - Cidade Universitária - CEP - 19050-680
2
RESUMO
O tratamento quimioterápico aumenta a severidade da periodontite e compromete o
resultado do tratamento. Os probióticos se constituem em fonte de compostos bioativos que
apresentam promissores efeitos benéficos no metabolismo ósseo e muscular, sendo então
uma alternativa viável para o tratamento e prevenção de doenças. O objetivo do presente
estudo é avaliar os efeitos da administração do probiótico (PROB) Bifidobacterium animalis
subsp. lactis HN019 sobre a microarquitetura óssea mandibular de ratos com periodontite
experimental (PE), submetidos a quimioterapia (5-fluorouracil – 5-FU) através de análise
microtomográfica. Esse projeto é parte do Programa de Pesquisa de Pós-Graduação
(PPG/PROBIC processo 3750) e será utilizado material biológico proveniente do mesmo.
Serão utilizados 80 ratos machos, divididos nos seguintes grupos: controle (C); tratamento
somente com 5-FU (5FU) (60 mg/kg no dia da indução da PE e 40 mg/kg após 48hs);
tratamento somente com PROB (HN019) (diariamente por 44 dias, iniciando 30 antes antes
da indução da PE); tratamento com 5-FU e PROB (5FU-HN019); somente PE (PE) (ligadura
nos primeiros molares inferiores, mantida por 14 dias); PE e tratamento com 5-FU (PE-5FU);
PE e tratamento com PROB (PE-HN019); e PE e tratamento com 5-FU e PROB (PE-5FU-
HN019). Todos os animais serão eutanasiados 44 dias após o início do experimento, serão
coletadas as hemi-mandíbulas direitas e as mesmas serão processadas para análise.
Espera-se com esse estudo demonstrar que o uso de probióticos poderá ser considerado
um importante aliado na prevenção de danos ósseos em indivíduos submetidos à
quimioterapia e acometidos pela doença periodontal.
Palavras-chave: Bifidobacterium animalis, Modelo animal, Neoplasias, Probiótico,
Quimioterapia.
3
1 INTRODUÇÃO
O câncer é uma doença ocasionada por uma mudança anormal na fisiologia celular,
cujo número de sobreviventes continua a aumentar devido às melhorias na sua detecção e
tratamento (1,2). A cavidade oral é o sub-local com maior prevalência de ocorrência dos
cânceres de cabeça e pescoço (3). As modalidades de tratamentos mais comuns são:
remoção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia, utilizadas isoladamente ou em combinação
(4), sendo a quimioterapia comumente aplicada nos casos em que há metástases à
distância (1). A quimioterapia evita a rápida divisão e/ou destrói as células malignas, porém
não possui toxicidade seletiva em relação às células neoplásicas, agindo também em
células normais (5,6). Com isso, pode causar alguns efeitos adversos na cavidade oral,
como a mucosite, xerostomia, distúrbios no paladar (1,5) e aumento da susceptibilidade do
hospedeiro a infecções bacterianas, fúngicas e virais. Consequentemente, gera alterações
na microbiota oral, podendo aumentar a quantidade de patógenos (7). Estudos clínicos em
humanos mostraram que a quimioterapia causa aumento no índice gengival, profundidade
de sondagem e moderado aumento no índice de placa (8), o que afeta a progressão das
doenças periodontais (DP) (7,9).
Dentre os agentes quimioterápicos utilizados para o tratamento do câncer, o 5-
fluorouracil (5-FU) é um antimetabólito análogo de pirimidina fluorado de uracila que
compromete a síntese de DNA e RNA, amplamente utilizado no tratamento de tumores
(7,10–12). Estudos em animais ajudaram a compreender os efeitos desse agente na
progressão e no tratamento da DP, e constataram que o 5-FU piora a severidade da
periodontite experimental e compromete a resposta do hospedeiro quando submetido ao
tratamento de raspagem e alisamento radicular (RAR) (9).
A DP é uma doença inflamatória crônica que afeta os tecidos de suporte dos dentes
e pode levar à perda dentária, afetando grande parte da população (13). O biofilme
bacteriano é o fator etiológico primário para o início da inflamação gengival e subsequente
destruição dos tecidos periodontais (14). Entretanto, a presença isolada do biofilme
responde por uma pequena proporção de variações na expressão da DP (15). De acordo
4
com um novo modelo de patogênese, o principal componente da destruição de tecidos
duros e moles na DP é o resultado da ativação da resposta imunoinflamatória do hospedeiro
às agressões bacterianas (16). Fatores de risco adquiridos e ambientais, como diabetes
mellitus e fumo, bem como algumas características geneticamente transmitidas, como por
exemplo os polimorfismos gênicos para a interleucina (IL)-1, podem acentuar a resposta
inflamatória decorrente da agressão bacteriana e, eventualmente, a suscetibilidade à DP
(16).
Como pacientes submetidos à quimioterapia não respondem bem à terapia
periodontal convencional, isso remete ao uso da terapia antimicrobiana associada à RAR
para um tratamento efetivo desses pacientes. Além disso, devido ao fato da resposta do
hospedeiro também desempenhar um importante papel na progressão da doença,
tratamentos supressores da inflamação, os chamados moduladores da resposta do
hospedeiro, têm sido investigados (17). A possibilidade de modular a resposta do
hospedeiro, interferindo na expressão de citocinas pró-inflamatórias foi demonstrada em um
estudo realizado por Assuma et al. (18), em 1998. Neste estudo a injeção local de
antagonistas de algumas IL pró-inflamatórias em dentes de primatas com periodontite
induzida pela colocação de ligaduras infectadas com Porphyromonas gingivalis reduziu em
80% o recrutamento de células inflamatórias, em 67% a formação de osteoclastos e em
60% a perda óssea quando comparados com dentes controles que não receberam a injeção
local dos antagonistas (18). Em suma, o uso de terapias adjuvantes ao tratamento
periodontal tem como objetivo tratar sítios que não respondem ao tratamento convencional
ou potencializar resultados normalmente obtidos com a instrumentação mecânica, evitando,
assim, a necessidade de procedimentos adicionais para a redução de bolsas periodontais
(19).
Durante a última década, a identificação de bactérias associadas à saúde e
potencialmente benéficas que podem residir no sulco gengival e na cavidade oral tem sido
tema de numerosos estudos focados na prevenção e tratamento de doenças (20).
Probióticos são microrganismos vivos que conferem benefícios a saúde quando consumidos
5
em quantidades adequadas (21–28). Seu consumo pode modificar a flora bacteriana e
modular a resposta imunológica (29). Pesquisas mostram a eficácia do probiótico em
favorecer a atividade fagocítica inespecífica dos macrófagos, sugerindo uma ação sistêmica
por secreção de mediadores que estimulariam o sistema autoimune, atuando também no
equilíbrio da microbiota intestinal, alívio da constipação, imunomodulação, prevenção do
câncer de cólon, prevenção de eczemas atópicos, atividade supressiva contra patógenos
gastrintestinais, prevenção de patologias do trato urogenital feminino, desordens intestinais,
entre outros, levando a um aumento da resistência contra a infecção (30). Esses
microrganismos se constituem em fonte de compostos bioativos que apresentam
promissores efeitos benéficos no metabolismo ósseo e muscular (31). Sua colonização no
trato gastrintestinal através da competição por sítios de adesão, restabelece a microflora
intestinal após danos quimioterápicos (32).
A maioria dos estudos envolvendo a utilização de probióticos na saúde bucal
concentram-se em medidas que visam diminuir a quantidade de Streptococcus mutans, cuja
presença é considerada um importante fator de risco para o desenvolvimento de cárie (33).
Porém, considerando as limitações da RAR no tratamento da DP (17), a recolonização de
bolsas periodontais após realização de RAR (34) e a participação de vários mecanismos
referentes ao sistema imune inato e adaptativo do hospedeiro na patogênese da doença, o
uso de probióticos como uma nova terapia adjuvante para a periodontite tem despertado o
interesse da comunidade científica odontológica, visto que os mesmos podem modular a
resposta imunoinflamatória do hospedeiro e modificar o ambiente bacteriano. Na DP, os
probióticos podem minimizar a aderência de bactérias patogênicas, assim como seu
estabelecimento, multiplicação e integração, além de modular a resposta imune-inflamatória
desencadeada pelos patógenos periodontais (35). Os principais microrganismos utilizados
como probióticos são bactérias dos gêneros Lactobacillus, Enterococcus, Bacillus e
Bifidobacterium (29,36). Até o presente momento, estudos que investigaram os efeitos dos
probióticos sobre DP utilizaram principalmente microrganismos do gênero Lactobacillus (36–
38). Contudo, outros potenciais probióticos merecem ser investigados.
6
A Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (B. Lactis) possui propriedades
imunomodulatórias e antimicrobianas (39), geralmente está presente na microbiota
intestinal, e apresenta um relacionamento simbiótico com o hospedeiro (40). Alguns estudos
demonstraram que a B. Lactis pode diminuir o crescimento de Streptococcus mutans sem
causar efeitos adversos, contribuindo na prevenção da cárie dentária (41). Pode também
inibir o crescimento de periodontopatógenos na cavidade oral (42), reduzir a quantidade de
biofilme bacteriano nas superfícies dentárias, bem como o índice de placa e o índice
gengival em indivíduos saudáveis (33), sendo considerada um probiótico promissor. Um
estudo em animais demonstrou que a administração tópica da B. Lactis na periodontite
experimental promove efeito protetor contra perda óssea alveolar e perda de inserção do
tecido conjuntivo, além de modular parâmetros imunoinflamatórios e microbiológicos (43).
Recentemente, a literatura vem sugerindo o uso de probiótico como uma
abordagem terapêutica para a mucosite intestinal. Em um projeto anterior, o nosso grupo de
pesquisa observou que a suplementação probiótica reduziu a inflamação decorrente da
mucosite oral em ratos imunossuprimidos por quimioterápico (5-FU) (44). Contudo, não há
na literatura indexada nenhum estudo avaliando os efeitos da administração de probiótico na
progressão da DP em animais submetidos a quimioterapia. Adicionalmente, embora
resultados promissores tenham sido relatados na literatura com relação ao uso de
probióticos, esses resultados não podem ser generalizados, uma vez que dependem da
dosagem, frequência e via de administração (28,29), parâmetros que ainda precisam ser
investigados e estabelecidos. Nesse contexto, tendo em vista a maior predisposição e
severidade das doenças periodontias em indivíduos submetidos a quimioterapia, a
administração probiótica pode ser de grande valia na prevenção e no tratamento da
periodontite, sendo necessário a realização de estudos bem controlados, histológicos e
biomoleculares, para determinar os reais efeitos dessa terapia.
2. OBJETIVO
7
O objetivo do presente estudo é avaliar, através da análise microtomográfica, os
efeitos da administração de probiótico Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 (PROB)
na microarquitetura óssea de ratos com periodontite experimental (PE), submetidos a
quimioterapia (5-fluorouracil – 5-FU).
3 MATERIAL E MÉTODOS
Esse projeto é parte do Programa de Pesquisa de Pós-Graduação (PPG/PROBIC
processo 3750) e será utilizado material biológico proveniente do mesmo. O projeto será
iniciado e executado após a aprovação do Comitê de ética em Pesquisa em Animais
(CEUA) da Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE), e seguirá os protocolos
experimentais de acordo com as normas determinadas pelo comitê.
3.1 Modelo experimental
Serão utilizados 80 ratos machos (Rattus norvegicus, albinus, Wistar), pesando
entre 170 e 250 g provenientes do Biotério do Campus II da UNOESTE. Os animais serão
acomodados em gaiolas coletivas, contendo de 3 a 4 animais cada, e mantidos no biotério
experimental da UNOESTE durante e após os procedimentos, onde serão submetidos a um
período de 7 dias de aclimatação com o ambiente e com equipe de execução do projeto. A
sala será climatizada e com ciclos de 12/12 horas claro-escuro. Durante todo o experimento,
os animais consumirão ração sólida selecionada e água ad libitum, sob controle de
temperatura, ambiente e ciclos claro-escuro, controlados durante todo o período do
experimento.
Os animais serão aleatoriamente divididos nos seguintes grupos experimentais:
C (controle) – ratos sem PE, sem administração do quimioterápico e sem
administração do probiótico (n = 10);
5FU – ratos sem PE, com administração do quimioterápico e sem administração do
probiótico (n = 10);
8
HN019 – ratos sem PE, sem administração do quimioterápico e com administração
do probiótico (n = 10);
5FU-HN019 – ratos sem PE, com administração do quimioterápico e com
administração do probiótico (n = 10);
PE – ratos com PE, sem administração do quimioterápico e sem administração do
probiótico (n = 10);
PE-5FU – ratos com PE, com administração do quimioterápico e sem administração
do probiótico (n = 10);
PE-HN019 – ratos com PE, sem administração do quimioterápico e com
administração do probiótico (n = 10);
PE-5FU-HN019 – ratos com PE, com administração do quimioterápico e com
administração do probiótico (n = 10).
O cálculo do tamanho amostral foi realizado pelo programa Graphpad Statemate
2.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUA). O tamanho da amostra foi
determinado para assegurar poder estatístico de 80% no reconhecimento de diferenças
significativas entre os grupos em torno de 20% e desvio-padrão de 15% com um intervalo
de confiança de 95% (α = 0,05), considerando as mudanças na perda de inserção da
região distal do 1o molar inferior como variável primária de resultado. Esses parâmetros
foram estabelecidos de acordo com o estudo de Oliveira et al. (2017)37, que usou
metodologia semelhante a do presente estudo. Dessa forma, chegou-se a um tamanho
amostral adequado de 8 animais por grupo experimental. Nós estimamos a perda de dois
ratos em cada grupo experimental, dado ao fato de que alguns animais podem não
desenvolver características histológicas da doença periodontal, além da possibilidade de
não suportarem a administração de anestésico e quimioterápico. Iniciando com 10
animais por grupo, nós devemos ter dados provenientes de, pelo menos, oito ratos.
Considerando que vamos trabalhar com 8 grupos experimentais, a partir desse cálculo
chegamos ao número total de 80 animais. Adicionalmente, estão sendo solicitados mais 5
9
animais para um projeto piloto, no qual será realizado o treinamento dos discentes
envolvidos na execução do projeto.
Os procedimentos serão realizados de acordo com o desenho experimental ilustrado
na Figura 1 e detalhado a seguir.
Figura 1. Desenho experimental do estudo.
3.2 Administração do Probiótico
O probiótico (B. lactis HN019; HOWARUTM Bifido, E. I. Dupont® de Nemoursand
Company, Wilmington, DE, EUA) será ativado em Mann-Rogosa-Sharp (MRS) enriquecido
com L-cisticina a 0,05% e disperso com um misturador vórtex por 30 segundos. Após
homogeneização, a suspensão será semeada em placas de Petri contendo meio MRS Ágar
pela técnica de esgotamento. As placas serão mantidas em condições de anaerobiose em
incubadora a 37oC para crescimento por 48 horas. Após esse período, os microrganismos
serão diluídos em água filtrada até atingir a densidade óptica de 1,0 em espectrofotômetro
regulado a 625 nm, que corresponde à concentração de 109 UFC/ml. Essa densidade óptica
foi determinada em um projeto desenvolvido por nosso grupo de pesquisa (protocolo 4003),
que avaliou viabilidade celular do B. lactis HN019 em solução salina, por meio de diluições
seriadas e estabelecimento da curva de crescimento (dados ainda não publicados).
10
Nos grupos HN019, PE-HN019, PE-5FU-HN019 e 5FU-HN019, diariamente, 10 mL
da solução contendo o probiótico na proporção de 109 UFC/mL será administrada aos
animais por via oral pelo método de gavagem ao longo de todo o experimento (44 dias),
iniciando 30 dias antes da indução da PE, para garantir o efeito preventivo dessa terapia,
conforme descrito por Messora et al.21. Essa concentração é recomendada pelo fabricante e
seus efeitos na prevenção da doença periodontal foram confirmados por experimentos
prévios37. Os animais dos grupos C, 5FU, PE e PE-5FU receberão água sem suplementação
probiótica, também por meio de gavagem.
3.3 Indução da Periodontite Experimental (PE) com Ligadura
Para a colocação da ligadura nos grupos PE, PE-5FU, PE-HN019 e PE-5FU-
HN019, 30 dias após o início da suplementação probiótica os animais receberão
primeiramente o analgésico Cloridrato de Tramadol (4mg/Lg) por via subcutânea, e
posteriormente serão anestesiados os animais serão anestesiados por meio de injeção
intraperitoneal, com solução de Cloridrato de Xilazina a 2% (20 mg/mL) (Rompum - Bayer
Saúde Animal) e Cloridrato de Ketamina a 10% (100 mg/mL) (Dopalen - Agribands - Brasil
Ltda) nas respectivas doses de 10 mg/Kg (Xilazina) e 75 mg/Kg (Ketamina). Após a
anestesia geral, os animais serão posicionados em mesa operatória, a qual permite a
manutenção da abertura bucal dos ratos, facilitando o acesso aos dentes posteriores da
mandíbula. Com o auxílio de porta agulha tipo castroviejo (Quinelato, Rio Claro, SP, Brasil)
e sonda exploradora odontopediátrica (Golgran, São Paulo, SP, Brasil), será colocado um fio
de sutura seda 4-0 (Ethicon, Johnson & Johnson, São José dos Campos, SP, Brasil) ao
redor dos primeiros molares inferiores esquerdo e direito de cada animal. O analgésico será
administrado por mais três dias após o procedimento.
3.4 Protocolo Quimioterápico
Nos grupos 5FU, 5FU-HN019, PE-5FU e PE-5FU-HN019, o tratamento com 5-FU
(50 mg/mL; Eurofarma Laboratorios, São Paulo, SP, Brazil) será realizado conforme descrito
11
por Theodoro et al.6, consistindo de administração intraperitoneal de 60 mg/kg de 5-FU no
dia da colocação da ligadura e 40 mg/kg 48 h após esse procedimento. A solução estéril de
5-FU será preparada imediatamente antes de cada experimento no Setor de Farmácia da
Oncologia do Hospital Regional de Presidente Prudente. O descarte também será realizado
no mesmo Setor, atendendo às Boas Práticas de Preparação da Terapia Antineoplásica e
as normas da ANVISA para manipulação de quimioterápicos.
3.5 Eutanásia e Processamento Tecidual
Todos os animais serão submetidos à eutanásia 44 dias após o início do
experimento, ou seja, 14 dias após a indução da PE. Serão coletadas amostras de intestino
grosso e delgado, que serão fixadas em formol neutro a 4% por 48 horas para posterior
processamento para análise histológica e histomorfométrica.
3.6 Análise Microtomográfica (micro-CT)
Os espécimes não desmineralizadas utilizados para a análise morfométrica serão
posteriormente escaneados por um sistema de micro-CT de feixe cônico (Skyscan 1172,
Bruker, Kontich, Bélgica) no LAB 3D BIO – Laboratório Multiusuário para Análises de
Imagens Tridimensionais de Tecidos Biológicos e Biomateriais do Departamento de Cirurgia
e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial (CTBMF) e Periodontia da Faculdade de Odontologia
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FORP – USP).
Usando um software apropriado (Data Viewer®, versão 1.5.0, Bruker, Kontich,
Bélgica), medidas lineares serão realizadas em quatro locais diferentes por um examinador
calibrado sem identificação dos grupos experimentais avaliados. Para sítios vestibulares,
linguais e interproximais, serão mensuradas as distâncias lineares (μm) da JCE à COA. Na
região de bifurcação, será mensurada a distância (μm) entre o centro do teto da bifurcação e
a COA. As quatro medidas lineares obtidas em cada animal serão somadas para expressar
o valor do nível ósseo alveolar microtomográfico (NOA-microCT).
12
As análises volumétricas serão realizadas com o software CT-Analyser® na região
de bifurcação do 1º molar inferior. As imagens serão visualizadas no eixo coronal e o
intervalo de cortes analisados será determinado utilizarando como ponto de partida o corte
microtomográfico no qual as quatro raízes do 1º molar inferior estiverem completamente
separadas e como ponto final o corte microtomográfico em que não será possível visualizar
mais o osso inter-radicular na região de bifurcação do 1º molar inferior, determinando então
o volume de interesse (VOI). Os seguintes parâmetros serão determinados na análise
volumétrica: Volume Ósseo (VO) - percentual do VOI preenchido com tecido ósseo;
Porosidade Óssea (PO) - percentual de porosidades presentes no tecido ósseo determinado
no VOI; Número de trabéculas (Tb.N) - número (mm-1) de trabéculas ósseas presentes no
VOI; Espaçamento trabecular (Tb.Sp) - total de espaços (mm) entre as trabéculas ósseas
presentes no VOI. Reconstruções renderizadas das secções microtomográficas serão
também obtidas para os grupos C, 5FU, HN019, 5FU-HN019, PE, PE-5FU, PE-HN019 e PE-
5FU-HN019 utilizando o software CTVox® (CTVox® , versão 3.1.0, Bruker, Kontich,
Bélgica).
4 FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS
Os dados coletados serão primeiramente tabulados, considerando o animal como a
unidade estatística. Para todas as análises estatísticas, um nível de significância de 5% será
adotado. Os dados serão agrupados e apresentados como médias e desvios-padrão
(variáveis contínuas) ou medianas, desvios interquartílicos e valores máximos e mínimos
(variáveis ordinais). A distribuição dos dados será verificada pelo teste Shapiro-Wilk. Para os
dados que apresentarem distribuição normal, será selecionado o teste paramétrico de
Análise de Variância (ANOVA) para análises das diferenças intergrupos, seguido pelo teste
post-hoc de Tukey. Para os dados com distribuição não-normal será utilizado o teste não
paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste post-hoc de Dunn. Para a realização
dessas análises será utilizado o software SPSS (IBM SPSS Statistics) v.21.
13
5 RESULTADOS ESPERADOS
Espera-se com esse estudo demonstrar que o uso de probióticos poderá ser
considerado um importante aliado na prevenção da destruição da microarquitetura óssea em
indivíduos submetidos à quimioterapia e acometidos pela doença periodontal, oferecendo
subsídios que apoiem a prevenção, o diagnóstico e o tratamento diferenciado e, por
conseguinte, uma melhora na qualidade de vida da população.
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ANEXO I