Eccellenza Cancerogenesi Ambientale Presentazione Progetto Inceneritori Bologna 13 aprile 2007 Linea 5 Valutazione degli effetti tossicologici dellaria

Presentazione Progetto Inceneritori Bologna 13 aprile 2007

Eccellenza Cancerogenesi Ambientale

Linea 5

Valutazione degli effetti tossicologici dell’aria

prelevata in prossimità degli impianti di incenerimento

Eccellenza Cancerogenesi

AmbientaleBologna 13 aprile 2007

Obiettivi intermedi

Analizzare il profilo tossicologico di campioni d’aria prelevati in aree circostanti l’inceneritore a confronto con campioni d’aria non interessati dall’impianto

Individuare i meccanismi d’azione Identificare marcatori specifici

dell’esposizione



Obiettivo finale

Predizione del rischio da esposizione a impianti attualmente in funzione





Esposizione

Attivazione AM

Infiammazione Acuta

AccumuloParticelle

Fibrosi

MeccanismiEpigenetici

ProliferazioneCellule Epiteliali

Metaplasia

CANCRO

InfiammazioneCronica

MeccanismiGenetici



Risom et al. Mutat. Res. 592: 119, 2005



Le azioni: 1





Le azioni: 2



Il test di Ames



Test di genotossicità

COMET Diventato popolare negli anni ’90 Probabilmente uno dei test più usati per

valutare la genotossicità 3117 lavori recensiti in PubMed

Micronucleo Considerato uno dei test più affidabili per

valutare la genotossicità Rete internazionale di convalidazione per

esposizioni ambientali e occupazionali



Le azioni: 3





Il modello BALB/c 3T3

Uno modello in grado di verificare le capacità trasformanti di composti singoli e miscele complesse e di predire la potenza cancerogena

Comprende differenti test che consentono di descrivere il ruolo e il peso della miscela in esame nel processo di cancerogenesi Test di citotossicità Test di trasformazione in cellule BALB/c 3T3 Test di trasformazione in 2 fasi: iniziazione/promozione Test delle comunicazioni intercellulari GJIC

Valutazione dell’impatto di promoventi sulla interazione cellula-cellula Test di chemiotassi/chemioinvasione

Valutazione delle tappe tardive della cancerogenesi multifasica Test di apoptosi

toxicity assessmenttoxicity assessment




Il modello: Descrive la tossicità della miscela Analizza la potenzialità cancerogena Individua relazioni dose-risposta Adatto allo studio di miscele complesse

ambientali





Il test di trasformazione cellulare misura un endpoint facilmente individuabile rappresentato dal focus trasformato

Il numero dei foci maligni è direttamente correlato con la dose




ENDPOINT FINALE

FREQUENZA DI TRASFORMAZIONE (TF) numero foci/ efficienza

clonale

ARPA – Eccellenza Cancerogenesi Ambientale

formazione di foci



Disegno sperimentale in vitro: modello 3T3

Il test di trasformazione BALB/c 3T3 Ripercorre le tappe del processo multifasico

tumorale E’ utilizzato da molti anni come test di

screening per agenti cancerogeni E’ ritenuto un ottimo test per discriminare tra

agenti genotossici e non genotossici Ha buone capacità predittive, alta sensibilità e

specificità per la valutazione di composti citotossici e non citotossici



TEST CITOTOSSICITA’

Effetti acuti miscela

TEST TRASFORMAZIONE

PM10 - PM2.5ultrafini

Effetti cronici miscela

Profilo Tossicologico della miscela

complessa

Relazioni dose-risposta

1 sola dose

3 dosi

Predizione del rischio cancerogeno

3 dosi



Le azioni: 4



Genomica funzionale

La tecnologia microarray si basa sull’abilità di ogni acido nucleico a singolo filamento di accoppiarsi alla sequenza complementare





controllo esposto

m-RNA m-RNA

ibridazione

lavaggi

scanner





Bioinformatica e Data Mining

Feature Extractor Primo screening dei dati provenienti dallo scanner. Il software ha il compito di

segnalare quegli spot troppo intensi, non uniformi Normalizzazione

Rende confrontabili i campioni etichettati con Cy3 e Cy5 ed ibridati congiuntamente su un singolo microarray.

Elimina errori sistematici dovuti a: diversa quantità di mRNA associata ad ogni marcatore diversa efficienza di incorporazione dei due marcatori diversa intensità di radiazione emessa dai due marcatori differentemente misurata dal

tubo fotomoltiplicatore differenti intensità misurate in diverse parti del microarray a causa del posizionamento

non perfettamente orizzontale del microarray rispetto al laser dello scanner differenze tra gruppi di spot creati da differenti penne

Controllo qualità della slide Analisi statistica dei dati

Maanova di R LIMMA

Interpretazione biologica: GoMINER High-Throughput

Integra i risultati di molteplici microarray in una singola analisi Organizza la lista di geni modulati nel contesto di Gene Ontology un database che

contiene una classificazione dei geni in categorie gerarchiche basate su processo biologico, funzione molecolare e compartimento cellulare



Tossicogenomica: la validità dell’approccio

L’espressione genica è influenzata direttamente o indirettamente dall’esposizione ambientale

L’espressione di alcuni geni è essenziale per l’insorgenza della malattia e della sua progressione

Le variazioni nella espressione dei geni mostrano una migliore sensibilità e specificità

I profili genici relativi a una specifica esposizione) possono essere usati per:

Biomarcatori di esposizione Biomarcatori di rischio Biomarcatori di stadio preclinico

VARIAZIONE GENE

FINGERPRINTFINGERPRINT

PREDIZIONE DEL RISCHIO



Le azioni: 5



Risk assessment Procedura per stimare

la probabilità che una esposizione possa costituire un pericolo per la salute

Slope factor Incremento del rischio

di tumore misurato sull’aspettativa di vita in risposta a una esposizione

Quale risposta?Quale risposta?

Cancer potency-slope estimates



Quali modelli?

In contrast to the 1986 guidelines there is no a priori focusno a priori focus

on animal cancer bioassayEPA’s revised cancer risk guidelines, 1998

Analisi integrata di tutta l’evidenza scientifica

Proprietà fisico-chimiche dei composti Correlazioni struttura-attività Informazioni farmacocinetiche Studi meccanicistici



Focus sui modelli in vitro

Limiti degli studi a lungo termine nell’animale Costi elevati Specificità di specie e di ceppo Peculiarità nelle vie di somministrazione Difficoltà nell’estrapolazione all’uomo Pochissimi dati su miscele complesse

Interesse internazionale a trovare test alternativi REACH



Dati di letteratura



Dati di letteratura



Dati di letteratura



La nostra esperienza





D

A

CE

B



II campagna-frequenza di trasformazione

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

NT

DM

SO

0.5

%

MC

A 2

.5µ

g/m

l

DB

E 5

0 µ

g/m

l

BP

2.5

µg/

ml

A B C D E A B C

D

E

T.F

.

PM 2.5 PM 10

II campagna-Citotossicità della trasformazione

0

20

40

60

80

100

120

NT

DM

SO

0.5

%

MC

A 2

.5µ

g/m

l

DB

E 5

0 µ

g/m

l

BP

2.5

µg/

ml

A

B

C D E A B C D E

n°

colo

nie

± e

.s. ** **** *****

PM 2.5 PM 10

Campagna Estiva

Postazione NO2

µg/m3

HCl µg/m3

A 23 <4

B 16 <4

C 17 <4

D 12 5

E 21 7

Postazione Benzo(a)pirene [ng/m3]

rilevato su PM10

Benzo(a)pirene [ng/m3]

rilevato su PM2.5

A 0.09 0.08 B 0.10 0.08 C 0.09 0.08 D 0.10 0.08 E 0.15 0.12

San Felice (su PTS)

0.27 0.27



III campagna-Citotossicità della trasformazione

0

20

40

60

80

100

120

NT

DM

SO

0.5

%

MC

A 2

.5

DB

E 5

0 µ

g/m

l

BP

2.5

µg/

ml

San

Fel

ice A

B

C

D E A B C D

E

n°

co

lon

ie ±

e.s

.

**** **

***

*

PM 2.5 PM 10

III campagna-frequenza di trasformazione

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

NT

DM

SO

MC

A 2

,5µ

g/m

l

DB

E 5

0 µ

g/m

l

BP

2.5

µg/

ml

S. F

elic

e P

M 2

.5 A

B

C

D E A B C D

E

T.F

.

PM 2.5 PM 10

**

**

* *

Campagna Autunnale

Postazione NO2

µg/m3

HCl µg/m3

A 23 <4

B 51 <4

C 24 <4

D 22 <4

E 26 <4

Postazione Benzo(a)pirene [ng/m3] rilevato su PM10

Benzo(a)pirene [ng/m3] rilevato su PM2.5

A 0.09 0.08 B 0.10 0.08 C 0.09 0.08 D 0.10 0.08 E 0.15 0.12

San Felice (su PTS) 0.27 0.27



IV campagna-Citotossicità della trasformazione

0

10

20

30

40

50

60

NT

DM

SO

0.5

%

MC

A 2

.5

DB

E 5

0 µ

g/m

l

BP

2.5

µg/

ml

A

B

C

D E A B C D

E

n°

co

lon

ie ±

e.s

.

** ** ***

***

PM 2.5 PM 10

** **

**

IV campagna-inverno trasformazione-PRELIMINARE

0

5

10

15

20

25

30

35

NT

DMSO

MCA 2

,5µg

/ml

DBE 50

µg/m

l

BaP 2

.5 µ

g/m

l A B C D E A B C D E

T.F

.PM 2.5 PM 10

**

*

**

Campagna Invernale

PostazioneBenzo(a)pirene (ng/m3 )

rilevato su PM10

Benzo(a)pirene (ng/m3 )

rilevato su PM2,5

A 0,93 0,86

B 1,14 0,94

C 0,99 0,94

D 0,95 0,90

E 2,59 2,45

San Felice (su PTS) 1,18 1,18

Postazione NO2

µg/m3

HCl

µg/m3

A 35 < 4

B 29 < 4

C 41 < 4

D 29 < 4

E 44 < 4



SITO A

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

NT DM SO M CA2,5µg/ml

DBE 50µg/ml

BaP 2.5µg/ml

estate autunno inverno estate autunno inverno

PM 2.5 PM 10

****

SITO B

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0


DBE 50µg/ml

BaP 2.5µg/ml


PM 2.5 PM 10

*****

SITO C

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0


DBE 50µg/ml

BaP 2.5µg/ml


PM 2.5 PM 10

** ***

SITO D

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0


DBE 50µg/ml

BaP 2.5µg/ml


PM 2.5 PM 10

**

SITO E

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0


DBE 50µg/ml

BaP 2.5µg/ml


PM 2.5 PM 10

**

**

**

Frequenza di trasformazione nei diversi siti

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Eccellenza Cancerogenesi Ambientale Presentazione Progetto Inceneritori Bologna 13 aprile 2007 Linea 5 Valutazione degli effetti tossicologici dellaria