1. UVOD

Ameriški slamnik (Echinacea spp.) in arnika (Arnica montana) sta vse bolj poznani in uporabljani rastlini, čeprav ljudje njihove učinke koristimo že skozi stoletja. Tradicionalno se ameriški slamnik uporablja pri prehladih in gripoznih obolenjih, arnika pa pri površinskih ranah. Med ljudmi velja prepričanje, da sta rastlini res učinkoviti, vendar je to potrebno ustrezno dokazati. V diplomskem seminarju je predstavljen način imunomodulatornega delovanja učinkovin iz rastline, gojenje ameriškega slamnika (Echinacea spp.) in arnike (Arnica montana), ki zagotavlja ustrezno količino in kvaliteto vodilnih učinkovin in uporaba v farmacevtskih izdelkih. Pomembno je, da vemo, ali so neke učinkovine varne za uporabo in ali je njihov vpliv na imunski sistem res tolikšen, da jih lahko označimo kot imunomodulatorne. Imunski sistem je namreč kompleksen sistem, katerega delovanje je zapleteno regulirano in potrebno je preučiti vpliv neke, telesu ne lastne učinkovine na njegovo delovanje. Glede na vpliv učinkovin iz rastline na imunski sistem, lahko določimo uporabo teh učinkovin, bodisi ob nastopu bolezni ali pa zgolj za okrepitev naše imunske obrambe pred patogeni. Pomembno je tudi, kako učinkovine iz rastline izoliramo, nekatere snovi so namreč topne v vodi, druge v alkoholu in zaradi nepravilnega rokovanja imunomodulatorne lastnosti lahko izginejo. V izdelkih želimo normirano količino neke učinkovine ali skupine učinkovin, natančno moramo poznati njen oz. njihov vpliv na celice in mediatorje imunskega sistema, ki naj bo vedno enak, kar je v diplomskem seminarju podano.

1

2. OPIS VRST AMERIŠKI SLAMNIK (Echinacea spp.) IN ARNIKA (Arnica chamissonis)

2.1.OPIS VRST

2.1.1Ameriški slamnik (Echinacea spp.)

Ameriški slamnik je trajnica, ki izvira iz Severne Amerike. Njegova uporaba sega v čas prerijskih indijancev, ko so uporabljali kašo ali sok rastline in prežvečeno korenino. Takšne pripravke ameriškega slamnika so uporabljali pri pikih kač in mrčesa, prehladih, zobobolih, vnetjih dlesni, ran, opeklin in vročice. Danes poznamo 9 vrst ameriškega slamnika in sicer: Echinacea angustifolia, Echinacea atrorubens, Echinacea laevigata, Echinacea pallida, Echinacea paradoxa, Echinacea purpurea, Echinacea sanguinea, Echinacea simulate in Echinacea tennesseensis. V zdravstvene namene se uporablja predvsem tri vrste, to so Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia in Echinacea pallida. Ameriški slamnik (Echinacea spp.) spada v družino nebinovk (Asteraceae), in je zeljnata trajnica. Vse vrste zrastejo v košate grme, višine do enega metra. Iz korenike poženejo poganjki, ki tvorijo velike, temno zelene liste, ki so rahlo porasli z žleznimi dlačicami in kasneje stebla s cvetovi. Ti so sestavljeni iz izbočene ježice, okoli katere so razporejeni cvetni listi rdeče – vijolične ali bele barve.

Slika 1: škrlatni ameriški slamnik (Echinacea purpurea)

2.1.2: Arnika (Arnica montana in Arnica chamissonis)

2

Arnika (Arnica montana) je trajnica, ki jo najdemo v vzhodni in osrednji Evropi in sicer na visokogorskih travnikih, pašnikih in v južno in srednjeevropskih pogorjih do višine 2800m. Skozi stoletja so jo uporabljali kot tinkuro pri oskrbi raznih ran in razjed. Danes poznamo več vrst arnike, v naravi najdemo vrsto Arnica montana. Kar se tiče rastišča je zelo zahtevna rastlina in ponavadi na vrtovih in njivah ne uspeva. Za potrebe gojenja so zato ustvarili novo vrsto, poljsko arniko (Arnica chamissonis), ki uspeva kot gojena vrsta, količina in kvaliteta droge pa primerljiva s tisto, ki jo vsebuje Arnica montana. Arnika spada v družino nebinovk (Asteraceae) in je zelnata trajnica. Nadzemni deli vsako leto poženejo iz vodoravno rastoče korenike, spodnji stebelni listi so tesno skupaj in tvorijo pritlično rozeto. Iz sredine rozete požene do pol metra visoko, močno, zelnato steblo, ki je poraslo z žlezastimi dlačicami. V zgodnjem poletju razvije bleščeče rumene cvetove (koške). Značilno obliko jim dajo obrobni, jezičasti cvetovi, ki niso enakomerno razporejeni in niso vsi enako veliki.

Slika 2: Arnica chamissonis

3. NAČINI GOJENJA in VPLIV GOJENJA NA KOLIČINO IN KVALITETO SEKUNDARNIH METABOLITOV V RASTLINI – IMUNOMODULATORNIH UČINKOVIN

Obe vrsti sta splošno uporabljani v različnih zdravilnih pripravkih in tako tudi dobro poznani. Danes se za potrebe predelave zdravilnih in aromatičnih rastlin le-te praviloma gojijo, saj tako zaščitimo naravne vrste in zagotovimo neko normirano vsebnost učinkovin v rastlini. Za potrebe farmacije se rastline gojijo na večjih poljih pri pridelovalcih, ki morajo zagotoviti kvaliteten pridelek, zato pridelujejo po načelih DAP – dobre agronomske prakse. Osnovni namen DAP je zadovoljiti najvišje zahteve po kakovosti, potem higienska proizvodnja, da s tem zmanjšamo mikrobiološko obremenitev, in skrbna pridelava, da zmanjšamo fizikalna in kemična onesnaženja. (Baričevič Dea, priročnik za ciklus predavanj pridelovanje zdravilnih rastlin, 1. Del, Ljubljana, avgust 1996). Pravila DAP določajo različne kriterije pri pridelovanju, žetvi, sušenju, pakiranju, hranjenju in prevozu, opremi, osebju in napravah, dokumentaciji, šolanju in kontroli kakovosti, z upoštevanjem katerih pridelamo kakovostno drogo. Zadostiti pa moramo tudi ekološkim parametrom; za neko okolje moramo izbrati pravo rastlino, torej ustrezen genotip, ki bo tam rastel in uspeval. Torej zagotoviti moramo primerno temperaturo, ki vpliva na razširjenost, način rasti in razvoja rastlin ter proizvodnjo biomase. Naslednji dejavnik je svetloba, zagotoviti moramo primerno fotoperiodo, svetloba je pomembna v procesu esterifikacije aromatskih rastlin. Nadalje na količino pridelka in kakovost učinkovin vpliva nadmorska višina. Zagotoviti moramo ustrezno preskrbo z vodo, ki lahko močno vpliva na pridelek in vsebnost metabolitov. Naslednji pomemben parameter, ki vpliva na kvalitativne in kvantitativne parametre zeliščnih in aromatičnih rastlin, so fizikalne, kemične in biološke lastnosti tal.

3

Vsi zgoraj našteti dejavniki vplivajo na količino in kvaliteto metabolitov v rastlinah in ravno ti dejavniki onemogočajo, da bi imeli konstantno kakovost in količino pridelka skozi več let, z različnimi rastlinami na različnih področjih. Tudi na istem mestu in z isto rastlino lahko imamo v dveh letih večjo razliko v kvaliteti in kvantiteti pridelka, saj podnebni oz. vremenski pojavi lahko močno nihajo. Na letni ravni pa vendar lahko, z upoštevanjem zgornjih kriterijev, zagotovimo enakomeren in kvaliteten pridelek rastlin. Tak pridelek analiziramo, določimo količino želenih učinkovin in potem lahko normiramo izdelek. Za potrebe farmacije torej zagotovitev enakomernega pridelka na letni ravni zadošča. Obe rastlini, ameriški slamnik(Echinacea spp.) in arnika (Arnica chamissonis) nimata večjih omejitev pri pridelavi, za kakovosten pridelek moramo upoštevati dobro agronomsko prakso in ekološke pogoje.

4. IMUNSKI SISTEM

Ljudje že stoletja živimo v okolju, katerega si delimo ogromnim številom različnih mikroorganizmov, naše telo je stalno v stiku z bakterijami, glivami, virusi in drugimi parazitskimi ali potencialno parazitskimi oblikami življenja. Skozi stoletja koeksistence smo sesalci razvili več učinkovitih mehanizmov, da se lahko ubranimo pred potencialno patogenimi organizmi, ki vdrejo v organizem. Tak mehanizem je na npr. naravna ali prirojena imunost. Naravna imunost vključuje genetične dejavnike, anatomske in mehanične ovire, nespecifične baktericidne snovi telesnih tekočin, fagocitozo in znotrajcelično uničenje mikroorganizmov, različne efektorske mehanizme, kot sta npr. sistem komplementa in interferoni. Dostikrat pa se zgodi, da mehanizmi naravne odpornosti niso dovolj učinkoviti proti nekaterim patogenim mikrobom. Skozi evolucijo so vretenčarji zato razvili še eno skupino obrambnih mehanizmov in sicer v odgovor na vdor infekcijskega agensa. Ker temeljijo na ˝izkušnjah˝ posameznika, jih imenujemo pridobljena ali adaptivna imunost. Za to obrambo je značilno spoznavanje tuje snovi ali mikroba, nastanek protiteles in efektorskih celic ter imunski spomin. Tuje snovi, ki spodbudijo specifično imunost, imenujemo antigeni.

4.1. Naravna imunost

Termin naravna imunost se nanaša na dejstvo, da je ta tip obrambe pri zdravem posamezniku vedno prisoten in pripravljen, da blokira vstop mikroorganizmov in hitro eliminira mikroorganizme, katerim se je uspelo infiltrirati v tkivo gostitelja. Nekateri mehanizmi naravne imunosti patogenom preprečujejo vstop v celico (epitelne bariere), drugi pa mikrobe eliminirajo, to so fagociti, celice naravne ubijalke in sistem komplementa.

Sistem komplementa : aktivirajo ga različne bakterije, omogoča fagocitozo z makrofagi in nevtofilci ter endocitozo,

Celice naravne ubijalke : aktivirajo jih interferoni, po aktivaciji se vežejo na okužene celice in jih ubijejo. Interferoni poleg aktivacije celic naravnih ubijalk zvečajo tudi odpornost navadnih celic proti virusnim infekcijam in tako predstavljajo močan obrambni mehanizem,

4

Fagociti: poznamo specializirane fagocitne celice, ki so monociti, nevtrofilci in tkivni makrofagi. Ko material v obliki delca dospe v fagosom, se fagosom zlije z lizosomi in fagocotoran material se razgradi.

4.2.Adaptivna imunost Adaptivna imunost je tip obrambe gostitelja, ki je stimuliran s strani mikrobov, ki napadejo tkivo, torej se adaptira na prisotnost mikrobov. Adaptivni imunski sistem se razvije kasneje po okužbi, in je mediiran s strani limfocitov in njihovih produktov. Poznamo dva tipa adaptivne imunosti in sicer humoralno in celično mediirano imunost.

Humoralna imunost : mediatorji humoralne imunosti so protitelesa, ki jih producirajo celice B. protitelesa se izločajo v krvni obtok in mukusne tekočine. Tam s svojim delovanjem nevtralizirajo in eliminirajo mikrobe in njihove toksine, ki so prisotni v krvi in v sluzi. Ena izmed pomembnejših funkcij protiteles je, da ustavijo mikrobe, ki so prisotni na površini sluznic in jim preprečijo kolonizacijo tkiva. Protitelesa nimajo dostopa do mikrobov, ki so že vstopili v celico, za eliminacijo le-teh skrbi celično mediirana imunost, katere akterji so celice T.

Celično mediirana imunost : limfocite T aktivirajo fagocite, da eliminirajo mikrobe, ki so jih fagocitirale ali pa ubijejo gostiteljsko celico, v katero je vstopil patogen.

Protitelesa limfocitov B so specializirana, da prepoznajo ekstracelularne mikrobne antigene, medtem, ko limfocite T prepoznajo antigene, ki jih intracelularni mikrobi sprožijo v napadeni celici. Druga pomembna razlika med celicami B in T je tudi, da večina celic T prepozna samo mikrobne proteinske antigene, medtem, ko so protitelesa sposobna prepoznati več različnih tipov mikrobnih molekul, kot so proteini, ogljikovi hidrati in lipidi.

slika

Tip celice Funkcija celice

Limfociti: limfociti B, limfociti T, celice Specifična prepoznava antigenov

5

naravne ubijalke

Limfocite B: mediatorji humoralne imunosti

Limfocite T: mediatorji celične imunostiCelice naravne ubijalke: celice naravne

imunosti

Antigen predstavljajoče celice: dendritske celice, makrofagi, folikularne dendritske

celice

Predstavitev antigenov limfocitomDendritske celice: iniciacija odziva celic

TMakrofagi: iniciacija in efektorska faza

celične imunostiFolikularne dendritske celice:

predstavitev antigenov limfocitom B in humoralni imunski odziv

Efektorske celice: limfociti T, makrofagi, granulocite

Eliminacija antigenov:Limfocite T: celice T pomagalke in

citolitične limfocite TMakrofagi in monocite: celice

mononuklearne fagocitozeGranulocite: neutrofilci in eozinofilci

Slika 3.: Celice imunskega sistema in njihove funkcije

5. IMUNOMODULATORNI UČINKI škrlatnega AMERIŠKEGA SLAMNIKA (Echinacea purpurea)

5.1.Delovanje ameriškega slamnika (Echinacea spp.) na naivno imunost

Škrlatni ameriški slamnik se za zdravilne namene uporablja kot svež ali posušen iztisnjeni sok ali pa tinktura na osnovi etanola iz, na zraku posušenih, korenin ali nadzemnega dela rastline. Tradicionalno ga uporabljamo pri naslednjih bolezenskih znakih:

5.1.1Virusne infekcije zgornjega dihalnega trakta

Virusne infekcije povzroča mnogo različnih družin virusov, z različnimi strukturami in načini replikacije. Izvlečki iz Echinacea purpurea (etanolni izvleček, 95% posušenih nadzemnih delov in 5% korenin) imajo potencialnno antivirusno delovanje proti večim virusom z membrano. Manj učinkovita je proti intracelularnim virusom.

Povzročitelj bolezenskega stanja Vpliv izvlečka iz škrlatnega ameriškega slamnika (Echinacea purpurea)

Rhinovirusi Pripravki iz E. purpurea lahko povsem ali delno obrnejo stimulacijo, ki jo povzročijo rhinovirusi. Ta je naslednja: stimulirajo sekrecijo mnogih različnih citokinov, vključno s protivnetnimi interlevkini IL-1, IL-6, IL-8 in TNFα. Ti mediatorji imunskega sistema povzročajo simptome, ki spremljajo

6

respiratorne infekcije (kihanje, vročina, smrkanje,…).

HSV-1, adenovirusi tipa 3 in 11, respiratorni sincitični virusi

Izvlečki iz E. purpurea, z vključitvijo večih signalnih poti stimulirajo sekrecijo pro-inflamatornih citokinov, ki jo povzročijo našteti virusi.

Virus gripe AIzvleček iz E. purpurea zavre produkcijo citokinov in kemokinov, ki jo povzroči delovanje virusa gripe A.

Slika 4: Prikaz odziva človeških bronhialnih in pljučnih celic ˝in vitro˝, okuženih z različnimi virusi, na etanolni izvleček iz škrlatnega ameriškega slamnika (Echinacea purpurea)

Iz rezultatov lahko sklepamo, da škrlatni ameriški slamnik pomaga imunskemu sistemu pred okužbami z virusi, vendar pa ne moremo povezati inhibitornega učinka na produkcijo citokinov s specifičnimi metaboliti v rastlini, ki delujejo imunomodulatorno. Pri škrlatnem ameriškem slamniku (Echinacea purpurea) so etanolni izvlečki iz vseh delov rastline (korenina, listi, steblo, cvet) delovali imnunomodulatorno, to so dokazali z merjenjem izločanja IL-6 in IL-8 v celicah, okuženih z različnimi virusi. Ta dva citokina se namreč začneta izločati kot vnetni odziv imunskega sistema na okužbo. IL-6 izdelujejo različni tipi celic, v odgovor na IL-1, ki je ključen vnetni citokin, kateri povzroča vročino, kaheksijo, resorpcijo kosti, proteolizo mišic in povečano nastajanje proteinov akutne faze. Il-6 na celice B deluje s pospeševanjem razmnoževanja in zorenja celic B, s čimer okrepi izločanje imunoglobulinov. IL-8 pa je najbolje opredeljen predstavnik družine kemokinov. To je družina majhnih molekul (8-10kDa), katere spodbudijo naključno gibanje in usmerjajo potovanje levkocitov ter so zelo pomembni pri naravni imunosti. IL-8 je močan kemoatraktant, sproži respirativni izbruh v nevtrofilcih in sproščanje histamina in levkotrienov iz bazofilcev.

Iz zgornje tabele je razvidno, da izvlečki iz E. purpurea zmanjšajo vnetne odzive imunskega sistema na virusne okužbe, kar sovpada s tradicionalno uporabo ameriškega slamnika (Echinacea spp.) kot antivirusne droge.

Prehlade in druge respiratorne bolezni ponavadi spremlja povečano izločanje sluzi iz bronhialnih celic. Gene za sluz kodira vsaj 18 različnih genov, to so visoko glikozilirane makromolekule, ki so del nativne imunosti pri obrambi pred patogeni. Pri študiji z bronhialnimi celicami in vitro v kulturi in v organotipični bronhialni tkivni kulturi, so rhinovirusi povečali sekrecijo MUC5A, to je dominantni respiratorni mukus, izvleček iz E. purpurea pa je to sekrecijo zmanjšal, kar lahko štejemo kot dodatno prednost pri zdravljenju okužb zgornjih dihalnih poti z E. purpurea. Rezultati študije so predstavljeni v spodnji tabeli, dobili so jih s pregledom supernatanta za MUC5A z elisa testom in sicer iz bronhialnih celičnih kultur, ki so jih tretirali z različnimi kombinacijami E. purpurea in RV1A.

Tretiranje celic Razmerje: tretiranje/kontrolaNič – kontrola 1,00

Samo Echinacea purpurea 0,76Okužba z rhinovirusom (RV1A) 2,18

Echinacea purpurea + RV1A 0,64

7

Slika 5: Sekrecija sluzi v človeških epitelnih bronhialnih celičnih kulturah ˝in vitro˝.

Rezultati jasno kažejo, da alkoholni izvlečki iz E. purpurea zmanjšajo sekrecijo sluzi iz bronhialnih celic zgornjih dihalnih poti.

V človeških bronhialnih celicah (celične kulture ˝in vitro˝) pa so preverjali tudi izražanje genov in sicer so bile celice okužene z rhinovirusi in tretirane z vodnim in alkoholnim izvlečkom E. purpurea. Oba ekstrakta sta povečala ekpresijo mnogih genov, vključno z geni za citokine in INFα. Medtem, ko je bila ekspresija genov za citokine močno povečana, pa je bila povečana ekspresija INFα komaj zaznavna. INFα je antivirusni interferon, ki preprečuje razširitev virusa na neokužene celice. Skupaj z INFβ preprečuje replikacijo virusov v vseh celicah, okrepi litični potencial celic naravnih ubijalk in zvečajo izražanje molekul PHK razreda I in preprečujeta izražanje molekul PHK razreda II. Povečana koncentracija INFα bi pomenila močnejši odziv na virusne okužbe, vendar je bi bilo treba na tem področju narediti podrobnejše raziskave, da bi potrdili ali ovrgli vpliv ameriškega slamnika (Echinacea spp.) na izražanje INFα ter tudi INFβ.

Pri odzivu na virusne okužbe pa so pomembne tudi celice naravne ubijalke. So del naivne imunosti in sicer spoznajo in ubijejo celice, prekrite s specifičnimi antigeni. Aktivacija celic naravnih ubijalk poteka preko interferonov ali makrofagnih citokinov. Te celice na površini nimajo T celičnih receptorjev ali površinskih imunoglobulinskih receptorjev za limfocite B. na površini so prisotni aktivacijski in inhibitorni receptorji, ki omogočijo prepoznavo okuženih celic. Toksičnost celic naravnih ubijalk zagotavlja izločanje perforinov in grancimov. Perforini so beljakovine, ki v okuženo celico naredijo poro, skozi katero v celico vstopijo grancimi, kateri povzročijo apoptozo celice. Pripravki iz E. purpurea povečajo toksičnost teh celic, kar pomeni, da le-te z večjo učinkovitostjo ubijejo okužene celice.

5.1.2.Bakterijske okužbe

Pri večih rodovih in vrstah bakterij so preučevali vpliv E. purpurea na stimulacijo vnetnih modulatorjev, ki jih povzročijo bakterijski lipopolisaharidi v večih človeških in mišjih celičnih kulturah. Rezultati so pokazali, da je E. purpurea dober protivnetni agent. S študijami so dokazali, da so izvlečki iz ameriškega slamnika (Echinacea spp.) selektivni pri anibakterijskih aktivnostih, ne delujejo na vse bakterije enako, odziv je odvisen od bakterijskih lipopolisaharidov in lipoproteinov tipa Braun. Tudi različni izvlečki (vodni, alkoholni), imajo različne vplive na bakterije. Tako kot pri virusnih okužbah, tudi pri bakterijskih izvlečki iz E.purpurea zavrejo izločanje protivnetnih citokinov.

Kot primer bakterije lahko vzamemo Hemophilus influenzae, ki je del normalnega nasopharyangeal sistema. Patogeni sevi povzročajo kronični bronhitis in pljučnico. Interakcija s celicami epitela povzroči proinflamatorno izločanje citokinov, preko različnim mediatorjev. Izvleček iz E. purpurea lahko uniči mikroorganizem in inhibira produkcijo citokinov v epitelnih bronhialnih celicah. Na izvlečke iz E. purpurea je občutljiva tudi Legionella pneumophila, katera povzroči legionarsko bolezen; pri tretiranju se zmanjša izločanje proinflamatornih citokinov.

8

Echinacea purpurea ali škrlatni ameriški slamnik je torej toksičen za nekatere bakterije in viruse, v vsakem primeru pa je protivnetni agent, ki ublaži mnoge simptome respiratornih infekcij.

Vse zgoraj naštete funkcije učinkovin iz vrst Echinacee modulirajo imunski odziv prirojene, torej naivne imunosti. Z raziskavami na mišjih celicah kostnega mozga so dokazali, vpliv izvlečka iz ameriškega slamnika na dendritske celice, ki sodelujejo pri odzivu tako prirojene, kot tudi pridobljene imunosti.

5.1.3.Delovanje ameriškega slamnika na adaptivno imunost

Dendritske celice so antigen predstavljajoče celice, ki so izredno učinkovite pri predstavljanju antigena celicam T pomagalkam CD4+. Aktivacija celic T se izrazi v klonalni ekspanziji in diferenciaciji, ki vodi v odgovor adaptivne imunosti. So celice, ki pomagajo tako pri imunskem odgovoru naivne kot adaptivne imunosti. Pri samem delovanju dendritskih celic so pomembni receptorji, ki omogočijo prepoznavo celic T. Raziskave na MHC II. receptorju so pokazale, da s polisaharidi bogati izvlečki iz korenin E. purpurea, povečajo ekspresijo molekul, povezanih z delovanjem MHCII, medtem, ko izvlečki iz listov to delovanje zavrejo. Zgornje navedbe so potrdili z DNA mikroploščami, ki so pokazale ekspresijo genov ob tretiranju z izvlečkom E. purpurea iz korenin in iz listov. Ekspresija CD86 je ob tretiranju z izvlečkom iz listov upadla, medtem, ko je bila ekspresija CD54 pozitivno regulirana ob dodatku izvlečka iz korenin E. purpurea. Pri raziskavi je jasno razvidno, da imajo izvlečki iz različnih delov rastline različno imunomodulatorno delovanje. Visoke koncentracije polisaharidov povečajo aktivnost dendritskih celic, medtem, ko jo visoke koncentracije alkilamidov zmanjšajo.

a) Delovanje ameriškega slamnika (Echinacea purpurea) na posamezne tipe celic in molekul imunskega sistema

Tip celice / molekula Vpliv E. purpurea na celico

celice naravne ubijalke povečajo toksičnost celic

citokinistimulacija izločanja – vpliv na

izražanje genov za citokine

dendritske celicevpliv na izražanje genov, ki kodirajo

zapis za dendritske celicemakrofagi stimulira fagocitozo

Slika 6: Vpliv različnih izvlečkov iz Echinacea purpurea na različne tipe celic in molekul imunskega sistema

5.1.4.VODILNE UČINKOVINE V AMERIŠKEM SLAMNIKU, KI SO ODGOVORNE ZA IMUNOMODULATORNE LASTNOSTI RASTLINE

V rastlini je več učinkovin, ki skupaj delujejo imunomodulatorno na človeški organizem. Te učinkovine so cynarin, alkilamidi, kavna kislina in njeni derivati ter polisaharidi. V

9

farmacetvskih izdelkih, ki vsebujejo ameriški slamnik (Echinacea spp.), so ponavadi izvlečki iz rastline in ne posamezne izolirane učinkovine.

Cynarin: prepozna ga CD28 T celični receptor, je antagonist CD28/CD80 interakcije. Ima visoko sposobnost blokade signalne poti 2 skozi CD28 T celični receptor. Na CD28 se veže močneje, kot B celični receptor CD80, na druge receptorje (CD154, CD86, CD40) pa se ne veže. Če cynarin inhibira signalno pot 2 celice T, potem se izločanje IL-2 zmanjša za 87%. Količina učinkovine v E. purpurea je zadostna, da jo lahko uporabljamo v kliničnih aplikacijah. Posebej priporočljiv je za bolnike z avtoimunimi boleznimi, saj prepreči hiper-reakcijo imunskega sistema, ali pa za otroke z alergijskimi boleznimi.

Alkilamidi: vsi alkilamidi so topni le v etanolu, zato je za imunomodulatorno učinkovanje le-teh potrebno zaužiti tinkturo ameriškega slamnika (Echinacea spp.). Alkilamidi in Bauer ketoni 22 in 23 imajo protivnetne lastnosti in sicer zavirajo nastajanje prostaglandina E2 in produkcijo NO v makrofagih. Dodecadiendiynoic amid iz E. purpurea in E. pallida inhibira aktivacijo murinske linije makroagov RAW264.7, ki jo povzročijo lipopolisaharidi. Alkilamidi izolirani iz E. angustiolia imajo ˝in vitro˝ inhibitorne učinke na ciklooksigenazo in 5-lipooksigenazo, stimulirajo funkcijo makrofagov.

Poliacetileni:V E. pallida so dokazali, da zgolj Bauer ketoni 22 in 23 zavirajo nastanek prostaglandina E2. V primerjavi z alkilamidi, potrebujemo za isto stopnjo učinkovitosti nekajkrat manjšo koncentracijo ketonov. Na splošno ketoni modulirajo P-glikoproteinski transporter, v ekstraktu iz E. pallida so dokazali, da Bauer keton 24 zmanjša iztok skozi P-glikoproteinski transporter. Prostaglandin E2 je poznan kot inducer povišane telesne temperature pri raznih obolenjih, torej lahko sklepamo, da izvlečki iz E. purpurea pomagajo pri zniževanju telesne temperature.

Kavna kislina in njeni derivati: v frakcijah, kjer se je v raztopinah z etanolom nahajala le kavna kislina, ni bilo zaznati nikakršne inhibicije mediatorjev vnetja. Sklepamo lahko, da kavna kislina in njeni derivati sicer so pomemben del učinkovin ameriškega slamnika (Echinacea spp), vendar le v kombinaciji z drugimi učinkovinami.

Polisaharidi: so ena izmed najbolj zastopanih učinkovin v ameriškem slamniku (Echinacea spp.), v največjih količinah se nahajajo v koreninah. Polisaharidi, izolirani iz korenin, povečajo sekrecijo TNFα in IL-6. Za IL-6 je značilno, da ga izdelujejo različni tipi v odgovor na sproščanje IL-1. Deluje na celice B s pospeševanjem razmnoževanja in zorenja in tako okrepi izločanje imunoglobulinov. TNFα je glavni mediator imunskega odziva na gramnegativne bakterije ter tudi na druge infektivne mikroorganizme, ima obsežne biološke funkcije. Polisaharidi torej delujejo na naivno imunost in sicer na izločanje vnetnih citokinov.

6. IMUNOMODULATORNI UČINKI ARNIKE (Arnica montana in Arnica chamissonis)

Arnika je ena izmed najbolj pogosto preučevanih zdravilnih rastlin. Tradicionalna uporaba zajema rabo alkoholnega izvlečka, ki se uporablja pri površinskih poškodbah kože, kot

10

protivnetno sredstvo. Beseda vnetje izhaja iz latinske besede ˝inflammare˝, ki pomeni zanetiti ogenj. Pod njo razumemo biološki proces, ki vključuje več različnih kemijskih mediatorjev, katere sprožijo različni negativni stimulusi vaskularnega tkiva, kot so patogeni, poškodovane celice, alergeni in razna dražila. Primarni namen vnetnih procesov je pomoč pri zdravljenju poškodovanega tkiva, velikokrat pa pretirani ali pa dolgotrajni vnetni procesi privedejo do kroničnih vnetnih stanj, kot je na primer revmatoidni artritis. Vnetja so s stališča ljudi in živali neprijetna, saj povzročajo oteklino, pordečitev, vročino in bolečino vnetega mesta, pri hujših boleznih, kot so astma, revmatoidni artritis,… pa brez ustreznega zdravljenja pripeljejo do smrti. Zaradi naštetih razlogov so protiinflamatorna sredstva med pomembnimi zdravili. Včasih so glavnino protivnetnih zdravil predstavljala sintetična zdravila, danes pa se farmacevtska industrija usmerja v iskanje naravnih antiinflamatikov, saj so sintetiki pogosto toksični in povzročajo mnogo stranskih učinkov.

Proces vnetja poteka preko različnih mediatorjev, ki se nahajajo v telesu. To so prostaglandini, leukotrieni, prostaciklini, limfokieni, kemokini (IFN-α, INF-γ), interleukini (IL)-1, IL-8, histamin, 5-hidroksitriptamin (5-HT) in TNF-α.

V arniki najdemo naslednje učinkovine: alkohole, tanine, flavonoide in sekviterpenske laktone, med katerimi so najpomembnejši helenalin, 11α,13-dihidrohelenalin, chamissonolidi in njihovi estri. Najpomembnejši in najbolj raziskan sekviterpenski lakton je helenalin, katerega učinki so tudi najboljše raziskani. Poznan je kot protirakavo in antiinflamatorno sredstvo, zaradi inhibicije NF-κβ in telomerazne aktivnosti ter tudi imparinga proteinov in DNA sinteze. Predvideva se, da je helenalin potencialni kandidat za zdravljenje dereguliranih in neželenih T-celičnih imunskih odzivov. Raziskave so pokazale, da helenalin inducira apoptozo v aktiviranih CD4+ celicah T pomagalkah s sprožitvijo mitohondrijske poti apoptoze. Indukcija apoptoz poteče s hitro stabilizacijo p53, nuklearno lokalizacijo p53 in AIF ter s povečanjem in ROS produkcijo, ki se kaže kot zmanjšanje potenciala mitohondrijske membrane. Aktivirane celice CD4+ T pomagalke, ki preživijo izpostavitev helenalinu, se izognejo inhibiciji proliferacije z indukcijo G2/M celičnega cikla. Ekspresija receptorjev na celični površini, povezanih z aktivacijo (CD25, CD27, CD28, CD120b), je oslabljena, ravno tako produkcija IL-2. Aktivacija transkripcije za gene, ki kodirajo CD25, IL-2 in IFNγ je regulirana s strani transkripcijskih faktorjev iz družine NFAT.

CD4+ celice T pomagalke pomagajo celicam B pri produkciji protiteles. Naivna celica CD4+ se sreča z APC in preko receptorjev prepozna antigen na površini APC. Preko signalne transdukcije začne izločati IL-2, kateri po povratni zanki vpliva nazaj na CD4+ in jo spodbudi k proliferaciji. Začne se klonalna ekspanzija celic T, nekatere se diferencirajo v efektorske celice, ki sodelujejo pri celični imunosti, druge pa se diferencirajo v spominske celice, ki imajo dolgo sposobnost preživetja. Te celice se aktivirajo ob ponovni okužbi z enakim antigenom in grejo takoj proliferacijo – ker imunski sistem antigen prepozna takoj, je odgovor na okužbo krajši. Efektorske celice T pomagajo pri aktivaciji makrofagov, celic B in drugih celic, ki sodelujejo pri imunskem odzivu.

Dokazali so, da helenalin zavira nuklearno translokacijo NFATc2 v aktiviranih CD4+ celicah pomagalkah, kar privede do nezmožnosti aktivacije genov, ki kodirajo receptorje na

11

površini celic T. Helenalin lahko tako označimo kot nov imuonosupresant za zdravljenje dereguliranih in neželenih T-celičnih imunskih odzivov. Molekularni mehanizem za protivnetni odziv, katerega povzroči helenalin, se razlikuje od drugih nesteroidnih protivnetnih drog, kot sta indometacin in acetil salicilna kislina, saj deluje selektivno na celice CD4+ pomagalke.

V prevelikih dozah helenalin povzroči hipersenzibitabilen odziv, v razredčeni dozi pa deluje imunostimulatorno. Na raziskavah na mišjih modelih tudi z nanosom zelo koncentrirane tinkture arnike na vneto kožo, niso mogli sprožiti hipersenzibitabilnega odziva. Tega so lahko sprožili le v knockout miškah z okvarjenim CD-4 MHCII kompleksom. Iz teh rezultatov lahko sklepamo, da je pri arniki (Arnica montana in Arnica chamissonis) hipesenzibilativni odziv preprečen s protivnetnim efektom in imunosupresijo, ki sta rezultat imunske regulacije te droge.

7. PRIMERJAVA IMUNOMODULATORNIH UČINKOV AMERIŠKEGA SLAMNIKA (Echinace spp.) IN ARNIKE (Arnica montana in Arnica chamissonis)

Ameriški slamnik (Echinacea spp.)Arnika (Arnica chamissonis in Arnica

montana)

vpliv na celice naravne ubijalke zaviranje vnetja - apoptoza aktiviranih CD4+ celic T pomagalk pri neželenih in dereguliranih T-celičnih odzivih

spremembe na nivoju ekspresije genov za citokinevpliv na gensko ekspresijo imuno molekul v človeških dendritskih celicahpovečanje funkcije fagocitov

stimulacija sinteze IL-1, IL-6, IL-10 in TNFαpovečanje citotoksičnosti celic naravnih ubijalkpozitivna regulacija funkcije makrofagov

Slika 7: Primerjava vplivov ameriškega slamnika (Echinacea spp.) in arnike (Arnica montana in Arnica chamissonis) na imunski sistem

Ameriški slamnik (Echinacea spp.) Arnika (Arnica montana in Arnica chamissonis)

Učinkovina cynarin helenalin

12

in delovanje

prepozna ga CD28 T celični receptor, je antagonist CD28/CD80

interakcije.

zavira nuklearno translokacijo NFATc2 v aktiviranih CD4+ celicah pomagalkah, kar privede do

nezmožnosti aktivacije genov, ki kodirajo receptorje na površini celic T

Učinkovina in delovanje

polisaharidi modulirajo z gripo povezan kliničen potek bolezni in imunski odgovor,

izločanje citokinovUčinkovina in delovanje

alkilamidi stimulirajo alveolarno funkcijo

makroagov, zavirajo nastanek PGE2

Učinkovina in delovanje

kavna kislina in njeni derivati je podporna učinkovina drugim, sama nima imunostimulatornih

lastnostiUčinkovina in delovanje

poliacetileni zavirajo nastanek PGE2

Slika 8: primerjava vodilnih učinkovin v ameriškem slamniku (Echinacea spp.) in v arniki (Arnica montana in Arnica chamissonis)

Kot je razvidno iz zgornjih dveh tabel, se ameriški slamnik (Echinacea spp.) in arnika (Arnica montana in Arnica chamissonis) v svojem imunomodulatornem delovanju precej razlikujeta. Medtem, ko ameriški slamnik (Echinacea spp.) vsebuje več vodilnih učinkovin z imunomodulatornimi lastnostmi, v arniki (Arnica montana in Arnica chamissonis) najdemo le helenalin, kateri stimulira imunski odziv. Delovanje učinkovin iz ameriškega slamnika (Echinacea spp.) je obsežnejše, kot učinki helenalina iz arnike (Arnica montana in Arnica chamissonis). Če povzamemo, ameriški slamnik (Echinacea spp.) deluje na večino celic imunskega sistema, izvleček uporabljamo pri gripoznih in prehladnih obolenjih, poslužujemo se oralne uporabe, alkoholni izvleček iz arnike (Arnica montana in Arnica chamissonis) pa uporabljamo zunanje pri poškodbah kože, kjer zavre proces vnetja. Obema rastlinama je skupno, da imata protivnetno delovanje, čeprav le-tega zavirata na različen način. Učinkovine iz obeh rastlin tudi delujejo tako, da posežejo v prepisovanje genov, ki kodirajo mediatoje imunskega sistema.

13

8. UPORABA AMERIŠKEGA SLAMNIKA (Echinacea purpurea) IN ARNIKE (Arnica montana in Arnica chamissonis) V FARMACEVTSKIH PRIPRAVKIH

V svetu je trenutno trend vračanja k naravi, temu sledi tudi farmacevtska industrija. Po dobi sintetičnih zdravil vse bolj narašča uporaba naravnih učinkovin, ki imajo po navadi širši spekter delovanja in manj stranskih učinkov. Poznamo več različnih farmacevtskih pripravkov, ki vsebujejo naravne izvlečke, to so tinkture, čaji, mazila, kreme,…

8.1.Ameriški slamnik (Echinacea spp).:

Za izolacijo učinkovin je primerna cela rastlina, tako korenina, kot tudi cel nadzemni del. V različnih pripravkih najdemo izvlečke samo iz korenine ali samo iz nadzemnega dela, lahko pa tudi oboje skupaj. Gledano v grobem, so učinkovine tako v korenini, kot tudi v nadzemnem delu, le različno so porazdeljene.

V uporabi so vodni in alkoholni izvlečki, ali pa enostavno stisnjen sok, odvisno, katero učinkovino želimo izolirati. Pri vodnem izvlečku imamo v pripravku največ polisaharidov, ki delujejo na naravno imunost ter pomagajo imunskemu sistemu pri obrambi pred bakterijami in virusi. Kura s čajem ameriškega slamnika se priporoča v prehodnih letnih časih, ko je povečana verjetnost okužbe z gripami in prehladi. Za razliko od vodnih izvlečkov, imamo v alkoholnih največjo koncentracijo alkilamidov, ki imajo protivnetno delovanje, in sicer zavirajo nastajanje PGE2 in povečajo učinkovitost makrofagov pri eliminaciji mikrobov. Alkoholni izvleček ima širši spekter delovanja, saj vsebuje več učinkovin. Najpogosteje pa v farmaciji uporabljajo iztisnjen sok ameriškega slamnika, katerega posušijo in pripravijo končno obliko zdravila. V iztisnjenem soku so vse učinkovine, ki se v rastlini nahajajo, zato je uporaba le-tega najbolj pogosta.

Danes je na trgu veliko izdelkov z izvlečki ameriškega slamnika (Echinacea spp.), pripravke najdemo v obliki raztopin, tablet, čajev in tinktur. Farmacevtske firme ga priporočajo za krepitev imunskega sistema, kar potrjujejo tudi strokovne raziskave.

8.2.Arnika (Arnica montana in Arnica chamissonis)

Pri arniki se uporabljajo le cvetni koški, ki jih pobiramo v začetku cvetenja. Praviloma se pripravke uporablja le zunanje, homeopatski izdelki, ki na trgu dobivajo svoj prostor, pa se aplicirajo tudi oralno.

Tradicionalno se arnika (Arnica montana in Arnica chamissonis) uporablja kot tinktura, ali mazilo, pri raznih površinskih ranah, revmatičnih obolenjih, pri bolečinah mišic in zvinih. Vse bolj pogosti pa so različni homeopatski pripravki, ki vsebujejo izvlečke iz arnike. Ti so v obliki kroglic, ki jih zaužijemo.

14

9. ZAKLJUČEK

Zdravilni pripravki iz zeliščnih in aromatičnih rastlin so vse pogostejši na prodajnih policah, bodisi kot tradicionalni farmacevtski izdelki ali pa homeopatska zdravila. Zdravila iz zeliščnih in aromatičnih rastlin so naravna; na organizem imajo ob pravilni uporabi manj škodljivih učinkov, kot sintetična zdravila. ameriški slamnik (Echinacea spp.) in arnika (Arnica montana in Arnica chamissonis) sta rastlini, katerih imunomodulatoni učinki so dobro preučeni in znanstveno potrjeni.

Ameriški slamnik (Echinacea spp.) vsebuje veliko različnih učinkovin, ki delujejo imunomodulatorno. To so cinarin, alkilamidi, polisaharidi, poliacetileni in kavna kislina ter njeni derivati. Delovanje učinkovin se izraža v okrepljenem imunskem odgovoru, saj izvlečki iz ameriškega slamnika povečajo citotoksičnost celic naravnih ubijalk, stimulirajo delovanje makrofagov, stimulirajo nastajanje citokinov, ki so pomembni del imunskega odziva, in pozitivno vplivajo na delovanje dendritskih celic in zavirajo nastanek PGE2. Imunomodulatorno delovanje ameriškega slamnika je torej širokega spektra, saj deluje na mnogo celic in molekul imunskega sistema. Imunskemu sistemu pomaga pri obrambi pred bakterijami in virusi, zanemariti pa ne smemo niti protivnetnih lastnosti, ki lajšajo simptome, ki bolezen spremljajo. Ameriški slamnik (Echinacea spp.) namreč vpliva tudi na zmanjšano izločanje sluzi pri različnih okužbah, kot so npr. prehladi, kjer se prekomerno zasluzita zgornji dihalni trakt in nosna votlina.

Učinkovine iz ameriškega slamnika (Echinacea spp.) pretežno delujejo na izražanje genov za različne gradnike imunskega sistema in tako modulirajo delovanje le-tega. Uporabljajo se izvlečki iz treh vrst ameriškega slamnika in sicer Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia in Echinacea pallida. Poznamo več različnih pripravkov, tako na vodni, kot na alkoholni osnovi, odvisno od topnosti učinkovin. V farmaciji se najpogosteje uporablja iztisnjen sok korenine ali nadzemnega dela rastline, v katerem se nahajajo vse učinkovine.

Arnika (Arnica montana) je rastlina, katere uporaba je v Evropi močno razširjena. Uporabljajo se cvetni koški, namočeni v alkohol, pri raznih zunanjih poškodbah kože, kjer pospešuje celjenje in preprečuje vnetje. Vodilna učinkovina, odgovorna za protivnetno delovanje arnike je helenalin. Ta deluje tako, da zavira nuklearno translokacijo NFATc2 v aktiviranih CD4+ celicah pomagalkah, kar privede do nezmožnosti aktivacije genov, ki kodirajo receptorje na površini celic T. Helenalin lahko tako označimo kot nov imuonosupresant za zdravljenje dereguliranih in neželenih T-celičnih imunskih odzivov.

Arnika (Arnica spp.) se uporablja tudi v homeopatiji, kjer jo priporočajo pri površinskih ranah, revmatičnih obolenjih, pri bolečinah mišic in zvinih. Tradicionalno se uporablja v obliki mazil, tinktur in krem, v homeopatiji pa v obliki suhih kroglic, ki so namenjene oralni uporabi.

15

Povzamemo lahko, da imata tako ameriški slamnik (Echinacea spp.), kot tudi arnika (Arnica montana in Arnica chamissonis) dokazano imunomodulatone učinke. Ameriški slamnik ima širše imunomodulatorno delovanje, medtem, ko je arnika izredno dober antiinflamatik.

16