全自动生化分析仪的原理及检测方法 - labmed.cn · 光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被比色皿的表面所反射。设入射光的强度为Io，吸收光的强度Ia

CompanyLOGO

ISO15189实验室认可系列培训讲座

全自动生化分析仪的原理及检测方法

牛广华

辽宁中医药大学附属医院临床检验中心

一、光的性质光是一种电磁波，具有波动性和微粒性，不同波长的光，能量不同。电磁辐射按其

波长可分为不同区域。我们日常所见到的白光，便是波长在400 -760nm之间的电磁波，它是由红、橙、黄、

绿、青、蓝、紫等色按照一定比例混合而成的复合光。

λ

γ射线

x射线

紫外光

红外光

微波

无线电波

10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm

可见光

可见光：λ＝400－750nm



自动生化分析仪的光学测定原理

二、光的互补及有色物质的显色原理

若把某两种颜色的光按照一定的比例混合，能够得到白色光的话，则这两种颜

色的光就叫做互补色。图1中处于直线关系的两种光为互补色。如绿光和紫光为互补

色、黄光和蓝光为互补色等。

图 1互补色光示意图图 2高锰酸钾溶液的光吸收曲线




1. 由于有色物质对光的吸收具有选择性，因此，在进行比色测定时，只能用光波中能被有色溶液吸收的那部分光线，即应该用单色光进行比色测定。

2. 至于不被有色溶液吸收的光线。则应设法在未透过有色溶液之前或之后将其消除掉。

3. 滤光片就起这个作用。根据前面所叙述的理由可知，选择滤光片的原则应是:滤光片的颜色应与待测溶液的颜色为互补色。




三、朗伯-比尔定律

当一束平行单色光照射到均匀、非散射的溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被比色皿的表面所反射。设入射光的强度为Io，吸收光的强度Ia，反射光的强度为Ir，透过光的强度为It。则它们之间有如下关系:

Io= Ia + Ir + It




在实际比色分析时，所用的比色皿都是同质料、同规格的，因此反射光的强度为一定值，不会引起误差，即反射光的影响可以不加考虑。这样，上式可简化为:

Io= Ia + It

当入射光的强度一定时，被吸收的光的强度越大，透过光的强度就越小。这就是说，光的减弱仅仅与有色溶液对光的吸收有关。

溶液的浓度越大、透过的液层越厚、入射的光线越强，则对光线的吸收越多。




如果入射光的强度不变，则光的吸收仅与液层厚度及溶液的浓度有关。它们之间的关系可以用下式表示:

A＝K×C×L

1.式中，A为吸光度；K为吸(消)光系数；C为溶液的浓度；L为液层厚度。

2.此公式说明：在入射光一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度及液层厚度成正比。

3.此式就是光的吸收定律的数学表达式，又称朗伯－比尔定律。这一定律是比色分析和其他吸收光谱分析的理论基础。




自动生化分析仪的光学测定技术

前分光生化分析仪测光原理后分光生化分析仪测光原理

一、后分光技术



日立生化仪的分光系统(后分光技术)ISO15189实验室认可系列培训讲座



二、双波长测定技术

双波长测定原理

双波长法的原理是利用正确选择副波长，使主波长下干扰物吸收值与副波长干扰物吸收值接近，但副波长下分析用特异性显色物质的吸收很低的原理，通过主副波长差计算出特异性显色物质在主波长下的真实吸收，以实现减低干扰。另外，双波长法还能去除背景噪声。




双波长测定原理

双波长测光的优点：

可以有效地扣除样本的混浊、溶血、黄疸的干扰，并将噪声部分降低到最低限度，例如:可消

除或最大限度地减少因反应液中的污物、纤维蛋白、光源的闪烁、漂移、反应杯的伤痕、污染、恒温水中的污物等引起的误差。 A=λ2−λ1= (a+b)− (c+d)

b= d A= a− c=A'



选择双波长的方法

1. 根据待测溶液对吸光谱的吸收曲线，选择最大吸收峰对应的波长为λp，吸收曲线下端较为平坦的某一波长为λs。

2. 选待测溶液最大吸收峰对应的波长为λp，选等吸收点的对应的波长为λs。所谓等吸收点，是指对于某个波长，尽管待测溶液的浓度不同，但对该波长的光的吸收均相等。等吸收点所对应的波长叫做等吸收波长。对于吸收光谱具有吸收峰的物质，同浓度下吸光度相等的两个波长，也是等吸收波长。等吸收波长是双波长法的理论基础之一。应用这一方法的必要条件是能准确地测定出等吸收点，否则将造成显著的误差。



选择双波长的方法

3. 选溶液最大吸收峰的波长为λp，选显色剂的最大吸收峰对应的波长为λs。该法又称为双波长增敏法，其原理是：当向一定浓度的显色剂溶液中加入待测物时，由于生成物质浓度的增大，生成物的吸光度也随之增大，而显色剂则由于不断消耗，其吸光度逐渐减小。如果以λp为测定波长，λs为参比波长时，测得的差吸收光度显然是生成物吸光度与消耗的显色剂的吸光度之和，从而提高了测定的灵敏度。



仪器结构ISO15189实验室认可系列培训讲座


投入部（含ISE)主要部件介绍ISO15189实验室认可系列培训讲座


P模块主要部件介绍ISO15189实验室认可系列培训讲座


清洗装置清洗装置试剂冷藏试剂冷藏

样品针样品针

反应机构ISO15189实验室认可系列培训讲座


160个反应杯

最长反应时间22分钟

恒温系统ISO15189实验室认可系列培训讲座


±±

1. 水浴式恒温是温控装置，使反应温度控制在37℃±0.1℃的水平，开机后水浴可以自动更换，换水后，仪器自动加入一定量水浴保护剂，其作用有：

使恒温水具有导电性；

抑制细菌生长；

润化比色杯以免产生气泡。

2. 水浴恒温的优点是：温度均匀、稳定；

3. 水浴恒温的缺点是：升温缓慢，开机预热时间长，因水质变化(微生物、矿物质沉积)影响测定，因此要定期换水和比色杯。为了加热均匀和防止变质，往往要设置电动机循环转动和添加防腐剂。

反应杯ISO15189实验室认可系列培训讲座

±±


在反应盘上安装清洗站。一项检验项目完成后，反应杯随即被自动清洗，实现了实时清洗。

1.反应杯清洗时，先吸走废液，灌入清洗液，再吸走清洗液，灌入清水，并自动进行水空白自检，确定反应杯是否清洗干净。

2.水空白自检通过后，由冲洗站吸掉水，由真空吸湿干燥反应杯，再做下面的检验项目。

3.假如反应杯污染，不能冲洗干净，仪器会自动放弃再次使用该反应杯，并且由电脑发出警告，在屏幕上显示出污染的反应杯所在位置，便于拿出反应杯进一步处理或更换新杯。

取样装置ISO15189实验室认可系列培训讲座

±±


1. 样品探针位于取样针下部，具液面感应功能和随量跟踪功能，取样针于样品上方下降，一旦接触到样品液面就缓慢下降并开始吸样。

2. 探针上的感应器还设有防碰撞报警功能，遇到障碍时取样针立即停止运动并报警。

3. 具有阻塞报警功能，即当取样针被样品中的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动报警并加大压力冲洗取样针，或跳过当前样品。

4. 水洗方式是对接触样品的样品针内外壁用水进行冲洗，日立采用浴盆浸泡式（涌泉式）冲洗。试剂针、搅拌棒的防止交叉污染措施与此相同。

回收部主要部件介绍ISO15189实验室认可系列培训讲座


仪器主要性能介绍

1. 分析方法： 1点终点、2点终点、1点速率、2点速率、3点、速率A、速率B

2. 校准方法：线性、K因数、同工酶、非线性等

3. 样本量： 1.5-35.0μl，0.1μl可调

4. 试剂量： 20-270μl，1μl可调

5. 总反应体积： 120-300μl, ﹡ 测光时必须满足该条件

6. 反应温度： 37±0.1℃水浴

7. 光源灯：保质期750小时，一般用1200H

8. 比色杯： 20只×8组共160只，依据杯空白值进行更换

9. 测光系统：采用凹面蚀刻光栅的后分光、单双波长测定方式 12个波长： 340、405、450、480、505、546、570、600、660、700、750、800nm



自动生化分析仪的常用分析方法

一、终点法

参与反应的物质包括被测物质在反应过程中完全被转换成另一种物质或被消耗掉，便达到反应的终点，此时吸光度将不再改变。通过检测吸光度的改变大小来求出被测物质含量的方法称为终点法。

实际上很多时候被测物质并没有完全被消耗，如酶法测定代谢物，仅能达到一个动态平衡，但是表观上吸光度已不再改变，所以我们也把这种酶法看成终点法。



终点时间的确定:

①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3-5分钟时其吸光度已趋向稳定，因而可将5分钟作为反应终点。

②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10秒内很快完成反应，之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生“慢反应”，使反应曲线上吸光度在10秒后仍继续缓慢上升，持续约达10分钟，因此终点时间应采用 10 -30秒，而不应选择10分钟。

自动生化分析仪的常用分析方法ISO15189实验室认可系列培训讲座


分析仪的检测方式1.一点终点法是指在时间-吸光度曲线上吸光度不再改

变时，选择一个时间点测定吸光度值。样品和第一试剂加入时刻做0点，第二试剂加时间是16和17点之间，因每两个测光点间间隔为18秒，故接近5.1分钟，第24点基本达到平衡，即反应“终点”。若以最后一点33点读取吸光度A33，则真正反应时间为9.6-5.1 = 4.5分钟。

分析仪通常在反应终点附近连续读两点吸光度(分别读取32和33点)，求出两点吸光度的平均值计算结果；并可根据两点的吸光度的差值判断反应是否到达终点(平衡)。





一点终点法一点终点法

时间（t）

A1

样本+R1

吸光度

21−+

=ΔlAAA l

2.两点终点法

在第二试剂加入以前，选择某一点(m)读取吸光度Am，它主要由样品本身或第一试剂与样品的非特异反应引起，相当于样品空白。经过一定时间后反应到达终点(平衡)后选择第二个点读取吸光度An，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法。

如上图通常读取16点为Am，第33点读取An。





两点终点法两点终点法

时间（t）

A2

A1

样本+R1

吸光度

时间（t）A2A1样本+R1

吸光度

21−+ lAAl

21−+ AmAm

添加试剂量的和或：到测光点、 ba

2)()( 11

RbRaRSRSK

AmAmKAAA

b

a

ll

++

=

+−+=Δ

−−

由于体积不同需要校正，K 就是体积校正因子

两点终点法能有效地消除在测定波长样品自身的吸光度，

如溶血、黄疸和混浊等原因造成的干扰。

溶血、黄疸、脂浊、NADN的吸光度



图中描述了几种终点法反应曲线的类型：

A.即刻反应而且反应产物颜色稳定、特异性高，如比色法测定Ca、Mg等；

B.反应缓慢达到平衡，如酶法测定胆固醇；C.产物不稳定，即随着时间延长吸光度下降者或抗原过剩时；D.反应接近终点但未达到平衡，读数点通常选择最后一点，如葡萄糖测定(氧化酶法)。



自动生化分析仪的常用分析方法

二、固定时间法

固定时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点。此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法，以前也称为两点法，但与两点终点法容易混淆，故建议称为固定时间法。

计算公式:C=(A2－A1) ×K, K为校正系数。



固定时间法固定时间法

时间（t）A2A1样本+R1

吸光度

21−+ lAAl

21−+ AmAm

t

t

AmAmAA

A

ll

2)(

2)( 11 −− +−

+

=Δ

固定时间法有助于解决某些反应的非特异性问题：

1.如苦味酸法测定肌酐，反应的最初30秒内，血清中快反应干扰物(丙酮酸、乙酰乙酸等)能与碱性苦昧酸反应;

2.在接着的50秒内碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间-吸光度曲线的线性较好(故也可用连续监测法测定肌酐);

3.在80-120秒及以后，碱性苦味酸可与蛋白质以及其他慢反应干扰物反应，故选择反应的50-80秒为测定时间。



三、连续监测法

连续监测法(又称速率法、动力学法)是根据反应速度与待测物的浓度成正比。通过测定一段时间内吸光度的变化速率(△A/min)来计算待测物的浓度。酶活性测定常用连续监测法。



下图表示单试剂反应方向上升的反应曲线，生物化学分析仪连续监测t0、t1、t2 、t3 、t4 、t5的吸光度，每个时间间隔的吸光度变化表示为δ1 、 δ2 、δ3 、δ4 、δ5值，从图中看出δ2 = δ3 = δ4 。将t1点至t4这段时间称为线性期。自动生物化学分析仪能记录整个反应

过程的吸光度变化，并自动判断线性度。

单试剂连续监测法反应进程曲线



同样道理，下图表示了双试剂反应方向向下的反应进程曲线，连续

监测法选取线性期中的主要测定区间来计算速率。

双试剂连续监测法反应进程曲线





连续监测法连续监测法

时间（t）样本+R1

吸光度

R2

l.mAΔ分钟的吸光度变化量之间、乘法求得的测光点用最小 1m2 l

计算公式:C= （△A/min） K

一般来讲，K值可分为理论K、实测K值和校正K值三种。

1.理论K值 K＝(106×Vt)/(ε×d×Vs)

因酶活性尚无公认的校准品可用，故多用于酶活性测定中(如CK-MB)。

式中产物的摩尔消光系数(ε)、反应液总容量(vt)、样品体积(vs)、比色杯光径(d)和换算成μmol/ L的换算因子(×106)都为定值。理论K值通过计算得出，可作为分析

参数输入到分析仪中。由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的

准确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的不同，因而有必要获得实际的摩尔吸光系数.然后用来计算的K值称为实测K值或校正K值。



2.实测K值

NADH( NADPH )摩尔吸光系数的测定:NADH(NADPH)没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)参与的反应途径。用己糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯制品，又有国家批准文号的葡萄糖标准液。因此，根据公式A = εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后便可计算出NADH(NADPH)的摩尔吸光系数ε为A/bC。



假设，葡萄糖标准液浓度为10mmol/L(0.01mol/L)，标准液加入量为3.5ul，酶试剂加入量为335 u，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光系数ε =6424，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH(NADPH)的摩尔吸光系数为6424，而理论上N ADH (NADPH)的ε为6220。



3.校准K值

酶活性校准品经校准操作后由分析仪自动计算得出。在进行酶学测定时，如果分析条件的变化如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等程度地影响校准物和待测样品，则使用校准品能进行补偿;一般来说以使用校准K值为好。

关于酶活性标准品，欧洲标准局(BCR)和美国国家标准技术研究院(NIST)均发表了人血清基质的酶活性标准物，但目前尚无公认的标准(校准)品问世。



四、带样品空白的速率法

带样品空白的速率法是利用同一反应杯在一个反应周期10(或8)分钟内进行两个项目测定，以除去副反应造成的△A/min。如图12-27所示，在反应的前5分钟(D点以前)，试验1的反应速率由L、M两点的吸光度变化△ALM来测定；在D点加入第二试剂后，试验2的反应速N、P两点的吸光度变化△ANP来测定。但是由于试验1在反应的第二阶段仍继续进行(为线1所示)，所以实际测得的△ANP并非试验2的真正反应速率。即真正的反应进程应为图12-27中虚线2所示。





所以在 N,P 两点虚线 2 的吸光度变化( "ANPΔ )应等于试验 2 的吸光度变化(△ANP)和虚线 1 的

吸光度变化( 'NPAΔ )的代数和，如果将向上的反应设定为正反应，则向下的反应就应为负反

应，即''" )( NPNPNPNPNP AAAAA Δ−Δ=Δ−+Δ=Δ ，注意

'NPAΔ 本身是负值。若试验 1 从 L 到

P 反应维持线性，即在 L 和 M 与 N 和 P 时间间隔相同条件下， LMNP AA Δ=Δ '，那么，

LMNPNP AAA Δ−Δ=Δ "，这时

"ANPΔ 代表了试验 2 的真正反应速率。

用碱性苦味酸法测定肌酐浓度时，样品中存在的胆红素会对肌酐测定产生负干扰。

因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而

且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。

若在加入第一试剂后一段时间内设置样品空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去样品空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰。



一般来说，双试剂的方法若使用终点法则选择两点终点法。

在此期间，与分析配备，用清洗机构不断

清洗反应容器，测定水空白。

杯空白用

样品到达吸样位后，样品针从样品容器吸样，

吐到反应容器中。

加了试剂的反应容器转到试剂加样位时，试剂针从试剂瓶吸试剂，吐到反应容器中。试剂针有R1和R2，用R1针吸第1和第4试剂，用R2吸第2和第3试剂。

样品到达吸样位后，样品针从样品容器吸样，

吐到反应容器中。

加了试剂的反应容器转到试剂加样位时，试剂针从试剂瓶吸试剂，吐到反应容器中。试剂针有R1和R2，用R1针吸第1和第4试剂，用R2吸第2和第3试剂。

加试剂后，用搅拌棒搅拌反应液。

反应盘每旋转1圈，反应容器会挡住来

自光源的光路。

此时，测定所有反应液的吸光度。

加试剂后，用搅拌棒搅拌反应液。

CompanyLOGO

[email protected]

mailto:[email protected]

Documents

全自动生化分析仪的原理及检测方法 - labmed.cn · 光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被比色皿 的表面所反射。设入射光的强度为Io，吸收光的强度Ia

全自动生化分析仪的原理及检测方法 - labmed.cn · 光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被比色皿的表面所反射。设入射光的强度为Io，吸收光的强度Ia