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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACY T- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-

MEDICINA Y AGRICULTURA, COMPAÑÍA LIMITADA -- MEDAG

INFORME FINAL

LA INFECCIÓN PERIODONTAL CON HELICOBACTER PYLORI COMO MECANISMO ETIOPATOGÉNICO DE LA INFECCIÓN GASTRICA ACTIVA PROD UCIDA POR ESTA BACTERIA EN NIÑOS Y ADULTOS GUATEMALTECOS.

PROYECTO FODECYT No. 048 - 2007

Dr. Roberto E. Schneider P.

GUATEMALA, 7 DE ABRIL DE 2010.

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AGRADECIMIENTOS: La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología, -SENACYT-, y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, -CONCYT-.

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INDICE

RESÚMEN SUMMARY PARTE I Pgs. 1.1 INTRODUCCIÓN……………………………………….... 7-8 1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA………………… 9-12 1.2.3 Antecedentes 1.2.4 Justificación del Trabajo 1.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS…………………………….. 13 1.3.1 Objetivos 1.3.1.1 General 1.3.1.2 Específicos 1.3.1.3 Hipótesis 1.4 METODOLOGÍA………………………………………… 14-20 1.4.1 Las Variables 1.4.2 Indicadores 1.4.3 Estrategia Metodológica 1.4.3,1 Población y Muestra. 1.4.4 El Método 1.4.4.2 Protocolo 1.4.5 La Técnica Estadística 1.4.6 Los Instrumentos a utilizar 1.4.6.1 Encuesta Socioeconómica y de Saneamiento 1.4.6.2 Formulario sobre Antecedentes y Sintomatología GI. 1.4.6.3 Obtención y manejo de muestras del Area Periodontal 1.4.6.4 Biopsias gástricas endoscópicas 1.4.6.5 Estudio morfológico de la mucosa duodenoyeyunal 1.4.6.6 Estudio histopatológico de la mucosa gástrica 1.4.6.7 Prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU) 1.4.6.8 Reacción en Cadena de la Polimerasa de punto final I.4.6.9 Aplicación tópica periodontal de Clorhexidina PARTE II II.1 MARCO TEORICO……………………………………. 21-37 PARTE III III.1 RESULTADOS…………………………………………. 38-50 III.1.1 GRUPO DE NIÑOS - MADRES III.I.I.1 Encuesta Socioeconómica, de Saneamiento e higiene dental III.I.I.2 Prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU) III.I.I.3 Estudios genómicos del H pylori periodontal observado III.I.I..4 Relación con variables socioeconómicas ambientales y de higiene III.I.I.5 Efecto de la Clohexidina tópica sobre el H pylori periodontal

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III.1.2 GRUPO DE ADULTOS DISPÉPTICOS. III.I.2.1 Formulario sobre antecedentes médicos y sintomatología GI III.I.2.2 Estudio Morfológico de mucosa duodeno yeyunal III.I.2.3 Estudio histopatológico de la mucosa gástrica III.I.2.4 Prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU) III.I.2.5 Estudios genómicos del H pylori periodontal y gástrico III.I.2.5 Similitud entre el material genómico del H pylori presente en la región antral y del cuerpo del estómago III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS………………………….. 51-53

PARTE IV.

IV.1 CONCLUSIONES ………………………………….. 54-57 IV.2 RECOMENDACIONES …………………………… 58 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………….. 59-69 IV.4 ANEXOS…………………………………………….. 70-76 IV.4.1 Consentimientos Informados IV.4.2 Encuesta general y de Cuidado dental IV.4.3 Formulario sobre antecedentes médicos y sintomatología GI.

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RESUMEN La infección gástrica por H pylori representa un serio problema de salud para la población infantil y adulta

pobre del mundo y de Guatemala. Es poco lo que se sabe sobre los mecanismos de transmisión de dicha bacteria y si existen o no otros reservorios además del estómago del hombre. Estudios recientes sugieren que la infección periodontal con H pylori representa un reservorio adicional de dicha bacteria en ests último. Objetivos: a) Determinar la prevalencia y características del material genético de H pylori presente en la región periodontal de escolares de 7 - 9 años de edad y de sus respectivas madres; b) Detectar y caracterizar el material genético de H pylori (Hp) de la región periodontal y de biopsias de mucosa gástrica obtenidos en adultos dispépticos de Condición socieconómica (CoSec) baja; c) Evaluar el efecto de clohexidina local sobre el Hp periodontal . Metodología: Se estudiaron 40 parejas niño madre y 40 adultos dispépticos. Las muestras periodontales se obtuvieron en a.m. despúes de un ayuno de 8 horas y sin cepillarse los dientes desde la noche anterior. Se usó un cepillo citológico estéril el que se pasó por la región periodontal de todos los dientes superiores e inferiores, incluyendo las areas interdentales. En el grupo niño-madre se obtuvieron 2 muestras separadas por 25 días. Las biopsias se obtuvieron del antro gástrico y area duodenoyeynal durante endoscopía diagnóstica; en un subgrupo se obtuvieron también biopsias del cuerpo gástrico a fín de comparar las caracterísitcas genómi-cas de las cepas de ambas regiones gástricas. La infección gástrica activa por Hp se investigó a) usando la Prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU) que mide la actividad de ureasa del Hp gástrico y b) la presencia histológica de bacterias similares al Hp y de gastritis crónica activa antral (HpHist). El ADN de Hp extraido de las muestras periodontales y de la mucosa gástrica se amplificó con la Reacción en Cadena de la Polimerasa de Punto Final. Se usaron a) un Primer Multiplex conteniendo los marcadores putativos de Virulencia del H pylori (MPV) VacA (s1, s2, m1, m2) y CagA ( 3R, 5F) y b) en una submuestra se investigó la presencia de IceA en material gingivodental y biosias gástricas. Se analizaron los resultados genómicos obtenidos en el grupo niño-madre y en el material genético periodontal y el de biopsias gástricas de los adultos dispépticos; también se evaluó su correlación con condiciones de saneamiento ambiental - higiene, y con el cuidado dental. En 12 parejas niño-madre se aplicó localmente clorhexidina analizandose su efecto sobre el Hp periodontal. Resultados: Se completó toda la información en 34 parejas niño-madre y 38 adultos dispépticos. La presencia de uno o mas de los MPV en el material preriodontal de todos los casos estudiados refleja la virulencia de dichas cepas. Grupo niño-madre: a) La prevalencia de la infección periodontal por Hp fue del 47% y 61% respectivamente; b) la presencia de los mismos MVP presentes en la primera y segunda muestras periodontales refleja que la misma es persistente y no un evento transitorio; c) La similitud en la distribución de los MPV periodontales encontrados en los niños y madres estudiados significa que existe contaminación madre↔hijo lo mas probable bidireccional; d) La aplicación local de clorhexidina en 10 parejas no redujo la prevalencia de la infección periodontal por Hp; e) La 13C-PAU evidenció la presencia de infección gástrica activa en el 60% y 71% de las parejas niño-madre respectivamente; e) Todas las parejas estudiadas eran pobres siendo sus condiciones de vivienda, saneamiento e higiene general y dental precarias. De aquí que no hubiesen diferencias significativas en la mayoría de dichos parámetros entre las parejas Hp(+) y Hp(-), excepto por el hecho de que un mayor número de las primeras vivían en casas alquiladas. También se observó una tendencia a que entre las primeras hubiese un mayor indice de hacinamiento y de consumo de agua guardada en recipientes; esta tendencia no fue sin embargo significativa. Adultos dispépticos: a) La prevalencia de infección periodontal por Hp fue del 58%. b) La presencia de infección gástrica activa, usandose la 13C-PAU y HpHist, fue del 63%. Sin embargo los MPV gástricos se encontraron presentes en el 81.1% de estos casos; este aumendo reflejando la mayor sensibilidad del procedimiento pero no necesariamente la presencia de infección gástrica activa. c) en el subgrupo de13 adultos en quienes se analizaron biopsias del antro y cuerpo gástricos se detectaron los mismos MPV evidenciando que ambas regiones estaban infectadas con la misma cepa de Hp. d) la presencia de cagA, fuera solo o con distintos aleles del vacA, se asoció de mayores cambios inflamatorios agudos y regenerativos del epitelio gástrico. e) Independiente de la presencia o no de infección gástrica por Hp todos los adultos dispépticos presentaron una mucosa duodenoyeyunal cerebroide lo que es sugestivo de la presencia de un estado disbiótico intestinal. Conclusión: La infección periodontal con H pylori es frecuente y duradera, afectando a niños y adultos pobres de Guatemala. Es necesario definir como puede ser tratada y considerar su presencia al planificarse intervenciones orientadas a reducir la infección gástrica por Hp Helicobacter pylori Infección Periodontal Infección Gástrica Niños-Madres Adultos dispépticos

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SUMMARY

Helicobacter pylori gastric infection represents a serious health problem for the infantile and adult population of the world and Guatemala. It is a serioue risk factor for gastroduodenal ulcers and gastric adenocarcinoma (intestinal type) and MALToma. Inspite extensive research the process of infection or human transmission remains unclear. The detection of this microorganism in the oral cavity has been recently reported raising the question if this represents a potential reservoir for H pylori and/or a potential rout of transmission. Objective: To investigate the prevalence and characteristics of H pylori genetic material present in the periodontal region of guatemalan school children and their respective mothers as well as in the periodontal and gastric mucosa of dyspeptic adults. Methodology: Forty child-mother pairs (Group 1) and 40 dyspeptic adults who were submitted to gastroscopy (Group 2) were studied. All were poor and lived in rural and suburban areas. Oral sampling were obtained from the lower and superior periodontal and interdental regions using a sterile cytology brush. In Group 1 a second set of periodontal samples were obtained 1 mo later. Two gastric antrum mucosa endoscopic biopsies were obtained in Group 2 for histologic and genetic evaluation. All patients had a 13C-BUT done. Presence of active gastric H pylory infection was determined using 13C-Urea Breath Test (13C-UBT). After DNA extraction, samples were amplified using End point Protein Chain Reaction with a) a Multiplex Primer containing VacA (s1, s2, m1, m2) and CagA (3R, 5F) and b) . Results from child-mother periodontal samples as well as from periodontal-gastric mucosa were anlyzed and statystically correlated; possible correlations with prevalent sanitary and hygienic conditions, dental hygiene and care were also investigated. Results: Studies were completed in 34 child-mother pairs and 38 adult dyspeptic patients.The sample´s DNA was amplified by end point PCR using a Multiplex primer containing VacA (s1, s2, m1, m2) CagA (3R, 5F) alleles of putative virulence markers of Hp (PVM). Results were correlated also with sanitation and hygienic conditions. RESULTS: Group1: 13C-BUT was positive in 63% of children and mothers; Hp periodontal infection was present in 47% of children and 60% of mothers. PVM distribution was similar within the child-mother pair. Results from the second set of samples were similar to the initial set also; there was a tendency to increased crowding and consumption of stored water among Hp(+) pairs. Among Group 2, 63% of the patients had a positive 13C-BUT and histologic detection of H pylori. Although Hp periodontal infection was present in 58% of cases, gastric PVM were detected in 81.1% of gastric biopsies. The presence of CagA in gastric mucosa, either alone or with other VacA alleles, was associate with greater degrees of acute inflamation and eithelial regeneration. The distribution of periodontal PVM was different from that observed in gastric mucosa. Independent of the presence or abscence of H pylori gastric infection all dyspeptic adults had a convoluted duodenojejunal mucosa. Conclusion: Among the population studied, periodontal infection with H pylori is not only frequent but stable. The fact that periodontal PVM were similar in a given child and mother strongly suggests contamination between the pair. The lack of correlation between periodontal and gastric PVM probably reflects different degrees of expression within these areas.

Helicobacter pylori Periodontal Infection Gastric Infection Children-mother Dyspeptic adults

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PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

El conocimiento sobre la importancia que tiene el Helicobacter pylori en la etiopatogenia

de las enfermedades gastroduodenales ha aumentado en forma impresionante desde esta bacteria fuera reportada por primera vez por Marshall y Warren en 1983 como el posible causal de la gastritis y la úlcera péptica gastroduodenal (Marshal BJ & Warren JR, 1983, Marshall BJ, et al, 1985). Hoy se reconoce que la infección gástrica por Helicobacter pylori constituye un serio problema de salud mundial especialmente en poblaciones pobres de paises subdesarrollados donde su prevalencia es muy elevada (Graham DY, 1994). Dicha infección juega un papel etiopatogénico importante en la Gastritis Crónica Activa, las Úlceras Gástrica y Duodenal, el Adenocarcinoma gástrico y el Linfoma Superficial Gástrico Primario (MALToma) 1 . Desde 1994 la OMS incluyó al H. pylori en su lista de Carcinógenos Tipo I para el ser humano (IARC Monographs, WHO, 1994). La evidencia epidemilógica acumulada hasta ahora sugiere que, aunque su patogenia es de carácter multifactorial (Peterson WL, 1991), la infección gástrica por H pylori se adquiere a temprana edad y durando toda la vida si no se le trata en forma apropiada (Malaty HM & Graham DY, 1994). Existe además una relacion inversa entre el riesgo de infección y las condiciones socioeconómicas en que se vivió la infancia y niñez (Blecker U, 1996 ). La cronicidad de la infección induce cambios progresivos en la estructura y fisiología de la mucosa gástrica los que juegan un papel etiopatogénico muy importante en el desarrollo de las entidades clinicas relacionadas con el H pylori especialmente las de tipo neoplásico (Helicobacter and Ca Collaborative Group, 1994, Schneider RE, y col, 1994; Schneider RE, y col, 1997;

Kikuchi, et al 1999).

En Guatemala la prevalencia de la infección gástrica por H pylori en poblaciones de condición socioeconómica baja es muy elevada y temprana. Así la seroprevalencia de anticuerpos IgG contra H pylori se eleva progresivamente durante los primeros diez años de edad hasta que los niveles que se encuentran en niños de 9 años son prácticamente iguales a la seroprevalencia observada en adultos jóvenes. Sesenta y tres por ciento de escolares de primer año primaria que asisten a las escuelas nacionales de los municipios de Guatemala presentan infecciòn gàstrica activa por H pylori. Tasas de infecciòn semejantes y aun mayores (89 %) se han detectado en adultos dispèpticos de una condiciòn socioeconòmica semejante a los primeros. Los factores epidemiológicos relacionados con la prevalencia de la infección infantil por H pylori son muy similares a los descritos para las infecciones bacterianas entéricas; entre los mismos se pueden mencionar aquellas condiciones que facilitan o elevan el grado de contaminación oral, una lactancia materna corta o ausente, la introducción temprana de otros alimentos, pobres condiciones higienico-sanitarias ambientales, estado nutricional deficiente etc. (Schneider RE, Informes finales Proyecto

Foni-12-3 y Proyecto Foni-32-0518-21). Una situación semejante se ha observado en otros países en vías de desarrollo (Malaty HM, Graham DY, 1994; Blecker U, 1996). En claro contraste con las elevadas tasas de infección reportadas y la especificidad

1 Marshall BJ &Warren JR; 1994; Jones DM, et al, 1984; Tytgat GNJ & Rauws EAJ, 1990; Steer HW, 1984;

Graham DY, 1989; Eslick GD, et al,1999; Wotherspoon AC, et al, 1997

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mostrada por la bacteria para infectar el moco y la mucosa gástrica humana, es muy dificil poder cultivar dicha bacteria así como inducir experimentalmente la infección en el ser humano. Hasta la fecha no se ha demostrado una forma infectante de la bacteria que resista el medio ambiente exterior y poco se sabe sobre los mecanismos de infección de esta última. Tampoco se conoce un reservorio animal para el mismo aunque si se ha logrado la infección experimental de distintos roedores con H pylori u otras cepas de la misma especie (Cai X, et al, 2005; Houghton JM & Wang TC, 2003). Estudios efectuados en la última década en distintos paises del mundo, incluyendo Guatemala, han demostrado la presencia de material genético propio del H pylori en la región periodontal y superficie lingual de adultos y adolecentes (Dowsett SA, et al, 1999; Berroterran A, et al, 2002; Oshowo A, et

al,1999). Este hallazgo plantea la posibilidad de que la región periodontal sea un nicho biológico para la bacteria que facilita la contaminación persistente de la mucosa gástrica a través de la saliva deglutida (Berroterran A, et al, 1999; Oshowo A et al, 1998; Allaker RP, et al, 2002). Aunque existen resultados contradictorios es posible que la infección periodontal por H pylori induzca la reinfección gástrica con esta bacteria después de un tratamiento de erradicación exitoso (Berroterran A, et al, 2002;

Czesnikiewicz-Guzic M, et al, 2007). Este proyecto tuvo como objetivo evaluar la prevalencia de material genético de H pylori en la región periodontal de niños entre 7 y 9 años de edad que asisten a escuelas de uno de los municipios del Departamento de Guatemala, así como en sus madres (consideradas como adultos de condición socioeconómica baja). Otro grupo de estudio fueron adultos dispépticos de condición socioeconómica baja y media a quienes se les efectuó gastroscopía diagnóstica. Las características genómicas del material periodontal y de la mucosa gástrica se determinaron usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa, o PCR, con primers específicos para los marcadores putativos de virulencia (MPV) y de la ureasa del H pylori. En todos los pacientes (niños y adultos) se obtuvo material periodontal en ayunas detectándose también la presencia o ausencia de infección gástrica activa por H pylori con la prueba de aliento con 13C-Urea; en los adultos con gastroscopía se detectó la presencia histológica de dicha bacteria en biopsias endoscópicas tomadas. En los casos niño-madre se analizó la prevalencia de los factores de virulencia del H pylori, el patrón con que los mismos se presentaban y la semejanza entre los mismos; también se evaluó su relación con la condición socioeconómica de saneamiento e higiene dental En los adultos dispépticos se analizó la presencia y patrón genético de los factores de virulencia del H pylori en el material periodontal y de la mucosa gástrica von rl fin de determinar si los mismos gurdaban alguna similitud entre sí.

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1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.2.1 ANTECEDENTES El Helicobacter pylori produce una infección transmisible y crónica que afecta la mucosa gástrica del ser humano causandole cambios inmunológicos a la vez que produce daño estructural y fisiológico de carácter progresivo hasta comprometer el funcionamiento normal de la misma. La infección gástrica por Helicobacter pylori afecta a un segmento importante de la población mundial (Graham DY, 1994) y aunque su patogenia es de carácter multifactorial (Peterson PL,

1991), su prevalencia está principalmente condicionada por: a) la condición socioeconómica, observándose que los países en vías de desarrollo y grupos poblacionales pobres de paises desarrollados presentan una mayor prevalencia de la infección (Graham DY, 1994); b) la edad en que ocurre la primoinfección lo que sucede en la infancia siendo la puerta de entrada posiblemente la vía oral (Blecker U,1996 ); c) la edad en que se adquiere la infección es también importante pues puede determinar el curso clínico de la misma (Farthing MJG 1998); d) existe una relación inversa entre el riesgo de infección y la condición socio-económica en que se desarrolla el individuo durante la niñez (Malaty HM & Graham DY, 1994); y finalmente e) el hecho de que una vez iniciada, la infección perdurará toda la vida a menos que se le erradique con la administración terapéutica específica o fortuita de antibióticos a los que dicha bacteria sea sensible (Peterson WL, 1991; Malaty HM, Graham DY,

1994). La infección gástrica por Helicobacter pylori produce un tipo de gastritis conocida como Gastritis Crónica Activa ya que presenta cambios inflamatorios crónicas y activos así como regenerativos; este tipo de gastritis juega también un papel etiopatogénico importante en las úlceras duodenal y gástrica, en el desarrollo del adenocarcinoma gástrico de tipo intestinal y de el linfoma gástrico primario tipo MALToma constituido primordialmente por linfocitos gástricos tipo B2.

En Guatemala, como en otros paises en desarrollo, la seroprevalencia de anticuerpos IgG contra el H pylori en niños de condición socioeconómica baja es significativa desde la primera década de su vida (Oregel SE, 2002 ; Afre JR & Flores LE, 2004). En contraste con los reciennacidos, en quienes dichos anticuerpos son del tipo pasivos (debido a su transmisión transplacentaria de la madre al niño), la persistencia y elevación progresiva de la tasa de seroprevalencia desde el primer año de vida a los 9-10 años de edad refleja el contacto de estos niños con dicha bacteria (Oregel SE,

2002 ; Afre JR & Flores LE, 2004). Durante esta primera década la tasa de Infección se eleva significativamente, encontrandose que los niños de 9 años de edad presentan una tasa de seroprevalencia del 65.7%, valor muy semejante al 68.2% demostrado en adultos jovenes del mismo nivel socioeconómico (Oregel SE, 2002 ; Afre JR & Flores LE, 2004).

El 63% de escolares de primer año primaria que asisten a las escuelas nacionales de los

municipios de Guatemala (7-9 años de edad) presentan infecciòn gàstrica activa por H pylori

2 Marshall BJ &Warren JR; 1994; Jones DM, et al, 1984; Tytgat GNJ & Rauws EAJ, 1990; Steer HW, 1984;

Graham DY, 1989; Eslick GD, et al,1999; Wotherspoon AC, et al, 1997

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(Schneider RE. Informe Final Proyecto Foni-32-05). Fuera de confirmarse la relación estadísticamente positiva con los factores epidemiológicos antes mencionados se demostró que niños con diarrea persistente tanían 2.7 veces mas probabilidad de tener la infección gástrica que niños sin diarrea (Schneider RE.

Informe Final Proyecto Foni-32-05). Este asociación es muy importante y amerita que se evalúe la presencia de daños morfológicos en la superficie gástrica y duodenoyeyunal en pacientes con infección gástrica activa por H pylori, cambios que podrían favorecer la malabsorción subclínica frecuentemente observada en niños y adultos de condición socio económica baja en nuestro país (Viteri FE & Schneider RE, 1974; Schneider RE, et al, 1981).

Tasas de infecciòn gástrica activa por H pylori semejantes y aun mayores (89 %) se han

detectado en adultos dispèpticos de una condiciòn socioeconòmica semejante a los primeros (Schneider RE, et al, 1994). Estos últimos individuos presentaron también una mayor frecuencia de cambios displásicos premalignos que sujetos dispépticos de condición socioeconómica alta (Schneider RE, et al, 1994). Como es sabido el Cáncer gástrico ocupa un lugar prominente entre los tipos de cáncer que afectan a la población adulta de Guatemala ocupando el primer lugar en el hombre y el segundo en la mujer inmediatamente por debajo del Ca del Cervix (Schneider RE, et al, 1994) (Ver adelante)

Hasta la fecha no se conocen claramente los mecanismos por los que dicha bacteria se transmite; esto ha limitado el desarrollo de programas de prevención efectivos. En las conclusiones de la mayoría de congresos y reuniones de expertos que abordan el tema, se enfatiza la necesidad de que se investiguen dichos mecanismos (Axon A, 2002). Teoricamente muchas características morfológicas de la bacteria y necesidades para su supervivencia la hacen una mala candidata para que sea la causante de una infección tan frecuente.

En la actualidad se considera que la transmisión de esta bacteria debe ser de persona a

persona ya que no se conoce otro reservorio natural para el H pylori mas que el mismo ser humano3. Hasta ahora, la evidencia con que se cuenta favorece la hipótesis de que las vías de transmisión mas probables seran la vía oral–oral en países desarrollados y fecal–oral u oral-oral en las paises en vías de desarrollo (Berroterran A, et al, 2002). El encontrar grupos familiares serologicamente positivos sugiere que existe transmisión individuo-individuo dentro de la familia (Drumm B, et al, 1990; Malaty HM, et al, 1994); sin embargo este mecanismo no puede explicar por si solo la alta prevalencia de infección gástrica. Años atrás se sugirió que la distribución etarea de la infección podría modificarse a medida que se redujera la transmisión entre grupos infantiles (Goodman KJ & Correa P, 1995); esto es lo que parece estar sucediendo en los países industrializados donde la prevalencia de la infección ha disminuido paulatinamente. Paradojicamente dichos eventos enfatizan la importancia de aclarar los mecanismos como se transmite dicha infección entre niño-niño y adulto-niño de la infección, ya que tomará muchas décadas para que las naciones en desarrollo logren alcanzar el nivel socioeconómico y educacional observado en esos países.

Debido a su capacidad para mantener un ambiente microaerofílico relativamente estable, la

región periodontal constituye un nicho biológico que puede ser colonizado por el H pylori ; esto ha sido documentado por varios investigadores (Oshowo A, et al, 1998; Allaker RP, et al, 2002; Madinier IM, et al,

3 El reporte inicial de que el mono rhesus era un reservorio natural de dicha bacteria (Baskerville A & Newell DG, 1988) no pudo ser confirmado posteriormente.

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1997) incluyendo a SA Dowsett y col. que reportó la presencia de material genético de H pylori en la area periodontal de adultos y adolecentes de una aldea de Guatemala en 1999 (Dowsett SA, et al,

1999). Sin embargo la prevalencia de la infección periodontal con Hpylori que se reporta en la

literatura varía según el método usado. El lograr cultivar el H pylori de la placa dental ha probado ser muy dificil o imposible (De Sousa L, et al, 2006; Hu W, et al, 2002). El desarrollo de distintas metodologías genéticas han abierto un nuevo campo para detectar la presencia de dicha bacteria en la región periodontal del ser humano. Entre estas vale la pena mencionar a) la Detección del DNA Polimórfico bacteriano amplificado al azar (Random amplification of Polimorfic DNA= RAPD) (Czesnikiewicz-Guzic M, et al, 200757, García C, et al, 1999) y b) la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR4 (Polimerase Chain Reaction) la que, con el uso de primers específicos, permite detectar las secuencias correspondientes a los distintos subgrupos de Marcadores putativos de Virulencia presentes en la Bacteria (Czesnikiewicz-Guzic M, et al, 2007; 57; García C, et al, 1999; Hernandez R, et al, 2001). Se espera que las mismas permitan aclarar las interrogantes antes planteadas como se discute en las Secciones sobre el Marco Teórico y la Discusión de los Resultados obtenidos en este proyecto.

4 Por razones de costumbre y su uso a nivel mundial, en el resto del presente documento en utilizará la abreviación PCR para identificar este método diagnóstico.

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1.2.2 JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN En otros proyectos financiados por FONISAL y FODECYT se ha demostrado la importancia epidemiológica de la infección gástrica por H pylori en la niñez Guatemalteca y evaluado la efectividad de la triple terapia y la suplementación oral con zinc para erradicar dicha infección; esperando con esto último romper la evolución del proceso inflamatorio crónico en el epitelio gástrico de dichos niños (Schneider RE. Informe Final Proyecto Foni-32-0519, Schneider RE. Informe Final

Proyecto Foni-03-2006, Schneider RE, y col, Informe Final Fodecyt 92-2006; Hernandez R, et al, 2001). Todos estos esfuerzos están orientados a romper el ciclo que lleva al desarrollo de las enfermedades inducidas por dicha infección en el adulto, incluyendo las neoplásicas. Otros trabajos han demostrado una prevalencia semejante o aun mayor en adultos Guatemaltecos (Schneider RE, y col, 1994; Oregel SE, 2002 ;

Afre JR & Flores LE, 2004) Es necesario sin embargo determinar a) si existe otro reservorio de H pylori en la población infantil y adulta de Guatemala, b) con que frecuencia se presenta, y c) si el H pylori detectado en dicho reservorio es geneticamente semejante al que existe en la mucosa gástrica infectada. Los informes publicados hasta la fecha (Dowsett SA, et al, 1999) sugieren que este reservorio existe en la región periodontal de adultos y adolecentes del area rural de Guatemala, aunque no se conoce si también existe en niños Guatemaltecos, como se ha reportado en otros paises. La localización de este reservorio, en facil contacto con la cavidad gástrica a través del esófago, sugiere que el mismo juega un papel importante en la infección y la reinfección de la superficie epitelial gástrica con esta bacteria. Esto último todavía se debate, debido a los diferentes resultados obtenidos por otros autores; dichos resultados y otros aspectos han sido discutido en la sección correspondiente a antecedentes de este documento.

Este proyecto estuvo orientado a a) investigar la prevalencia de la infección periodontal por Helicobacter pylori en niños de 7 a 9 años de edad, de condición socioeconómica baja y en sus respectivas madres; b) en todos ellos se estableció la existencia o ausencia de infección gástrica activa por H pylori usandose la Prueba de Aliento con 13C-Urea. En los adultos sintomáticos (dispépticos) se obtuvo también biopsias de la mucosa gástrica durante gastroscopía; c) la detección y caracterízación del material genético de H pylori presente en el material periodontal y la mucosa gástrica se efectuó usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con primers que detectan las secuencias correspondientes a los distintos subgrupos de los Marcadores putativos de Virulencia de la Bacteria (Czesnikiewicz-Guzic M, et al, 2007; 57; García C, et al, 1999; Hernandez R, et al, 2001). El uso de dichos primers permitió no solo la detección del material genético sino también determinar si su patrón genómico en la región periodontal era semejante al de las biopsias de mucosa gástrica; d) Se evaluó la relación que puediera existir entre la infección periodontal, las alteraciones histológicas de la mucosa gastrica y las condiciones de saneamiento ambiental e higiénicas así como los hábitos y el cuidado dental.

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1.3.1 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

1.3.1.1 GENERAL: Determinar la prevalencia y caracterísiticas genéticas de la infección periodontal por Helicobacter pylori en niños Guatemaltecos entre 7 a 9 años de edad de condición socioeconómica y sus respectivas madres. Se estudió si existe o no similitud genómica entre el material genético de H pylori presente en dicha región y el detectado en la mucosa gástrica de adultos dispépticos. Se analizará también si la presencia de la infección periodontal producida por dicha bacteria se relaciona con los distintos parámetros considerados en este estudio. . 1.3.1.2 ESPECÍFICOS:

• Determinar la prevalencia de la infección periodontal por Helicobacter pylori en niños entre siete (7) y nueve (9) años de edad y adultos guatemaltecos de condición socioeconómica baja sin y con sintomatología gastrointestinal.

• Determinar en todos ellos la prevalencia de infección gástrica activa por Helicobacter pylori usando la Prueba de Aliento con 13C-Urea.

• Analizar si existe o no similitud genómica entre el material genético de Helicobacter pylori presente en la región periodontal con el detectado en la mucosa gástrica de pacientes adultos dispépticos a quienes se les efectúe gastroscopía con fines diagnósticos.

• Evaluar la posible correlación entre la infección periodontal por H pylori y la infección gástrica histológica producida por esta bacteria así como con otros parámetros (alteraciones morfológicas de la mucosa gastrointestinal, seroprevalencia de anticuerpos IgG contra Helicobacter pylori, condiciones de sanemiento ambiental e higiénicas, jáboitos y cuidado dental).

• Evaluar en los niños y adultos asintomáticos el efecto logrado con 2 aplicaciones locales de Clorhexidina sobre la infección periodontal por H pylori.

1.3.1.3 HIPÓTESIS: La tasa de infección periodontal por H pylori detectada en los niños estudiados será significativa y en concordancia con la alta prevalencia de infección gástrica activa observada en grupos de escolares de la misma edad. En la madre del niño(a) (adulto asintomático se encontrará también una tasa de infección periodontal alta. Especialmente se podrá demostrar la relación entre las características genómicas de la infección periodontal presente en los niños y sus respectivas madres. Se encontrará semejanza genómica entre el materiál genético del H pylori periodontal y el presente en la mucosa gástrica infectada de adultos dispépticos. Existirá también una relación importante entre la tasa de infección periodontal por H pylori y otros indicadores estudiados, como la presencia de alteraciones morfológicas e histológicas de la mucosa gastrintestinal, las condiciones de saneamiento ambiental y de higiene, y los hábitos y prácticas de aseo y cuidado dental.

14

1.4 METODOLOGÍA.

Debido a la perdida de viabilidad en un buen número de muestras y la imposibilidad de seguimiento experimentado en los grupos iniciales se tuvieron que modificar varias de las actividades originalmente planificadas; las razones se explicaron en los avances técnicos presentados anteriormente.

1.4.1 LAS VARIABLES: La mayoría de las variables consideradas en este estudio se pueden considerar Variables Independientes exceptos las relacionadas con las pruebas y las Determinaciones Genómicas que son Dependientes (Ver adelante). 1.4.2 INDICADORES: Los indicadores usados para evaluar los Objetivos Específicos de este proyecto se distribuyeron según el grupo de sujetos estudiados:

• Grupo Niño-Madre: a) PCR del material Periodontal; b) Prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU); c) Encuesta socioeconómica, de saneamiento, higiene dental y antropometría (Niños). d) Efecto de la aplicación periodontal de Clohexidina. • Adultos dispépticos sometidos a Gastroscopía:

a) PCR del material periodontal. b) PCR de biopsias endoscópicas de mucosa gástrica. c) Prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU) d) Morfología tridimensional de biopsias de mucosa duodeno-

yeyunal. e) Evaluación histológica de secciones de biopsias de mucosa

gástrica. f) Encuesta de Morbilidad previa y sintomatología. g) Manifestación del Marcador IceA en las muestras periodontales y

gástricas

1.4.3 ESTRATEGIA METODOLÓGICA 1.4.3.1. LOCALIZACIÓN: Las muestras de los niños y adultos asintomáticos (madres de los niños) se obtuvieron en la Escuela de la Aldea “El Tular , Municipio de San José Pinula. Las coordenadas geográficas de dicha aldea son: latitud norte 14° 32´ 54.9” y longitud oeste 90° 24´ 53.8”; está localizada en un valle entre montañas en la región central sur del país, su altitud es de 1,753.0172 Mts. La temperatura ambiente fluctúa entre una máxima de 22.8° C y 11.7° C con una temmperatura promedio 16.6° C. La precipitación pluvial anual promedio es de 1,639.3 mm con una humedad relativa del 84%.

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1.4.3.2. POBLACIÓN Y MUESTRA: Originalmente se había planificado estudiar a: a) 50 escolares del Primer Grado de Primaria que asistían a la Escuela Oficial Urbana Mixta No. 850, Jornada Matutina de San José Pinula; b) 50 adultos clínicamente sanos enrolados en la Consulta Externa de la Facultad de Odontología de la Universidad de San Carlos de Guatemala; y c) 50 Adultos Dispéticos programados para una Gastroscopía en un Hopital Nacional de la ciudad capital. Desafortunadamente por situaciones imprevistas y de causa mayor como el traslado de los niños originalmente escogidos a otras escuelas de la región y las medidas profilácticas tomadas durante el brote de la Gripe producida por del virus A1-H1N1 se tuvo que modificar la muestra a estudiar quedando de la siguiente manera:

• 40 parejas formados por los niños del Primer Grado Primaria de la Escuela Nacional localizada en la Aldea El Tular (a 8-9 Kms de San José Pinula) y sus respectivas madres (Adultos Asintomáticos).

• 40 Adultos Dispépticos (Adultos sintomáticos) programados para Gastroscopía en distintas Clinicas de la ciudad capital.

1.4.4. EL MÉTODO

1.4.4.4. PROTOCOLO: PROCEDIMIENTO PARA ENROLAR CASO S AL ESTUDIO Pareja Niño-Madre: Además de lograrse la aprobación y colaboración del Director y Profesores de la Escuela de la Aldea “El Tular” se tuvo sesiones con los padres de familia y los niños del Primer Grado de Primaria de dicha escuela explicandoles en que consistía el estudio; al final de las mismas se les pidió a las mamas que se inscribieran ella y su hijo(a) en forma voluntaria en listas que se les dejó a los profesores de las secciones del Primer Grado de Primaria. Adicionalmente se les pidió firmar o poner su huella digital en el Conocimiento Informado el cual les fue previamente leído. La encuesta socioeconómica y de saneamiento, así como la toma de muestra periodontal [niño-madre], la 13C-PAU [niño-madre] y las mediciones antropométricas [niño(a)] se efectuaron en una de las aulas con autorización del profesor y del director de la Escuela. Adultos Dispépticos programados para Gastroscopía: El gastroenterólogo a cargo del paciente decidió que pacientes eran buenos candidatos para el estudio explicandoles en que consistía el proyecto. Previo al procedimiento se entrevistó a los pacientes explicándoles de nuevo, y en detalle, en que consistía el proyecto; los que estuvieron de acuerdo firmaron el consentimiento informado procediendose a tomar la muestra periodontal y a efectuar la 13C-PAU. Se llenó también la encuesta registrando los antecedentes médicos importantes y la sintomatología que presentaban. De acuerdo a los hallazgos endoscópicos se decidió si el paciente era o no candidato para el proyecto.

Se consideraron como “candidatos” aquellos adultos de ambos sexos, clinicamente sanos ≤62 años de edad y que firmaran un consentimiento escrito aceptando participar en el estudio (Ver Anexo II).

Se excluyeron del estudio aquellos casos: a) que padecieran de enfermedades crónicas de tipo cardiorespiratorio, hematológico,

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renal, metabólicas (como Diabetes mellitus) etc; b) adultos que usaran prótesis dentales extensas o totales o que estuvieran sometidos a trabajos dentales mayores; c) pacientes adultos con historia de cirugía mayor del tracto gastrointestinal. d) adultos dispépticos a quienes se documentara durante la gastroscopía la presencia de cáncer esofago-gástrico, úlceras en esófago, estómago y/o duodeno sangrantes u otra lesion causando sangrado GI alto reciente o activo; y d) que no hubiesen firmado el consentimiento informado correspondiente. Ninguno de los pacientes, fueran niños o adultos, debían haber ingerido Antibióticos, Antiamebianos, Sales de Bismuto o Inhibidores de la Bomba de Protones Gástrica (IBP) por lo menos 3 semanas antes de ser examinados. 1.4.5 DISEÑO Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO: La información de tipo general y la que se derivó de los distintos análisis y pruebas efectuados, se trasladó a una base de datos (Epi-Info 5 y 6). Además de la evaluación tradicional de dicha información, se usaron otros programas, como el de Regresión logística, para evaluar el riesgo de desarrollar la infección gástrica por H pylori cuando existe infección periodontal. Dependiendo del tipo de datos evaluados, se usaron también medidas de asociación, determinación de razónes de chance y la t de student. En la comparación de las características genómicas del material genético de H pylori periodontal y gástrico y el correspondiente a las parejas niño-madre se usaron análisis multivariados así como el “Cluster analysis”. 1.4.6 INSTRUMENTOS A UTILIZAR: 1.4.6.1 Encuesta Socio-económica y de Saneamiento (Ver Anexo II): Las madres de los niños estudiados fueron entrevistadas para obtener información sobre su estado de salud, sus hábitos, composición familiar, condiciones socioeconómicas e higienico-sanitarias. También se investigó cuales eran los hábitos y cuidados dentales del niño preguntandole especificamente sobre el cepillado de los dientes, las visitas al dentista efectuadas en los últimos 12 meses y el tipo y extensión de los trabajos dentales que hubieran tenido durante ese mismo período. 1.4.6.2 Formulario sobre antecedentes médicos y Sintomatología GI (Anexo II): Se llenó en los pacientes adultos dispépticos previo a que se les efectuara la Gastroscopía. 1.4.6.3 Obtención y manejo de muestras del Area Periodontal: Previamente se le indicó al paciente presentarse a la toma de la muestra temprano en am. con 8 horas de ayuno y sin haberse cepillado o enjuagado la boca desde la noche anterior. Antes de tomar la muestra se interrogó a cada paciente si había cumplido con dichas indicaciones. La muestra se obtuvo en condiciones asépticas recogiendo la placa dental presente y/o del contenido del surco gingivo-dental de todas las piezas dentales superiores e inferiores presentes. Para esto se utilizó un cepillo especial esteril (Cyto-Pak, CytoSoft Brush ● 1CP-5B, Medical Packaging Corp, Amarillo, CA, USA). Las muestras se guardaron a -20° C para que 5 a 10 días después se extrajera el Acido Desoxiribonucleico (ADN) presente en las mismas usandose Kits QIAmp (QIAGEN, 9600 De Soto Avenue, Chatsworth, CA 91311, USA) siguiendo la metodología descrita por el fabricante. El

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ADN extraido se guardo a -6-8° C, hasta que se procedió a correr el PCR. 1.4.6.4 Biopsias Gástricas endoscópicas: Durante la Gastroscopía diagnóstica que se les efectuara a los adultos dispépticos, se obtuvo 2 biopsias de la mucosa antral, (y del cuerpo cuando fue posible) las que se colocaron juntas en un frasco de Eppendorf estéril conteniendo bufer para PCR; estos frascos se guardaron a -20° C hasta que 5 a 10 días después se extrajo el Acido Desoxiribonucleico (ADN) presente en las mismas usandose Kits QIAmp (QIAGEN, 9600 De Soto Avenue, Chatsworth, CA 91311, USA) siguiendo la metodología descrita por el fabricante. El ADN extraido se guardo a -6-8° C, hasta que se procedió a correr el PCR. Adicionalmente se obtuvieron 1 a 2 biopsias del antro, cuerpo y fundus (cuando fue posible), de la primera porción del duodeno y de la región duodeno-yeyunal; todas ellas se fijaron en una solución buferada de formól al 10%, para su estudio morfológico e histopatológico. En un grupo de estos casos se guardaron biopsias del antro y cuerpo del estómago para su evaluación genómica. 1.4.6.5 Estudio morfológico de la mucosa duodeno-yeyunal (Steer HW, 1984): Se fotografió la superficie mucosa de las biopsisas correspondientes a la primera porción del duodeno y de la región duodeno-yeyunales (bien orientadas) a través de un microscopio tridimensional a x3, x10 y x30 magnificaciones. Las imágenes obtenidas a x10 se ampliaron procediendose a hacer un conteo de las distintas formas de vellosidades presentes en la biopsia duodenal y duodeno-yeyunal. Las formas de vellosidades consideradas fueron aquellas que se distinguieran claramente clasificándolas como en forma de dedo, de hoja o cerebroide. Estos conteos buscaban detectar y caracterizar alteraciones en la superficie de la mucosa duodenal y duodeno-yeyunal. 1.4.6.6 Estudio histopatológico de la mucosa Gástrica: Posterior a ser fotografiadas, las biopsias siguieron el proceso tradicional de fijación, deshidratación e inclusión en parafina. Las secciones histológicas coloreadas con Hematoxilina-Eosina y Giemsa se evaluaron a través de un microscopio de luz para determinar los siguientes parámetros (Schneider RE. Informe Final del Proyecto Foni-12-03; Dixon MF, et al, 1996):

1. Se reportó la presencia de cambios inflamatorios, atróficos, regenerativos así como de metaplasia intestinal gástrica y de cambios displásicos; cuando presentes, dichos cambios se gradaron visualmente como Leves, Moderados o Severos (Dixon MF, et al, 1996).

2. la presencia de H pylori se reportó como positiva o negativa. Cuando posible, se gradó la severidad de la infección gástrica (presente en una o mas regiones estudiadas) y la densidad bacteriana (0: Negativo, 1: <10 bacterias/campo, 2: 10-20/campo, 3: >20 bacterias/campo (Ver Anexo II).

1.4.6.7 Prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU): A todos los pacientes se les efectuó esta Prueba para detectar la presencia de infección gástrica activa por H pylori. La misma ha sido previamente validada (Schneider RE. Informe Final del Proyecto Foni-12-03) y se ha efectuado en grupos poblacionales (Schneider RE. Informe Final Proyecto Foni-32-05) evidenciando ser un medio diagnóstico no invasivo sencillo y confiable. Se efectuó después de un ayuno de 8 horas tomándose una muestra de aire espirado basal, dandole inmediatamente después al paciente, sea niño o adulto, una tableta conteniendo 50 mlg de 13C-Urea; 20 minutos después de la ingesta de la tableta se tomó la muestra post-dosis. Las dos muestras se guardaron en bolsas de Mylar, que es un plástico aluminizado que no permite la pérdida de los gases presentes en la muestra. La concentración de 13CO2 en ambas muestras se midió en un Cromatógrafo Infrarrojo reportandose el resultado como el ∆‰ de la

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diferencia entre la concentración presente en la muestra basal y la post-dosis (Schneider RE. Informe

Final del Proyecto Foni-12-03). La prueba se efectuó inmediatamente después de la toma de la muestra periodontal. Como se ha reportado que posiblemente la deglusión de bacterias orales ureasa positivas pueden dar falsos positivos de las 13C-PAU se repitió la prueba en la mayoría de las parejas niño-madre 2 a 4 semanas mas tarde. 1.4.6.8 Reacción en Cadena de la Polimerasa de Punto Final (PCR): El ADN extraído de las muestras del surco periodontal y de las biopsias de mucosa gástricas se mantuvieron a 6-8° C hasta su análisis por PCR. Para la detección y caracterización genotípica de Helicobacter pylori se usó el procedimiento Multiplex descrito por Chattopadhyay S y col (Chattopadhyay S, y col, 2004).

1.4.6.9.1 Procedimiento Multiplex: El mismo tiene como objetivo detectar por amplificación genética simultánea, los marcadores putativos o determinantes de virulencia del H. pylori : vacAs1, vacAs2; vacAm1, vacAm2 y CagA potencialmente presentes en las muestras tomadas de la región periodontal y de biopsia endoscópicas de la mucosa gástrica. Debido al elevando contenido bacteriano normalmente presente en el area periodontal, dichas muestras se extrajeron por un proceso de purificación y no solamente por ebullición. La Tabla 2 resume los Iniciadores o Primers usados en este procedimiento .

Tabla 2. Iniciadores o Primers presentes en el Sistema Multiplex usado

Región de ADN

amplificada

Nombre del

Iniciador

Secuencia del Iniciador Tamaño del

Amplicón vacA s1/vacA s2

VAI-F VAI-R

5'-ATGGAAATACAACAAACACAC-3' 5'-CTGCTTGAATGCGCCAAAC-3'

259/286

vacA m1/vacA m2

VAG-F VAG-R

5'-CAATCTGTCCAATCAAGCGAG-3' 5'-GCGTCAAAATAATTCCAAGG-3'

567/642

cagA cag5c-F cag3c-R

5'-GTTGATAACGCTGTCGCTTC-3' 5'-GGGTTGTATGATATTTTCCATAA-3'

350

A fin de evitar contaminación u otros problemas, el procedimiento se llevó a cabo en ambientes físicos distintos denominados tradicionalmente Cuarto Blanco, Gris y Negro. En el Cuarto blanco se procede a:

1. Mezclar, en un tubo de 1.5 ml, los ingredientes según la tabla preparada para el Master Mix (Tabla 3) y que en el caso del presente estudio fue para correr 19 tubos.

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Tabla 3. MASTER MIX

MARCA CONCENTRACION µl/tubo # de tubos

ul/Total

10 X Buffer Nova 10 X 5 19 95 DNTPs Invitrogen 2.5 mM 2.5 19 47.5 Primer 1: VAI-F Invitrogen 100 mM 1 19 19 Primer 2: VAI-R Invitrogen 100 mM 1 19 19 Primer 3: VAG-R Invitrogen 100 mM 1 19 19 Primer 4: VAG-F Invitrogen 100 mM 1 19 19 Primer 5: Cag 3R Invitrogen 100 mM 1 19 19 Primer 6: Cag 5F Invitrogen 100 mM 1 19 19 Agua HPLC 24.2 19 459.8 MgCl2 GIBCO 50 mM 2 19 38 TAQ NOVA 5 U/ml 0.3 19 5.7 Volumen Mezcla 40 19 Volumen Muestra 10 19 Volumen Total 50 19

2. Mezclar en el vórtex y luego centrifugar para que no quede mezcla en la tapadera y alicuotar en porciones de 40 uL por tubo de 200 uL, cuidando de colocarlos en hielo y trabajar lo más rápido posible para evitar dímeros de iniciadores.

En el Cuarto Gris: Usando guantes y bata del cuarto gris: Rotular los tubos según la lista de muestras 1. Agregar, en la campana, 10 uL de ADN de muestra al tubo correspondiente y mezclar en el Vortex 2. Correr un control negativo del cuarto blanco (agregar agua estéril del cuarto blanco en vez de muestra) 3. Correr un control negativo del cuarto negro (agregar agua estéril del cuarto negro en vez de muestra) 4. Correr los controles negativos de extracción como controles del cuarto gris. 5. Incluir entre las muestras los controles positivos conocidos para vacAs1, s2, vacA m1, m2 y cag A.

En el Cuarto Negro: Usando bata y guantes del cuarto negro 1. Colocar en el termociclador previamente programado de la siguiente forma:

a. 3 minutos a 94°C b. 35 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 55°C y 1 min a 72°C c. 10 minutos a 72°C d. Mantener a 4°C

2. Una vez terminada la corrida correr un gel que se ha preparado al 2% de agarosa con TBE 0.5x y que se mantuvo refrigerado hasta antes de inocular 3. Inocular en el primer pozo el marcador de peso molecular 4. Inocular en los pozos siguientes las muestras, incluyendo controles positivos conocidos 5. Inocular en los últimos pozos los controles negativos del cuarto blanco, gris y negro. 6. Inocular otro marcador de peso molecular en el último pozo 7. Correr por dos horas a 30-35 mAmp.

8. Al terminar de correr el gel, usando guantes colocarlo en el transiluminador y tomar un fotografía usando el cono y la cámara digital.

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En la Oficina 1. Editar la foto con el programa para colocar los nombres de las muestras, pesos moleculares de las bandas control 2. Interpretar y reportar los resultados, según el ejemplo siguiente

En cada corrida se agregaró a) una cepa de control estandar de H pylori que expresaba todos los marcadores analizados y b) una de las variedades de Ureasa producida por dicha bacteria. El método arriba descrito simplifica, abarata y acelera no solo la detección sino la tipificación del H pylori en biopsias de la mucosa gástrica sin tener que cultivar y aislar las cepas de la bacteria presentes en la misma. Sus características lo hacen también un excelente método para detectar y tipificar el H pylori presente en el material periodontal de donde, como se discutiera anteriormente, es muy dificil o casi imposible cultivar dicha bacteria.

1.4.6.9 Efecto de la aplicación topica de Clohexidina sobre el Hp periodontal: En 10 parejas niño-madre con H pylori peridodontal se evaluó si la aplicación tópica de clorhexidina (x2) producía algún efecto sobre dicha infección tomando una muestra adicional periodontal 1 semana después de la última aplicación..

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PARTE II

II.1 MARCO TEÓRICO 2.1.2 HELICOBACTER PYLORI :

Aspectos Genéticos:

El Helicobacter pylori es una bacteria espiralar, Gram negativa, y muy movil gracias a que

cuenta con 4 a 6 flagelos en uno de sus polos. Crece lentamente en un ambiente microaerofílico y en medios de cultivo especiales. Presenta una gran biodiversidad genética, situación que se ha hecho mas evidente al completarse el genoma de dos cepas de Helicobacter pylori: la 26695 y la J995; el primer genoma fue descrito y documentado en Inglaterra y el segundo en los Estados Unidos. En general el tamaño del genoma de esta bacteria oscila entre 1.6 y 1.73 millones de bases con un promedio de 1.67. Mientras que dicho tamaño es similar al del genoma del Haemophilus influenzae, equivale unicamente a una tercera parte del tamaño del genoma de la Escherichia coli. Figura 1. Características generales del Genoma del Helicobacter pylori (Tomb JF, et al,1997)

GenomaGenomadel H. pylori (1997)del H. pylori (1997)

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000

600,000

700,000

800,000900,000

1,000,000

1,100,000

1,200,000

1,300,000

1,400,000

1,500,000

1,600,000

11

1

CaracterCaracteríísticas Generalessticas Generales

•• 1,600 Segmentos abiertos 1,600 Segmentos abiertos (ORFs= Open(ORFs= Open--Read Frames)Read Frames)

•• Actividad MetabActividad Metabóólica Complejalica Compleja

•• Comparte sistemas de sobrevivencia Comparte sistemas de sobrevivencia de Anaerobios y Aerobiode Anaerobios y Aerobioss::Cisteina y GlutatiCisteina y Glutatióón para Oxidon para Oxido--ReducciReduccióónn

•• AdaptaciAdaptacióón Dinn Dináámica:mica:Mutaciones, Transferencia horizontal de ADN Mutaciones, Transferencia horizontal de ADN

•• Resistencia a AntimicrobianosResistencia a Antimicrobianosde tipo GenGenéética y no episomaltica y no episomal

•• Cada cepa contiene genes especCada cepa contiene genes especííficosficos

A la fecha se han secuenciado los genomas de 3 cepas distintas. Las mas estudiadas y usadas en estudios genómicos son las cepa 26695 (Tomb FL, y col, 1997) y la cepa J99 (Alm RA, et al, 1999).

5 En 1996 se completó el genoma de una tercera cepa.

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Ambas cepas a) se secuenciaron en forma separada, b) aunque los cromosomas de cada una están organizados en forma diferente, el tamaño del genoma y el orden de los genes en ambas cepas son muy semejantes, c) ambas cepas son también altamente virulentas (cagA+ y vacA+) y finalmente d) los genes son específicos para la cepa Helicobacter pylori no encontrándose genes homologos a los mismos en la biblioteca pública de datos genómicos (Alm RA & Trust TJ, 1999). Ambos genomas contienen dos copias de los genes 16S y dos juegos de los genes 5S-23S del RNA (Acido Ribo Nucleico) ribosomal [RNAr]. En contraste a otras bacterias, los genes RNAr del Helicobacter pylori no están situados en forma continua en el cromosoma, lo que sugiere que su regulación es mas compleja que la de las primeras. El genoma de la tercera cepa, HPAGI, fue reciente secuenciado por Oh JD, y col en 2006 siendo también virulento (Oh JD, et al, 20006). El mapa del Genoma6 de la cepa 26695 se completó en 1997 (Tomb FL, y col, 1997). La versión circular de dicho mapa se presenta en la Figura 1. En general tiene 1,667,867 pares de base y un contenido promedio de Guanina (G) y Citosina (C) del 38%; la Isla de Patogenicidad cag (PAI-cag) está flanqueada por 31 pares de base repetidas que parecen ser producto de una transferencia horizontal (Ver mas adelante). Además del mapa general se han sumarizado algunas de las características genéticas de dicha cepa en la parte derecha de la Figura 1 que son discutidas a continuación (Tomb FL, y col, 1997, Pareja A, 2002). Este mapa presenta 1, 600 Segmentos o marcos de lectura abiertos (Open-Reading Frames= ORFs)7 y 1,590 códigos secuenciales predecibles; adicionalmente se demostraron sistemas muy bien desarrollados con distintos objetivos:

1. Para implementar y sostener la marcada movilidad de la bacteria, 2. Para utilizar Fe++ 3. Para restrigir y modificar su ADN favoreciendo especialmente mutaciones regionales y la

tranferencia horizontal del ADN. 4. En la parte superficial de su membrana externa se encontraron también un gran número de

adhesinas putativas, lipoproteínas y proteinas que le permiten mantener una interacción muy compleja con su hospedero, muchas veces de carácter patogénico pero primordialmente de adaptación al mismo (Tomb FL, y col, 1997).

5. La capacidad del H pylori para sobrevivir en un ambiente con un pH acido (gástrico) se debe a que tiene la habilidad de establecer un potencial positivo en su membrana interna que reduce o anula el efecto del medio externo. Sin embargo su supervivencia no solo depende de esta característica ya que posee una variedad de mecanismos observados no solo en bacterias anaerobias sino también en las aeróbicas. Así, el análisis genómico de esta

6 Genoma es todo el material genético contenido en las células de un organismo en particular. En seres eucarioticas este término solo se refiera al ADN contenido en el nucleo organizado en cromosomas. Su nombre es un acrónimo derivado de las palabras gen y cromosoma propuesto por el investigador alemán Hans Winkler (1920). Al usar el término “genoma” se está haciendo referencia al genoma cromosomal ya que en las células eukariotas existe otro genoma adicional y diferente que es el genoma mitocondrial.Es importante tener en cuenta a) que el genoma no analiza la diversidad genética o polimorfismo de los genes de una especie y b) que las células diploides tienen 2 copias del genoma debido a tener pares de cromosomas homólogos. 7 Open Reading Frame (ORF= Marco de lectura abierto) En genética molecular un ORF es una porción del genóma de un organismo que contiene una secuencia de bases de largo variable y que tiene la capacidad potencial de codificar una proteina. Las areas de inicio y terminal de un ORF no son las mismas que las areas terminales que presenta el RNA mensajero (RNAm); sin embargo las areas terminales de los ORF forman parte de la secuencia general del RNAm.

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bacteria ha demostrado la presencia de varias lipoproteínas y por lo menos de 5 proteinas de la membrana externa (HopA a HopE) una de cuyas funciones es actuar como adhesinas ayudando a mantener a la bacteria adosada a la superficie epitelial gástrica (Logan RPH, 1996). Existen otras proteinas denominadas BabA1, Bab2, y BabB que son también proteinas de superficie codificadas por genes putativos que llevan el nombre de las mismas. La mayoría de las proteinas antes mencionadas interactuan con los receptores de las células epiteliales del hospedero pudiendo modificar el curso de la enfermedad sin alterar los niveles de colonización bacteriana (Ver adelante).

6. Todas las cepas de H pylori comparten la característica bioquímica de producir grandes cantidades de Ureasa. Esta enzima se encuentra en la superficie y en el citoplasma del H pylori representando aproximadamente un 5% del total de las proteinas celulares de la bacteria; posee un peso molecular de 600 kDA y la codifican 7 genes denominados ureA a ureG de los cuales los mas importantes son el ureA y ureB. Esta enzima no solo es necesaria para que la bacteria pueda colonizar el epitelio gástrico, sino también su presencia es la base de distintas pruebas diagnósticas incluyendo la Prueba de Aliento usando 13C-Urea (Ver informe del Proyecto Foni – 32 – 05).

7. Finalmente el desarrollo de resistencia a antibacterianos y antibióticos es de naturaleza genética (mutacional) y no episomal como sucede en la mayoría de las otras bacterias.

Todas las características antes mencionadas le permiten al H pylori desarrollar una actividad metabólica muy compleja y adaptarse dinámicamente al medio ambiente gástrico de cada hospedero. Esto hace que cada variedad de H pylori sea diferente a las demás aunque sin perder los genes específicos para la cepa (cepa-específicos). 2.1.2.2 Islas de Plasticidad, Islas de Virulencia y Marcadores putativos de Virulencia: El genoma bacteriano evoluciona a través de mutaciones, re-arreglos entre genes y la transferencia genética horizontal8. El genoma bacteriano resultante de todos estos procesos está formado no solo por los genes básicos sino también por un número de genes accesorios adquiridos por transferencia genética horizontal, los que juegan un papel importante en la diversificación y adaptación bacteriana, influyendo de manera significativa en la plasticidad bacteriana (Juhas M, et al,

2009). El grado de plasticidad--o sea la capacidad que tiene una bacteria dada para modificar su forma, estructura funcional y aun genómica, con el fin de adaptarse mejor al ambiente en que viven -- es variable. En las bacterias patógenas determina el grado de patogenicidad de las mismas. Los genes accesorios generalmente forman bloques genéticos llamados Islas Genómicas9; estas son de tamaño variable, pensandose que su formación contribuye a la diversificación y la adaptación de los microorganismos. Las mismas juegan también un papel importante en la diseminación de la resistencia a los antibióticos, la presencia de factores determinantes de virulencia y la formación de vías o mecanismos relacionados con procesos catabólicos (Juhas M, et al, 2009).

8 Transferencia genética horizontal (o lateral): proceso por el que un organismo vivo incorpora a su genoma material genético de otro organismo vivo sin ser un descendiente del segundo. La transferencia genética vertical sucede cuando el material genético que recibe procede de sus progenitores, de un ancestro o de la especie a la que pertenece. 9 En algunos textos se encontrará también el nombre de Zonas de Plasticidad (Plasticity Zones) haciendo referencia a la Plasticidad Genómica ya descrita.

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El mecanismo mas comúnmente utilizado en los procesos arriba descritos es la Variación genética de fases (Phase variation). Este mecanismo les permite a los microorganismos lograr una amplia diversidad entre cepas y/o especies la que tiene como objeto alcanzar una mejor adaptación a un nicho dado; además, este proceso está también fuertemente asociado a los determinantes de virulencia presentes en las bacterias patógenas. La Variación genética de fases se lleva a cabo en areas definidas del genoma o Islas genómicas como se mencionó antes. En las bacterias patógenas algunas zonas de dichas Islas, o Islas completas, pueden dedicarse primordialmente a la codificación10 de factores de virulencia llamandose en general Islas de Patogenicidad. Distintos factores de virulencia presentes en las bacterias como adhesinas, toxinas, sistemas de secreción de proteinas, sistemas de captura de hierro y otros, pueden codificarse en dichas Islas (Hacker J & Kaper

JB, 2000). La codificación de dichos factores puede influir en la respuesta del organismo hacia la infección; tal es el caso de la capacidad de virulencia de la Brucella spp, que depende si su fenotipo de lipolisacáridos produce el tipo liso (virulento) o rugoso (no virulento) (Rittig MG, et al, 2003). Muchos de los genes accesorios involucrados en la variación de fases no están claramente demostrados o se desconoce parcial o totalmente la o las proteinas que codifican; en estos casos se les llama Genes Putativos11 o Supuestos Genes. El H pylori recurre a este mecanismo frecuentemente presentando un amplio repertorio de genes capaces de modificarse gracias a la variación de fases a nivel de las distintas cepas de la bacteria (Salaün L, et al, 2004). Aun cuando la prevalencia de la Infección Gástrica por H pylori es elevada, el número de individuos que llegan a desarrollar enfermedades gastrointestinales serias como úlcera péptica (gástrica o duodenal), adenocarcinoma gástrico o MALTomas es reducido; según algunos autores es alrededor del 20% (Yamaoka Y, 2008). Se considera que el desarrollo de dichas enfermedades resulta de la interacción entre el grado de virulencia de la(s) cepa(s) infectante(s), las características genéticas del hospedero y factores ambientales. Un ejemplo frecuentemente mencionado es el de los individuos con antecedentes familiares de Ca gástrico en quienes la presencia de infección gástrica por H pylori aumenta el riesgo de desarrollar dicha neoplasia (Miehlke S, et al, 2000). De aquí que se siga investigando simultáneamente el papel que juegan los factores o marcadores putativos de virulencia conocidos y la búsqueda de nuevos marcadores putativos. Todo esto, con el objeto de aprender más sobre la fisiopatología de la infección y de determinar aquellos marcadores putativos que tengan una mayor asociación con las enfermedades gastrointestinales antes mencionadas. Los criterios para considerar un factor de virulencia del H pylori como marcador específico de una enfermedad (disease-specific o marcador patogénico) incluyen el que el mismo tenga credibilidad biológica y que sea epidemiológica y experimentalmente consistente en su asociación con la enfermedad o enfermedades evaluadas (Graham DY & Yamaoka Y, 2000). De aquí que la mayoría de los genes estudiados hasta le fecha se les consideren como marcadores putativos de virulencia y patogenia. Los genes putativos de virulencia del H pylori que se han reportado hasta la fecha y que

10 Se refiere a la Codificación genética. El código genético es una serie de secuencias que permiten a las células “traducir” la información genética codificada en el material genético (ADN y ARN) en proteinas (McKee T & MacKee JR, 2003). 11 Gen Putativo (Supuesto gen): es un fragmento de ADN que se piensa es un gen en base a su secuenciación y del que no se conoce(n) la(s) proteina(s) que produce o cual es la función que debe(n) cumplir dicha(s) proteina(s) una vez expresada(s).

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posiblemente jueguen algún papel en el desarrollo de patología gastroduodenal severa, pueden clasificarse en tres categorías: Tabla 1. Factores-Marcadores putativos de Virulencia del H pylori Categoría Status de identificación del ADN

genético (Gen) Factores Mayores de Virulencia

Genes Específicos de la Cepa H pylori

Gen Positivo o Negativo Isla de Patogenicidad cag (PAI-cag) Regiones o zonas de Plasticidad

Genes de Variación de fase

Gen positivo; algunos producen proteinas funcionales y otros no.

oipA, sabA, babA

Genes c estructuras/ge-genotipos diferentes

Gen positivo pero la función y/o los niveles de producción son diferentes entre las distintas cepas

Genotipos de vacA (combinaciones de s1/s2 y m1/m2) Genotipos de IceA (1 y 2)

(Modificada de Yamaoka Y, 2008)

El primer grupo, constituido por genes cepa-específicos solo está presente en algunas cepas de H pylori. El mas estudiado corresponde a la PAI-cag que contiene alrededor de 30 genes incluyendo al gen cagA, localizado en la region 3´ del extremo de la isla, que codifica una proteina citotóxica (cagA) y posiblemente otras proteinas (Yamaoka Y, 2008). Alrededor del 60% de estas cepas producen proteinas codificadas por genes localizados en dicha isla de patogenicidad denominada cag (PAI-cag) (Cecini S, et al, 1996). Esta isla tiene un tamaño aproximado de 40 kb teniendo características semejantes a las islas de patogenicidad presentes en la E. coli, Salmonella spp. y Yersinia spp. Distintos genes de la PAI-cag, como el picB, producen proteinas que aumentan la virulencia de la cepa estimulando la producción de Isoleucina 8 por parte de las células epiteliales gástricas y el grado de inflamación tisular (Shimoyama T, et al,1997); adicional a esto, hay genes en dicha isla que codifican un sistema secretorio tipo IV el que puede traslocar la proteina cagA al interior de la célula epitelial gástrica (Odenbreit S, et al, 2000). Figura 2. Isla de Patogenicidad del Helicobacter pylori.

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Estadísticamente las cepas que contienen PAI-cag tienen mayor tendencia a asociarse a la Ulcera duodenal y Ca gástrico que las que no lo tienen (Blaser MJ, et al, 1995). El segundo grupo lo constituyen genes putativos con “capacidad de variación genética de fases” los que están localizados en otras regiones de plasticidad donde se encuentran más de la mitad de los genes cepa-específicos. Estos genes constituyen buenos candidatos a ser considerados Marcadores putativos de Virulencia. Entre los mismos se pueden mencionar los 6 genes que codifican las proteinas de la membrana externa de la bacteria oipA, sabA, sabB, babB, babA y hopZ; entre ellos el oipA sabA y babA se han encontrado asociados a úlcera péptica y Ca gástrico (Yamaoka Y, 2009). Finalmente el tercer grupo lo constituyen genes con estructura/genotipo variables siendo el mas conocido el gen vacA caracterizado por codificar una toxina vacuolizante de 93-kDa producto del par de bases 3933 localizado en un ORF del gen vacA (Atherton JC, et al; 1995); esta toxina es excretada por el H pylori y daña las células epiteliales (Cover TL, 1996; van Doorn L-J, et al,1998). El gen que codifica dicha proteina citotóxica fue clonado en 1994 denominandosele vacA (Pareja C, 2002). Entre los alelos que codifica el gen están el s1 (a, b y c) y el s2 así como el m1 y m2 (posiblemente hay también subtipos de estos últimos); el mosaicismo con que se presentan los alelos mencionados implica que ocurren distintas recombinaciones in vivo de los mismos (Atherton

JC, et al; 1995). La mayoría de las veces se determinan los alelos s1/s2 y m1/m2 lo que limita la capacidad discriminativa cuando se estudia la distribución geográfica de las cepas de H pylori (van

Doorn L-J, et al,1998). En términos de patogenicidad las cepas vacA s1/cagA(+)12 son las mas patógenas y las cepas vacA s2/m2/cagA(-) las menos patógenas (van Doorn L-J, et al,1998); las primeras teniendo relación significativa con ulcera duodenal y en menor grado con Ca gástrico. La presencia de cagA se asocia significativamente con la presencia de vacA s1 por lo que algunos consideran que uno es un subrogante del otro (van Doorn L-J, et al,1998; Graham DY & Yamaoka Y, 2000).

En el tercer grupo se encuentran también dos genotipos IceA diferentes: el IceA1 y el IceA2; mientras que el IceA1 es homólogo al gen que codifica la endonucleasa NIaIIIR en la Neisseria lactamica, el IceA2 no tiene homología conocida (Figueiredo C, et al, 2000). La expresión de estos genotipos es inducida por el contacto del H pylori con el epitelio gástrico del ser humano y puede estar asociado a la presencia de úlcera duodenal (Peek RM, et al, 1996). La virulencia de las distintas cepas de H pylori hasta ahora aisladas se ha medido en base a la habidilidad que tengan para producir una proteina citotóxica (CagA) y/o una citotoxina vacuolizante (VacA) (Labigne A & de Reuse H, 1996). Adicionalmente se ha buscado si alguno o un grupo de los factores-marcadores putativos de Virulencia del H pylori (MPV) era también un marcador para la presencia de alguna de las enfermedades GI arriba mencionadas (Disease-specific). Desde las primeras publicaciones en que se buscaron asociaciónes de este último tipo fue evidente de que las mismas no eran consistentes; LJ,VanDoorn y colaboradores reportaron en 1998 que aproximadamente 25% de los pacientes con gastritis por H pylori que no tenían úlcera duodenal estaban infectados con cepas consideradas no solo altamente virulentas sino que tenían una asociación significativa con esta última. Una década después, y a pesar de un gran número de estudios, no se ha encontrado que alguno de los MPV sean especificos para alguna de las enfermedades GI relacionadas con la infección gástrica de dicha bacteria (Graham DY & Yamaoka Y,

12 generalmente son IceA(+) también.

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2000). Lo más probable es que en la patogenia de dichas enfermedades jueguen un papel importante factores ambientales y las características genéticas del hospedero. 2.1.2.4 Etiopatogenia – relación con Neoplasias gástricas La infección gástrica por Helicobacter pylori produce un tipo de gastritis conocida como Gastritis Crónica Activa ya que histologicamente se encuentran grados variables de inflamación crónica y aguda así como de cambios regenerativos; este tipo de gastritis juega también un papel etiopatogénico importante en las úlceras duodenal y gástrica, en el desarrollo del adenocarcinoma gástrico de tipo intestinal y de el linfoma gástrico primario tipo MALToma constituido primordialmente por linfocitos gástricos tipo B13. Se considera que la cronicidad de la infección y del fenómeno inflamatorio y regenerativo epitelial gástrico, llevan al daño estructural y fisiológico que, fuera de comprometer el funcionamiento normal de la mucosa gástrica pueden inducir con el tiempo cambios pre-malignos en la misma. A la decisión de la Organización Mundial de la Salud (OMS) tomada en 1994 de incluir al H. pylori como un Carcinógeno Tipo I para el ser humano (IARC Monographs, WHO,

1994) le han seguido una serie de reportes, publicados desde esa fecha a la actual, en que se discute esta relación. En el meta-análisis publicado por el Grupo Colaborativo “Helicobacter y Cáncer” en el 2,001 se encontró que los individuos con evidencia histológica de la infección por dicha bacteria tenían un riesgo 6 veces mayor de desarrollar AdenoCa Gástrico (tipo intestinal) diez años mas tarde que aquellos que no tenían la infección (Helicobacter and Ca Colaborative Group, 2001). También se ha calculado que el riesgo (chance) de tener un Ca gástrico en la población del Japón que está infectada con H pylori es aproximadamente 6 veces mayor que la no infectada; este riesgo se eleva hasta 15 veces más en aquellos casos con edades menores de 40 años y que presentan la infección (Kikuchi, et al 1999). Por el otro lado, la tasa de Cáncer Gástrico en la mayoría de los países pobres del mundo es muy elevada; dicha tasa es aun mayor entre las poblaciones pobres que presentan una alta prevalencia de la infección por H. pylori en niños menores de 5 años (Eslick GD, et al,1999; Malaty HM & Graham DY, 1994). Estudios efectuados en ratones C57BL/6 infectados con cepas de H pylori y H felis demostraron el desarrollo de cambios epiteliales sucesivos hasta llegar a desarrollar un Adenocarcinoma Gástrico (Cai X, et al, 2005) como aparentemente sucede en el ser humano (Houghton JM & Wang TC, 2003). La relación etiopatogénica entre el H. pylori y el MALToma gástrico está bien documentada (Wotherspoon AC, et al, 1997), y varios estudios han demostrado también que este tipo de linfoma gástrico ha presentado una remisión completa poco tiempo después de haber sido erradicada la infección por H pylori con antibióticos (Asaka M & Dragosics BA, 2004; Kim JS, et al, 2007).

13 Marshall BJ &Warren JR; 1994; Jones DM, et al, 1984; Tytgat GNJ & Rauws EAJ, 1990; Steer HW, 1984; Graham DY, 1989; Eslick GD, et al,1999; Wotherspoon AC, et al, 1997

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2.1.2.5 Epidemiología: La infección gástrica por Helicobacter pylori afecta a un segmento importante de la población mundial (Graham DY, 1994) y aunque su patogenia es de carácter multifactorial (Peterson PL,

1991), su prevalencia está principalmente condicionada a factores que afectan la evolución de la misma en mas de un sentido. Entre los mas importantes estan:

1. una pobre condición socioeconómica, de saneamiento, higiene y hacinamiento (Graham DY,

1994); 2. la primoinfección durante la infancia (Blecker U,1996 ) que parece jugar un papel importante

en el curso clínico de la enfermedad [debe recordarse que la mayoría de los niños infectados no presentan síntomas] (Farthing MJG 1998); y

3. la perpetuidad de la infección la que durará toda la vida a menos que se le erradique con la administración terapéutica específica o fortuita de antibióticos a los que dicha bacteria sea sensible (Peterson WL, 1991; Malaty HM & Graham DY, 1994).

La asociación de dichos factores puede influenciar el curso y desarrollo de la infección. Así se considera que la infección a edades tempranas reduce las posibilidades de infección en el adulto. Esta situación podría estar cambiando ya que, como fuera sugerido años atrás (Goodman KJ &

Correa P, 1995), la distribución etarea de la infección se está modificando en países industrializados a medida que se reduce la transmisión entre grupos infantiles lo que implicaría un mayor riesgo de infección en la edad adulta. Sin embargo se ha encontrado que existe una relación inversa entre el riesgo de infección y la condición socio-económica en que vivió el individuo durante su niñez (Malaty HM & Graham DY, 1994); es decir que una condición de pobreza durante la infancia parece favorecer la infección con H pylori en el adulto. A pesar del serio impacto que causa la infección gástrica por H pylori, no se conocen claramente los mecanismos por los que dicha bacteria se transmite; esto ha limitado el desarrollo de programas de prevención efectivos. En las conclusiones de la mayoría de congresos y reuniones de expertos que abordan el tema, se enfatiza la necesidad de que se investiguen dichos mecanismos (Axon A, 2002). No existiendo evidencia de un reservorio natural fuera del hombre y habiendose descartado la transmisión por vía respiratoria y sanguinea queda solamente la vía oral. Teoricamente muchas características morfológicas de la bacteria así como sus complejas necesidades para poder subsistir, la hacen una mala candidata para que sea la causante de una infección tan frecuente. Entre estas características se pueden mencionar:

1. Su alta especificidad por la mucosa gástrica y estricta microaerofilia, que le impiden sobrevivir en un medio ambiente que no sea el gástrico (Farthing MJG, 1998) y

2. La falta de una forma o estadío bacteriano resistente al ambiente externo y con capacidad para producir infección en el ser humano cumpliendo con los postulados de Koch. Es necesario aclarar que todavía se discute si la forma cocoide del H pylori es capaz de producir infección en el ser humano. Mientras que dicha forma no ha sido capaz de transformarse a la forma bacilar original en medios de cultivo específicos (Bode G, et al, 1993), otros autores reportan haber logrado inducir infección gástrica por H pylori en ratones a los que inocularon formas cocoides (She FF, et al, 2003). Es muy posible que esta disparidad en resultados sea debida al diferente grado de viabilidad de las formas cocoides; esto ha sido

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documentado al seguir la trasformación de la forma helicoidal en cocoide con el microscopio electrónico (Saito N, et al, 2003).

3. Compensando sus aparentes desventajas para ser el patógeno que afecta a mas del 50% de la población adulta mundial, existen también datos fidedignos de su persistencia a través de los siglos; así se ha reportado la recuperación de ADN de H pylori del estómago de una momia encontrada en México que data mas o menos del año 1,350 AD. (Lopez-Vidal Y et al,

BioMed Central´s open access journal, BMC Microbiology). Siendo un sobreviviente, su genoma es complejo y con muchas características especiales que parecen estar diseñadas para que el H pylori se adapte a cada ser humano que infecta (Tomb JF, et al, 1997; García C, et al, 1999; Kersulyte D,

et al, 2000).

En Guatemala, como en otros países en desarrollo, la seroprevalencia de anticuerpos IgG

contra el H pylori en niños de condición socioeconómica baja es significativa desde la primera década de su vida (Oregel SE, 2002 ; Afre JR & Flores LE, 2004) (Figura 3) En contraste con los recién nacidos, en quienes dichos anticuerpos son del tipo pasivo (debido a su transmisión transplacentaria de la madre al niño), la persistencia y elevación progresiva de la tasa de seroprevalencia desde el primer año de vida a los 9-10 años de edad refleja el contacto de estos niños con dicha bacteria (Oregel SE, 2002 ; Afre JR & Flores LE, 2004). Durante esta primera década la tasa de Infección se eleva significativamente, encontrandose que los niños de 9 años de edad presentan una tasa de seroprevalencia del 65.7%, valor muy semejante al 68.2% demostrado en adultos jovenes del mismo nivel socioeconómico (Oregel SE, 2002 ; Afre JR & Flores LE, 2004).

Además de la edad, otros factores epidemiológicos demostraron estar significativamente

relacionados con la elevación de la tasa de seroplevalencia observada; así se encontró una relación estadística significativa con distintas situaciones que facilitan o elevan el grado de contaminación oral (dentición, introducción temprana de alimentos preparados fuera de casa, contacto prolongado con otros niños en ambientes diferentes a la casa) asi como pobres condiciones higiénico-sanitarias del hogar (uso de recipientes para guardar agua y hacinamiento) (Schneider RE, et al; 1981; Oregel SE, 2002

; Afre JR & Flores LE, 2004). El 63% de escolares de primer año primaria que asisten a las escuelas nacionales de los

municipios de Guatemala (7-9 años de edad) presentan infecciòn gàstrica activa por H pylori (Schneider RE. Informe Final Proyecto Foni-32-05). Fuera de confirmarse la relación estadísticamente positiva con los factores epidemiológicos antes mencionados se demostró que niños con diarrea persistente tanían 2.7 veces mas probabilidad de tener la infección gástrica que niños sin diarrea (Schneider RE.

Informe Final Proyecto Foni-32-05). Este asociación es muy importante y amerita que se evalúe la presencia de daños morfológicos en la superficie gástrica y duodenoyeyunal en pacientes con infección gástrica activa por H pylori, cambios que pdrían favorecer la malabsorción subclínica frecuentemente observada en niños y adultos de condición socio económica baja en nuestro país (Viteri FE & Schneider RE, 1974; Schneider RE, et al, 1981).

Tasas de infecciòn gástrica activa por H pylori semejantes y aun mayores (89 %) se han

detectado en adultos dispèpticos de una condiciòn socioeconòmica semejante a los primeros (Schneider RE, et al, 1994). Estos últimos individuos presentaron también una mayor frecuencia de cambios displásicos premalignos que sujetos dispépticos de condición socioeconómica alta (Schneider RE, et al, 1994). Como es sabido el Cáncer gástrico ocupa un lugar prominente entre los tipos

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de cáncer que afectan a la población adulta de Guatemala ocupando el primer lugar en el hombre y el segundo en la mujer inmediatamente por debajo del Ca del Cervix (Schneider RE, et al, 1994). Según la última encuesta publicada por la OMS, cubriendo hasta el año 2005, el Cáncer Gástrico ocupa el primer lugar entre las 10 causas principales de muerte por Cáncer en adultos, hombres y mujeres, Guatemaltecos (www.who.int/ WHO Global Infobase ) Figura 3 Prevalencia de anticuerpos séricos IgG contra el Helicobacter pylori en mujeres embarazadas, recién nacidos y niños Guatemaltecos entre 0 y 10 años de edad de baja condición socioeconómica (RE Schneider, et al, 2009 (imprimiendose)

0

10

20

30

40

50

60

70

A B C D E F G H I J K L M N O

A: A: PregnantPregnant WomenWomen D: D: 77--12 12 monthsmonths G:G: 2525--30 30 monthsmonths J:J: 44--5 5 yearsyears M:M: 77--8 8 yearsyearsB:B: NewbornNewborn E: E: 1313--18 18 monthsmonths H:H: 3131--36 36 monthsmonths K:K: 55--6 6 yearsyears N:N: 88--9 9 yearsyearsC:C: 00--6 6 monthsmonths F: F: 1919--24 24 monthsmonths II:: 33--4 4 yearsyears L:L: 66--7 7 yearsyears O:O: 99--10 10 yearsyears

P

E

R

C

E

N

T

A

G

E

Figure 1. Figure 1. PrevalencePrevalence ofof serumserum IgGIgG antibodiesantibodies againstagainst HelicobacterHelicobacter pyloripylori in in GuatemalanGuatemalan lowlowincomeincome pregnantpregnant womenwomen, , newbornnewborn andand childrenchildren betweenbetween 0 0 andand 10 10 yearsyears ofof ageage

2.1.2.3 Mecanismos de Infección: Transmisión. Metodos genéticos recientemente desarrollados ofrecen aclarar o ampliar nuestro conocimiento sobre el o los mecanismos de transmisión de esta bacteria. Dichos métodos permiten detectar y tipificar el material genético del H pylori presente en muestras de diferente origen como agua, suelo y otros componentes del medio ambiente, cosa que antes no era posible (Sasaki K, et al,

1999). Desde el punto de vista metodológico las muestras se someten a una separación inmunomagnética previo a analizarlas por PCR; este proceso de separación permite eliminar cualquier inhibidor de la polimerasa presente en las muestras, a la vez que favorece la concentración de bacterias, o de su material genético, con lo que mejora sensiblemente la sensibilidad y especificidad de la PCR (Sasaki K, et al, 1999; Enroth H & Engstrand L, 1995); por el momento esta metodología está en etapa experimental. Existen otros métodos de llevar a cabo la PCR con una tecnología mas simple y barata que la antes descrita. Los mismos se circunscriben a detectar la presencia de marcadores putativos o factores de virulencia presentes en distintas cepas de

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Helicobacter pylori. Estos métodos han probado ser fidedignos y suficientemente sensibles para permitir el análisis de la biodiversidad genómica de esta bacteria (Chattopadhyay S, y col, 2004; Kersulyte D,

et al, 2000). Uno de estos métodos fue el utilizado en este proyecto. En la actualidad se considera que la transmisión de esta bacteria debe ser de persona a

persona ya que no se conoce otro reservorio natural para el H pylori mas que el mismo ser humano14. Hasta ahora, la evidencia con que se cuenta favorece la hipótesis de que las vías de transmisión mas probables serían la vía oral–oral en países desarrollados y fecal–oral u oral-oral en las paises en vías de desarrollo (Berroterran A, et al, 2002). El encontrar grupos familiares serologicamente positivos sugiere que existe transmisión individuo-individuo dentro de la familia (Drumm B, et al, 1990; Malaty HM, et al, 1994); sin embargo este mecanismo no puede explicar por si solo la alta prevalencia de infección gástrica.

La elevada tasa de infección a nivel mundial contrasta con las multiples dificultades que se

tuvo que superar para lograr infectar experimentalmente a los únicos dos voluntarios reportados en la literatura (Marshall BJ, et al, 1985; Morris A & Nicholson G 1987; Morris AJ, et al, 1991). Estos individuos se infectaron solo cuando se usó un inóculo en el orden de 105-9 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) de formas bacilares de H pylori viables, siempre que su administración estuviera precedida de hipocloridria inducida con la administración oral de Cimetidina (Marshall BJ, et al, 1985;

Morris A & Nicholson G 1987). A esto debe agregarse el carácter microaerofílico del H pylori, que limita seriamente la sobrevivencia de la bacteria en ambientes naturales.

Otro interrogante sin resolver es cual es la tasa real de reinfección gástrica por H pylori

versus la reactivación de dicha infección después un “tratamiento de erradicación”. Es muy facil confundir una con otra. Por un lado, en la reinfección el tratamiento logró erradicar la infección original y el individuo se volverá a infectar; por el otro, en la reactivación es la misma infección original que después de un período de supresión, inducido por el tratamiento, vuelve a reactivarse.

Si solo existe un reservorio contaminante, la reinfección estará condicionada por la tasa de

infección que existe en una población dada, así como por el grado de inmunidad natural y adquirida que tiene cada individuo (Parsonnet J, 2003). De aquí que la literatura mundial reporte una tasa de reinfección mayor en países en vías de desarrollo (Soto G, et al, 2003; Gunaid AA, etal, 2004; Gottrand F

& Vincent P, 2005) que en países industrialzados (Gisbert JP, et al, 2002 ; Knipping C, et al, 2002). La reactivación, por el contrario, estará relacionada a la eficacia del tratamiento administrado y a la resistencia de la cepa(s) infectante(s) (Gisbert JP, 2005). Para diferenciar ambas situaciones es necesario efectuar estudios genómicos y que los mismos se hayan efectuado antes de dar el tratamiento y repetirlos post-tratamiento (Soto G, et al, 2003; Gisbert JP, 2005). Esto podría responder la interrogante planteada (reinfección vrs reactivación) si no fuera por el hecho que investigaciones recientes apuntan a que además del reservorio gástrico existe otro reservorio de H pylori en la región periodontal.

14 El reporte inicial de que el mono rhesus era un reservorio natural de dicha bacteria (Baskerville A & Newell DG, 1988) no pudo ser confirmado posteriormente.

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2.1.3 LA REGIÓN PERIODONTAL, LA PLACA DENTAL Y EL H PYLORI La cavidad oral del ser humano es un ecosistema muy complejo que contiene un gran

numero de bacterias que la colonizan dando origen a un ambiente muy dinámico y cambiante. Al igual que lo que sucede en el resto de la superficie mucosa del tracto GI, la relación entre el hospedero y estos microorganismos produce, a través del tiempo, una interacción balanceada donde las celulas de la mucosa oral y las células bacterianas co-existen infligiendose el menor daño posible unas a otras. Este balance se traduce en un estado de buena salud oral. Será necesario que dicho balance se pierda para que se desarrolle un estado de enfermedad. Esta última podría considererse, por lo tanto, como la resultante de la perdida del balance normal hospedero-microroganismo a nivel celular y molecular.

Figura 4. Etapas en la formación de Biofilms bacterianos

Sitios de adherencia bacteriana en la superficie de

la mucosa gastrointestinal

Adherencia de la primera especie

Co-adherencia de otras especies

Micro-colonias

Biofilms

Figura Etapas en la formación de Biofilms bacterianos

Esta co-existencia es posible gracias a estructuras como los Biofilms, que aunque comunes

a toda la mucosa gastrointestinal y respiratoria, se encuentran mas frecuentemente en la boca e Intestinos delgado y grueso. Los biofilms se forman por la adherencia de bacterias a la superficie epitelial de la mucosa GI. y juegan un papel muy importante en la coexistencia de las bacterias y la célula epitelial de dicha mucosa. La Figura 5 muestra en forma esquemática la formación de los biofilms bacterianos siendo la etapa inicial de los mismos la adherencia de una primera especie la que posteriormente favorece la colonización de otros microorganismos en un proceso de co-adherencia a la primera especie ya adherida hasta llegar a formar microcolonias y finalmente biofilms. El tipo de proteinas y polímeros secretorios presentes en el moco que cubre la mucosa gastrointestinal juega un papel muy importante en la adherencia inicial de dichas bacterias

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constituyendo una barrera a la colonización de ciertas bacterias y favoreciendo la adherencia de otras (Kleesen B & Blaut M, 2005) Como se ve mas adelante en dicho biofilm pueden encontrarse distintas proteinas, minerales y azúcares que ayudan a generar un ambiente favorable para el crecimiento de ciertas especies bacterianas, algunas de ellas consideradas patógenas.

En estos biofilms la intercomunicación entre la microflora, el epitelio, el sistema

inmunológico y el sistema neuroendócrino GI es compleja y dinámica, pudiendo variar de un habitat a otro (Savage DC, 1977). En el caso de la cavidad oral, las células del epitelio gingival constituyen la interfase entre los microorganismos de las microcolonias y el hospedero. Como ya se mencionara antes la interacción entre las celulas de la mucosa oral y las células bacterianas mantiene un balance favorable para que se mantenga un estado oral saludable.

Las células epiteliales de todo el tracto GI son capaces de responder a nivel

transcriptacional a la influencia y/o acciones de las bacterias; esto no solo sucede a nivel intestinal sino tambien en la cavidad oral (Handfield M, et al, 2008). Dicha respuesta puede medirse usando tecnología de microformaciones de ADN (DNA Microarray Technology) la que ha permitido visualizar en parte la respuesta genómica de dichas células a cambios en su ambiente intra y extracelular. En otras palabras ha permitodo monitorear el diálogo molecular entre el hospedero y las celulas bacterianas (Mans J, et al, 2006). De esta manera se ha determinado que, igual a lo que sucede en el epitelio intestinal, la infección de las celulas epiteliales de las encías y boca por especies microbianas con diferente potencial patogénico inducen repuestas diferentes cualitativa y cuantitativamente.

Esta situación afecta la expresión y actividad de diversas proteinas que son necesarias para

distintas funciones citoplásmicas y de las microorganelas de la célula epitelial. Algunas de estas proteinas son la Actina, Tubulina, Vimentín, Profilin, Filamin, Fibrina/Plastina y otras relacionadas con la función inmune, la forma y motilidad celular, los movimientos cromosómicos y de las organelas y la fagocitosis (Handfield M, et al, 2008). Un ejemplo de estos mecanismos tan diferentes se presenta en la Figura 6 en la que se esquematiza la forma como penetran la Salmonella, la Shigella y los Treponemas la pared celular (Gruenheid S & Finlay BB, 2003). Cada una de estos microorganismos alteran o modifican la expresión de proteinas citoplasmáticas o de distintas organelas de tal forma que les facilita la penetración de la superficie externa celular para iniciar su actividad patogénica.

34

Figura 5. Forma como penetran diversos patógenos la pared externa de las células epiteliales : a) La entrada de la Salmonela está mediada por su Isla de patogenicidad SPI-1 que induce la activación del Sistema de Secreciones tipo III. Las uniones de la actina cortical de la célula se aflojan afectandose después la actina y otros de los componentes superficiales hasta que los rearreglos inducidos permiten formar una vacuola intracelular que aloja la bacteria; b) La entrada de la Shigella es semejante a la primera pero la segunda desestabiliza los microtubulis citoplásmicos produciendo una cascada de cambios que incluyen filopodia y formación lamelar en las cercanías de la bacteria hasta formar una vacuola intracelular; c) Los tripoanosomas inducen un aumento de calcio intracelular lo que desestabiliza la actina cortical induce alteraciones microtubulares y fusión de lizosomas a la membrana plasmática hasta que se forma una vacuola. (Gruenheid S & Finlay BB, 2003)

Estudios muy detallados usando la tecnología mencionada anteriormente han demostrado

que existen cambios mas complejos que ocurren una vez que las bacterias han entrado a la célula. Se sugiere revisar las referencias mencionadas en la monografía de Handfield M et al.

2.1.3.1 Biofilm Gingivodental o Placa Dental: El biofilm gingivo dental, o placa dental, es primordialmente una colección de

micoroorganismos embebidos en una matriz intercelular de compuestos orgánicos (como glicoproteinas) e inorgánicos (como Ca y otros minerales) (Dye BA et al, 2002). La matriz del biofilm preserva y promueve la ecología bacterian entre las que se encuentran bacterias simbióticas (cuando ambas partes, bacteria y hospedero, se beneficiaan de dicha relación), parásitas (cuando el beneficio que ellas alcanzan es a costa del hospedero), comensales (cuando la bacteria se beneficia pero no afecta al hospedero) y patógenas (muchas de ellas sin ejercer su acción patogénica). La placa se forma en la región periodontal adhiriendose a la superficie dental no solo en su area supra sino también subgingival formándose rapidamente cuando no hay una buena

35

higiene oral. Con el tiempo se formarán cálculos que no son mas que formaciones calcareas cubiertas de este biofilm.

La placa bacteriana puede mejorar la sobrevivencia de algunas bacterias al proporcionarles

acceso a Urea que será hidrolizada por bacterias productoras de ureasa como distintas especias de los géneros Streptoccoccus spp, Haemophilus spp y Actinomyces spp (Dowsett SA & Kowolik MJ, 2003); este proceso también neutralizará el medio ácido del ambiente de la placa (Marquis RE, 1995). La Tensión de O2 en la región periodontal varía según la profundidad de los sacos subgingivales presentes. Dichos cambios parecen determinar la composición microbiológica de la región (Lowsche

WJ, et al, 1983). Así los niveles de tensión de O2 llegan a promediar 13.3 mm de Hg en la base de sacos que miden entre 5 y 10 mm de profundidad. En estas areas predominan distintas especies de bacterias anaeróbicas muchas de ellas relacionadas con la etiopatogenia de la Periodontitis. La tensión de O2 aumenta cerca de la superficie gingival donde se encuentran niveles >15mm de Hg. Es en estas regiones donde se han encontrado bacterias microaerofílicas como distintas especies del género Capnocytophagus y otras viviendo en la placa dental. Se ha considerado que estos biofilms no solo están involucrados con procesos infecciosos crónicos sino que también hacen a las bacterias que residen en el mismo mas resistentes a la acción de los antibióticos (Costerton JW, et al,

1999). La Figura 6 esquematiza como la placa dental puede favorecer un estado de periodontitis. Figura . Representación esquemática de la infección de un biofilm. a) Acción libre de los

macrófagos, antibióticos y anticuerpos en una superficie epitelial sin formación de biofilm; b) Biofilm bacteriano normal (la acción de los macrófagos, antibióticos y anticuerpos se lleva a cabo normalmente afuera del biofilm); c) Reacción inflamatoria a nivel del area del biofilm condición que atrae a los fagocitos al biofilm el que no pueden penetrar liberando enzimas fagocíticas y citokinas; d) Se ha instalado un proceso inflamatorio existiendo daño celular epitelial con contaminación del biofilm y migración hacia y desde este último al exterior de enteropatógenos.

ANTIBIÓTICOSANTICUER-

POSBACTERIAS PATOGENAL

MICROORG. BIOFILM

ENZIMAS FAGOCÍTICAS

36

2.1.3.2 La Región Periodontal [Placa dental] y el Helicobacter pylori:

Debido a su capacidad para mantener un ambiente microaerofílico relativamente estable, la región periodontal constituye un nicho biológico que puede ser colonizado por el H pylori ; esto ha sido documentado por varios investigadores (Oshowo A, et al, 1998; Allaker RP, et al, 2002; Madinier IM, et al,

1997) incluyendo a SA Dowsett y col. quienes reportaron la presencia de material genético de H pylori en la región periodontal de adultos y adolecentes de una aldea de Guatemala en 1999 (Dowsett

SA, et al, 1999). La prevalencia de la infección periodontal varía según la metodología usada. Las

dificultades en este aspecto se pueden considerar debidas a 1) la población estudiada, 2) la obtención de las muestras orales y 3) la metodología que se use para detectar la presencia de H pylori en las muestras colectadas: (Se encontrará una revisión bastante completa sobre estos temas en Dowsett SA & Kowolik MJ, 2003):

1. Población estudiada: hasta la fecha, la evidencia epidemiológica demuestra que la

prevalencia de infección gástrica por H pylori está relacionada con condiciones ambientales de pobreza y hacinamiento así como de saneamientos e higiene deficientes. En estos mismos ambientes las condiciones de salud oral son muy precarias (WHO Global

Infobase: www.who.int/infobase). Algunos reportes parecen sugerir que en grupos poblacionales viviendo en las condiciones descritas es frecuente encontrar material genómico periodental de H pylori.

2. Obtención de la muestra: en algunos artículos se obtuvo de solo algunas piezas dentales, otras de la mucosa oral, de las encías y/o lengua y saliva; los instrumentos usados para obtener las mismas también fueron diferentes: desde puntas de papel filtro, cepillos, hizopos o curetas esteriles. Algunos autores obtuvieron las muestras unicamente de formaciones saculares gingivodentales limitandose así a areas con gingivitis clínica.

3. Métodos para detectar la presencia de Helicobacter pylori: Los mas sencillos han consistido en efectuar:

• pruebas para detectar la presencia de ureasa en la superficie oral, gingival o lingual; sin embargo estas tienen poca especificidad debido a que frecuentemente se encuentran en estas superficies otras bacterias productoras de ureasa y

• pruebas de ELISA (Enzyme-linked Immuneosorbent Assay) en las muestras obtenidas.

Entre los métodos mas específicos están:

• El cultivo y aislamiento de la bacteria de las muestras obtenidas. Aunque sigue siendo el estandar de oro para demostrar la presencia de dicha bacteria, el cultivar el H pylori de la placa dental ha probado ser muy dificil o imposible para muchos autores (De Sousa L, et al, 2006; Hu W, et al, 2002). Esto posiblemente debido a la densa y compleja flora bacteriana oral que facilita el sobrecrecimiento microbiano en los medios de cultivo lo que hace

37

necesario muchas veces el uso de métodos moleculares para confirmar la identidad de la bacteria aislada. Se debe recordar que la forma cocoide del H pylori es un estadío dificil de estudiar y analizar (Ver secciones anteriores).

• Los Métodos moleculares han abierto la puerta a una investigación mas

satisfactoria. Especialmente los distintos métodos que utilizan la Reacción en Cadena de la Polimerasa, o PCR en inglés, que permiten detectar y evaluar la presencia de material genético de H pylori en la placa dental con relativa facilidad; sin embargo la frecuencia con que se demostró dicha bacteria por este método dependió de la cantidad de material obtenido del area periodontal (Madinier IM, et al, 1997; Berroteran A, et al, 2002). Además es importante usar primers de factores o marcadores putativos de patogenicidad del H pylori lo que cumple con el doble objetivo de demostrar la existencia de material genético de la bacteria y a la vez que el mismo corresponde a areas genómicas involucradas en la capacidad de virulencia del H pylori.

La mayoría de los autores considera que la presencia de H pylori en el area periodontal

juega un papel importante en la infección gástrica (Allaker RP, et al, 2002; De Sousa L; et al, 2006; Hu W, et al;

2002; Mishra KK, et al, 2002; Anand PS, et al, 2006; Siddiq M, et al, 2004; Madinier IM, el al, 1997; Berroteran A; 2002 ) y también en la reinfección gástrica después de erradicar la infección gástrica (Czesnikiewicz-Guzic M, et al,

2007). Otros dudan sobre su importancia (Kamat AH, et al, 1998 ; Cammarota G, et al, 1996). Aunque varios autores lo intentaron, no ha sido podible demostrar que el material genético

de H pylori del area periodontal sea semejante al material genético de las bacterias presentes en biopsias gástricas. Esto debido a la diferente especificidad y secuencias genéticas detectadas por los primers usados en la PCR.

Así, los primers que solo detectan la secuencia del gen C de la ureasa del H pylori son utiles

unicamente para revelar su presencia en la muestra estudiada (Mishra KK, et al, 2002). Es necesario usar primers o métodos que permitan detectar varias secuencias genéticas de la bacteria para lograr comparar las características genómicas de las cepas de H pylori presentes en distintas areas del tracto GI. Esto se logra usando pruebas como la Detección del DNA Polimórfico amplificado al azar (Random amplification of polimorfic DNA= RAPD) (Czesnikiewicz-Guzic M, et al, 2007, García C, et al,

1999) o con primers para PCR que permitan detectar las secuencias correspondientes a los distintos subgrupos de genes alelomorficos de los Marcadores putativos de Virulencia de la Bacteria (Czesnikiewicz-Guzic M, et al, 2007; 57; García C, et al, 1999; Hernandez R, et al, 2001): Mientras que la RAPD unicamente se puede llevar a cabo usando la bacteria cultivada, la PCR se puede efecuar en muestras conteniendo solo material genético del H pylori.

Teoricamente la infección periodontal con H pylori se vuelve una fuente continua de

contaminación para la superficie gástrica al deglutirse la bacteria con la saliva. Dicha contaminación puede llevar a la infección gástrica superficial cuando a) sobrepase la capacidad de aclaramiento bacteriano del epitelio gástrico y b) que su llegada coincida con períodos fisiológicos de hipocloridria como sucede durante el sueño.

38

PARTE III III.1 RESULTADOS.

III.1.1 GRUPO DE NIÑOS ESCOLARES Y MADRES ESTUDIADOS De las 40 parejas enroladas en la Escuela de la Aldea “El Tular” se completaron los estudios y la doble obtención de muestras gingivodentales en 34 parejas (68 sujetos en total: 34 escolares asistiendo al Primer año de Primaria y sus 34 madres respectivas). La edad de los 34 niños estudiados fue de (Prom ± DE) 7.41 ± 1.73 años (6 a 10 años) siendo 19 del sexo femenino y 15 del sexo masculino. La edad promedio de las 34 madres fue de (Prom ± DE) 32.0 ± 7.33 años (22 a 46 años). Todos ellos vivían dentro del perímetro de San José Pinula. III.I.I.1 Encuesta Socioeconómica, de Saneamiento e higiene dental: Esta encuesta se llevó a cabo entrevistando a las madres de los niños en estudio (Ver Anexos). Los datos que se mencionan en los siguientes parrafos se basan en la información recabada durante esta actividad. El grupo familiar de los sujetos encuestados estaba formado por 3 a 8 personas predominando familias con 4 a 6 miembros (75%). El 82% (23/28) de las madres manifestaron estar casadas o en unión estable.Al preguntarseles si consideraban que su familia estaba integrada el 80% respondieron afirmativamente. La condición socioeconómica de la mayoría de estas familias era baja teniendo un ingreso promedio de Q 2,036.54 ± 1,017.6 al mes(Q 750.00 a Q 4,000.00); el ingreso del 71.5% de las familias encuestadas fluctuaba entre Q 1,000.00 y Q 2,500.00 al mes15. Aunque en la mayoría de las ocasiones era el esposo el principal proveedor, el 34.5% de las esposas tenían un empleo o actividad de trabajo con el que lograban alcanzar el ingreso familiar antes mencionado. La mayor parte de las parejas (padre y madre) tenían escasa educación [ninguna o 2-3 años de enseñanza primaria] y la mayoría de los jefes de familia trabajaban como obreros o empleados menores fuera en el campo o en fábricas cercanas. Aunque el 50 % de los encuestados manifestaron que vivían en casa “formal” y el 89% que el piso de las mismas estaba cementado, el número promedio de cuartos (78%) de las casas fluctuaba entre 2 y 4 y el de dormitorios entre 1 y 2 por casa (80%). El número promedio de personas viviendo en la casa fue de 5.5 ± 1.96. Solo el 48.3% (14/29) manifestaron que la casa era de su propiedad; el resto la rentaban o vivían en la misma en condición de “guardianes” de una finca o fábrica. El 55.6% refirieron tener inodoro en la casa; el resto contaban con letrina. Sin embargo el funcionamiento del inodoro era solo parcial ya que la mayoría de los encuestados mantenían el

15 Los salarios mas bajos los devengaban familias que trabajaban como guardianes; en dicho salario iba incluida la vivienda por la que no pagaban renta.

39

depósito superior vacío teniendo que acarrear agua en recipientes para limpiar el receptáculo del mismo después de usarlo. Un 66% (19/24) manifestaron tener servicio entubado de agua pero que el servicio era irregular. El 21% se abastecían de un chorro lejano a su casa acarreando el agua en recipientes. Solo El 100% de los encuestados tenían pila en la casa; 80% de los mismos guardaban además agua en recipientes especialmente en toneles y un número menor en otro tipo de recipienteusando dicha agua para todo tipo de actividades diarias incluyendo para beber de la misma. El promedio de peso al nacimiento de los niños estudiados fue de 6.7 ± 1.0 libras. Ochenta y tres por ciento de las madres lactaron a sus niños. Aunque la duración del período de lactancia materna fue (Prom ± DE) de 18.5 ± 7.9 meses, la misma no fue exclusiva desde temprana edad. Así la mayoría de los niños ingirieron otros alimentos (atoles, Incaparina etc) a partir de los 3 meses de edad; 88.5% de los niños estudiados tenían ya una lactancia mixta, incluyendo distintos alimentos, a los 6 meses de nacidos. Las pachas eran lavadas con el agua de los recipientes. La dentición de los niños estudiados se inició a los 7.1 ± 2.4 meses; en 33% de los mismos la dentición principió ≥8 meses. Las madres refirieron que 64% de estos niños presentó diarrea en el período inicial de la dentición especialmente entre los 5 y 7 meses de nacidos. Despúes de este evento, la frecuencia de episodios diarreicos se redujo y, según las madres, solo el 23% (6/26) de los niños encuestados habían presentado episodios de diarrea con cierta frecuencia en los últimos 2 años previos a esta actividad. Es interesante el hecho que el 75% (18/24) de los niños en estudio habían recibido al menos 1 tratamiento antiparasitario. Según las madres el 48% de los niños tenía buena dentadura, y otro 47% tenía una dentadura regular o mala. De acuerdo a las respuestas obtenidas “el 77% de las madres le había principiado a cepillar los dientes a sus hijos entre el año y 2 años de edad. En el mismo sentido (y también según las madres), el 77% de los niños encuestados se cepillaban actualmente los dientes de 1-3 veces al día . El 100% de los niños se enjuagaban los dientes después de las comidas principalmente con agua. Contrastando con esta información el 65% (20/31) de los niños encuestados tenían problemas con su dentadura siendo los mas frecuentes dolor y “por estar picados” (caries); 52% no habían visitado dentista o solo ocasionalmente (la principal causa siendo porque se le había caido un diente) y solo 4/31 (13%) lo habían hecho en los últimos 12 meses para recibir tratamiento. III.I.I.2 Prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU) De las parejas estudiadas 20/34 (59.9%) niños y 24/34 (71%) madres tuvieron una 13C- PAU positiva respectivamente. El resultado de la 13 C-PAU efectuada 2-3 semanas después de la primera prueba fue practicamente el mismo(59.4% de niños positivos y 71.3% de madres positivas).

40

III.I.I.3 Estudios genómicos del H pylori periodontal observado Todo el material genómico del H pylori obtenido de la región periodontal del grupo de niños y madres estudiados presentaba bandas correspondientes a alguno de los aleles de los Marcadores Putativos de Virulencia (MPV) confirmando que todas las cepas presentes en esta región eran virulentas. En la primera recolección de material periodontal se sufrió un retraso de 13 a 15 días debido a las medidas preventivas que se tomaron durante el brote de gripe A1 H1N1, además algunas parejas se cepillaron los dientes la mañana antes de la toma de muestra. Por estas razones se comparó las características del material genómico de H pylori obtenido de los niños y madres estudiados en la primera y segunda toma de muestras y que no se habían cepillado los dientes antes de la primera toma de muestra periodontal. En general la tendencia de los valores fue a hacerse mas positivos en la segunda muestra sin embargo la prueba de McNemar (Valor –P exacto= 0.0391) mostró que no hubo tandencia significativa de cambio en ninguno de los MPV evaluados en la etapa I y etapa II: Tabla 2 Valor P de McNemar en los Marcadores Putativos de Virulencia (MVP) estudiados: Etapa I vrs II.

MPV Valor P Interpretación VacA s1 1.000 No hubo tendencia de cambio

VacA s2 0.125 "

VacA m1 0.125 "

VacA m2 1.000 "

CagA 1.000 " (Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007)

Se evaluó si existía diferencias significativas en la presencia de material genético de H pylori periodontal en 27 parejas niño-madre en que se obtuvieron las muestras las Etapas I y II. Las Tabla 3 presenta la comparación obtenida. De acuerdo con la Prueba de McNemar son muestras dependientes entre sí. En otras palabras no hay ninguna tendencia a que sean diferentes: si un miembro de la pareja tiene H pylori periodontal el otro también lo tendrá. (Ver Tabla 3 en pxma. Página)

41

Tabla 3 Presencia de Material genético de H pylori en el material periodontal obtenido de 27 parejas niño-madre durante las etapas I y II de toma de muestra. La Prueba de McNemar mostró que en ambas ocasiones las muestras eran dependientes entre sí Etapa I Madres Niños 0 1 Total

0 13 4 17 1 6 4 10

Total 19 8 27 (Parejas) Etapa II

Madres Niños 0 1 Total

0 13 4 17 1 6 4 10

Total 19 8 27 (Parejas) Prueba de McNemar (P=0.7359)

MPV Valor P Interpretación

Etapa I VacA s1 1.000 La presencia en madre-hijo es similar VacA s2 1.000 " VacA m1 1.000 " VacA m2 1.000 "

CagA 1.000 " Etapa II

VacA s1 1.000 La presencia en madre-hijo es similar VacA s2 1.000 " VacA m1 1.000 " VacA m2 1.000 "

CagA 1.000 "

(Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007)

III.I.I.4 Relación con variables socioeconómicas ambientales y de higiene: Se evaluó la posible correlación entre la condición socieconómica, distintas condiciones de vivienda, saneamiento e higiene dental evaluadas en la encuesta y la presencia de material genético de H pylori periodontal. Es importante aclarar que practicamente todas las parejas evaluadas eran de condición socioeconómica pobre de aquí que muchas de las variables evaluadas no tuvieron suficiente capacidad discriminatoria entre los casos H pylori periodontal popsitivo (Hp+) y los H pylori periodontal negativo (Hp-). Las variables evaluadas individualmente fueron: Ingreso familiar, peso al nacer, lactancia materna y su duración, diarrea, tipo de construcción de la vivienda, si eran propietarios o alquilaban la viviendo, número de personas que viven en la casa, servicio y manejo de agua intradomiciliar, cepillado de dientes, problemas dentales y visita al dentista. Se analizó con

42

StatXact usando el cálculo exacto del Valor-P con la prueba “exacta de Fisher” organizando el cuadro de salida para poblaciones dependientes. Ninguna de dichas variables tuvo una asociación significativa con la presencia de material genético de H pylori excepto por la que evaluaba “si eran propietarios o alquilaban la vivienda”; en esta el valor de P=0.0995. Era mas frecuente que los casos Hp (+) alquilaran casa que los Hp (-). Los índices generados a partir de las variables individuales mostraron que los casos HP (+) tenían mayor tendencia a vivir en condiciones de hacinamiento y usar agua contenida en recipientes que los Hp (-); sin embargo las diferencias no llegaron a ser significativas. III.1.1.5 Efecto de la aplicación tópica de Clorhexidina: Se efectuó en 10 parejas niño-madre. La presencia y distribución de MPV obtenida después de estas aplicaciones fue semejante a la muestra basal. III.1.2 GRUPO DE ADULTOS DISPÉPTICOS. Se estudiaron 38 pacientes con una edad promedio de 40.06 (21 a 62) años siendo 18 del sexo femenino y 20 del sexo masculino. A todos ellos se les había indicado una gastroscopía por especialista debido a su sintomatología. El procedimiento se efectuó bajo ligera sedación y en forma tradicional. Todos los casos estudiados presentaban cambios de gastritis generalizados o del area antral de intensidad variable. Se observó la presencia de erosiones prepilóricas en el 50% y de nodularidad antral en el 30% de los casos estudiados; en 2 casos se detectó una pequeña úlcera prepilórica. III.I.2.1 Formulario sobre antecedentes médicos y sintomatología GI Sirvió para detectar entre los posibles candidatos quienes tenían antecedentes o síntomas que los clasificaran como “No Candidatos” para este estudio. Todos los casos incluidos no refirieron dichos antecedentes y su sintomatología era predominantemente dispéptica (esofago-gástrica). III.I.2.2 Estudio Morfológico de mucosa duodeno yeyunal Se efectuó en 18 casos. Debido al diámetro limitado de las pinzas de biopsia que pueden usarse en el canal de los gastroscopios, el resto de las biopsias obtenidas fueron muy pequeñas. En la foto B, que corresponde a las biopsias obtenidas de la tercera porción del duodeno, pueden verse claramente tres pequeños fragmentos que mantuvieron satisfactoriamente su morfología. Como puede verse en la fotografía C en el area duodenoyeyunal de individuos de paises industrializados predominan las vellosidades en dedo. En los 18 casos estudiados por el contrario se observó un aspecto cerebroide homogeneo siendo semejante en la mucosa de la primera y tercera porciones del duodeno (Figs A y B). Esto se hizo evidente también en los conteos del tipo de vellosidades observado: Los conteos de vellosidades en forma de dedo, en forma de hoja y en forma cerebroide fueron similares en las dos regiones del duodeno analizadas (Ver Tabla y Figura a continuación)

43

Tabla 4. Tipo (Forma) de Vellosidades Intestinales identific adas en 18 pares de

biopsias endoscópicas de la mucosa de la primera y tercera porciones

del Duodeno.

Primera Porción del Duodeno Tercera Porción del Duo deno

Dedo ¥ Hoja Cereb Total ¶ Dedo Hoja Cereb Total

26.45* 38.37 35.18 26.0 29.78 36.43 34.49 34.39 6.15 5.98 8.28 10.0 5.81 4.82 7.61 18.82

*: Porcentaje Promedio y D.E. del tipo de vellosidades observadas ¥: Forma de Vellosidades: Cereb= Cerebroides ¶: Total: Numero Total de Vellosidades contadas por biopsia.

(Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007)

Figura 7.

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

DED HOJ CER

Tipo de Vellosidades

DUO-1

DUO-3

Porcenta

J

e

Frecuencia de los distintas formas de vellosidades intestinales observadas en 18 pares de biopsias endoscópicas correspondientes a la prime ra y tercera porciones del

Duodeno.

Figura 7

(Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007)

44

Fig A. Primera porción del Duodeno en adultos dispét icos de Guatemala

Franco predominio de vellosidades Cerebroides y en forma de hoja

__________________________________________ (Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007)

45

Fig. B. Región Duodenoyeyunal en adultos dispépticos de Guatemala

Franco predominio de vellosidades cerebroides y en forma de hoja (Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007)

Fig. C. Area Duodenoyeyunal de sujetos de paises indus trializados.Las flechas señalan a una vellosidad en dedo y una vellosidad en forma de hoja

______________________________________________________ (Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007)

46

III.I.2.3 Estudio histopatológico de la mucosa gástrica: Se efectuó el estudio histopatológico de la mucosa antral en 37 de los 38 pacientes estudiados. La Tabla 5 presenta la frecuencia de los cambios histopatológicos observados de acuerdo a la presencia o ausencia de material genético del H pylori en las biopsias de mucosa gástrica obtenidas. Tabla 5. Frecuencia de los cambios histopatológicos observados de acuerdo a la presencia [Hp(+)] o ausencia [Hp(-)] de material genético del H pylori en las biopsias de mucosa gástrica

(Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007)

Los mucosa gástrica de los pacientes Hp (+) presentó mayor grado de inflamación aguda y de cambios regenerativos epiteliales que los Hp (-). La frecuencia y grado de atrofia fue semejante en los 2 grupos estudiados. Solo el 63.9% (23/36) de los pacientes estudiados tuvieron presencia histológica de H pylori en las secciones estudiadas (Ver adelante). En 19% (7/37) de los casos el patólogo reportó erosion superficial del epitelio. Solo 1 caso presentó areas de displasia epitelial leve siendo Hp(-). III.I.2.4 Prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU) Sesenta y tres por ciento de los adultos dispépticos tuvieron una 13C-PAU positiva. La siguiente gráfica muestra la estrecha correlación entre la Prueba de Aliento y el diagnóstico histológico de las biopsias gástricas estudiadas (Ver pxma. página)

Cambio histopatológico Hp (-) (n=8)

%

Hp (+) (n=29)

%

Total (n= 37)

% Atrofia 85.7 83.0 83.8 Inflamación Crónica 85.7 79.0 87.3 Inflamación Aguda 20.6 80.0 70.3 Cambios Regenerativos 60.0 80.0 77.1

47

Tabla 6. Correlación entre la Prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU) y el Diagnóstico Histológico de H pylori en biopsias de mucosa gástrica.

Diagnóstico Histológico

13C-PAU 0 1 Total

0 12 2 14

>85.7% >14.3% >38.9%

92.30% 8.7%

1 1 21 22

>4.5% >93.5% >61.1%

7.7% 91.3%

Total 13 23 36

36.1% 63.9%

Chi2 Valor P

Mantel- Haenzel 23.75 <0.0000008

Yates 21.04 <0.000005 ________________________________________________ (Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007)

III.I.2.4 Estudios genómicos del H pylori periodontal y gástrico El 58% (22/38) de las muestras periodontales y el 81 % (30/37) de las biopsias gástricas obtenidas de los adultos dispépticos presentaban una o un número mayor de bandas de los MPV evaluados. El 53% (20/38) de estos individuos presentaban material genético de H pylori en la muestra periodontal y biopsias gástricas estudiadas. La tabla 7 y Fig. 7muestran la distribución de los distintos MPV detectados en las muestras del area gingivodental y biopsias gástricas. Es evidente que hay mayor expresión de los MVP en las muestras gástricas; un mayor porcentaje de las mismas presentando distintos aleles de VacA y CagA, especialmente de las variedades mas patógenas, que lo observado en las muestras periodontales (Ver pxma. Página)

48

Tabla 7. Distribución de los diferentes Marcadores Putativos de Virulencia del H pylori detectados en las muestras periodontales y en las biopsias gástricas obtenidas en los adultos dispéticos estudiados.

Marcadores Area peri- Mucosa

odontal Gástrica

n= 38

VacA s1 4 3

11* 8*

VacA s2 2 1

5 3

VacA m1 7 2

18 5

VacA m2 2 0

5 0

Cag A 2 1

5 3

VacA s1/m1 1 4

3 11

VacA s1/m2 2 0

5 0

VacA s2/m2 0 1

0 3

VacA s1, CagA 2 7

5 18

VacA s2, CagA 0 5

0 13

VacA m1, CagA 0 2

0 5

VacA m2, CagA 0 1

0 3

VacA s1/m1, CagA 1 3

3 8

VacA s2/m2, CagA 0 1

0 3

*: Porcentaje _______________________________________ (Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007)

49

Figura 7. Distribución de los distintos aleles de MPV mas patógenos presentes en las muestras periodontales (Ging) y biopsias de mucosa gástrica (Gast) en adultos dispépticos. Expresados en por ciento.

37

18

8

16

53

8

39

3

11

0

5

10

15

20

25

30

35

40

V-1 V-2 Cg V+Cg(2) V+Cg(3)

Ging

Gast

V-1=VacA s1; V-2= VacA s2; Cg= CagA; V+Cg(2)= Una banda de VacA y una banda de CagA presentes; V+Cg(3)= 2 bandas de VacA y una banda de CagA presentes. ___________________________________________________ (Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007) Así el 8% (3/38) de las biopsias gástricas positivas presentaban la cepa patógena VacA s1/m1, CagA; esta cepa se detectó en solo una de las muestras periodontales. La banda correspondiente al CagA estuvo presente en el 52.6% (20/38) de las biopsias gástricas fuera sola (3%) o asociada con bandas correspondientes a distintos aleles del VacA (50%). En el 14% de las muestras periodontales se detectó la banda de CagA fuera única o asociadas a otras.. Se analizó si existía o no similitud entre el material genético de H pylori periodontal y el presente en las biopsias de la mucosa gástrica. La asociación entre cada uno de los MPV y sus distintas combinaciones se evaluó con StatXact usando el cálculo exacto del Valor-P con la prueba “exacta de Fisher” organizando el cuadro de salida para poblaciones dependientes. Se consideró que no había asociación cuando el Valor-P era mayor de 0.10. Como puede verse en la Tabla 8 no hubo ninguna asociación significativa; en la mayoría de las ocasiones se notó una mayor presencia de MPV en las muestras de mucosa gástrica como se describió anteriormente.

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Tabla 8. Asociación entre cada uno de los Marcadores Putativos de Virulencia (MPV) y sus distintas combinaciones presentes en el material genético de H pylori periodontal y en la mucosa gástrica de adultos dispépticos. Valor signivicativo de P: >0.10.

Marcadores Valor-P Interpretación VacA s1 0.1320 No hay asociación.

VacA s2 0.4424 No hay asociación

VacA m1 0.1819 No hay asociación

VacA m2 0.4135 No hay asociación

Cag A 0.3361 No hay asociación

VacA s1/m1 0.8718 No hay asociación

VacA s1/m2 1.0000 No hay asociación

VacA s2/m2 0.5101 No hay asociación

VacA s1, CagA 0.8462 No hay asociación

VacA s2, CagA 1.0000 No hay asociación

VacA m1, CagA 1.0000 No hay asociación

VacA m2, CagA 1.0000 No hay asociación

VacA s1/m1, CagA 1.0000 No hay asociación

VacA s2/m2, CagA 1.0000 No hay asociación

(Schneider RE, Torres O, Proyecto FODECYT 48-2007) La posibilidad de una mayor expresión de los MPV de H pylori en la mucosa gástrica se investigó determinando la presencia de IceA1 y IceA2 en muestras periodontales y de la mucosa antral de 20 adultos dispépticos. En 55% de las muestras de ambas regiones se encontró la presencia de IceA; en 15% de los pacientes se encontró el IceA expresado en las muestras periodontales pero no en las muestras del antro pilórico; finalmente 30% de los sujetos no presentaron IceA en las muestras periodontales ni en las antrales. Estos resultados descartan la posibilidad de una mayor expresión de los MPV del H pylori en la mucosa gástrica de los sujetos dispépticos estudiados. También se evaluó la posible correlación entre los MPV de H pylori presentes en la mucosa gástrica y los parámetros histopatológicos medidos: Atrofia, Inflamación crónica, Inflamación Aguda, Regeneración epitelial y Displasia. Para ello se usó de nuevo StatXact y la prueba exacta de Fisher (Valor-P=0.01). No se encontró ninguna asociación con la presencia de atrofia, inflamación crónica, grado de regeneración epitelial y presencia de displasia. Por el contrario si la hubo entre la inflamación aguda y CagA ya fuera que se observara como banda única (P= 0.0652) o acompa-ñado de otras bandas correspondientes a distintos alelos del VacA (P= 0.0767). Como se mencionara en la sección sobre el análisis histopatológico de las biopsias gástricas la presencia de Inflamación aguda fue mayor en los paciente Hp (+) que en los Hp (-).

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III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS La serie de eventos inesperados descritos anteriormente redujo el período de tiempo para la recolección de muestras y sus respectivos análisis así como para el estudio y evaluación de pacientes. A pesar de esto se logró obtener evidencia significativa en relación a los distintos objetivos específicos de este Proyecto. Este es el primer estudio llevado a cabo en Guatemala en el que no solo se detecta la presencia de material genético de H pylori en la región periodontal de la población infantil y adulta pobre sino que se le caracteriza desde el punto de vista genético. Esta caracterización se efectuó con un Sistema Multiplex descrito por Chattopadhyay S y col (Chattopadhyay S, y col, 2004) que permite detectar la presencia de 5 genes alelomórficos característicos de los Marcadores putativos de Virulencia vacA y cag [MPV] (Ver Tabla 2). La ventaja del Sistema Multiplex es que ha probado ser discriminativo a la vez que simplifica y acelera la caracterización genética del H pylori; esto último es muy util en estudios poblacionales como fue en nuestro caso. Se investigaron 2 grupos poblacionales pobres de Guatemala: el primer grupo lo formaron niños de edad escolar con sus respectivas madres, sin sintomatología GI, en quienes se obtuvieron muestras de material gingivodental en dos ocasiones distintas; también se les efectuó la prueba de aliento con 13C-Urea (13CPAU) para detectar la presencia de infección gástrica activa por H pylori; la encuesta efectuada en dicha población mostró las pobres condiciones socioeconómicas, de vivienda y saneamiento en que vivían así como hábitos de cuidado e higiene dental muy deficientes, con el 65% (20/31) de los niños encuestados presentando problemas dentales (dolor o caries). El otro grupo lo formaron adultos con síntomas dispépticos a los que se les tomó muestras periodontales y se obtuvieron biopsias de la mucosa gástrica durante una gastroscopía diagnóstica. También se les efectuó la 13C-PAU para validar el resultado de la misma con el diagnóstico histológico de H pylori. Estudios previos (Informe Final Proyecto FONI-12-3) demostraron que ambas, la 13C-PAU y el diagnóstico histológico, tenían un alto grado de acuerdo. Esto se volvió a confirmar en la presente investigación: Chi2= 23.75, P de Mantel-Haenel.= 0.0000008 y Yates corregida= 0.000005 (Tabla 2).

El análisis por PCR demostró que todas las cepas de H pylori detectadas en el material periodontal de ambos grupos de estudio contenían algún tipo de MPV y por lo tanto tenían capacidad patógenica (Cecini S, et al, 1996). La mayoría de los estudios publicados hasta la fecha se han limitado a reportar la presencia de H pylori en areas de la boca sin especificar sus caracterísitcas genéticas (Oshowo A, et al, 1998; Allaker RP, et al, 2002; Madinier IM, et al, 1997; Dowsett SA, et al, 1999). Dowsett SA & Kowolik MJ, revisaron los trabajos publicados hasta el año 2003 mencionando varias limitaciones de orden técnico que los mismos presentaban. Por nuestra parte, revisamos lo publicado sobre el tema entre el 2003 al 2009 sin encontrar publicaciones que describan características genéticas del H pylori periodontal. En uno de los mas recientes, Zaric S y col reportan que el porcentaje de erradicación de la infección gástrica por H pylori logrado con triple

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terapia aumentó hasta alcanzar 77.3% cuando la misma se combinaba con un tratamiento periodontal simultaneo; sin embargo no mencionan si confirmaron la presencia de infección periodontal por H pylori en estos pacientes ni sus características genéticas (Zaric S, et al, 2009) Usando la 13C-PAU, la prevalencia general de infección gástrica activa por H pylori en los escolares fue del 59% y del 71% en las madres estudiados. En la etapa I, 8 parejas niño-madre se cepillaron los dientes el día en que se tomaron las muestras correspondientes a la Etapa I dando un exámen genómico negativo; en la Etapa II muchos de estos casos fueron positivos. A fin de definir el comportamiento del material genético de H pylori detectado en la etapa I y II se analizó los resultados obtenidos en el grupo de parejas que no se había cepillado los dientes en la etapa I y que además se había obtenido la muestra correspondiente a la etapa II. No hubo ninguna diferencia significativa (Tabla 2), lo que evidencia que la presencia de dicho material no es transitoria sino permanente. La aplicación tópica de Clorhexidina en 10 parejas Hp(+) tampoco logró modificar la presencia y distribución de los MPV periodontales observados en las muestras basales de estos casos. El hecho de que la distribución de MPV de las muestras periodontales de los niños estudiados y sus respectivas madres sea semejante, significa que existe contaminación posiblemente bidireccional niño ↔ madre. El concepto no es nuevo (Sasaki K, et al, 1999; Allaker RP, et al, 2002; De Souza DL, y col, 2006; Cammarota G, et al,1996; Drumm B, et al, 1990) . Sin embargo esta es la primera vez, hasta donde sabemos, que se documenta la similitud genómica del H pilori presente en la región periodontal del niño y de la madre. De todas las variables ambientales contempladas en la encuesta general la única significativamente diferente mostró que, comparado con las parejas Hp(-), un mayor número de parejas Hp(+) alquilaban la casa donde vivían. Aunque las parejas niño-madre Hp(+) tendieron a presentar mayores índices de hacinamiento, y de consumo de agua guardada en recipientes que en las parejas negativas, la diferencia no alcanzó niveles significativos; esto posiblemente por el tamaño de la muestra. En el 63% de los adultos dispépticos estudiados la 13C-PAU y el diagnóstico histológico gástrico demostraron la presencia de infección gástrica activa por H pylori. Ambas pruebas evidencian la presencia de una infección activa ya que la primera se basa en la actividad de la Ureasa del H pylori en la superficie gástrica y la segunda en la presencia de bacterias morfologicamente semejantes al H pylori en número suficiente para poderse identificar a bajas magnificaciones del microscopio de luz; la mayoría de estas ocasiones se encontraron cambios histológicos de una gastritis crónica aguda. El número de casos en que se encontraron MPV presentes en el PCR de las biopsias gástricas fue del 81.1%. Este aumento en positividad posiblemente resulta de la mayor sensibilidad del PCR para detectar material genético del H pylori pero no necesariamente refleja la presencia de infección gástrica activa. Entre todos los MPV detectados en las biopsias gástricas de estos individuos, fue el cagA el único que tuvo una asociación significativa con la presencia de inflamación aguda y cambios regenerativos histológicos. Fuera de que este gen es un gen cepa-específico, codifica una proteina citotóxica (cagA) y posiblemente otras proteinas (Yamaoka Y, 2008). Está localizado en una isla de patogenicidad denominada PAI-cag (Cecini S, et al, 1996); el 60% de las cepas que contienen esta isla (y por lo tanto elaboran cagA) producen otras proteinas codificadas por otros genes localizados en dicha isla (Cecini S, et al, 1996). Todas estas proteinas potencian los cambios inflamatorios y regenerativos en el epitelio gástrico inducidos por el cagA.

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El estudio efectuado en biopsias del antro y cuerpo gástricos de 13 sujetos dispépticos mostró que en cada caso existía el mismo patrón genético de H pylori en ambas regiones. Esto evidencia que dichas regiones estaban infectadas por la misma cepa. Esto ya lo había reportado con anterioridad por García C y col en 1999 Individuos adultos asintomáticos de paises industrializados presentan una mucosa cerebroide en la primera porción del duodeno (Foto A) la que cambia a una mucosa predominentemente formada por vellosidades en forma de dedo a partir del area duodenoyeyunal (DY) (Rubin CE, et al, 1960) (Foto C). Estudios previos (Schneider RE, et al, 1981; Viteri FE& Schneider RE, 1974) han demostrado que la mucosa DY de niños y adultos pobres de Guatemala es frecuentemente cerebroide muy semejante a la observada en nuestros adultos dispépticos (Foto B); muchos de los casos reportados en los trabajos antes mencionados presentaban también malabsorción subcíinica y disbiosis intestinal (Schneider RE, et al, 1981). La presencia de cambios cerebroides DY en todos los adultos dispépticos estudiados fueran Hp(+) o Hp(-) sugieren que los mismos están relacionados a un problema disbiósico intestinal.

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PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES:

• El uso del Sistema Multiplex, simplifica y agiliza las técnicas de detección y

caracterización del material genético de H pylori presente en muestras obtenidas de la región periodontal y mucosa gástrica del ser humano. Sin embargo dicha caracterización está limitada a los Primers de genes alelomórficos de los Marcadores putativos de Virulencia (MPV) incluidos en dicho Sistema.

• La presencia de H pylori gástrico detectado por medio de a) la 13C-PAU, b) el estudio histopatológico de la mucosa gástrica y c) la detección de material genético de H pylori (PCR) en dicha mucosa fue variable. Mientras que en a) y b) se encontró prevalencias muy semejantes, 63.2% y 63.9% respectivamente, con el c) se detectó en el 81.1% la presencia de algúno de los MPV en las biopsias gástricas de los casos estudiados.

• La capacidad diagnóstica de los métodos a) y b) se ve limitada si la presencia de la bacteria en el epitelio gástrico es escasa o la expresión de ureasa bacteriana es baja. Es importante aclarar que no existe evidencia de que en dichas situaciones exista en la mucosa gástrica una infección activa por H pylori. Por definición el método c) o PCR es mas sensible que los 2 primeros detectando cantidades mínimas de material genético de H plori. Sin embargo con el mismo no se sabe si todo el material genético detectado corresponda a bacterias viables o no.

Recomendación: A pesar de sus limitaciones, la 13C-PAU y el diagnóstico histológico en biopsias gástricas endoscópicas siguen siendo los dos métodos clínicos de referencia. El hecho de que la 13C-PAU sea una prueba no invasiva y que tiene un alto grado de asociación y acuerdo con el diagnóstico histológico la hace la prueba mas indicada para estudios de sujetos de todas las edades sea a nivel individual o poblacional; dichos estudios pueden ser para el diagnóstico, la determinación de la efectividad de tratamientos diseñados para erradicar la infección y/o el seguimiento de los mismos a fin de detectar la reinfección o reactivación de dicha infección. El estudio genómico de biopsias gástricas (PCR) es un método muy util para llevar a cabo estudios de investigación orientados a evaluar características epidemiológicas, fisiopatológicas y de reinfección o reactivación de la misma.

OBJETIVO I : DETERMINAR LA TASA DE INFECCIÓN PERIODONTAL Y SIMILITUD GENÓMICA DEL HELICOBACTER PYLORI PRESENTE EN ESCOLARES GUATEMALTECOS Y SUS RESPECTIVAS MADRES (adultos sanos).

• Conclusión 1: La prevalencia de infección periodontal por H pylori en los escolares estudiados fue del 60% y el de sus respectivas madres del 47% .

• Conclusión 2: Todo el material genómico de H pylori detectado en las muestras periodontales de estos niños y sus madres mostró la presencia de diferentes genes alelomórficos de Marcadores putativos de Virulencia (MPV) lo que evidencia la patogenicidad de las cepas presentes en esta región.

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• Conclusión 3: La presencia de MPV semejantes en las muestras correspondientes a las dos etapas de recolección significa que esta infección es persistente y no un evento transitorio.

• Conclusión 4: La similitud en la distribución de MPV de las muestras periodontales de los niños estudiados y sus respectivas madres fue significativa. Esto evidencia que existe contaminación madre - hijo sea esta uni o bi-direccional.

Recomendación: Estudiar formas como erradicar la infección periodontal por H pylori en niños y adultos. En dicho estudio se deben evaluar medidas locales y/o tratamientos sistémicos acompañados de un programa educativo de higiene dental a todos los niveles. Esta recomendación incluye a los pacientes adultos dispépticos y/o con sintomatología GI alta o diarrea con infección gástrica por H pylori. OBJETIVO IIa: EVALUAR LOS CAMBIOS MORFOLÓGICOS DE LA MUCOSA G.I. DE LOS SUJETOS ESTUDIADOS.

• Conclusión 1: La mucosa duodeno-yeyunal de los sujetos dispépticos estudados presentó un aspecto cerebroide sin observarse la transición a vellosidades en dedo y hoja observada en adultos de paises industrializados. El aspecto cerebroide de la mucosa duodeno-yeyunal se ha observado en niños y adultos Guatemaltecos con Disbiosis Intestinal.

Recomendación: Investigar la presencia de Disbiosis Intestinal en adultos Guatemaltecos con sintomatología dispéptica.

OBJETIVO II b: DETERMINAR LA PREVALENCIA DE INFECCIÓN GÁSTRICA ACTIVA POR H PYLORI USANDO LA PRUEBA DE ALIENTO CON 13C-UREA EN TODOS LOS GRUPOS ESTUDIADOS.

• Conclusión 1: La prevalencia de “infección gástrica activa” por H pylori usando la 13C-PAU en los escolares estudiados fue del 59%, en las madres de estos niños del 71% y en los adultos dispépticos del 63%. Estos valores siendo similares a los reportados en otros estudios.

Recomendación: La prueba de Aliento con 13C-Urea (13C-PAU) es un buen recurso para determinar en forma no invasiva la prevalencia de “la infección gástrica activa por H pylori” a nivel poblacional sean los sujetos niños o adultos.

• Conclusión 2: El porcentaje de casos H pylori positivos detectados por la 13CPAU y el diagnóstico histológico fue similar (63%) siendo menor a la detección de material genético de H pylori por PCR en la región gástrica de adultos dispépticos (81.1%). Este aumento en positividad posiblemente resulta de la mayor sensibilidad del PCR para detectar material genético del H pylori pero no necesariamente refleja la presencia de infección gástrica Recomendación: Es necesario efectuar estudios semejantes al actual eagregando al mismo el cultivo de las biopsias gástricas colectadas para una mayor caracterización genómica.

OBJETIVO III : ANALIZAR SI EXISTE O NO SIMILITUD GENÓMICA ENTRE EL MATERIAL GENÉTICO DE H PYLORI PRESENTE EN LA REGIÓN PERIODONTAL CON EL DETECTADO EN LA MUCOSA GÁSTRICA DE PACIENTES ADULTOS DISPÉPTICOS A QUIENES SE LES EFECTÚE GASTROSCOPÍA CON FINES DIAGNÓSTICOS.

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• Conclusión 1: La prevalencia de material genético de H pylori en la región peridodontal

de estos individuos fue del 58% y en las biopsias gástricas del 81% • Conclusión 2: No hubo una coincidencia clara entre los Marcadores Putativos de

Virulencia (MPV) observados en la región periodontal y los existentes en las biopsias gástricas.

• Conclusión 3: El número de MPV presentes en el material proveniente de las biopsias gástricas fue significativamente mayor al observado en la región periodontal.

• Conclusión 4: Las diferencias mencionadas en las 3 conclusiones previas podrían reflejar una mayor expresión del material genético del H pylori a nivel gástrico ya que este es el nicho preferido y específico de esta bacteria; sin embargo los resultados obtenidos en una submuestra en que la que se investigó la presencia del Marcador IceA no apoyan dicha posibilidad.

• Conclusión 5: La diferencia en expresión genómica del material gingivodental y de las biopsias gástricas no descarta el que el H pylori periodontal pueda colonizar en algún momento el ambiente gástrico al ser deglutido frecuentemente con la saliva y su llegada coincida con períodos de hipoclorhidria fisiológica como sucede durante la etapa de sueño.

Recomendación: Es necesario efectuar mas investigación de tipo experimental y de campo para confirmar o descartar las conclusiones antes mencionadas.

OBJETIVO IV : EVALUAR LA POSIBLE CORRELACIÓN ENTRE LA INFECCIÓ N PERIODONTAL POR H PYLORI Y LA INFECCIÓN GÁSTRICA HISTOLÓGICA PRODUCIDA POR ESTA BACTERIA.

• Conclusión 1: Hubo una relación discreta entre los hallazgos histopatológicos de la mucosa gástrica y los distintos MPV detectados en la región periodontal. En ningún caso llegó a ser significativa.

Recomendación: Es necesario efectuar estudios con un mayor número de casos para confirmar o descartar este tipo de correlación OBJETIVO V: ANALIZAR POSIBLES RELACIONES ENTRE LA INFECCIÓN PERIODONTAL POR H PYLORI CON LAS CONDICIONES DE SANEAMIENTO AMBIENTAL E HIGIÉNICAS, HÁBITOS Y CUIDADO DENTAL ESTUDIADOS EN ESTE PROYECTO.

• Conclusión 1: Las condiciones socioeconómicas de la población estudiada eran pobres asociandose a deficientes condiciones ambientales, de hacinamiento e higiénicas. Dichas condiciones eran prevalentes en los lugares en que vivían todos los sujetos estudiados; de aquí que no fue posible determinar una mayor asociación de alguna de las mismas con la prevalencia del H pylori periodontal.

• Conclusión 2: El número de parejas niño-madre con H pylori periodontal [Hp (+)] que vivían en casa alquilada fue significativamente mayor que el de parejas Hp (-). Hubo una tendencia a presentar indices mayores de hacinamiento y de consumo de agua guardada en recipoientes en las parejas Hp (+) que en las Hp (-). Esta tendencia no fue significativa posiblemente por el tamaño insuficiente de la muestra.

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• Conclusión 3: El mal estado dental (caries y placa dental) fue prevalente en los niños y madres estudiados sin que se pudieran detectar por lo tanto diferencias significativas entre los niños Hp (+) y Hp (-).

Recomendación: Es necesario mejorar las condiciones ambientales de vida así como los hábitos de limpieza e higiene dental de estas poblaciones para reducir la prevalencia de la infección periodontal por H pylori presente en las mismas. El eliminar la infección periodontal puede contribuir a reducir la primoinfección gástrica por dicha bacteria, mejorar el grado de erradicación logrado con un tratamiento dado y evitar la reinfección gástrica después de un tratamiento de erradicación efectivo.

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IV.2 RECOMENDACIONES

El demostrar la presencia de Infección Periodontal por Helicobacter pylori en la población infantil y adulta pobre de Guatemala es un hallazgo significativo que abre una gama de opciones. El camino mas razonable es desarrollar actividades en dos sentidos:

1.Implementar Programas Piloto orientados a promover la mejora de los hábitos de higiene dental a nivel familia entre las poblaciones de baja condición socioeconómica de Guatemala. Los mismos deberán contar con la participación y apoyo de las Escuelas, los Centros de Salud, las Municipalidades y organizaciones civiles, como las asociaciones de padres de familia, de los municipios incorporandolos a dichos programas. El objetivo inicial sería el de estimular el cepillado y la limpieza dental, varias veces al día, no solo entre los niños sino también los padres de familia. Fuera de ser informativa, dicha campaña enfatizará las ventajas que conlleva la mejora dental buscada. Será necesario implementar también mecanismos que faciliten la obtención de cepillos y pastas dentales así como el control y tratamiento dental por personal en salud entrenado. Este objetivo podrá ampliarse a medida que las actividades planteadas en el inciso 2) permitan definir otras medidas orientadas a la erradicación y/o prevención de la infección.

2. Investigar (a nivel experimental y de campo) la efectividad de distintas medidas locales

y/o tratamientos sistémicos para erradicar la infección periodontal por H pylori. Basado en los resultados obtenidos, debiera poderse definir un programa efectivo para la erradicación y prevención de la infección gástrica activa y periodontal producida por el Helicobacter pylori en niños y adultos guatemaltecos.

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IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Afre JR, Flores LE. Prevalencia de anticuerpos séricos IgG contra Helicobacter pylori en niños de 3 a 10 años de edad. Tesis de Graduación para obtener el título de Médico y Cirujano, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de San Carlos de Guatemala, Comunicación Gráfica G&S, Guatemala 2,004, 40 pgs.

2. Allaker RP, Young KA, Hardie JM et al. Prevalence of Helicobacter pylori at oral and

gastrointestinal sites in children: evidence for possible oral-to-oral transmission. J Med Microbiol 2002;51:312-317.

3. Alm RA , Ling L-S L, Moir Dt, et al. Genomic-sequence comparixon of two unrelatec

isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature 1999;397:176- 180

4. Alm RA , Trust TJ. Análisis of the genetic diversity of Helicobacter pylori: the tale of two

genes. J Mol Med. 1999;77(12):834-45 5. Anand PS, Nandakumar K, Shenoy KT. Are dental plaque, poor oral higiene, and

periodontal desease associated with Helicobacter infection?. J Periodontol 2006;77(4):692-698.

6. Asaka M, Dragosics BA. Helicobacter pylori and Gastric Malignancies. Helicobacter

2004;9(Suppl.1):35-41.

7. Atherton JC, Cao P, Peek RMJ, et al.Mosaicism in vacuolating sytotoxin alleles of Helocobacter pylori. Association of sepecific vacA types with cytotocin production and peptic ulceration. J Biol Chem 1995;17771-17777.

8. Axon A. Priorities for further research in Helicobacter pylori management – the way

forward. En: Hunt RH, Tytgat GNJ (Eds): Helicobacter pylori. Basic Mechanisms to Clinical Cure 2002, Dordrecht, Holanda, Kluwer Academic Publishers, 2002:523- 526.

9. Banatvala N, Lopez Cr, Owen R et al. Helicobacter pylori in dental plaque. Lancet 1993;

341:380.

10. Baskerville A, Newell DG. Naturally occurring chronic gastritis and C pylori infection in the rhesus monkey: a potencial model for gastritis in man. Gut 1988;29:465-469.

11. Berroterran A, Perrone M, Correnti M et al. Detection of Helicobacter pylori DNA in the

oral cavity and gastroduodenal system of a Venezuelan population. J Med Microbiol 2002;51;764-770.

60

12. Blecker U. Helicobacter pylori disease in childhood. Clin Pediatr (Phila) 1996;35:175 183.

13. Bode G, Match F, Malfertheiner P- The coccoid forms of Helicobacter pylori. Criteria of

their viability. Epidemiol Infect 1993;111(3):483-490.

14. Brown LM Helicobacter pylori: epidemiology and routes of transmisión. Epidemiol Rev 2000;22(2):283-97.

15. Cai X, Carlson J, Stoicov V, et al. Helicobacter felis erradication restores normal

architecture an inhibits gastric cancer progresión in C57BL/6 mice. Gastroenterology 2005;128(7):1937-1952

16. Cammarota G, Tursi A, Montalvo M, et al. Role of dental plaque in the transmisión of

Helicobacter pylori infection. J Clin Gastroenterol 1996;22(3):174-177.

17. Cecini S, Lange C, Xiang Z, et al. cagA Pathogenicity Island of Helicobacter pylori, Encodes Type I-Specific and Disease-Associated Virulence Factors. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:14648-14653.

18. Chattopadhyay S, Patra R, Ramamurthy T, et al. Multiplex PCR Assay for rapid detection

and genotyping of Helicobacter pylori directly from biopsy specimens. Jour Clin Microbiol, 2004;42(6): 2821-2824.

19. Chow TK, Lambert JR, Wahlkvist ML, et al. Helicobacter pylori in Melbourne Chinese

immigrants: evidence of oral-oral transmission via chopsticks. J Gastroenterol Hepatol 1995;10:562-569.

20. Costerton JW, Stewarr PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause or

persistent infections. Science 1999;284:1318-1322.

21. Cover TL. The vacuolating Cytotoxin of Halicobacter pylori. Mol Microbiol 1996;20:241- 246.

22. Czesnikiewicz-Guzic M, Bartolomiej L, Bielanski W et al. Implications of Oral

Helicobacter pylori for the outcome of its gastric eradication therapy. J Clin Gastroenterol 2007;41:145-151.

23. De Sousa L, Vasquez L, Velasco J, Parlapiano D. Aislamiento de Helicobacter pylori,

placa dental y saliva en una población de los andes venezolanos. Invest Clin 2006;47(2):109-116.

24. Dixon MF, Genta RM, Yardley JH et al. Classification and Grading of Gastritis. The

Updated Sydney System. Amer J Surg Pathol 1996;20 (10):1161-1181.

61

25. Dowsett SA, Archila L, Segreto VA, et al. Helicobacter pylory infection in indigenous

families of Central America: Serostatus and oral and fingernail carriage. J Clin Microbiol 1999;37 (8):2456-2460.

26. Dowsett SA, Kowolik MJ. Oral Helicobacter pylori: Can we Stomach It?. Crit Rev Oral

Biol Med 2003;14(3):226-233.

27. Drumm B, Perez-Perez GI, Blaser MJ. Intrafamilial clustering of Helicobacter pylori infection. N Engl J Med 1990;332:359-363.

28. Dye B, Kruszon-Moran MS, McQuillan G. The relationship between Periodontal Disease

attributes and Helicobacter pylori Infection among Adults in the United States. Am J Pub Health 2002;92(11):1809-1815

29. Enroth H, Engstrand L. Immunomagnetic separation and PCR for detection of Helicobacter pylori in water and stool specimens: J Clin Microbiol 1995;33(8):2162-2165.

30. Eslick GD, Lim LL-Y, Byles JE, et al. Association of Helicobacter pylori infection with

gastric carcinoma: A Meta-Analysis. Amer J Gastroenterol 1999;94:2373-2379.

31. EUROGAST Study Group. Epidemiology of, and risk factors for, Helicobacter pylori infection among 3194 asymptomatic subjects in 17 populations. Gut 1993;34:1672.

32. Farthing MJG. Helicobacter pylori infection: an overview. Brit Med Bull 1998;54:1, 6.

33. Figueiredo C, Quint MGV, Sanna R, et al. Genetic organization and heterogeneity of the

IceA locus of Helicobacter pylori. Gene 2000;246:59-68.

34. García C, Schneider RE, Torres O, et al. Genetic diversity of Helicobacter pylori strains in Guatemalan adults. Can J Gatroenterol 1999;13 (SupplB):148B

35. Gisbert JP, García Arata I, Boixeda D, et al. Role of partner´s infection in reinfection after

Helicobacter pylori eradication. Eur J.Gastroenterol Hepatol 2002;14(8):865-871.

36. Gisbert JP. The recurrence of Helicobacter pylori: incidence and variables influencing it. A critical review. Am J Gastroenterol 2005;100(9):2083-2099

37. Gottrand F, Vincent P. What can we learn from Helicobacter pylori reinfection in

childhood? J Pediatr Gastroenterol Nutr 2005;40(3):276-278.

38. Graham DY. Evolution of concepts regarding Helicobacter pylori: from a cause of gastritis to public health problem. Amer J Gastroenterol 1994;89:469-471.

62

39. Graham DY. Campylobacter pylori and peptic ulcer disease.Gastroenterology 1989;96:615-625.

40. Gruenheid S, Finlay BB. Microbial patogénesis and cytoskeletal function. Nature

2003;442:775-81.

41. Gunaid AA, Hassan NAGM, Murray-Lyon IM. Recurrence of Helicobacter pylori infection 1 year after successfull treatment: prospective cohort study in the Republic of Yemen . Eur J Gastroenterol 2004;16(12):1309-1314.

42. Hacker J, Kaper JB. Pathogenicity islands and the evolution of microbes. Annu Rev

Microbiol 2000;54:641-679

43. Handfield M, Baker HV, Lamont RJ. Behohnd Good and Eveil in the Oral Cavity: Insights into Host-Microbe relationships derived from Transcriptional Profiling of Gingival Cells. J Dent Res 2008;87(3):203-223.

44. Hammermeister I, Janus G, Schamarowski F, et al. Elevated risk of Helicobacter pylori in

submarine crews. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1992;11:9-14. 45. Helicobacter and Cancer Collaborative Group. Gastric cancer and Helicobacter pylori: a

combined analysis of 12 case control studies nested within prospective cohorts. Gut 2001;49:49:347-53.

46. Hernandez R, Torres O, García C, et al. Marcadores de Virulencia [MV] y Neutros [MN]

del Helicobacter pylori [Hp] presentes en biopsias de pacientes Guatemaltecos con Adenocarcinoma Gástrico. Hallazgos iniciales. Rev Cetroam Gastroent Endosc Digest 2001;5:29-34.

47. Houghton JM, Wang TC.Helicobacter pylori and Gastric Cancer: A new Paradigm for

inflammation –associated Epithelial Cancers. Gastroenterology 2005;128:1567- 1578.

48. Hu W, Cao C, Meng H, et al. Detection and analysis of Helicobacter pylori in oral cavity

and stomach from chronic gastritis patients. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2002;82(15):1037-1941.

49. IARC Monographs on the evaluation of Carcinogen Risks to Human. Lyon: World Health

Organization, 1994:155-240.

50. Jones DM, Lessells AM, Eldridge J. Campylobacter like organisms on the gastric mucosa: culture, histology and serological studies. J.Clin.Pathol. 1984;37:1002-6.

51. Juhas M, van der Meer JR, Gaillard M, et al. Genomic islands: tools of bacterial horizontal

gene transfer and evolution

63

52. Kikuchi S, Crabtree JE, Foreman D, et al. Association between infections with CagA- positive or negative strains of Helicobacter pylori and risk for gastric cancer in young adults. Research Group on Prevention of Gastric Carcinoma among Young Adults. Am J Gastroenterol 1999;94:3455-3439.

53. Kamat AH, Mehta Pr, Natu AA, et al. Dental plaque: an unlikely reservoir of Helicobacter

pylori. Indian J Gastroenterol 1998;17(4):130140.

54. Kersulyte D, Mukhopadhyay AK, Valapatiño B, et al. Differences in Genotypes of Helicobacter pylori from different Human Populations. J Bacterial 2000;182 (11):3210-3218.

55. Kim JS, Chung SJ, Choi YS, et al. Helicobacter pylori eradication for low-grade gastric

mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma is more successful in inducing remission in distal compared with proximal disease. Br J Cancer 2007;96(9):1324- 1328.

56. Kleesen B, Blaut M. Modulation of gut mucosal biofilms. Br J Nutr 2005;93(Suppl 1):S35-

S40.

57. Knipping C, Arand F, Leodolter A, et al. Prevalence of H pylori infection in family members of H pylori positive patients and its influence on the reinfection rate after successful eradication therapy: A two-years follow-up. Z Gastroenterol 2002;40(6):383-387.

58. Labigne A, Reuse H. Determinant of Helicobacter pylori pathogenicity. Infect. Agents

Disease 5, 1996: 191-202.|ISI| ChemPort|

59. Li C , Ha T, Ferguson DA et al. A newly Developer PCR assay of Helicobacter pylori en gastric biopsy, saliva and faeces. Evidence of high prevalence of H pylori in saliva supports oral transmission. Dig Dis Sci 1996;41:2142-2149.

60. Loesche WJ, Gusberti F, Mettraux G, et al. Relationship between Oxigen Tension and

Subgingival Bacterial Flora in Untreated Human Periodontal Pockets. Infect Immun 1983;42(2):659-667.

61. Logan RPH. Adherence of Helicobacter pylori. Aliment Pharmacol Ther 1996;10 (Suppl 1):3-15.

62. Madinier IM, Fosse TM, Monteil RA. Oral carriage of Helicobacter pylori: a review. J

Periodontol 1997;68(1):2-6.

64

63. Magistá AM , Ierardi E, Castellaneta S, et al. Helicobacter pylori status and symptom assessment two years alter eradication in paediatric patients from a high prevalence area. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2005;40:312-318.

64. Malaty HM, Graham DY. Importance of childhood socioeconomic status on the current

prevalence of Helycobacter infection. Gut 1994;35:742-745

65. Malaty HM, Engstrand NL, Pederson NL, Graham DY. Helicobacter pylori infection: genetic and environmental influences. Ann Intern Med 1994;120:982-986.

66. Mans JJ, Lamont RJ, Handfield M. Microarray análisis of human eopithelial cell responses

to bacterial interdiction. Infect Disord Drug Targets 2006;6:299-309 [Pub Med]

67. Marquis RE. Oxigen metabolism, oxidative stress and acid-base physiology of dental plaque biofilms. J ind Microbiol 1995;15:198-207.

68. Marshal BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active gastritis. Lancet 1983;i:1273.

69. Marshall BJ, Mcgechie DB, Rogers PA, Glancy RJ. Pyloric Campylobacter infection and gastroduodenal disease. Med J Aust 1985;142(8):439-444.

70. Marshall BJ, Armstrong JA, McGechie DB, Glancy RJ. Attempt to fulfil Koch´s

postulates for pyloric campylobacter. Med J Australia 1985;142:436-439.

71. Marshall BJ, Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 1994;i:1311-5.

72. McKee T, McKee JR. Bioquímica, la base molecular de la vida. 3ª. Edición, Madrid:

McGraw-Hill, Interaemericana, 2003, 703 pp.

73. McMahon BJ, Bruce MG, Hennessy TW, et al. Reinfection alter successful eradication of Helicobacter pylori: a 2 year prospective study in Alaska Natives. Aliment Pharmacol Ther 2006;23(8):1215-1223

74. Megraud F. Transmisión of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Aliment

Pharmacol Ther 1995;9 (Suppl 2):85-91.

75. Megraud F, Lehours P. Helicobacter pylori detection and antimicrobial susceptibility testing. Clin Microb Rev 2007;20(2):280-322.

76. Mendall MA , Goggin PM, Molineaux N, et al. Childhood living contidions and

Helicobacter pylori seropositivity in adult life. Lancet 1992,;239:896-897

77. Miehlke S, Bayerdörffer E, Ehninger G, Stolte M. Precancerous risk markers in Helicobacter pylori gastritis. Pathology 2001;22:31-36.

65

78. Mishra KK, Srivastava S, Dwivedi PP, et al. Rure C PCR based of Helicobacter pylori

infection and detection of cag A gene in gastric biopsias. Indian J Pathol Microbiol 2002;45(1):31-37.

79. Morris A, Nicholson G. Ingestion of Campylobacter pyloridis causes gastritis and raised

fasting gastric pH. Amer J Gastroenterol 1987;82 (3):192-199.

80. Morris AJ, Rafia Ali M, Nicholson GI, et al. Long-Term follow-up of voluntary ingestión of Helicobacter pylori. Ann Int Med 1991;114(8):662-663.

81. Mvak-Stipetic M , Gall Troselj K, Lukac J, et al. Detection of Helicobacter pylori in

various oral lesion be nested-polymerase chain reactios (PCR). J Oral Pathol Med 1998;27:1-3.

82. Odenbreit S, Püls J, Sedlmaier B, et al. Translocation of Helicobacter pylori cagA into

gastric epithelial cells by type IV secretion. Science 2000;287 (5457):1497-1500.

83. Oh JD, Kling.Blackhed H, Giannakis M, et al. The complete genome sequence of a chronic atrophic gastritis Helicobacter poylori strain: evolution during disease progresión. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:9999-1004

84. Ohara S, Kato M, Asaka M, ToyotaT.The UBIT-100 13CO2 infrared analyzer: comparison

between infrared spectrometry analyses and mass spectrometric analysis. Helicobacter 1998;3:49.

85. Oregel SE. Prevalencia de anticuerpos séricos contra Helicobacter pylori en niños menores

de 3 años de baja condición socioeconómica. Tesis de Graduación para obtener el título de Médico y Cirujano, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de San Carlos de Guatemala, Impresos Ramirez, Guatemala 2,002, 62 pgs.

86. Oshowo A, Gilliam D, Botha A, et al. Helicobacter pylori : the mouth, stomach, and gut

axis. Ann Periodontol 1998;3(1):276-280.

87. Pareja A. Biología Molecular del Helicobacter pylori, Capítulo III. En: Ramírez Ramos A y Gilman RH. (eds) Helicobacter pylori en el Perú. Lima: Impresiones Santa Ana S.A. 2002:45-52.

88. Parsonnet J. What is the Helicobacter pylori global reinfection rate?. Can J Gastroenterol 2003;17(Suppl B):46B-48B.

89. Peterson WL. Helicobacter pylori and peptic ulcer disease. N Eng J Med 1991;324:1043-

1048.

66

90. Peek RM, Thompson SA, Atherton JC, et al. Expressión of a novel ulcer-associated H pylori gene, iceA, following adherence to gastric epithelial cells. Gastroenterology 1996;110(Suppl):A225

}

91. Rittig MG , Kaufman A, Robins A, et al. Smooth and rouge lipopolysacharide phenotypes of Brucilla induce different intracellular trafficking anc cytokine/chemokine release in human monocytes. J Leuko Biol 2003;74:1045-1055.

92. Rothembacher D, Bode G, Berg G, et al. Helicobacter pylori among preschool children

and their parents: Evidence of Parent.Child transmission. Jour Infect Dis 1999;179:398-402.

93. Rubin CE, Brandborgh LL, Phelps PC, Taylor HC Jr. Studies of celiac disease. I. The

apparent identical and specific nature of the duodenal and proximal jejunal lesion in celiac disease and idiopathic sprue. Gastroenterology 1960;38:28-49.

94. Saito N, Konishi K, Sato F, et al. Plural transformation-processes from spiral to coccoid

Helicobacter pylori and its viability. J Infect 2003;46(1):49-55.

95. Salaün L, Linz B, Sauerbaum S, Saunders NJ. The diversity within an expanded and redefined repertoire of phase-variable genes in Helicobacter pylori. Microbiology 2004;150(4):817-30.

96. Santos A, Magalhäes DM, Menard A,et al. New Pathogenicity Marker found in Plasticity

Region of the Helicobacter pylori Genome. J Clin Microb 2003;41(4):1651-1655.

97. Sasaki K, Tajiri Y, Sata M, et al. Helicobacter pylori in the natural environment. Scand J Infect Dis 1999;31:275-279.

98. Savage G, Microbial ecology of the gastrointestinal tract. Ann Rev Microbiol 1977;31:307-

133

99. Schneider RE, Torún B, Shiffman M, et al. Absorptive capacity of adult Guatemalan rural males living under different contitions of sanitation WHTR-4/UNUP-295, Tokio: The United Nations University; 1981:139-149.

100. Schneider RE, Vettorazzi M, Torres MA, et al. La infección gástrica por Helicobacter

pylori en adultos dispépticos de Guatemala. Su relación con el estado socioeconómico y cambios displásicos gástricos. Rev Med Int (Guat) 1994;5:2-9.

67

101. Schneider RE, Solis Guerra CA, Lacayo K, et al. Reporte preliminar sobre la frecuencia del cáncer en adultos guatemaltecos de diferente condición socio-económica con especial referencia al cáncer gastrointestinal. Rev CentroAm Gastroenterol 1997;1:20-25.

102. Schneider RE. Informe Final del Proyecto Foni-12-03: Validación de pruebas

diagnósticas no invasivas para la detección de la infección gástrica por Helicobacter pylori en adultos guatemaltecos, Octubre 2003:

103. Schneider RE. Informe Final Proyecto Foni-32-05: Prevalencia de la Infección Gástrica

Activa por Helicobacter pylori en Escolares de Municipios del Departamento de Guatemala, 2005.

104. Schneider RE, Torres O, Matute J, Informe Final, Proyecto Fodecyt 92-2006; Efecto de

la suplementación de zinc por 8 meses en la prevalencia de el Síndrome Diarreico, la Disbiosis Intestinal y la Infección Gástrica Activa por Helicobacter pylori en niños escolares de Guatemala, Octubre 2008

105. Schneider RE. Informe Final Proyecto Foni-03-2006: Eficacia de la triple terapia para

erradicar la Infección Gástrica por Helicobacter pylori en Escolares de 8 a 10 años de edad del Departamento de Guatemala, Septiembre 2009

106. She FF, Lin J-Y, Liu JY, et al. Virulence of water-induce coccoid Helicobacter pylori

and its experimental infection in mice. World J Gastroenterol 2003;9(3):516-520.

107. Shimoyama T, Crabtree JE- Mucosal chemokines in Helicobacter pylori infection. J Physiol Pharmacol 1997;48:315-323.

108. Shinchi K, IshiiH, Imanishii K, et al. Relationship of cigarette smoking, alcohol use, and

dietary habits with Helicobacter pylori infection in Japanese men. Scand J Gastroenterol 1997;32:651-655.

109. Soto G, Bautista CT, Roth DE, et al. Helicobacter pylori Reinfection in common

peruvian adults alter antibiotic eradication therapy. Jour Infect Dis 2003;188:1263- 1279.

110. Souto FJ, Fontes CJ, Rocha GA, et al. Prevalence of Helicobacter pylori infection in a

rural área of the sate of Mato Grosso. Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 1998;93:171- 174.

111. Siddiq M, Hassb-ur-Rehman, Mahmood A. Evidence of Helicobacter pylori in dental

plaque and gastric mucosa. J Coll Physicians Surg Pak 2004;14(4):205-207.

112. Silness J, Löe H. Periodontal desease in pregnancy. II. Correlation between oral higiene and periodontal condition. Acta Odont Scand 1964;22:121-135.

68

113. Soto G, Bautista CT, Roth DE, et al. Helicobacter pylori reinfection is common in peruvian adults alter antibiotic eradication therapy. J Infect Dis 2003;188(9):1263- 1275.

114. Steer HW. Surface morphology of the gastroduodenal mucosa in duodenal ulceration.

Gut 1984;25:1203-1210.

115. Thomas JE, Gobson GR, Darboe MK, et al. Isolation of Helicobacter pylori from human faeces. Lancet 1992;340:1194-1195.

116. Tomb JF, White O, Kerlavage AR, et al. The complete genome sequence of the gastric

pathogen Helicobacter pylori. Nature 1997;338 (6642):539-547.

117. Torres J, Leal-Herrera Y, Perez-Perez G, et al. A community –based seroepidemiologic study of Helicobacter pylori in Mexico. J Infect Dis 1998;1089-1094.

118. Tytgat GNJ, Rauws EAJ. Campylobacter pylori and its role in peptic ulcer disease. Gast

Clin N Am 1990;19:183-196.

119. Van der Wouden EJ, Thijs Jc, Van Zweet AA, Kleibeuker JH. Six year follow-up after successful tripole therapy for Helicobacter pylori in patients with peptic ulcer disease. Eur J Gastroenterol Hepatolo 2001;13:1235-1239

120. van Doorn L-V, Figueiredo C, Sanna R, et al. Clinical relevante of the cagA, vacA and

IceA status of Helicobacter poylori. Gastroenterology 1999;115:58-66.

121. Viteri FE, Schneider RE. Gastointestinal alteration in protein-calorie malnutrition. Med Clin North Am 1974;58(6):1478-1505.

122. Webb PM, Knight T, Greaves S, et al. Relation between infection with Helicobacter

pylori and living conditions in childhood: evidence for person to person transmission in early life. BMJ 1994;308:750-753

123. Wizla-Derambure N, Michaud L, Arego S, et al. Familial and community environmental

risk factors for Helicobacter pylori infection in children and adolescents. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001;35:58-63.

124. Wotherspoon AC, Ortiz-Hidalgo C, Falzon MR, et al. Helicobacter pylori-associated

gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet 1997;338:1175-1176.

125. Wu C-C, Chou P-Y, Hu C-T, et al. Clinical relevante of the vacA, iceA, cagA and flaA genes of Helicobacter poylori strains isolated in Eastern Taiwán. J Clin Microbiol 2005;43(6):2913-2915.

126. Yamaoka Y. Roles of the plasticity regions of Helicobacter pylori in gastroduodenal

patogenesis. J Med Microb 2008;56:545-553.

69

127. Zaric S, Bojic C, Jankovic LJ, et al. Periodontal therapy improves gastric Helicobacter pylori eradication. J Dent Res 2009;88 (10):946-50

70

IV.4 ANEXO

IV.4.1 Consentimientos Informados IV.4.2 Encuesta General y Cuidado Dental IV.4.3 Formulario sobre antecedentes médicos y sintomatología GI

71

Consentimiento Informado (Niños ) Yo_____________________________________________________________he sido informado(a) por__________________________________________ que se va a iniciar un Proyecto con el objeto de investigar la frecuencia con que una bacteria llamada Helicobacter pylori produce infección en las encías de los niños. Entiendo que para esto se les examinará al niño(a) la boca, los dientes y las encías tomandosele muestras del borde de la encía con los dientes con un hisopo o una instrumento especial. Esta toma de muestra no es dolorosa ni le causa molestia al niño(a). Dicha muestra será analizada para ver si la bacteria Helicobacter pylori está presente. También se le efectuará una prueba de aliento para ver si el niño(a) tiene la misma bacteria en el estómago. Esta prueba debe hacerse en ayunas y tiene tres etapas: 1º.Soplar dentro de una bolsa por la mañana mientras el niño está en ayunas; 2º. seguidamente se traga con un poco de agua una tableta (o cápsula) que contiene una sustancia inofensiva (13C-Urea); si el niño tiene la infección en el estómago por el Helicobacter pylori la bacteria romperá esta sustancia en su estómago eliminandose una porción de la misma con el aire que sale de los pulmones; 3º. para detectar si la porción de esta sustancia está presente en el aire que sale de los pulmones el niño(a) tiene que soplar de nuevo en otra bolsa 20 minutos después de que se haya tragado la tableta. Ya tomadas las muestras y completada la prueba de aliento se se aplicará en el borde de la encía con los dientes de cada niño(a) un agente capaz de matar a dicha bacteria. Dicho agente se aplicará dos veces en días separados. Me han explicado que estas aplicaciones no son dolorosas y no tienen ningún efecto en el organismo del niño(a). Treinta días después de la última aplicación se le tomarán de nuevo al niño(a) muestras del borde de la encía con los dientes y se le repetirá la Prueba de Aliento para ver si el tratamiento ha sido efectivo o no. Le he consultado a mi hijo(a) para ver si está anuente a participar en este estudio. Yo por mi parte tambièn estoy de acuerdo en que el (o ella) participe en dicho estudio. El nombre de mi hijo (a) es hijo(a)_______________________________________________________ Me informarán de el resultado de los exámenes de las muestras tomadas de la boca de mi hijo(a) así como de las pruebas da aliento que se le hagan. Si tengo dudas podré hablar con el personal del Proyecto o consultar con el Médico que me parezca Tengo completa libertad de retirar del Proyecto a mi hijo (a) en el momento que así lo considere. Firma del Padre o la Madre del niño(a): __________________________________________CedulaNo.__________________________

Guatemala:___________________________________

72

Consentimiento Informado (Madres) Yo_____________________________________________________________he sido informa- do (a) por__________________________________________ del estudio que está llevandose a cabo con el objeto de investigar la frecuencia con que una bacteria llamada Helicobacter pylori produce infección en las encías de las personas. Entiendo que para esto se me examinará la boca, los dientes y las encías tomandome muestras del borde entre la encía y los dientes con un hisopo o un instrumento especial. Esta toma de muestra no es dolorosa ni causa grandes molestias. Dicha muestra será analizada para ver si la bacteria Helicobacter pylori está presente. También me harán una prueba de aliento para ver si tengo esa misma bacteria en el estómago donde produce gastritis. Esta prueba la haré estando en ayunas y tiene tres etapas: 1º Debo soplar dentro de una bolsa por la mañana mientras estoy en ayunas; 2º. Después de esto voy a tragar con un poco de agua una tableta que contiene una sustancia inofensiva (13C-Urea) y una capsula con acido cítrico; me informaron que el acido cítrico es el mismo que contienen las naranjas y los limones siendo inofensivo también. En el caso de que tenga la gastritis producida por el Helicobacter pylori la bacteria romperá la 13C-Urea que me tomé cuando llege a mi estómago eliminandose una porción de esta sustancia con el aire que sale de mis pulmones; 3º. para detectar si la porción de esta sustancia está presente en el aire que sale de mis pulmones voy a soplar de nuevo en otra bolsa 20 minutos después de que haya tragado la tableta. Me han informado que también investigarán si existe evidencia de esta bacteria en la muestra de sangre que he proporcionado. Ya tomadas las muestras de mi boca y de sangre, y completada la prueba de aliento se me aplicará un agente capaz de matar la bacteria Helicobacter pylori en el borde de la encía con mis dientes. Dicho agente se aplicará dos veces en días separados. Me han explicado que estas aplicaciones no son dolorosas y no tienen ningún efecto en mi organismo. Treinta días después de la última aplicación volverán a tomarme muestras del borde de la encía con mis dientes, se me tomará otra muestra de sangre y repetiré la Prueba de Aliento para ver si el tratamiento ha sido efectivo o no. Habiendo comprendido en que consiste este estudio y las pruebas que debo hacer, declaro que estoy de acuerdo en participar en el mismo. Guatemala________de___________________________de _________________ Firma_________________________________Cedula No.__________________ Huella digital:

73

Consentimiento Informado (Adultos dispépticos ) Yo_____________________________________________________________he sido informa- do (a) por__________________________________________ del estudio que está llevandose a cabo con el objeto de investigar la frecuencia con que una bacteria llamada Helicobacter pylori produce infección en las encías de las personas. Esta es la misma bacteria que puede producir gastritis si llega a infectar el estómago de las personas. Durante la gastroscopía que tengo programada para este día el gastroenterólogo decidirá si puedo participar o no en este estudio. En el caso que considere que sí puedo participar me tomará biopsias de el estómago y duodeno para investigar la presencia de dicha bacteria y sotendraán una muestra de mi sangre mientras estoy sedado. Si puedo participar en el estudio entiendo que uno o dos días después de la gastroscopía se me examinará la boca, los dientes y las encías tomandome muestras del borde entre la encía y los dientes con un hisopo o un instrumento especial. Esta toma de muestra no es dolorosa ni causa grandes molestias. Dicha muestra será analizada para ver si la bacteria Helicobacter pylori está presente en mi boca. También me harán una prueba de aliento para confirmar si tengo esa misma bacteria en el estómago. Esta prueba la haré estando en ayunas y tiene tres etapas: 1º Debo soplar dentro de una bolsa por la mañana mientras estoy en ayunas; 2º. Después de esto voy a tragar con un poco de agua una tableta que contiene una sustancia inofensiva (13C-Urea) y una capsula con acido cítrico; me informaron que el acido cítrico es el mismo que contienen las naranjas y los limones siendo inofensivo también. En el caso de que tenga la gastritis producida por el Helicobacter pylori la bacteria romperá la 13C-Urea que me tomé cuando llege a mi estómago eliminandose una porción de esta sustancia con el aire que sale de mis pulmones; 3º. para detectar si la porción de esta sustancia está presente en el aire que sale de mis pulmones voy a soplar de nuevo en otra bolsa 20 minutos después de que haya tragado la tableta. Me han informado que investigarán si existe evidencia de esta bacteria en la muestra de sangre que he proporcionado. En el caso de que el gastroenterólogo considere que no puedo participar en el estudio este consentimiento será destruido en mi presencia. Habiendo comprendido en que consiste este estudio y las pruebas que debo hacer, en el caso que el resultado de la gastroscopía me permita participar en dicho estudio declaro que estoy de acuerdo en participar en el mismo. Guatemala________de___________________________de _________________ Firma_________________________________Cedula No.__________________ Huella digital:

74

2.15.2 ENCUESTA GENERAL Niños 1 Caso No________ Grupo__________________ Fecha Día____ Mes___________ Año_____ Nombre del Niño________________________________________________________________ Edad____________ Sexo________ Escuela________________________________________________________________________ Nota__________________________________________________________________________ Nombre de la madre:____________________________________________________________ Nombre del padre______________________________________________________________ DirecciónCasa__________________________________________________________________ Teléfono_____________________________________________ Ingreso Salarial:<Q 1,200___ >Q 1,200.00___ Total: Q________ Familia Integrada No= Si= ; Aportan Mamá: ; Papá: ; Los Dos: ; Los dos y familiar: ; Familiar: Quien_________________________________________________________________ Escolaridad Mama:_______________________ Papá:________________________________ Trabajo Mamá________________________Trabajo Papá____________________________ Familia Integrada: Si______ No_______ Datos Mamá: Edad______ G____ P___ A____ Edad Caso del Estudio________ Niños muertos__________ Niños Vivos____ F_____ M____ Enfermedades de la mamá________________________________________________________

▲ LACTANCIA Y DENTICIÓN

• Peso al nacer_____________________________________________________________

• Lactancia materna: Si___No___ Duración_______________

• Introducción de Otros Alimentos: Edad de Inicio:____________________________ Alimentación Libre (Edad)__________________

75

Niños 2

• Dentición……………….: De leche: Inicio ________(meses) Fin__________(años)

Definitiva: Inicio ________ Años

• Enfermedades Diarreicas: con dentición de leche No____Si____ Edad en que comenzaron?___________ Edad en que se le quitaron______ Estado Actual de diarrea: Persiste hasta la fecha Si_____ No___ Frecuencia de los Episodios: Muy raro 2 a 3 veces al año Una vez al mes 2 a 3 veces al mes • Le aumentaron los catarros con la salida de los dientes de leche Si No

________________________________________________________________________

• Padece su niño(a) de otra enfermedad del estómago que no sea diarrea? Si No

Cual ha sido?_____________________________ Cuando fue____________________ La sigue padeciendo ahora?________________________________________________ • Tratamiento Antiparasitario?: No___ Si___ _________________________________ • Que otras enfermedades le han dado?________________________________________ ________________________________________________________________________

CASA No= Si= ; Alquilada= Propia= • Características : Formal_________ Informal______ Mixta_______________

Personas en la casa__________ Número de Cuartos_____________ Número de Dormitorios____________________________________________________

CUARTO No= Si= ; Alquilado= Propio=

• Piso tierra_____ Piso Cemento______ Inodoro______ Escusado_____

• Agua: No hay________________ Chorro en la casa_____ Chorro lejano_________ Depósito Aereo______________ Cisterna con Bomba_____________________

Guardan agua en Toneles Generales________________________________________ Guardan agua en recipientes: No____ Si______ Para Baño Para beber Compran agua por tonel: No____ Si_____ ; por tambos No____ Si______ Notas:_________________________________________________________________________

76

CUIDADO DENTAL : Niños 3

• Cual es el estado de los dientes de su niño(a)? Bueno Regular Malo No sé

________________________________________________________________________

• Desde que edad le cepilló o limpió los dientes al niño?:__________________________

• Se cepilla el niño los dientes?: Si______ No______ Cada cuando?______________________________________________________ Desde que edad?____________________________________________________

• Solo se los enjuaga? Si_______ No_______ Solo con agua Con Producto (Enjuague) No sé Cada cuando?_____________________________________________________ • Ha tenido su niño(a) problemas con los dientes: Si_______ No_______

Que tipo de problema?_______________________________________________ Cuantas veces?_____________________________________________________ Cuando fue la última vez?____________________________________________

• Lo ha llevado a que lo vea un dentista? Si ______ No_______ Cual fue el problema_________________________________________________ Cuantas veces lo ha llevado?__________________________________________ Cuando fue la última vez?____________________________________________ Le completó el tratamiento?__________________________________________ • Han tenido sus hermanitos también problemas con los dientes?___________________ ________________________________________________________________________

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ACLARACIÓN: Este Proyecto enfrentó una serie de contratiempos que obligaron a modificar en parte el diseño inicial. El diseño que se llevó a cabo es el que se describe en la Sección de Metodología de este proyecto. Las circunstancias y contratiempos que condujeron a la pérdida de muestras biológicas y de grupos de pacientes parcialmente estudiados fueron:

• El inicio del proyecto se hizo efectivo hasta en abril del 2008 debido a cambios que se tuvieron que hacer en el Contrato original (firmado 3l -08-07) para modificarlo al tipo por “Consultoría”. Sin embargo el reclutamiento de niños escolares y madres se inició desde enero 2008 efectuandoles la 13C-PAU a 53 niños escolares y sus respectivas madres. Para esa fecha se tenía entendido que todos estos niños serían trasladados a otra escuela con el objeto de remodelar la original, planeandose seguirlos y tomar la muestra periodontal en la escuela a donde los trasladaran. Desafortunadamente, y debido a la sobrepoblación escolar que se presentó en ese año, los niños en estudio fueron relocalizados en distintas escuelas de San José Pinula haciendo imposible su seguimiento. Esto obligó a reiniciar la búsqueda de nuevos niños en una escuela distinta a la originalmente planeada como se describe en la sección de Metodología.

• Al haberse firmado el Contrato original se iniciaron también los trámites ante las autoridades del Hospital Roosevelt para estudiar al grupo de adultos dispépticos que estaban programados para tener una Gastroscopía en dicho Hospital. Desde noviembre del 2008 se inició el reclutamiento de pacientes efectuandoseles la 13C-PAU, el estudio histopatológico-morfológico de las biopsias gástricas y recolección de las muestras gingivodentales y de biopsias gástricas las que se mantuvieron almacenadas a -70° C hasta poder ser procesadas. Esto no pudo llevarse a cabo en el momento apropiado ya que se tuvo que licitar las Pruebas de Aliento y de estudios genómicos a través de Guatecompras. Este trámite duró alrededor de 5 meses sin que ninguna compañía o laboratorio cotizara para efectuar dichos análisis. El resultado de esta demora fue que ya no se pudo recuperar el ADN de las muestras almacenadas debiendose descartar todas, perdiendose todos los casos colectados y con ellos las pruebas de aliento así como los estudios de histopatología y morfología ya realizados.

• La perdida de tiempo y de recursos económicos ( por los exámenes efectuados que se tuvieron que pagar pero que no se pudieron usar al faltar las PCR) hizo que se revisara el plan de investigación original para poder adaptarlo a la situación existente. El programa resultante descartó efectuar algunas de las actividades originalmente planeadas y reducir el número de nuevos casos a fin de poder llevar a cabo las actividades y pruebas mas importantes de esta investigación en lo que quedaba del año y tener la mejor oportunidad de obtener un análisis de resultados significativo. La nueva planificación que se llevó a cabo se plantea en la Sección de Metodología de este informe.

• Un último inconveniente se presentó con la aparición de la epidemia de Gripe A H1N1 en Guatemala y que coincidió con la etapa en que estabamos estudiando al nuevo grupo de niños escolares y madres. Debido a las medidas profilácticas tomadas en la escuela se tuvo que modificar el calendario de toma de muestras gingivodentales prolongando el tiempo entre la primera y segunda toma de muestras a 25 – 30 días. Se tuvo que limitar también los enjuagatorios con Clorhexidina a un subgrupo de sujetos ya que bajo dichas circunstancias, no se podía tener ningún control sobre el número y forma como los llevaran a cabo tdos los sujetos de estudio.