Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Cytogenetika
jádro
buňka
chromosom
centomera
telomera
telomera
histony páry bazí
dvoušroubovice
DNA
Typy chromosomů
Karyotyp člověka
• 46 chromosomů
• 22 párů autosomů (1-22
od největšího po nejmenší)
• 1 pár gonosomů (X a Y)
7 skupin - dle velikosti a morfologie (A-G)
46,XX nebo 46,XY
Cytogenetické vyšetření
• Preimplantační - vyšetření embrya před implantací do těla matky (při umělém oplodnění)
• Prenatální – vyšetření plodu
• Postnatální
Materiál pro cytogenetické vyšetření
• Periferní krev
• Fibroblasty z kožní biopsie
• Kostní dřeň
• Nádor
• Sekční materiál (v případě úmrtí pacienta)
Kultivace periferní krve• Fytohemaglutinin – vysoce imunogenní látka –
působí proliferaci lymfocytů
Kultivace Hypotonizace FixaceVzorek krve
kolcemid
Barvení chromosomů
• Klasické barvení (Giemsovo barvivo)
G - pruhování
46,XX 46,XY
Základní morfologické skupiny chromozomů
6 – 12
13 – 15
19 – 20 21 – 22
4 – 5
A BC
D EF G
Karyotyp člověkaSkupina Chromosomy Tvar a velikost
A 1 – 3 veliký
metacentrický
B 4 – 5 veliký
submetacentrický
C 6 – 12 (+X) stř.
submetacentrický
D 13 – 15 stř. akrocentrický
E 16 – 18 malý
submetacentrický
F 19 – 20 malý
metacentrický
G 21, 22, Y malý akrocentický
velké metacentry
malé metacentry
velké akrocentry
malé akrocentry
zbytek -
submetacentry
Každý G-pruh má své číslo
Xq27.3
Chromozom X s očíslovanými G-pruhy
Syndrom fragilního X
Další metody barvení chromozomů
• R-pruhování – reverse banding
• C-pruhování – constitutive heterochromatin
• Ag-NOR – nucleolar organizers (barvení stříbrem)
• Q-pruhování – quinacrine (chinakrin)
Chromosomální aberace
• numerické (změny v počtu chromosomů)
polyploidie - změna v počtu celých chromosomových sad – triploidie
– tetraploidie
aneuploidie - změna v počtu jednotlivých chromosomů
– monosomie
– trisomie
• strukturální (přestavby částí chromosomů)
nebalancované
balancované
Chromosomální aberace
• strukturální (přestavby částí chromosomů)
nebalancované
balancované
DELECE - delINTERSTICIÁLNÍ
DELECETERMINÁLNÍ
RING CHROMOSOM
ISOCHROMOSOM
INVERZE
paracentrická pericentrická
Inverze paracentrická
Nosiči - snížená plodnost- riziko narození postiženého dítěte nízká
Inverze pericentrická
Nosiči – riziko narození postiženého dítěte 1-10% v závislosti na velikosti inverze
TRANSLOKACERECIPROKÁ
TRANSLOKACEROBERTSONOVA
Metoda FISH (fluoresceční in situ hybridizace)
FISH
(fluorescenční in situ hybridizace )
● kombinace cytogenetické a molekulární metody
● bez nutnosti izolace DNA
● pomocí značených DNA sond umožňuje vizualizaci úseků DNA v chromozomech, buňkách nebo tkáních přímo na mikroskopickém preparátu (= in situ)
● cíl DNA sondy - gen, celý chromozom či jeho část
Metoda FISH - spojení postupů klasické cytogenetiky atechnologie molekulární genetiky
Založena na schopnosti jednovláknové (denaturované) sondy DNA vázat sek cílové sekvenci (princip komplementarity)
Použití pro vyšetření chromosomů v mitóze nebo v interfázi
DNA sonda je předem označena některým fluorochromem (př. Texas Red, FITC,atd.)
Je možné použít několik typů sond – centromerické, lokus-specifické, malovací,konkrétní sondu volíme podle indikace vyšetření
Centromerické sondy: tvořeny -satelitními sekvencemi repetitivní DNA přítomné v oblasti centromery rychlá detekce numerických aberací, zejména v nedělících se buňkách
Lokus-specifické sondy: váží se specificky na vybrané místo (lokus) na chromosomu stanovení některých strukturálních změn (mikrodelečnísyndromy, specifické translokace u některých malignit atp.)
Hybridizace
cílová DNA
sonda
denaturace
hybridizace
FISH
Délka sondy pro FISH
• cca 300 – 600 bp.
• pokud je cílový úsek delší, musí být sonda před použitím naštěpena.
NE !
Mnohobarevná malovací sonda– karyotyp nádor hyperdiploidní počet chromosomů + přestavby
Typy sondcentromerická
telomerickácentromerická
X- a Y-centromerická
malovací – 1, 4 a 8
lokus - specifická
Typy sond
Mnohobarevné pruhování (M-BAND) nejnovější modifikace metody mnohobarevné FISH (M-FISHzpřesnění cytogenetické diagnostiky CAv jedné reakci analyzuje celý genom použitím mixu 24 rozdílných DNA sond každý chromosomový pár jinou barvatzv. parciálních malovacích sond specifické pro určitou oblast vyšetřovaného chromozomu 5 spektrálně odlišnými fluorochromy a jejich vzájemnou kombinací.
parciální karyotyp:
duplikace krátkého ramena chromosomu 9 ● výsledný obraz ● nasnímané jednotlivé fluorochromy● intenzity jednotlivých fluorochromů● ideogram chromosomu● pseudo G-pruhy
G-pruhy FISH M-BAND
Barvení chromosomů
Lokus specifické sondy
Normální nález
Amplifikace prokázána
vyšetření amplifikace onkogenu HER2/NEU