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http://dx.doi.org/10.4014/mbl.1502.02007
Microbiol. Biotechnol. Lett. (2015), 43(1), 56–64http://dx.doi.org/10.4014/mbl.1502.02007pISSN 1598-642X eISSN 2234-7305
Microbiology and Biotechnology Letters
주류의
풍미
및
품질
향상을
위한
야생
효모의
분리
및
특성분석
백성열1, 이유정1,2
, 김재현1, 여수환1
*
1농촌진흥청
국립농업과학원
농식품자원부
발효식품과2충북대학교
농업생명과학대학
식품생명공학과
Received: February 24, 2015 / Revised: March 6, 2015 / Accepted: March 9, 2015
서 론
우리나라의 전통주는 주로 찹쌀이나 멥쌀을 원료로 하고
누룩을 발효제로 사용하여 만들어진다. 전통주는 담금 후, 누
룩 중의 미생물에 의한 효소작용으로 원료 성분이 분해되어
당분, 아미노산, 유기산 등이 생성된다. 그리고 효모나 젖산
균 등의 미생물에 의한 알코올 발효로 휘발성 향미 성분이
생성되어 색과 함께 품질의 조화를 이룬다[22].
전통주의 담금 과정 중 미생물학적 변화에 대한 연구는 지
금까지 많은 연구자들에 의하여 진행되었으며, Seo 등[21]은
탁·약주 발효과정 중의 미생물 균총 변화를, Lee 등[14, 15]
은 효모 종류를 달리하여 탁주 술덧의 품질특성과 향기성분
을, Kim [12]은 증자와 무증자 탁·약주의 품질특성과 발효
미생물 분석을 연구하였다. 또한 Kwon 등[13]은 PCR-
DGGE 법을 이용한 막걸리 발효 중의 미생물 다양성을 조
사한 결과, Pichia kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae,
Asidia idahoensis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomycopsis
fibuligera 및 Torulaspora delbrueckii로 6종이 주요 효모로
나타났으며, 우점 효모는 배양 2일까지 Pichia kudriavzevii
가 이후에는 Saccharomyces cerevisiae로 나타났다고 보고
하였다.
최근 와인 제조 분야에서는 S. cerevisiae가 아닌 non-
Saccharomyces 효모에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.
non-Saccharomyces 효모는 포도밭에서 기인한 야생효모이
며, 다양한 효소를 세포 밖으로 분비함으로써 와인의 향기성
분 증가에 중요한 영향을 준다고 알려져 있다[3]. 와인제조
사 및 미생물학자들은 non-Saccharomyces 효모가 와인의 관
능적 특성에 관여하고 있음을 인지하고, 산업적 응용에 대한
관심을 가지고 있다[4]. non-Saccharomyces 효모의 일부 종
과 S. cerevisiae와의 혼합 발효를 통해 와인의 품질을 향상
시킨 연구 결과도 보고되었다[4]. 발효능이 낮은 레몬형 효
모인 Hanseniaspora uvarum와 이의 무성세대인 Kloeckera
apiculata는 포도 과피 표면에 가장 많이 존재하는 미생물이
며, 와인의 알코올 발효 초기에 우점종으로 작용하는 것으로
Isolation and Characterization of Wild Yeasts for Improving Liquor Flavor and Quality
Seong Yeol Baek1, You Jung Lee1,2, Jae Hyun Kim1, and Soo-Hwan Yeo1*1Fermented Food Division, Department of Agro-food Resource, NAAS, RDA, Jeollabuk-do 565-851, Republic of Korea2Department of Food Science and Biotechnology, Chungbuk National University, Cheongju 362-763, Republic of Korea
It has been known for some time to the wine industry that non-Saccharomyces yeasts play an important role in increasing volatile
components through the secretion of extracellular enzymes. The objective of this study was to investigate what types of
enzymes are produced by 1,007 non-Saccharomyces yeast strains isolated from Korean fermented foods. Among 1,007 yeast
strains, the 566, 45 and 401 strains displayed β-glucosidase, glucanase and protease activity, respectively. In addition, the 563
and 610 strains possessed tolerances against cerulenin and TFL, and the 307 strain was tolerant to 15% ethanol. Yeasts pro-
ducing harmful biogenic amines and hydrogen sulfide were excluded from further study, and eventually 12 yeast strains belong-
ing to the genera Wickerhamomyces, Hanseniaspora, Pichia, Saccharomyces were identified, based on the 26S rRNA gene
sequences. Among the 12 strains, the 9 and 5 strains possessed glucose and ethanol tolerance, respectively. Yeasts belonging
to the genus Saccharomyces produced more than 8% alcohol, but non-Saccharomyces yeasts produced only 3% alcohol.
Keywords: Yeast, non-Saccharomyces, extracellular enzyme, fermentation, liquor
*Corresponding authorTel: +82-63-238-3610, Fax: +82-63-238-3843E-mail: [email protected]© 2015, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology
Characterization of Yeasts for Improving Liquor Quality 57
March 2015 | Vol. 43 | No. 1
관찰되었다[6]. 이러한 효모들은 와인의 휘발성 향기성분 생
성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[4]. 국내 연구
진에 의해 non-Saccharomyces인 Pichia anomala Y197-13
으로 막걸리 품질 향상을 위한 연구가 수행되었다[11].
일본의 대표 술인 사케의 향기성분 중 isoamyl acetate는
과일 향과 달콤한 향을 내는 주요 성분이며, 이것은 alcohol
acetyltransferase와 esterase의 가수분해에 의해 isoamyl
alcohol과 acetyl coenzyme A의 합성물질로 알려져 있다
[28]. Isoamyl alcohol은 leucine 생합성 과정의 전구물질로
α-ketoisocaproate로부터 생성된다[10]. Leucine 생합성 과
정에서 α-isopropyl malate 생합성 효소(α-IPM)가 L-
leucine의 양이 많을 때 피드백 억제에 의해 조절되어 α-
isopropyl malate에서 α-kotoisovalerate로의 변환을 촉진한
다[2]. 이러한 경우 isoamyl alcohol 합성이 감소된다. 효모
중에서 α-IPM의 피드백 조절을 상실되어 L-leucine이 과생
산되는 균주는 에스테르와 고급 알코올류의 생산이 증가하
여 isoamyl alcohol과 isoamyl acetate 또한 증가한다. 이러한
균주의 탐색법은 5,5,5-trifluor-DL-leucine (TFL) 즉 L-
leucine 유사물질에 미생물을 노출시켜 저항성 균주를 선발하
는 것으로 보고되었다[1]. 최근에 L-leucine 피드백 조절이 제
거된 LEU4 유전자(α-IPM) 돌연변이 균주는 isoamyl alcohol
을 고생산하는 것으로 나타난 연구 결과도 보고되었다[19].
효모가 내는 또 다른 중요한 향기성분은 에스테르인 ethyl
caproate이다[28]. 이 물질의 축적과 합성은 전구체(ethanol,
caproic acid), alcohol acyl transferase와 esterase 효소의
존재에 달려 있다[25]. 지방산 생합성은 cerulenin에 의해 억
제되는 지방산 생합성 효소에 의해 촉진되며, 지방산 고생성
균주의 탐색은 cerulenin 저항성 균주를 탐색하는 것으로 알
려져 있다[8].
본 연구의 목적은 발효식품에서 분리된 효모의 특성 연구
를 통해, 우리술의 품질 향상을 위한 우수한 효모 종균의 다
양성을 확보하고자 하였다. 따라서 효모의 세포외 효소인 β-
glucosidase, glucanase, protease, amino acid decarboxylase 등
을 조사하였으며, 에탄올 내성, 황화수소 생성능 등 효모의
환경내성을 탐색하였다. 또한 효모의 경우, 아미노산 생합성
및 지방산 생합성 경로를 통해 고급 알코올류, 향기성 에스
테르 계열의 물질을 생산하는데 이 생합성 경로 저해제에 대
해 내성을 가지는 균주를 발굴함으로써, 향기가 뛰어난 것으
로 예상되는 효모 생물자원 12 균주를 확보하였다.
재료 및 방법
효모 균주 및 사용 시약
본 실험에 사용한 효모는 전국에서 수집한 발효액 등의 발
효식품 126점에서 1,007주를 분리하여 사용하였다. 비교 균
주로 시판효모인 Fermivin (Sacchromyces cerevisiae, Gist
Brocades, Denmark), Frootzen (Pichia kluyvery, Chr.
Hansen, Denmark)를 사용하였다.
배지 및 효소활성 분석
수집된 발효식품 (10 g)을 0.85% NaCl (90 ml) 용액에 현
탁하여 tYPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose,
0.0018% tartaric acid) 한천 배지[16]에 100 μl 도말하여
30oC에서 48시간 배양하였다. 배양된 효모의 집락 모양, 크
기, 색깔 등 형태적 특징을 관찰하여 서로 다른 균주를 YPD
(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) 한천 배지를
사용하여 순수분리 하였다. 순수 분리된 효모는 YPD 액체
배지에 배양 후, glycerol를 20% 함유하도록 첨가하여 80oC
에서 보관하여 실험에 사용하였다.
분리효모의 β-glucosidase (EC 3.2.1.21.), glucanase (EC
3.2.1.6.), protease (EC 3.4.), amino acid decarboxylase (EC
4.1.1.) 활성을 확인하였다. 한천 평판법으로 실험하였고 각
효소의 적합한 한천 평판을 만든 후 분리 효모를 접종하여 효
소활성 유무를 확인하였다. β-Glucosidase 활성은 esculin
(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA)을 YPD 한천배지에 농
도가 0.5% (w/v)가 되도록 첨가하고 pH 5.0으로 조정 후 멸
균한 다음, 1% ferric ammonium citrate (Sigma-Aldrich
Co., St. Louis, USA)를 농도가 2% (v/v) 되도록 첨가하여 배
지를 제조하였다. 이 배지에 효모를 접종하고 30oC에서 24시
간 배양 후 집락 주변에 검은색 환의 생성 유무에 따라 평가
하였다[7]. Glucanase는 β-D-glucan (Sigma-Aldrich Co., St.
Louis, USA)을 YPD 한천 배지 전체 농도의 0.2% (w/v)로 첨
가하여 제조 후 효모를 접종하고 30oC에서 48시간 배양한 다
음 congo red (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA)를 0.1%
으로 희석한 용액으로 염색 후 집락 주변에 형성된 투명 환
의 생성 여부로 활성을 확인하였다[23]. Protease는 YM
(0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1%
glucose) 한천 배지에 skim milk 농도가 1% 되도록 첨가하
여 제조 후 효모를 접종하고 30oC에서 48시간 배양 한 다
음 집락 주변에 형성된 투명 환으로 활성을 확인하였다. 그리
고 amino acid decarboxylase는 YPD 한천 배지에 아미노산
1% (histidine, tyrosine, phenylalanine, tryptophane, lysine,
leucine) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA), bromocresol
purple (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA)을 0.006%가 되
도록 첨가하고 pH 5.3으로 조정한 다음 효모를 접종 후 집락
주변 보라색 환의 생성 여부에 따라 평가하였다[18].
에탄올, 아황산 내성 및 황화수소 생성능 분석
에탄올 내성 평가는 YPD 한천 배지에 5%, 10%, 15%의 에
탄올을 첨가하여 제조한 후 효모를 접종하여 집락의 생성여
58 Baek et al.
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부에 따라 내성을 평가하였다[17]. 아황산 내성 평가는 YPD
한천 배지에 tartaric acid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis,
USA)을 전체 농도의 1.8%가 되도록 첨가하고 1 M K2S2O5
를(Daejung Chemicals Co., Ltd, Korea) 첨가하여 SO2의
농도가 20 mg으로 조정한 후 효모를 접종하여 집락의 생성
여부에 따라 내성을 평가하였다[5]. 황화수소 생성능을 알아
보기 위해 Biggy 한천 배지(Becton Dickinson GmbH,
Heidelberg, Germany)에 효모를 접종하여 30oC에서 48시간
배양 한 다음, 집락 색깔의 진하기에 따라 황화수소 생성능
을 평가하였다[5].
Cerulenin 및 5,5,5-trifluor-DL-leucine 내성
Cerulenin과 5,5,5-trifluor-DL-leucine (TFL) (Sigma-
Aldrich Co., St. Louis, USA)의 대한 저항성은 0.67% YNB
(yeast nitrogen base), 2% glucose, 2% agar 조성의 한천
배지에 cerulenin (25 μM)과 TFL (1 mM)을 각각 첨가하여
제조 후 효모를 접종하고 30oC에서 48시간 배양 한 다음 집
락 생성 여부에 따라 평가하였다[26].
효모의 동정
분리 효모를 동정하기 위하여 26S rRNA 유전자의 D1/D2
부위 염기서열을 분석하였다. 프라이머[27]로 NL1 (5'-
GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3') 및 NL4 (5'-
GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')를 사용하여 26S rRNA
D1/D2 부위 단편을 증폭 후, ㈜ZEOTECH사에 의뢰하여 염
기서열을 분석하였다. 염기서열은 National Center for
Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)
의 BLAST를 사용하여 26S rRNA 유전자 단편의 염기서열
상동성을 비교하였으며, 염기서열은 DNASTAR pro software
(SeqMan Pro, Ver 8.1.5., Lasergene)를 이용하여 수행하였
다. 효모의 계통분석도(phylogenetic tree) 작성은 GenBank
에 보고된 다른 효모 균주의 26S rRNA 염기서열을 비교 분
석하여, MEGA version 4.0 [24]의 neighbor-joining method
[20]로 작성하였다.
당 및 에탄올 내성 측정
분리 효모의 포도당에 대한 내성 측정은 포도당 농도를 20,
30, 40% 첨가한 YPD 액체 배지(yeast extract 1%, peptone
2%, glucose 1.5%, pH 6.5)에 효모를 접종하고 30oC에서
180 rpm으로 24시간 동안 진탕 배양한 후 600 nm에서 흡
광도를 측정하여 균주의 성장을 비교하였다. 이때 대조구는
포도당 1%를 첨가한 YPD 액체 배지에서 효모 균주의 성장
으로 하였다. 에탄올 내성은 에탄올이 각각 0, 5, 10, 15%의
농도로 함유된 YPD 액체 배지 10 ml에 전 배양한 효모의
배양액을 0.1% 농도로 접종하고 25oC에서 5일간 배양 후,
600 nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 성장을 조사하였다.
에탄올 발효능 분석
효모의 에탄올 생성량은 전 배양한 효모를 포도당 25%가
함유된 YPD 액체 배지 100 ml에 0.1%의 농도로 접종하고
30oC에서 48시간 동안 정치 배양한 후, 10,000 rpm에서
10분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 생성된 에탄올 함
량을 측정하였다. 에탄올 함량은 비중법을 이용하여 배양 상
등액 100 ml를 증류한 다음 70% (v/v)를 메스실린더에 회수
하고 다시 증류수를 이용하여 100 ml로 정용한 다음 주정계
를 이용하여 측정하였다[9].
결과 및 고찰
효모의 효소활성
효모의 β-glucosidase, glucanase, protease 및 amino
acid decarboxylase 효소 활성을 확인한 결과는 Table 1에
나타내었다. β-Glucosidase는 분리 균주 1,007주 중에서 566
균주가 활성을 보였고, glucanase는 45 균주 만이 활성을 보
였다. Protease 활성은 401 균주에서 나타났다. 바이오제닉
아민(biogenic amine, BAs)은 아미노산의 탈탄산작용, 아미
노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 생성되는 질소화합
물이다. 바이오제닉아민류는 단백질을 함유한 식품이 미생
물에 의해 분해되는 과정에서 생성되며, 알러지 유발물질인
히스타민(histamine)과 티라민(tyramine)이 대표적이다[18].
Amino acid decarboxylase 활성을 보유한 효모는 바이오제
닉아민류 생성 가능성이 높으며, 각 아미노산 기질을 바이오
제닉아민류로 변화시킨 균주를 조사한 결과, histidine은
69 균주, tyrosine은 306 균주, phenylanine은 171 균주,
Table 1. Yeast isolates used in this study.
β-Glucosidase Glucanase ProteaseAA decarboxylation
His Tyr Phe Trp Lys Leu
566 45 401 69 306 171 23 197 198
Tolerance Ethanol tolerance H2S production
Cerulenin TFL 5% 10% 15%
563 610 934 792 307 500
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tryptophane은 23 균주, lysine은 197 균주, leucine은 198
균주로 나타났다. 또한 cerulenin, TFL, SO2, 에탄올 내성 균
주 및 황화수소 생성능에 대한 결과는 Table 1에 나타내었
다. Cerulenin, TFL 내성 균주는 각각 563, 610 균주로 나타
났고, SO2 내성은 22 균주로 상대적으로 적은 수의 효모에
서 나타났다. 에탄올 내성의 경우, 에탄올 농도가 높을수록
내성을 나타내는 균주는 현저히 감소하였으며, 에탄올 농도
가 5%, 10%, 15%에 대하여 각각 934, 792, 307 균주로 나타
났다. 황화수소를 생성할 것으로 추정되는 효모는 500 균주
로 분석되었다.
위 결과를 바탕으로 biogenic amine decarboxylase 활성
미보유 균주, 황화수소 저생성 균주 중심으로 1차 선별 하였
으며, 이후 효소 활성능, cerulenin, TFL, SO2, 에탄올 내성
특성 등을 보유한 12 균주를 선별하였다(Table 2).
β-Glucosidase는 와인 제조시 비휘발성 향기성분으로 중
요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 이는 non-Saccharomyces 효
모에서 많이 발견된다고 보고되었다[7, 23]. 특히, Hansenispora
vinea와 Candida 종이 생산한 glucosidase가 와인의 다양한
향에 영향을 미친다고 알려져 있다[23]. β-Glucosidase 활성
은 시판 효모인 S. cerevisiae, P. kluyvery보다 분리 효모인
N43-8, N77-4, SM2-7, Y685, BY30-1, M1-9, SD1-2 등 7
균주가 더 우수한 것으로 나타났다.
Glucanase 활성은 시판 효모인 S. cerevisiae, P. kluyvery
에서 나타나지 않았으며, N43-8, Y685 2 균주만 활성을 나
타내었다. Glucanase 활성을 보유한 균주로는 Candida
stellata, C. hellenica, C. pulcherrima, Kloeckera apiculata 효
모들로 보고된 바 있다[23]. Protease의 경우, 약한 활성을 보
인 균주가 7균주로 나타났다. 또한, amino acid decarboxylase
활성은 선발 효모와 시판 효모 모두 음성으로 나타난 것으
로 보아 바이오제닉아민류 생성 가능성이 매우 낮을 것으로
예상되었다.
Cerulenin, TFL, SO2, 알코올 내성 균주
효모가 생성하는 고급 알코올류와 에스테르 계열의 성분
들이 주류의 향을 증진시킬 수 있음을 감안하여, cerulenin
과 TFL에 내성을 보유한 효모를 탐색하였다. Cerulenin과
TFL은 isoamyl alcohol과 caproic acid를 생산할 수 있는 균
을 선별하는데 사용되어 왔다[8]. 선별된 12주의 효모 중
cerulenin과 TFL에 대하여 내성을 나타낸 효모는 각각 8, 7
균주로 나타났다(Table 3). N43-8, N56-10, N77-4, SM2-7,
Y447, Y685 및 HP1-2 균주는 cerulenin과 TFL에 대한 내
성을 동시에 가지며, CM4-5 균주는 cerulenin 내성만 가지
는 것으로 나타났다. A9-1, BY30-1, M1-9, SD1-2 효모와 시
판효모인 S. cerevisiae는 두 가지 항생물질에 대해 민감한
것으로 나타났다. non-Saccharomyces 시판효모인 P. kluyvery
는 cerulenin과 TFL에 내성을 나타내어, 두 항생물질에 감
수성을 보인 S. cerevisiae와 대조적인 결과를 나타내었다.
Cerulenin과 TFL에 내성을 나타낸 7주의 효모는 고급 알코
Table 2. Production of extracellular enzymes of selected wild type yeasts and commercial yeasts.
Strains β-Glucosidase Glucanase ProteaseAA decarboxylation1
His Tyr Phe Trp Lys Leu
N43-8 +++ + - - - - - - -
N56-10 - - + - - - - - -
N77-4 +++ - + - - - - - -
SM2-7 +++ - + - - - - - -
Y447 - - - - - - - - -
Y685 +++ + - - - - - - -
A9-1 - - + - - - - - -
BY30-1 ++ - - - - - - - -
CM4-5 + - + - - - - - -
M1-9 ++ - + - - - - - -
SD1-2 ++ - + - - - - - -
HP1-2 + - - - - - - - -
Frootzen ++ - - - - - - - -
Fermivin + - + - - - - - -
Positive result clear or fluorescence zone of more than 1 mm margin from edge of colony: +, 1 mm; ++, 2 mm; +++, 3 mm; –,
negative result.1Amino acid decarboxylase activity means biogenic amines production.
60 Baek et al.
http://dx.doi.org/10.4014/mbl.1502.02007
올류와 에스테르 계열의 향기성분을 생산할 수 있을 것으로
예상되며, 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된
다. SO2에 대하여 내성을 나타낸 효모는 2 균주로 A9-1과
HP1-2로 나타났다. 시판효모인 S. cerevisiae는 SO2에 대한
내성이 높은 것으로 나타났다. 알코올 내성에 대해서는 대부
분의 효모가 높은 내성을 보였으며, 그 중 N56-10, Y447 균
주는 알코올 내성이 상대적으로 낮은 것으로 나타났다. 황화
수소는 와인이나 알코올 음료에 좋지 않는 냄새로 미생물 발
효에 의해 생성될 수 있는데[5], 본 연구에 사용한 시판효모
를 포함하여 대부분의 효모는 황화수소 생성능이 낮았으며,
SM2-7, Y447, CM4-5, M1-9, SD1-2, HP1-2 균주는 생성능
이 거의 없는 것으로 보아 와인이나 전통주 발효산업에 사
용 가능할 것으로 기대된다.
효모 동정
선발된 효모 12 균주의 26S rRNA 유전자의 D1/D2 부위
염기서열 분석 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 효모 12주는 C.
tropicalis, H. opuntiae, H. uvarum, P. kudriavzevii, S.
cerevisiae 및 Wickerhamomyces anomalus로 각각 동정되
었다. SD1-2, M1-9, CM4-5, A9-2, BY30-1 균주는 S.
cerevisiae로 동정되었다. HP1-2 균주는 H. opuntiae, N56-
10 균주는 H. uvarum, N43-8, SM2-7, Y685 균주는 W.
anomalus, Y447 균주는 C. tropicalis, N77-4 균주는 P.
kudriavzevii로 각각 동정되었다.
효모의 내당성 및 에탄올 내성
주류 제조에 이용되는 효모는 고농도의 당에서 충분히 생
육을 하면서 알코올 발효를 진행할 수 있어야 하므로 선발
된 효모 12 균주를 대상으로 포도당이 20%, 30%, 40%로 첨
가된 YM 액체 배지에서 생육과 당 내성을 비교하였다(Fig.
2). S. cerevisiae 효모 중에서 BY30-1 균주를 제외하고, 대체
적으로 포도당 40%가 첨가된 YM 액체 배지에서 양호한 생
육을 나타내었다. non-Saccharomyces 효모 중에서는 H.
opuntiae HP1-2, C. tropicalis Y447 균주를 제외하고 포도
당 40%가 첨가된 YM 액체 배지에서 생육이 양호한 것으로
보아 내당성이 우수하며 주류 제조에 사용 가능성이 충분한
것으로 판단된다.
일반적으로 일정 수준 이상의 에탄올 농도에서는 효모 생
육이 저해되어 더 이상 알코올 발효가 일어나지 않는 것으
로 알려져 있으며[24], 주류 등 알코올 발효음료 제조용 효
모는 에탄올에 우수한 내성을 보유하는 것이 바람직하다. 효
모 12 균주를 대상으로 에탄올을 5%, 10%, 15% 농도로 첨
가한 YM 액체 배지에서 효모 생육과 에탄올을 첨가하지 않
은 YM 액체 배지에서의 생육을 비교한 결과(Fig. 3), 배양
5일 뒤 S. cerevisiae 효모 중에서 BY30-1를 제외하고는 10%
에탄올 첨가한 YM 액체 배지에서 효모의 생육은 양호하였
으나 15% 에탄올 농도에서는 모두 생육이 낮게 나타났다.
non-Saccharomyces 효모 중에서는 균주마다 다른 특성이 나
타났다. 5% 에탄올 농도의 경우, H. uvarum N56-10, H.
Table 3. The cerulenin, TFL, SO2 and ethanol tolerance and production of H2S of selected wild type yeasts and commercial yeasts.
Strains Cerulenin TFL SO2
Ethanol con. H2S
production1 5% 10% 15%
N43-8 + + - + + + +
N56-10 + + - + - - +
N77-4 + + - + + + +
SM2-7 + ++ - + + + -
Y447 + + - + - - -
Y685 + + - + + + +
A9-1 - - + + + + +
BY30-1 - - - + + - +
CM4-5 + - - + + + -
M1-9 - - - + + + -
SD1-2 - - - + + + -
HP1-2 + + + + + - -
Frootzen + + + + + - ++
Fermivin - - ++ + + + +
Tolerance symbols ; + growth, - no growth.1-, no color; +, light brown; ++, dark brown.
Characterization of Yeasts for Improving Liquor Quality 61
March 2015 | Vol. 43 | No. 1
Fig. 1. Phylogenetic tree based on 26S rDNA sequences showing the relative genetic position of the selected 12 yeast strains
isolated from Korean fermented food.
Fig. 2. Glucose tolerance of selected wild yeast strains and commercial yeasts. The selected wild yeast strains were grown shaking
on 100 ml of YPD broth medium containing 1, 20, 30, and 40% glucose in 250 ml flask at 30oC for 24 h. Glucose tolerance was determined
by absorbance of yeasts growth at 660 nm. The data were averages based on three trials.
62 Baek et al.
http://dx.doi.org/10.4014/mbl.1502.02007
opuntiae HP1-2 균주를 제외하고는 양호한 생육을 보였다.
그러나 10% 에탄올 첨가한 YM 액체 배지에서 효모의 생육
은 P. kudriavzevii N77-4를 제외한 모든 효모가 저조하였으
며, P. kudriavzevii N77-4는 에탄올 농도 15%에서 생육이
낮은 것으로 나타나 에탄올 내성이 non-Saccharomyces 효
모 중에서 상대적으로 높은 것으로 나타났다.
효모의 에탄올 발효능
효모 12 균주를 대상으로 포도당을 25% 첨가한 YM 액체
배지에서 48시간 배양한 후 각 균주의 에탄올 생성량을 측
정한 결과(Fig. 4), S. cerevisiae SD1-2 균주의 에탄올 생성
량이 9.5%로 가장 우수하였으며, S. cerevisiae 속 균주들은
최소 7.3%에서 최고 9.5%의 에탄올 생성량을 나타내었다.
non-Saccharomyces 균주 중에서는 W. anomalus N43-8,
SM2-7 균주가 4.7%으로 높은 에탄올 생성량을 보였으며, 최
소 2.2%에서 최고 4.7%로 나타났다. Kim 등[11]이 P.
anomala Y197-13 효모로 막걸리 제조 연구에서 알코올 함
량이 11.1%로 나타나 막걸리 제조시 좋은 후보 균주가 될 수
있다고 보고하였다. 또한 Pichia 속 효모와 non-Saccharomyces
속 효모들은 와인 등의 아로마 형성에 중요한 역할을 한다
고 알려져[3, 23] 본 연구에서 선발한 7주의 non-Saccharomyces
속 효모 균주 역시 추가적인 주류 제조 연구를 진행하고 있
으며 독특한 향미를 가진 주류 발효음료 제조 가능성이 있
을 것으로 판단된다.
요 약
non-Saccharomyces 효모는 야생효모로서, 다양한 효소를
세포 밖으로 분비하여 와인의 향기 성분 증가에 중요한 영
향을 준다고 알려져 있다. 본 연구에서는 한국의 발효식품에
Fig. 3. Ethanol tolerance of selected wild yeast strains and commercial yeasts. The selected wild yeast strains were grown static
culture on 10 ml of YPD broth medium containing 0, 5, 10, and 15% ethanol in test tube at 25oC for 5 days. Ethanol tolerance was deter-
mined by absorbance of yeasts growth at 660 nm. The data were averages based on three trials.
Fig. 4. Ethanol production by selected wild yeast strains and commercial yeasts. The selected wild yeast strains were grown static
culture on 100 ml of YPD broth containing 25% glucose in 500 ml flask at 30oC for 48 h. Ethanol production was determined by alco-
holometer. The data were averages based on three trials. *, significance between commercial yeasts (Fermivin and Frootzen) and selected
strains, p < 0.05.
Characterization of Yeasts for Improving Liquor Quality 63
March 2015 | Vol. 43 | No. 1
서 분리된 효모 1,007주의 세포외 효소 활성을 조사하였다.
그 결과, β-glucosidase 566, glucanase 45, protease 401로
나타났으며, AA decarboxylase 활성 균주는 각 아미노산 별
로 His 69, Tyr 306, Phe 171, Trp 23, Lys 197, Leu 198
균주로 나타났다. Cerulenin 과 TFL 내성 균주는 각각 563,
610주로, 15% 에탄올 내성 균주는 307주로 나타났다. 황화
수소 생성균은 500주로 조사되었다. AA decarboxylation와
황화수소 저생성 균주 중 유용 효모 12 균주를 선발하여 26S
rDNA 염기서열을 분석한 결과, C. tropicalis, H. opuntiae,
H. uvarum, P. kudriavzevii, S. cerevisiae, W. anomalus
로 각각 동정되었다. 12주의 효모 중 당 내성 우수 균주는
9주이며, 알코올 내성 우수 균주는 5 균주로 나타났다. 알코
올 발효능은 Saccharomyces 효모는 8% 이상으로 나타났으
며, non-Saccharomyces 효모는 3% 내외로 나타났다.
Acknowledgments
This work was carried out with the support of “Cooperative
Research Program for Agriculture Science & Technology Develop-
ment (Project No. PJ00947701)” Rural Development Administra-
tion, Republic of Korea.
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