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EFECTO DE LA INHIBICIÓN DE LA PROTEÍNA QUINASA C
EN LA DIFERENCIACIÓN DE MONOCITO
INDUCIDA POR FORBOL 12-MIRISTATO-13 ACETATO
MONICA PATRICIA CUBILLOS ROJAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGIA
Bogotá, D.C.
Junio 13 de 2007
EFECTO DE LA INHIBICIÓN DE LA PROTEÍNA QUINASA C
EN LA DIFERENCIACIÓN DE MONOCITO
INDUCIDA POR FORBOL 12-MIRISTATO-13 ACETATO
MONICA PATRICIA CUBILLOS ROJAS
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el título de
BIOLOGA
JEAN PAUL VERNOT, Biol., Ph.D., Director
ANA MARIA PERDOMO, M.D., M.Sc., Co-directora
VIVIANA RODRIGUEZ, Bac., M.Sc., Asesora
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGIA
Bogotá, D.C.
Junio 13 de 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
ANEXO 1CARTA DE AUTORIZACIÓN DE LOS AUTORES PARA CONSULTA Y PUBLICACIÓN
ELECTRÓNICA
Ciudad y FechaBogotá, agosto 21 de 2007
SeñoresPONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANACuidadEstimados Señores:
Yo Mónica Patricia Cubillos Rojas (nosotros), identificado(s) con C.C. No. 53.122.858, autor(es) del trabajo de grado tituladoEfecto de la inhibición de la proteína quinasa C en la diferenciación de monocito inducidapor forbol 12 miristato 13 acetato, presentado como requisito para optar al título de Bióloga en el año de 2007; autorizo(amos) a la Universidad Javeriana a: (escriba si o no en cada opción según la decisión tomada con su Director de trabajo de grado).
a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrónico con el fin de ofrecerlo para la consulta en la Biblioteca General.____Si_______
b) Poner a disposición para la consulta con fines académicos, en la página web de la Facultad, de la Biblioteca General y en redes de información con las cuales tenga convenio la Universidad Javeriana. ____Si______
c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea seleccionado para participar en concursos de trabajos de grado. _____Si________
d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades educativas con las que la facultad tenga convenio de intercambio de información, para que este sea consultado en las bibliotecas y centros de documentación de las respectivas entidades. __Si___
e) Todos los usos, que tengan finalidad académica. ____Si_____
Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que se consulte la obra, mediante cita bibliográfica se debe dar crédito al trabajo y a su(s) autor(es). Este documento se firma, sin perjuicio de los acuerdos que el autor(es) pacte con la Unidad Académica referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad industrial que puedan surgir de la actividad académica.
ANEXO 2FORMATO DESCRIPCIÓN TRABAJO DE GRADO
AUTOR O AUTORES
Cubillos Rojas Mónica PatriciaApellidos Nombres Vernot Jean Paul Perdomo Ana Maria DIRECTOR (ES)Apellidos Nombres Rodriguez Viviana ASESOR (ES) O ASESORApellidos Nombres
TRABAJO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE: ____Bióloga_______________________TÍTULO COMPLETO DEL TRABAJO: __Efecto de la inhibición de la proteína quinasa
C en la diferenciación de monocito inducidapor forbol 12 miristato 13 acetato_________
SUBTÍTULO DEL TRABAJO: ____________________________________________________________________________________________________________________FACULTAD: __Ciencias___________________________________________________PROGRAMA: Carrera __x__ Especialización ____ Maestría ____ Doctorado ____NOMBRE DEL PROGRAMA: _Biología_______________________________________CIUDAD: BOGOTA AÑO DE PRESENTACIÓN DEL TRABAJO: ______2007________NÚMERO DE PÁGINAS _______67__________________________________________
TIPO DE ILUSTRACIONES:- Ilustraciones- Mapas- Retratos- Tablas, - gráficos y diagramas- Planos- Láminas- Fotografías
MATERIAL ANEXO (Vídeo, audio, multimedia o producción electrónica):Duración del audiovisual: ___________ Minutos.
Número de casetes de vídeo: ______ Formato: VHS ___ Beta Max ___ ¾ ___ Beta Cam ____ Mini DV ____ DV Cam ____ DVC Pro ____ Vídeo 8 ____ Hi 8 ____Otro. Cual? _____
Sistema: Americano NTSC ______ Europeo PAL _____ SECAM ______Número de casetes de audio: ________________Número de archivos dentro del CD (En caso de incluirse un CD-ROM diferente al trabajo de grado:
DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVE: ___Diferenciación, monocito, péptido quimérico, proteína quinasa C RESUMEN DEL CONTENIDO Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígenos
más potentes del sistema inmune. Se sabe que pueden originarse a partir
de diferentes precursores hematopoyéticos, incluidos los monocitos por la
estimulación con GM-CSF e IL-4. Ambas citoquinas señalizan a través de
la proteína quinasa C (PKC), sugiriendo que la activación directa de PKC
sea suficiente para inducir un fenotipo de CD. Esto ha sido demostrado
para otros progenitores de CD pero no para monocitos. En este trabajo se
estableció un modelo de diferenciación in vitro de monocitos estimulados
con forbol 12-miristato-13 acetato (PMA), activador de la PKC. En una
primera etapa se establecieron las condiciones para el aislamiento de
monocitos en una buena cantidad y pureza. Establecimos que densidades
bajas de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y
adherencias de hasta 24 horas permiten la obtención de un buen número
de monocitos. Sin embargo, los métodos de desprendimiento celular con
EDTA resultaron en la pérdida de viabilidad y en un bajo de número
celular, optándose por el desprendimiento por incubación en hielo de la
microplaca. Experimentos posteriores mostraron que si esas células se
purificaban además con perlas inmunomagnéticas CD14, se obtenía una
pureza cercana al 85%. Estas células se estimularon con TNFα y PMA a
bajas (10 ng/ml = 16 nM) y altas (l00 nM) concentraciones. Ambas
condiciones produjeron células con morfología semejante a CD, pero el
cambio se produjo más rápido a altas concentraciones. Únicamente en
las células tratadas con PMA a 100 nM se encontró una regulación
negativa de CD14 y CD45 y una regulación positiva de CD83, mostrando
un direccionamiento hacia CD. Sin embargo, no hubo variaciones en la
expresión de CD11b ni de CD86. Además, el patrón de expresión de
HLA-DR no se sobre-regulo positivamente, como se hubiera esperado en
una CD madura. Finalmente, se demostró que estos cambios inducidos
por el PMA, son mediados por la PKC, en la medida que el péptido
quimérico, inhibidor de la actividad de la enzima, revirtió todos los
cambios, mostrando su posible utilidad para bloquear selectivamente esta
vía de señalización.
A mis padres por ser el soporte y el apoyo
en todos los momentos de mi vida.
A mis hermanos por la compañía,
la solidaridad y el apoyo incondicional.
A todos mis demás familiares por el apoyo y el cariño.
A mi Mayta, mi ángel protector por siempre.
AGRADECIMIENTOS
A mis padres por su solidaridad, motivación y apoyo económico.
Al Dr. Jean Paul Vernot por su orientación, apoyo, conocimiento compartido y
haberme permitido la oportunidad de vincularme al grupo de investigación de
Fisiología Celular y Molecular de la Universidad Nacional de Colombia.
A la Dra. Ana María Perdomo por compartir sus conocimientos a lo largo del
desarrollo de este trabajo de investigación y desde mi vinculación al grupo, por su
infinita paciencia, su preocupación y sus buenos consejos.
A los demás integrantes del grupo por su colaboración.
Al grupo de Síntesis de la Fundación Instituto Inmunologia de Colombia por la
síntesis y caracterización de los péptidos.
A todas las personas integrantes del laboratorio de Parasitología de la Facultad de
Medicina de la Universidad Nacional de Colombia, por haberme permitido el
desarrollo del trabajo experimental en sus dependencias.
A todos los donantes de sangre, especialmente a los que repitieron más de una vez,
sin ustedes hubiera sido imposible desarrollar este trabajo.
vi
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN 1. Introducción 10 2. Marco teórico 13 2.1 Monocitos 13 2.1.2 Células dendríticas derivadas de monocitos 14 2.2 PKC en la diferenciación celular 17 2.2.1 PKC durante la diferenciación de células dendríticas 17 2.3 Estructura de PKC 18 2.3.1 Activación de la PKC 20 2.4 Péptidos permeables 21 3. Formulación del problema y justificación 23 3.1 Formulación del problema 23 3.2 Justificación de la investigación 24 4. Objetivos 26 4.1 Objetivo general 26 4.2 Objetivos específicos 26 5. Materiales y métodos 27 5.1 Separación de células mononucleares a partir de sangre
periférica humana 27 5.2 Aislamiento de monocitos 27 5.3 Diferenciación de monocitos 28 5.4 Caracterización celular 28 5.5 Síntesis de péptidos 28 5.6 Inhibición PKC mediante el péptido quimérico 29 6. Resultados 30 6.1 Aislamiento y estimulación de monocitos 30 6.2 Inhibición de PKC por el péptido quimérico durante el 44 proceso de diferenciación 7. Discusión y conclusiones 50 8. Recomendaciones 56 9. Literatura citada 57 10. Anexos 66
vii
LISTA DE FIGURAS Figura 1. Patrones de citometría de células adheridas y no a
las 4 y 24 h de incubación 31 Figura 2. Efecto de la densidad de CMSP por unidad de área
de la caja de cultivo 33 Figura 3. Morfología de células adheridas cultivadas hasta por
6 días 34
Figura 4. Aislamiento y purificación de monocitos marcados con perlas inmunomagnéticas CD14 y separados por columna 36
Figura 5. Inmunofenotipo de las células marcadas con perlas inmunomagnéticas CD14 y separadas por columna 37
Figura 6. Morfología e inmunofenotipo de células CD14+
cultivadas hasta por 6 días 38 Figura 7. Morfología de células CD14+ cultivadas hasta por 2
días 39 Figura 8. Inmunofenotipo células CD14+ cultivadas por 2
días 41
Figura 9. Inmunofentipo de la población de monocitos 42 Figura 10. Morfología e inmunofenotipo de células CD14+
cultivadas hasta por 2 días y estimuladas con PMA solo y TNFα solo 43
Figura 11. Efecto del tratamiento con los péptidos HKPS Y HKK
en células estimuladas y no sobre la viabilidad 45 Figura 12. Aspecto del cultivo en células tratadas y no con HKPS 47 Figura 13. Efecto del tratamiento con los péptidos HKPS y HKK
sobre el inmunofenotipo 48
Figura 14. Efecto del tratamiento con los péptidos HKK y HKPS sobre la población de monocitos 49
viii
1. Introducción
Los monocitos son precursores circulantes de macrófagos tisulares y de células
dendríticas (CD). Los macrófagos y CD derivados de monocitos cumplen un papel
importante en la respuesta inmune innata y adaptativa durante la inflamación;
además, los monocitos mantienen estas poblaciones celulares en los tejidos
periféricos durante la homeostasis. La capacidad de los monocitos de diferenciarse a
CD se demostró por primera vez in vitro con células humanas, procedimiento que se
convertiría a la postre en la aproximación metodológica de preferencia para la
producción de CD y su utilización en inmunoterapia contra el cáncer. Sin embargo,
todavía hay controversia al respecto de la ocurrencia in vivo en humanos de este
proceso de diferenciación y cual(es) supboblación(es) de monocitos sería(n)
responsable(s) fisiológica(s) de este proceso. El hecho de que subpoblaciones de
monocitos murrnas, equivalentes a las humanas, tengan la capacidad de diferenciarse
in vivo a CD cuando migran al bazo, y a macrófagos cuando migran a la cavidad
toráxica, sugiere primero, que en humanos este proceso también podría suceder y
segundo, que la diferenciación a CD es dependiente del microambiente celular. Al
igual que en ratones, se cree que los monocitos responsables de la generación de CD
durante procesos inflamatorios es la subpoblación CD14+, CD16- que expresan
CCR2, CD64 y CD62L. Aunque otras poblaciones de células CD14+/bajo son
responsables del mantenimiento estable de CD durante la homeostasis. La variación
existente en los precursores monocíticos de CD con toda seguridad es un elemento
adicional que contribuye a la diversidad encontrada en estas últimas y establece un
modelo experimental para estudiar las relaciones entre estas poblaciones y los
mecanismos moleculares de su diferenciación.
Las citoquinas más utilizadas para inducir la diferenciación de CD a partir de
monocitos de diferentes orígenes son IL-4 y GM-CSF, a veces en combinación con
TNFα. Estos mismos factores, en combinación con SCF, han sido también utilizados
con CD34+ de cordón umbilical para la diferenciación de estos progenitores
hematopoyéticos a CD. Si bien las CD que se producen a partir de monocitos y de
10
CD34+ son similares, la regulación de la expresión de moléculas co-estimulatorias
como CD80 y CD86 es diferente, lo que indicaría que los procesos de señalización
intracelular tienen requerimientos distintos. Esto tendría importancia en la respuesta
inmune ya que la capacidad de estimulación de linfocitos T se ve afectada de manera
diferencial en estos dos tipos de CD.
La señalización de estas citoquinas incluye la activación de la PKC, lo que sugiere
que la sola activación de la PKC podría ser suficiente para inducir un fenotipo de CD.
Esto ha sido estudiado y demostrado claramente para las células CD34+, en parte por
su mayor utilidad en transplantes, pero no para monocitos. Por otra parte, el hecho de
que el proceso mismo de diferenciación hacia CD a partir de CD34+ y monocitos
estimulados con citoquinas ocurra con una cinética distinta, sugiere que el papel de
PKC podría ser variado en estos precursores y que su activación en monocitos podría
generar un fenotipo celular con características funcionales diferentes a una CD
madura, de eventual utilidad en algunos desórdenes inmunes.
El trabajo desarrollado por el Grupo de Fisiología Celular y Molecular de la
Universidad Nacional de Colombia, ha evidenciado la importancia de la PKC en
procesos de proliferación celular y supervivencia en células del sistema inmune. En
estos trabajos se ha podido inhibir la actividad de PKC mediante la internalización de
un péptido quimérico constituido por una secuencia pseudosustrato de la enzima y
una secuencia de transducción proteica (DTP) con capacidad de internalización
celular. Este péptido quimérico se constituye en una herramienta muy útil para el
estudio de esta vía de señalización en otros procesos fisiológicos como la
diferenciación celular.
El propósito de este trabajo fue 1) estandarizar un proceso de diferenciación celular
de monocitos estimulados con PMA (activador de la PKC) y caracterizar el fenotipo
obtenido y su similitud con CD en relación a la morfología y a la expresión de
algunos marcadores; 2) determinar el efecto de la inhibición de PKC en este proceso
de diferenciación y 3) valorar la utilización de un péptido quimérico como una
11
herramienta para el estudio de vías específicas de señalización durante la
diferenciación celular. Este trabajo permitirá determinar la contribución de esta vía de
señalización durante la estimulación de monocitos con PMA y a futuro permitirá
realizar comparaciones funcionales entre CD obtenidas a partir de precursores y
estimulaciones diferentes.
12
2. Marco teórico
2.1 Monocitos
Los monocitos circulantes CD14+ se originan a partir de células madre
hematopoyéticas en la medula ósea y representan del 5 al 10% de leucocitos en
humanos. Los monocitos son una población heterogénea en términos de marcadores
de superficie, tamaño, forma, granularidad capacidad fagocítica y potenciales de
diferenciación (Seta y col. 2007). La vida media de los monocitos en sangre es
relativamente corta, cerca de un día en ratones y tres días en humanos. Este hecho
soporta el concepto que los monocitos sanguíneos pueden repoblar continuamente
las poblaciones de macrófagos o de células dendríticas (CD) para mantener la
homeóstasis y durante la inflamación para diferenciarse hacia estos dos tipos
celulares, cumpliendo un rol importante en la inmunidad innata y adaptativa (Tacke
y col. 2006).
Diversos trabajos muestran que los monocitos circulantes además de diferenciarse
dentro de una variedad de fagocitos incluyendo macrófagos, células dendríticas,
osteoclastos, microglia en el sistema nervioso central y células de Kupffer en el
hígado, también lo pueden hacer en células no fagocíticas de tejidos óseo, cartílago,
músculo esquelético y cardiaco, nervioso y endotelio (Seta y col. 2007).
Los monocitos se identificaron inicialmente por la expresión elevada de CD14, que
sirve como parte del receptor para el lipopolisacárido. Sin embargo, posteriormente se
ampliaron los marcadores de superficie y se mostró, que los monocitos en sangre
periférica humana eran una población bastante heterogénea, y que el marcador CD16,
también conocido como receptor FcγIII, permitía dividir los monocitos en dos
grupos: células CD14altoCD16-, los cuales son los llamados monocitos clásicos,
porque su fenotipo se asemeja a la descripción original de monocitos y las células
CD14+CD16+, que expresan mayores cantidades de moléculas de complejo mayor de
13
histocompatibilidad (CMH) clase II y CD32, por lo cual se ha sugerido su semejanza
a macrófagos maduros residentes en tejidos. Otras diferencias fenotípicas se dan en
los receptores de quemoquinas, mientras los monocitos CD14+CD16+ expresan
receptor quemoquina CC-5 (CCR5), los monocitos CD14altoCD16- expresan CCR2
(Gordon y col. 2005). Otros trabajos han identificado otros marcadores como CD11c,
CD86 y CD40, que permiten separar poblaciones de monocitos que al ser estimulados
o no con factor transformante de crecimiento (TGF) originan CD de distintos tipos y
que pueden además dividirse activamente (Nunez y col. 2004).
Usando un modelo de migración trans-endotelial in vitro, en el cual monocitos de
sangre periférica eran incubados sobre monocapas de células endoteliales derivadas
de vena de cordón umbilical, se ha demostrado que los monocitos pueden migrar a
través de la barrera endotelial in vitro y diferenciarse a macrófagos, permaneciendo
en la matriz sub-endotelial, o a CD cuando migraban la membrana endotelial (Gordon
y col. 2005). Esta diferenciación de monocitos hacia un tipo celular u otro depende
del fenotipo de la población de monocitos cultivados y de los factores presentes en el
cultivo (Gordon y col. 2005). La heterogeneidad de fenotipos de monocitos es un
factor que además contribuye a la gran heterogeneidad tanto de macrófagos como de
CD que se pueden distinguir en los distintos órganos así como en los cultivos in vitro
(Dilioglou y col. 2003).
2.1.2 Células dendríticas derivadas de monocitos
La capacidad de monocitos para diferenciarse a CD se demostró originalmente por
Sallusto y Lanzavecchia, quienes reportaron la generación de CD a partir de
monocitos de sangre periférica humana después del cultivo in vitro con GM-CSF e
IL-4 (León y col. 2005). Desde este momento, este método ha sido utilizado en
numerosos estudios sobre los procesos de diferenciación y maduración de CD
humanas, debido a la gran dificultad de trabajar con CD humanas aisladas ex-vivo
(León y col. 2005).
14
Tanto en sistemas murinos como en humanos, los monocitos cultivados con GM-
CSF e IL-4 se diferencian en CD inmaduras, con gran capacidad fagocítica pero
baja capacidad para activar LT (Banchereau y col. 2005). Estas células expresan
receptores de quemoquinas CC y CXC como CCR1, CCR2, CCR5 y CXCR1,
responden a la proteína 1a inflamatoria de macrófagos (MIP-1a), proteína 1
quimiotáctica de monocitos (MCP-1) y regulan la expresión de RANTES en LT
(Lipscomb y col. 2002). La generación de CD tanto murinas como humanas no
involucra proliferación celular (León y col. 2005).
CD inmaduras derivadas de monocitos pueden posteriormente ser maduradas con el
tratamiento con compuestos como LPS, TNFα, INFβ o CD40L (León y col. 2005). La
maduración de las CD es un proceso complejo que determina la sobre-regulación en
la expresión de moléculas co-estimuladoras como CD40, CD58, CD80, CD83 y
CD86, cambios de morfología, cambios en los compartimentos lisosomales como la
sobre-regulación de LAMP3 (proteína de membrana 3 asociada a lisosomas) y
aumento en el número de moléculas de CMH clase II (Banchereau y col. 2005). In
vivo, la maduración de las CD esta ligada a la migración desde el tejido periférico al
órgano linfoide (Banchereau y col. 2005), en respuesta a una señal de peligro, por lo
cual las CD en su migración comienzan a incrementar la expresión de receptores
“homing” linfoides y a disminuir la de receptores de quemoquinas inflamatorias. Las
CD maduras regulan en bajo la expresión de CCR1, CCR2 y CXCR1 y sobre-regulan
la expresión de CXCR4, CCR4 y de CCR7 (Lipscomb y col. 2002). Datos recientes
sugieren que diferentes estímulos de diferenciación podrían conferir funciones
específicas a CD derivadas de monocitos, reflejando la plasticidad de la
diferenciación monocítica (León y col. 2005).
La señalización por el receptor de IL-4 parece tener un papel esencial en la regulación
de la diferenciación de monocitos a CD, al bloquear el desarrollo de macrófagos. Se
ha demostrado que IL-4 inhibe la producción del factor estimulante de colonias de
15
macrófagos (M-CSF), regulando negativamente la expresión del receptor para esta
citoquina e impidiendo la pérdida en la expresión del receptor GM-CSF.
Adicionalmente, IL-4 puede también influenciar la producción inducida por LPS de
IL-12 por CD derivadas de monocitos (León y col. 2005).
Desde el momento en que Caux y col (1996) evidenciaron que a partir de células
progenitoras derivadas de médula ósea de ratones podrían diferenciarse a CD en
presencia de GM-CSF, avances sustanciales en la caracterización de las vías de
diferenciación de CD humanas se han logrado. Posteriormente, con la adición de
factor de necrosis tumoral α (TNFα) al GM-CSF se logró inducir el desarrollo de CD
a partir de progenitores CD34+ de médula ósea, cordón umbilical y sangre periférica
proveniente de humanos (Lipscomb y col. 2002). Progenitores CD34+ derivados de
médula ósea y estimulados con GM-CSF y TNFα en un sistema de cultivo semi-
sólido originó dos tipos de colonias distintos: un tipo denominado CFU-GM que
origino monocitos, granulocitos y pocas CD, y un segundo donde la mayor parte
fueron CD denominado CFU-DC. Cuando se evaluó la eficiencia de ambos tipos de
colonias como estimuladores de células T en reacciones alogeneicas, se encontró que
la adición del TNFα era crucial en la diferenciación hacia CD en las colonias CFU-
DC pero no en las CFU-GM. Al inducir la expresión de CD40 en las células CD34+
se originaban grandes números de CD, que expresaban además CD18 y CD86 (Curti
y col. 2001).
Al comparar las CD derivadas de monocitos o de progenitores CD34+ ha sido
evidente que el proceso durante el cual se adquiere el fenotipo de CD en cada caso es
distinto. Se ha reportado que al día 0 de cultivo monocitos estimulados expresan
CD86, pero en las células CD34+ este marcador aparece solo hasta el día 5 de cultivo.
Igualmente, estas células presentan diferencias funcionales en reacciones
leucocitarias mixtas (Dilioglou y col. 2003).
16
2.2 PKC en la diferenciación celular
La importancia de PKC durante la diferenciación celular se ha evidenciado en los
diferentes linajes hematopoyéticos. La activación de PKC induce a células de
leucemia promielocítica a diferenciarse a macrófagos (Rovera y col. 1979),
mieloblastos de leucemia a progenitores de monocitos y granulocitos, células de
eritroleucemia a megakariocitos (Long y col. 1990). Por otra parte, en unidades
formadoras de colonias granulocito-macrófagos, la modulación de su actividad
favorece la diferenciación hacia neutrófilos o hacia macrófagos (Whetton y col.
1994). Así mismo, se ha establecido la expresión diferencial de las isoformas de PKC
durante la diferenciación de los fenotipos eritroides, megakariocito, granulocitos y
monocitos originados a partir de los progenitores CD34+ (Oshevski y col. 1999).
2.2.1 PKC durante la diferenciación de células dendríticas
Procesos de diferenciación inducidos por activadores de la PKC como los esteres de
forbol o ionóforo de calcio hacia células con fenotipo de CD sin requerimientos
adicionales de citoquinas han sido reportados en progenitores CD34+ de médula ósea
(Davis y col. 1998; St Louis y col. 1999; Ramadan y col. 2001) y en líneas de
leucemias mieloides (St Louis y col. 1999; Kharfan-Dabaja y col. 2005; Cejas y col
2005a, b). Las CD obtenidas en estos trabajos adquieren fenotipo de CD y capacidad
de inducir proliferación de células T en pruebas alogeneicas, este proceso se
caracteriza además por la ausencia de proliferación y la disminución de la viabilidad
celular.
El mecanismo de diferenciación hacia CD inducido por la activación de PKC, al
parecer sería el mismo desencadenado por los receptores de citoquinas utilizados
tradicionalmente en la diferenciación de distintos progenitores hacia CD. Esto se
presume, al ser PKC un componente corriente abajo de la señalización de IL-4
(Arruda y col. 1992), IL-1, TNFα (Schütze y col. 1994; Lee y col. 2000), CD40
17
(Lisowska y col. 2003; Yan y col. 2003) y GM-SCF (Geijsen y col. 1999). La
activación directa de PKC por el éster de forbol PMA (acetato de forbol miristato) o
iónoforo de calcio actuaría como un “bypass” de la señalización mediada por
receptores, capaz de sostener el proceso de diferenciación hacia CD (Cejas y col.
2005b).
Adicionalmente PKC activa corriente abajo factores transcripcionales como STAT-3,
rel/NFκB, Notch, y la vía de señalización de las proteínas quinasas activadas por
mitógenos (Ras/Raf-1/MEK/Erk) (Buchner 1995), todo esto de particular importancia
en los procesos de diferenciación celular y especialmente en el de las CD. El factor
transcripcional RelB, miembro de la familia rel/NFκB requerido para el desarrollo y
función de las DC, es controlado por el nivel de expresión de PKC, más exactamente
por la isoforma βII al nivel del tamaño de los transcritos de RelB (Cejas y col.
2005a).
También se ha reportado que PKC actúa sobre la regulación de marcadores de
superficie importantes en la maduración y función de las CD. Por ejemplo en la línea
monocítica U937 la estimulación con PMA permite un aumento de 12 y 17 veces de
la expresión de CD11b y CD86 respectivamente luego de 48 h de estimulación
(Deszo y col. 2004). En esta misma línea celular se demostró que CD45 es un
regulador negativo de la actividad de PKCδ inducida por PMA, esta inducción es
necesaria en el aumento de CD11b de estas células y en su diferenciación hacia
macrófagos (Deszo y col. 2001).
2.3 Estructura de PKC
Detectada por primera vez en 1977 por el grupo de Yasutomi Nishisuka en un
extracto purificado de cerebelo bovino (Takai y col. 1977), la familia de las PKC ha
sido objeto de numerosos estudios en el mundo, por su particular importancia en los
18
procesos de señalización involucrados en el crecimiento, proliferación, diferenciación
y muerte celular. La PKC se reconoció como una serina/treonina quinasa dependiente
de Ca2+, regulada por el 1,2 sn- diacil- glicerol (DAG) un segundo mensajero (Inoue
y col. 1977) y mas tarde como un sustrato de los ésteres de forbol, promotores
tumorales (Leach KL y col. 1983) utilizados en los estudios del desarrollo y bases
enzimológicas de la transducción de señales durante la carcinógesis (Silinski y col.
2003). Todo esto, ha puesto a PKC como un blanco farmacológico y terapéutico en el
tratamiento de varias enfermedades principalmente en el cáncer (Ron y col. 1999).
PKC comprende 11 isoformas agrupadas dentro de tres subclases: PKC clásicas o
convencionales (α, βI, βII, γ), activadas por Ca2+, DAG, fosfatidilserina y ésteres de
forbol; PKC nuevas (ε, δ, θ, η) reguladas por DAG, esteres de forbol y
fosfatidilserina, calcio independientes; y PKC atípicas (ζ, ι/λ) cuya regulación no se
ha establecido bien pero su activación es dependiente de fosfatidilserina (Newton
1997; Ron y col. 1999; Silinsky y col. 2003).
Cada isoenzima PKC presenta dos regiones estructuralmente bien definidas: una
reguladora amino-terminal y otra catalítica carboxilo-terminal, unidas por una región
bisagra altamente sensible al clivaje proteolítico por proteasas celulares (Ron y col.
1999). La región regulatoria comprende tres dominios: el C1 es un motivo de
cisteínas e histidinas conservadas, receptor del DAG y esteres de forbol y que se une
fuertemente a dos átomos de Zn2+, lo cual mantiene la conformación activa del
dominio. La unión del DAG o de esteres de forbol al dominio C1 no induce ningún
cambio conformacional pero permite alterar la hidrofobicidad de la superficie del
dominio (Toker 1998), permitiendo al complejo ser insertado y anclado dentro de la
membrana (Silinsky y col. 2003). El dominio C2 presente solo en las isoformas
clásicas se une al Ca2+, algunos lípidos y proteínas, consiste en dos hojas plegadas β
(cuatro hebras) antiparalelas o permutadas (Hurley y col. 2000), con 5 residuos de
aspartato conservados que funcionan como “switch” electroestáticos movilizando
rápidamente el Ca2+ (Silinsky y col. 2003). El otro dominio es el pseudosustrato (PS)
19
o inhibitorio que mantiene la enzima en estado inactivo en ausencia de cofactores o
activadores, al ocupar el sitio de unión del sustrato en el dominio catalítico (Ron y
col. 1999), la secuencia de aminoácidos del PS es similar al de los sustratos de PKC,
pero presentan aminoácidos no fosforilados como alanina en lugar de serina o
treonina (Ron y col. 1999).
2.3.1 Activación de la PKC
El modelo propuesto para explicar la activación de PKC es el siguiente: las isoformas
convencionales son activadas por el Ca2+ y por el DAG, en la ausencia de estos
segundos mensajeros, PKC tienen una afinidad muy baja por la membrana y se
localiza en el citosol. La activación estimulada por agonistas de fosfolipasas tipo C,
genera DAG e inositoles fosfatos solubles que permiten la liberación de Ca2+ de los
reservorios. La unión del DAG o de esteres de forbol al dominio C1, y del Ca2+ al
dominio C2, lo cual incrementa la unión de fosfatidilserina al dominio regulatorio,
resulta en la remoción del PS del sitio catalítico y el anclaje a la membrana por el
dominio C1, el PS una vez removido también contribuye a la unión de la enzima a la
membrana a través de sus residuos básicos (Toker 1998). Una vez expuesto el “loop”
de activación, ocurre una fosforilación mediada por otras quinasas (PDK1) y luego 2
autofosforilaciones sobre la Thr641 y Ser660, finalmente los sustratos son
fosforilados mediante la transferencia de un grupo fosfato proveniente del ATP que
se unió al dominio C3 (Newton 1997; Toker 1998).
2.4 Péptidos permeables
Los péptidos permeables a la célula o dominios de transducción proteica (DTP) se
definen como secuencias capaces de atravesar la membrana, llegar al citoplasma y
alcanzar compartimentos nucleares luego de su internalización, con la particularidad
de llevar consigo otras moléculas o secuencias cargo permitiendo la regulación,
estimulación o inhibición de una señal específica dentro de la célula. Estos se
20
descubrieron luego de observar como proteínas integrales o dominios de proteínas
podían desplazarse a través de la membrana plasmática. El primer péptido permeable
descrito fue el transactivador Tat del VIH y luego se reportó el homeodominio del
factor transcripcional de Antennapedia de Drosophila melanogaster como otro
péptido de las mismas características (Joliot y col. 2004).
Actualmente se utilizan un gran número de DTP sintéticos, como la región
hidrofóbica de la secuencia señal de secreción del factor de crecimiento de
fibroblastos K, el péptido derivado de la toxina mastoparan (transportana) y de la
buforina, un péptido antimicrobial de anfibios, la proteína PreS2 del virus de la
hepatitis B (HBV), entre otros (Kelemen y col. 2002; Joliot y col. 2004).
El uso de péptidos permeables a la célula ha demostrado ser una técnica
bioquímicamente útil para la regulación de varios procesos intracelulares que
requieren la transducción de señales y la transcripción de genes (Rojas et al 1996).
Las características más importantes de los DTPs incluyen la permeabilidad sin efectos
citotóxicos (como si sucede con otras técnicas que forman poros o la
microinyección), selectividad funcional y fácil detección (Du y col., 1998), eficiencia
generalmente elevada en todos los tipos celulares, y especialmente en células durante
el cultivo in vitro; además, la cantidad de péptido y su cargo puede ser controlado
dentro de las concentraciones fisiológicas, y es posible internalizar no solo secuencias
cargo funcionales y ácidos nucleicos, sino también proteínas modificadas (Joliot y
col. 2004).
La localización del péptido y su cargo luego de atravesar la membrana, es un punto
importante en la utilización de esta técnica. Después de la translocación, el DTP
ligado al cargo en el citoplasma puede quedarse allí o moverse a otro compartimiento
lo cual no depende solo del vector sino también del cargo fusionado; además, la
naturaleza de la unión entre DTP y cargo determina si este se libera (por ejemplo si
están unidos a través de un enlace disulfuro) o se queda ligado permanentemente, así
21
mismo la afinidad del cargo con su blanco determinará su localización (Joliot y col.
2004).
22
3. Formulación del problema y justificación
3.1 Formulación del problema
Las CD se han logrado obtener a partir de distintos precursores hematopoyéticos,
permaneciendo desconocidos los mecanismos moleculares que regulan los procesos
que llevan a la diferenciación en estas células. Los principales factores que estimulan
la diferenciación in vitro de CD, como las citoquinas GM-CSF e IL-4, señalizan por
la vía de la PKC regulando moléculas y factores transcripcionales expresados durante
la diferenciación y maduración de las CD. Esto llevó a plantear que la activación
directa de esta enzima es suficiente para inducir la diferenciación hacia CD, lo cual ha
sido demostrado en otros precursores de CD como los progenitores CD34+ y en líneas
blásticas estimulados con esteres de forbol como el PMA que activan la PKC, pero no
en monocitos donde no se conoce si la activación directa de PKC induzca la
adquisición de un fenotipo diferenciado y si puede ser semejante al de una CD.
La modulación de la señalización mediada por PKC se ha realizado tradicionalmente
utilizando activadores de la proteína como esteres de forbol (PMA) o inhibidores
como bisindolilmaleimida. El grupo de Fisiología Celular y Molecular ha
implementado el uso de péptidos permeables a la célula asociados a la secuencia
pseudosustrato de PKC en células mononucleares y linfocitos, como un método para
inhibir a la PKC. Este método ha mostrado una permeabilidad con pocos efectos
citotóxicos para la célula comparado con otros métodos de permeabilización,
inhibición selectiva funcional y de fácil detección. Así, con el propósito de progresar
en el entendimiento de la regulación de la PKC durante la diferenciación celular, se
pretende implementar un modelo de diferenciación de monocitos inducida por PMA
donde se pueda evaluar la importancia de la enzima y determinar si los monocitos
pueden adquirir fenotipo o características de CD.
23
3.2 Justificación de la investigación
Los monocitos de sangre periférica han sido los precursores más ampliamente
utilizados en distintos modelos animales para obtener CD. Las CD han sido
denominadas células presentadoras de antígenos profesionales, dada su importancia
en el inicio y regulación de la respuesta inmune adaptativa, y por ello muchos
trabajos han dirigido sus esfuerzos para lograr implementar su utilización como
vacunas en la inmunoterapia en patologías como el cáncer en razón a la habilidad de
las CD para presentar antígenos derivados de tumores y servir de estimuladores
efectivos de linfocitos T citotóxicos.
Los diferentes mecanismos y vías de señalización intracelular que controlan la
diferenciación en monocitos hacia CD solo se han logrado definir parcialmente. El
estudio de la señalización de PKC en precursores de CD como células CD34+ y líneas
celulares derivadas de leucemias como KG1, han mostrado la relevancia de la
activación de esta proteína en los procesos de diferenciación y maduración hacia
células dendríticas, pero establecer el mecanismo por el cual PKC actúa no se conoce
en su totalidad y si en otros precursores de CD como los monocitos la activación
inducida de PKC también sea suficiente para la adquisición de un fenotipo
diferenciado.
El grupo de Fisiología Celular y Molecular de la Universidad Nacional, durante los
últimos tres años ha trabajado en el mecanismo de señalización celular en células del
sistema inmunitario, con la implementación del uso de péptidos permeables a las
células con capacidad selectiva de modulación de la señalización. Particularmente, se
han podido modular la actividad y función de la enzima tirosina quinasa p56Lck,
específica de linfocitos y esencial en la activación de estas células (Pérez y col. en
preparación) y de la PKC durante procesos de proliferación celular y supervivencia
(Perdomo y col. enviado). Este trabajo de grado, complementa los trabajos del grupo
realizados en la definición de las vías de señalización que determinan el destino
24
celular, amplía el conocimiento sobre los efectos del péptido quimérico en otro
modelo de los estudiados anteriormente y permite establecer si la PKC es
determinante durante la diferenciación de monocitos inducida por PMA.
25
4. Objetivos
4.1 Objetivo General
Determinar el efecto de la inhibición de la enzima PKC en la diferenciación de
monocitos de sangre periférica humana inducida por PMA, mediante el uso de un
péptido quimérico constituido por una secuencia pseudosustrato de la enzima y una
secuencia hidrofóbica con capacidad de internalización.
4.2 Objetivos Específicos
1. Implementar un modelo de diferenciación in vitro de monocito con PMA.
2. Caracterizar morfológicamente y mediante el uso de marcadores moleculares de
superficie el proceso de diferenciación de monocitos inducidos con PMA.
3. Determinar mediante el uso de péptido quimérico el efecto de la inhibición de PKC
sobre el proceso de diferenciación inducido por PMA.
26
5. Materiales y métodos
5.1 Separación de células mononucleares a partir de sangre periférica humana
Muestras de sangre periférica obtenida en tubos vacutainer heparinizados (BD) a
partir de voluntarios sanos obtenida según las consideraciones éticas pertinentes
(Anexo 1), se centrifugó a 400 X g durante 20 min. El buffy coat se diluyó 1:1 con
medio RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado con 10 mM HEPES (Sigma), 1 mM
piruvato de sodio (Sigma), 0.2 mM bicarbonato de sodio (Sigma) y 1X vitaminas
(Sigma; medio incompleto) y se sirvió sobre un gradiente de Ficoll-hypaque
(densidad 1.077 mg/ml; Sigma). Después de centrifugar por 20 min a 400 X g, la
interfase que tenía las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se
recuperó y lavó tres veces con medio incompleto. Después del último lavado se
resuspendió en medio completo [medio incompleto suplementado con 10% suero
fetal bovino (SFB; Gibco BRL)], se determinó el número de células y la viabilidad
por exclusión del colorante azul de Tripán.
5.2 Aislamiento de monocitos
Las CMSP a una densidad de 7 x 105 por cm2 se cultivaron en cajas de cultivo (Nalge
Nunc Internacional) de 25 cm2 de área preincubadas a 4°C por 2 h con SFB, para
permitir la adherencia de los monocitos al plástico. Al día siguiente las células no
adheridas se retiraron, y las adheridas se recuperaron sirviendo medio incompleto
frío e incubando sobre hielo por 10 a 15 min y retirando con “scraper”, se contaron y
se determino viabilidad. Para obtener una población más pura de monocitos,
adicionalmente se utilizaron perlas magnéticas acopladas a anticuerpos
mononoclonales anti-CD14 utilizando el sistema MidiMaCs (Miltenyi Biotec)
siguiendo las instrucciones del fabricante, con previa adherencia de CMSP como se
indico antes.
27
5.3 Diferenciación de monocitos
Los monocitos se cultivaron a una densidad de 1 x 106/ml de medio completo, en
presencia y ausencia de PMA (100 nM/ml; Sigma) con TNFα (10 ng/ml; Invitrogen)
por 2 días, a 37ºC y 5% CO2. Se verificó a diario el cambio de morfología por
microscopio invertido, se registró la apariencia del cultivo y de las células por
microfotografías, adicionalmente cultivos en cajas de 96 pozos o láminas de cultivo
se fijaron con metanol al 100% y luego se tiñeron con colorante de Wright.
5.4 Caracterización celular
Las células recuperadas se resuspendieron en el buffer de marcación (PBS más 2%
BSA). La expresión de marcadores de superficie celular se evaluó al inicio del cultivo
y al día 2 con los siguientes anticuerpos: CD14 (Biosource; Caltag), HLA-DR
(Caltag); HLA-ABC (Caltag); CD45 (Caltag); CD11b (Sigma); CD83 (eBioscience);
CD86 (eBioscience), en todos los casos se utilizó el correspondiente control de
isotipo. Después de 45 min de incubación a 4ºC y tres lavados, las células vivas
(10.000) se analizaron en un citómetro de flujo FACScan (Beckton Dickinson, BD
Biosciences, San Jose, CA, USA.) mediante el software CellQuest (versión 3.2.1) y/o
WinMDI (versión 2.8).
5.5 Síntesis de péptidos
Los péptidos se sintetizaron utilizando la técnica de síntesis en fase sólida (Hougten
1985; Merrifield 1965), empleando resinas MBHA y aminoácidos t-Boc, clivajes
altos y bajos (Tam y col. 1983). La secuencia del péptido de internalización
correspondió a la región hidrofóbica de la secuencia señal del factor de crecimiento
de los fibroblastos Kaposi K-FGF (AAVALLPAVLLALLP) designada aquí como
HK; el pseudosustrato o PS secuencia conservada de las isoformas α, βI, βII y γ de
PKC, residuo de 8 aminoácidos (RKGALRQY) y el péptido quimérico HKPS,
28
combinación de ambas secuencias (AAVALLPAVLLALLAPRKGALRQY). El
péptido control HKK corresponde a la secuencia de internalización y una secuencia
“cargo” irrelevante (EILLPNNYA). Los péptidos se caracterizaron por cromatografía
líquida de alta presión y espectrometría de masas realizadas en el laboratorio de
síntesis química de péptidos de la FIDIC, y se utilizaron aquellos en donde el peso
molecular obtenido coincidió con el teórico.
5.6 Inhibición PKC mediante el péptido quimérico
Los monocitos se incubaron por una hora previa a servir los estímulos con y sin los
péptidos HKPS y HKK a una concentración de 10 μM. Se verificó morfología por
microscopía invertida y la expresión de marcadores de superficie celular por
citometría de flujo como se indicó antes a los 2 días de cultivo. Adicionalmente, se
evaluó el efecto de los péptidos sobre la sobrevivencia celular, mediante ensayos de
exclusión con ioduro de propidio (IP); para ello las células se resuspendían en 250 μl
de una solución de IP 50 μg/ml resuspendida en PBS pH 7.4 e incubadas en hielo por
30 min, pasado este tiempo las células se incubaron a 4ºC hasta el análisis por el
citómetro de flujo.
29
6. Resultados
6.1. Aislamiento y estimulación de monocitos
Para la realización de este trabajo, fue necesario optimizar el aislamiento de
monocitos a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). El
procedimiento utilizado inicialmente fue la recuperación de las células adherentes
luego de su incubación en cajas de cultivo (previamente incubadas con SFB). Dos
aspectos que se encontraron como relevantes para el aislamiento y purificación
óptima de los monocitos fueron el tiempo de incubación de las células y la densidad
de CMSP por unidad de área de la caja de cultivo que se siembra inicialmente. Se
examinaron diferentes tiempos (2, 4 y 24 h) de incubación de las CMSP y luego se
realizó citometría de flujo para inicialmente distinguir por tamaño y granularidad las
poblaciones de linfocitos y monocitos. Las poblaciones de tamaño intermedio-alto y
granularidad intermedia en citometría de flujo (Forward Scatter (FSC) 400-800, Side
Scatter (SSC) 150-300) mayoritariamente corresponden a monocitos, mientras que las
mas pequeñas y menos granulares corresponderían a linfocitos. En la figura 1 se
observan los patrones de citometría de flujo (ventanas de FSC y SSC) de las CMSP
después de 4 h y 24 h de incubación, tanto de las células no adheridas como de las
adheridas. En la figura se observa que la obtención de células que corresponden con
el tamaño y granularidad de los monocitos se encuentran en mayor cantidad a las 24 h
que a las 4 h, sin embargo la pureza es limitada por cuanto poblaciones de menor
tamaño y granularidad también están presentes. Cuando la adherencia se realizo por 2
h, el número de células adheridas fue muy bajo, por lo cual se opto por utilizar
siempre periodos de adherencia más largos.
Posteriormente se probaron distintas densidades celulares por unidad de área en un
cultivo de 24 h. Densidades celulares altas de CMSP limitan la recuperación de
30
Figura 1. Patrones de citometría de células adheridas y no a las 4 y 24 h de incubación. A las 4 h y 24 h de incubación de CMSP sobre cajas de cultivo se recuperaron las células adheridas y no adheridas. En los paneles de la izquierda aparecen las ventanas de FSC (eje X) y SSC (eje Y) para los sobrenadantes no adheridos y en los de la derecha para las células adheridas a la caja. En los óvalos se ubican la población de monocitos con FSC entre 400-800 y SSC 150-300.
31
monocitos. Se determinó una concentración óptima entre 500.000 y 700.000 células
por cm2 (Fig. 2A). En la figura 2B se muestran las citometrías de flujo realizadas a las
células recuperadas sembradas a 500.000 células/cm2 después de la adherencia de 24
h, observándose que el 70% de esas células son CD14+. De esta manera se logró
establecer un método por el cual se obtuvo una pureza de monocitos aproximada del
70%, es decir la siembra de alrededor de 700.000 CMSP/cm2 durante 24 h.
Habitualmente la estimulación de los monocitos para la obtención de CD se realiza
con GM-CSF, IL-4 y la maduración con TNFα (Pickl y col. 1996; Zhou y col. 1996),
los cuales activan la vía de señalización PKC entre otras vías (Arruda y col. 1992;
Schütze y col. 1994; Geijsen y col. 1999; Lee y col. 2000). En progenitores
hematopoyéticos se ha observado que la estimulación con PMA, por tanto la
activación de PKC, permite la diferenciación hacia CD (Davis y col. 1998; Ramadan
y col. 2001; Cejas y col. 2005a, b) y una maduración de las mismas se produce a
través de la estimulación con TNFα (Cejas y col. 2005a). Se decidió comparar los
cambios morfológicos en respuesta al estímulo con PMA y TNFα en monocitos
aislados como se describió arriba. Se encontró que al segundo día hubo cambios
morfológicos importantes con la estimulación con PMA (10 ng/ml) y PMA más
TNFα (10 ng/ml), no así con el TNFα solo (Fig. 3). Estos cambios se hicieron más
prominentes en los días 2, 4 y 6 (Fig. 3).
Al recuperar las células para citometría de flujo con EDTA 5 mM, como se ha
utilizado regularmente (Pickl y col. 1996), se encontró una muy baja eficiencia y una
pérdida de la viabilidad celular, optándose por la incubación en frío para recuperar las
células adheridas. Adicionalmente por el método de adherencia de ~100 millones de
CMSP se obtuvieron 5-8 millones de células adheridas correspondientes solo al 5-8
% del total de células. Debido a que se necesitaba un número alto de monocitos para
la evaluación de los marcadores que se sobre-regulan (HLA-DR, HLA-I, CD83,
CD11b y CD86) y aquellos que se disminuyen (CD14 y CD45) (Pickl y col. 1996;
32
A.
B.
Figura 2. Efecto de la densidad de CMSP por unidad de área de la caja de cultivo. A. Porcentajes de recuperación de células adheridas por número de CMSP sembradas por cm2. B. En los 2 paneles de arriba se muestran las ventanas de FSC y SSC para las células no adheridas y adheridas luego de 24 h de incubación. En los 2 paneles de abajo se indica la expresión de CD14 para las células adheridas recuperadas después de 24 h de incubación y sembradas a una densidad de 500.000 CMSP por cm2. A la izquierda esta el control de isotipo para eliminar la fluorescencia inespecífica. A la derecha esta la marcación de las células adheridas con un anticuerpo monoclonal conjugado con PE (FL2, eje Y).
33
Figura 3. Morfología de células adheridas cultivadas hasta por 6 días. Microfotografías de células cultivadas sin estímulo, con PMA solo (10 ng/ml), TNFα solo (10 ng/ml) y PMA más TNFα (Tinción de Wright, aumento 40X y acercamiento 1.5).
34
Zhou y col. 1996) durante la diferenciación hacia células dendríticas, y además a
diferentes tiempos, se optó por una separación en columna utilizando perlas
inmunomagnéticas (Ryan y col. 2002), y realizando la recuperación de las células
adheridas mediante la incubación en hielo y retirando con “scraper”, un método por el
cual no se observo un efecto negativo considerable sobre la viabilidad y numero de
células.
Con esta separación se obtuvieron 30.000.000 células CD14+ de una cantidad inicial
~150.000.000 de CMSP (20% del total de células), es decir, 10% más células que con
el método de adherencia. Por otra parte, en tres experimentos independientes la
obtención de células CD14+ después de la purificación fue muy similar, confirmando
la reproducibilidad del aislamiento de monocitos por este método (Fig. 4). Las células
CD14+ aisladas por columna se evaluaron por citometría de flujo para la expresión de
todos los marcadores encontrando el siguiente inmunofenotipo: CD14+, HLA-DR+,
HLA-I+, CD83-, CD45+, CD11b+, CD86bajo- (Fig. 5).
Los cambios morfológicos inducidos por el PMA y TNFα en los monocitos
purificados por la columna, no se evidenciaron en los monocitos aislados por
adherencia, incluso en el día 6 (Fig. 6A). La recuperación de las células fue óptima y
permitió la realización de las citometrías sin mayor problema. No se evidenciaron
cambios en los marcadores CD14, CD45, CD83, HLA-I, HLA-DR, CD86 y CD11b
entre células estimuladas y no estimuladas. En la figura 6B se observa este resultado
para los marcadores CD14, CD45 y CD83.
Debido a esto, se probó una concentración mayor de PMA (100 nM), la cual en
reportes anteriores resultaba en la activación de PKC y en regulación de marcadores
como CD45 (Deszo y col. 2001), CD86 y CD11b (Deszo y col. 2005) en líneas
monocíticas por la activación de PKC inducida por el PMA. Al estimular las células
purificadas con esta nueva concentración de PMA (dejando igual concentración de
35
Figura 4. Aislamiento y purificación de monocitos marcados con perlas inmunomagnéticas CD14 y separados por columna. Las células recuperadas de la columna se marcaron con un anticuerpo monoclonal CD14 conjugado con PE (FL2; eje Y) y un anticuerpo monoclonal HLA-DR conjugado con FITC (FL1; eje X). Los cuadrantes se definieron de acuerdo al control de isotipo para eliminar la fluorescencia inespecífica. Resultado de 3 experimentos independientes que muestran la reproducibilidad del aislamiento de monocitos por este método.
36
Figura 5. Inmunofenotipo de las células marcadas con perlas inmunomagnéticas CD14 y separadas por columna. Las células recuperadas se evaluaron por citometría marcando con CD14 (PE), HLA-I (FITC), HLA-DR (FITC), CD45 (FITC), CD11b (FITC), CD86 (PE-Cy5) y CD83 (PE). En el eje X se muestra la fluorescencia media para cada marcador. En el eje Y se indica el numero de eventos. La línea negra corresponde al respectivo control de isotipo y en sombreado se muestra la expresión de cada marcador.
37
A.
B.
Figura 6. Morfología e inmunofenotipo de células CD14+ cultivadas hasta por 6 días. A. Morfología. Microfotografías de células en cultivo sin estímulo (izquierda) y estimuladas (derecha) con PMA (10 ng/ml) y TNFα (10 ng/ml) en el día 6. Aumento 40X. B. Inmunofenotipo de las células CD14+ cultivadas hasta el día 6. En el eje X se muestra la fluorescencia media para la expresión de CD14, CD45 y CD83. En el eje Y se muestra el numero de eventos y en sombreado gris la expresión para cada marcador en el tiempo 0. La línea negra sólida corresponde a la expresión de las células sin estimular al día 6 y en línea negra punteada para las células estimuladas con PMA más TNFα.
38
Figura 7. Morfología de células CD14+ cultivadas hasta por 2 días. Microfotografías de células cultivadas sin estímulo y con PMA (100 nM) más TNFα (10 ng/ml). Tinción de Wright, aumento 100X y acercamiento 1.7.
39
TNFα), se evidenciaron muy tempranamente diferencias morfológicas entre las
células CD14+ estimuladas y las no estimuladas (Fig. 7). Al primer y segundo día de
cultivo se observaron formas ahusadas, prolongaciones citoplasmáticas y un notorio
aumento en el tamaño de las células estimuladas, repitiéndose el efecto observado al
segundo día con las células separadas por adherencia (Fig. 3).
Con el fin de evaluar el efecto de los estímulos en la diferenciación de monocitos,
células CD14+ a una densidad de 1’000.000/ml se estimularon con PMA (100 nM)
más TNFα (10 ng/ml), PMA solo (100 nM), TNFα solo (10 ng/ml) y después de 48 h
de cultivo se caracterizaron nuevamente evaluando los mismos marcadores. Las
células CD14+ no estimuladas al día 2 sobre-regularon sustancialmente este
marcador, mientras que las que fueron estimuladas con PMA más TNFα regularon en
bajo la expresión de este marcador característico de monocito. Al comparar la
expresión de HLA-DR en los monocitos del día 0 con los no estimulados del día 2
(Fig. 8, columna izquierda, HLA-DR), se observa una regulación en bajo que en
presencia del estímulo no se presenta. En este último caso hay una población HLA-
DR positiva más definida. Después de 2 días de estímulo, las células CD14+
regularon negativamente, de forma importante, la expresión de CD45 y de HLA-I
(Fig. 8, columna derecha). En las células estimuladas, CD83 se reguló positivamente,
CD11b se mantuvo igual mientras que CD86 no presentó ningún cambio (Fig. 8).
Cuando se evalúan únicamente los cambios sobre la población de monocitos
seleccionada mediante un gate, se observa lo mismo (Fig. 9) si se compara con el
análisis sobre la población total (Fig. 8).
Cuando se analizaron los efectos en la morfología y la expresión de marcadores en
respuesta al estímulo con PMA o el TNFα individualmente, se observó que los
cambios producidos por la doble estimulación también se presentaban en la
estimulación con PMA solo (comparar Fig. 10A con Fig. 7; Fig. 10B) sugiriendo una
40
Figura 8. Inmunofenotipo células CD14+ cultivadas por 2 días. Células estimuladas o no con PMA (100 nM) más TNFα (10 ng/ml) se evaluaron por citometría de flujo. En la columna izquierda se encuentran los histogramas que comparan la expresión del tiempo 0 con las células sin estimular al día 2. En la columna derecha se compara tiempo 0 con las células estimuladas con PMA más TNFα al día 2. Eje X representa la fluorescencia media para cada marcador y en el eje Y se muestran el número de eventos.
41
Figura 9. Inmunofenotipo de la población de monocitos. En el primer panel se muestra la región seleccionada R1 que corresponde principalmente a la población de monocitos por FSC y SSC. En los paneles siguientes aparece la expresión para R1 de monocitos al día 0 (primera columna), sin estímulo (segunda columna) y estimulados (tercera columna) con PMA (100 nM) y TNFα (10 ng/ml) al día 2 de cultivo. Los cuadrantes se ubicaron de acuerdo al respectivo al control de isotipo para eliminar fluorescencia inespecífica.
42
A.
B.
Figura 10. Morfología e inmunofenotipo de células CD14+ cultivadas hasta por 2 días y estimuladas con PMA solo y TNFα solo. A. Morfología. Microfotografías de células en cultivo sin estímulo, PMA solo (100 nM) y TNFα solo (10 ng/ml). Tinción de Wright, aumento 100X, acercamiento 1.7. B. Comparación del inmunofenotipo de las células CD14+ cultivadas hasta el día 2 con diferentes tratamientos. La línea negra corresponde a la expresión en el tiempo 0. En sombreado aparece la expresión del marcador para cada tratamiento. La flecha indica la expresión de CD14 en células sin estímulo que esta por fuera del rango de fluorescencia del histograma.
43
acción mayoritaria del PMA en los experimentos en que se usaba combinado con el
TNFα.
6.2 Inhibición de PKC por el péptido quimérico durante el proceso de diferenciación
Con el propósito de determinar la influencia de la PKC en el proceso de
diferenciación celular establecido a través de la estimulación de células CD14+ con
PMA y TNFα, se usó un péptido quimérico inhibitorio compuesto por una secuencia
hidrofóbica y una secuencia pseudosustrato de las isoformas clásicas de
la PKC. Como control se usó un péptido quimérico con la misma secuencia
hidrofóbica y una secuencia “cargo” irrelevante. En trabajos previos, el péptido
quimérico inhibitorio de la PKC, llamado HKPS, se utilizó para inhibir esta señal en
CMSP encontrándose una disminución de la capacidad proliferativa secundaria a la
inducción de apoptosis (Perdomo-Arciniegas y col. enviado).
Se determinó la viabilidad por medio de la incorporación de IP por citometría de flujo
en células CD14+ estimuladas o no con PMA y previamente tratadas con los péptidos
HKK y HKPS (10 y 80 μM) hasta por 24 h. De acuerdo con los trabajos realizados
con anterioridad (Perdomo-Arciniegas y col. enviado) el péptido HKPS a una
concentración de 80 μM después de 1 h de incubación causa muerte celular, mientras
que a 10 μM la inhibición no afecta mayormente la viabilidad. Como se observa en la
figura 11, a las 24 h se observó que las células incubadas con HKPS a 80 μM eran
más permeables al IP en comparación a las tratadas con HKK. A 10 μM los péptidos
no afectaron considerablemente la viabilidad celular, y no hay mayores diferencias en
la permeabilidad al IP por el tratamiento con los dos péptidos, aunque en las células
estimuladas se observa mayor permeabilidad al IP con los dos péptidos a 10 μM.
Estos resultados permitieron concluir que la disminución de la viabilidad se debió
principalmente a la internalización de la secuencia hidrofóbica (HK) asociada al
pseudosustrato (PS) y la inhibición de PKC, por lo cual en este modelo también es
posible utilizar los péptidos como una herramienta para inhibir la PKC.
44
Figura 11. Efecto del tratamiento con los péptidos HKPS y HKK en células estimuladas y no sobre la viabilidad. Células CD14+ tratadas por 1 h previa a la estimulación o no con PMA (100 nM) con HKPS y HKK después de 24 ha 80 y 10 μM. En sombreado gris se muestra la fluorescencia media para las células que no recibieron tratamiento con los péptidos, la línea negra sólida tratamiento con HKPS los péptidos a 80 μM y la línea negra punteada a 10 μM.
45
Para determinar el efecto de la inhibición de PKC en el proceso de diferenciación de
células CD14+, estas se incubaron con los péptidos HKPS o HKK a 10 μM durante 1
h antes de la estimulación con PMA y TNFα. Después de 1 h con los péptidos, se
evidenciaron agregados celulares en las células tratadas con HKPS pero no con HKK,
los cuales se mantuvieron hasta por los 2 días del cultivo. En las células estimuladas y
tratadas con HKPS los agregados fueron mayores que en las células sin estimular
(Fig. 12). Estos agregados también han sido observados en otras líneas celulares
hematopoyéticas cuando son tratadas con estaurosporina, un inhibidor inespecífico de
PKC, a concentraciones más bajas de las requeridas para causar muerte celular (Youl
y col. 2003).
A los 2 días de cultivo, se evaluó la expresión de marcadores de superficie en las
células estimuladas o no, y tratadas con o sin péptidos. En las células estimuladas y
tratadas con HKPS se evidenció un aumento en la expresión de todos los marcadores
en comparación a las estimuladas sin péptido. Como se observa en la figura 13, la
regulación negativa de CD14 en presencia del estímulo y tratadas con el péptido
HKPS disminuye en presencia de este; lo mismo se observó para la molécula CD45.
En las células sin estimular, la sobre-regulación de CD14 se mantiene y los demás
marcadores no cambian. El control HKK no pareció tener mayor incidencia sobre la
expresión de los diferentes marcadores en células estimuladas o no. Se puede por lo
tanto afirmar que los efectos se debieron principalmente a la internalización e
inhibición de PKC por el péptido HKPS. Cuando se analizan los cambios en al
expresión de CD14 y HLA-DR para la población de monocitos seleccionada por gate,
se observa que el efecto de la estimulación y de los péptidos ocurrió sobre estos (Fig.
14).
46
Figura 12. Aspecto del cultivo en células tratadas y no con HKPS. Microfotografías del día 4 de células en cultivo estimuladas y no con PMA (10 ng/ml) más TNFα (10 ng/ml) y tratadas con el péptido HKPS (10 μM). Aumento 40 X y acercamiento de 1.5.
47
Figura 13. Efecto del tratamiento con los péptidos HKPS y HKK sobre el inmunofenotipo. Expresión de marcadores al día 2 de cultivo células estimuladas o no, tratadas o no con los péptidos. En sombreado gris se muestra la fluorescencia media para células sin tratar con los péptidos al día 2. La línea negra sólida corresponde a la expresión del marcador en células tratadas con HKPS (10 μM) y la línea negra discontinua a HKK (10 μM).
48
Figura 14. Efecto del tratamiento con los péptidos HKK y HKPS sobre la población de monocitos. En el primer panel se muestra la región seleccionada R1 que corresponde a la población de monocitos por FSC y SSC. En el segundo panel se muestra la expresión de CD14 (eje y) y HLA-DR (eje X) para monocitos al día 0 y al día 2 de cultivo sin estímulo y estimulados (respectivamente). En el tercer y cuarto panel se muestra la expresión de los monocitos R1 sin estímulo y con estímulo al día 2 tratados con HKK y HKPS respectivamente. Los cuadrantes se ubicaron de acuerdo al respectivo al control de isotipo para eliminar fluorescencia inespecífica.
49
7. Discusión y conclusiones
En este trabajo se estudio el papel de la vía de señalización de PKC durante la
diferenciación de monocitos inducida con PMA. La activación de la enzima se indujo
por el éster de forbol PMA y se demostró que su inhibición afecta la diferenciación
monocítica. Anteriormente, en progenitores hematopoyéticos CD34+ (Davis y col.
1998; St Louis y col. 1999; Ramadan y col. 2001) y líneas blásticas de leucemia
mieloide (Kharfan-Dabaja y col. 2005; Cejas y col. 2005a) inducidos con PMA se
diferencian a CD, sin requerimientos adicionales de citoquinas. Estas células
adquieren tanto el fenotipo como las características funcionales de CD. La
señalización mediada por la estimulación de receptores como GM-CSF, IL-4, TNFα y
CD40 importantes en la diferenciación hacia CD inducen la activación de la PKC, por
lo cual la activación directa de la PKC por esteres de forbol representa un “bypass” de
la señalización a través de receptores (Kharfan-Dabaja y col, 2005). Debido a la
importancia y papel central de la PKC en diferentes procesos, en este trabajo se
investigo si en otros precursores de CD como los monocitos la activación directa de
PKC por PMA era suficiente para inducir la diferenciación hacia CD. Para esto se
utilizo un péptido quimérico (Perdomo-Arciniegas y col. enviado), con capacidad de
inhibir específicamente la PKC y así elucidar la importancia de esta enzima en la
diferenciación de monocitos inducida con PMA.
En los experimentos iniciales, en los que se aislaron monocitos por adherencia y se
estimularon con PMA (10 ng/ml) y TNFα (10ng/ml) se observaron cambios
morfológicos drásticos como células multinucleadas en presencia de PMA solo y
combinado con TNFα (Fig.3). Las dificultades en cuanto al número de células
obtenido, pérdida de viabilidad en la cosecha y contaminación con otros tipos
celulares para la realización de la citometría, llevaron a un cambio del método de
aislamiento. Al estimular células CD14+, purificadas por columna con las
concentraciones mencionadas de PMA y TNFα no se observaron los anteriores
cambios morfológicos (Fig. 6A), sugiriendo que la posible mezcla de poblaciones
50
celulares podría estar influyendo sobre el primer resultado observado. Se ha reportado
que los esteres de forbol al ser potentes activadores de crecimiento y mitógenos de
linfocitos, influyen sobre la apariencia morfológica y forma de linfocitos T y B a
corto y largo plazo al aumentar la capacidad locomotora de estas células (Wilkinson y
col, 1988), por lo tanto cambios en los linfocitos B y T pudieron influenciar los
resultados de los primeros experimentos. Sin embargo las fusiones celulares
observadas en las células CD14+ estimuladas con PMA (Fig. 3), donde se llegaron a
observar hasta 20 núcleos, también se han observado en CD (Akagawa y col. 1996) y
en macrófagos (Dugast y col. 1997), como resultado del aumento en la expresión de
moléculas de adhesión en monocitos inducidos con GM-CSF, IL-4, M-CSF.
Comparando los resultados de estos experimentos se puede determinar que la pureza
de los monocitos en el cultivo es fundamental para la evaluación de los efectos ante
ciertos estímulos.
Los resultados en cuanto a la regulación en la expresión de la mayoría de marcadores
moleculares de monocitos purificados por columna indicaron que la concentración de
PMA es fundamental. Células CD14+ (purificadas por columna) no mostraron
cambios morfológicos ni fenotípicos después de una estimulación de PMA con 10
ng/ml (Fig 6B), concentración utilizada previamente en progenitores CD34+ y en
líneas celulares (Davis y col. 1998; St Louis y col., 1999; Ramadan y col. 2001;
Kharfan-Dabaja y col., 2005; Cejas y col 2005a). Al parecer en monocitos puros se
requiere de una mayor concentración de PMA (100 nM; Fig. 8). Esto es similar a lo
que ocurre en células HL-60, en donde altas concentraciones de PMA inhiben la
proliferación y favorecen la diferenciación, mientras que las bajas actúan como
mitogénicos y no afectan el fenotipo (Trayner y col. 1992). Esto mismo ha sido
evidenciado con progenitores hematopoyéticos transformados donde el tratamiento
con PMA a 100 nM induce la diferenciación mielomonocítica mientras que una
concentración de 20 nM favorece la diferenciación hacia eosinófilos (Rossi y col.
1996), por lo cual diferentes niveles de actividad de PKC resultan en respuestas y
fenotipos distintos. Estos mismos autores observan que bajas concentraciones de
51
PMA resultan en una activación neta más alta comparativamente con mayores
concentraciones, por tanto plantean que existe un mecanismo por el cual diferentes
niveles de activación de la misma vía de señalización favorece la diferenciación
dentro de un linaje específico por la activación diferencial de factores
transcripcionales.
Con este trabajo se mostró que la estimulación con PMA produjo la regulación
negativa de CD14 y CD45, la estabilización en la expresión de HLA-DR,
disminución de HLA-I y la regulación positiva de CD11b y CD83, en concordancia
con la adquisición de características de CD y la pérdida de fenotipo de monocito (Fig.
8). Este nuevo fenotipo se logro seguramente por la activación de PKC inducida por
el PMA. La estimulación con TNFα solo no produjo ningún cambio en los
marcadores como era de esperarse, al ser este un factor de maduración incapaz de
iniciar un proceso de diferenciación (St Louis y col. 1999). Sin embargo, durante
todos los experimentos (monocitos separados por adherencia o por columna) los
cambios morfológicos fueron mas consistentes en las células estimuladas con PMA
más TNFα en comparación a las estimuladas con PMA solo. De esta manera,
parecería que el TNFα si favorece la maduración en acción conjunta con otros
estimuladores, aumentando la expresión de CD83 y CD86, moléculas co-
estimulatorias de gran importancia para la activación de LT por parte de las CD.
CD86 no cambió durante la estimulación y el aumento de CD83 pareció ser
principalmente en respuesta al PMA; sin embargo, es importante anotar que las
células sin estímulo aumentaron espontáneamente CD83. Adicionalmente, a lo largo
de los experimentos se observo que tanto las células estimuladas con PMA solo,
TNFα solo o con ambos, se formaban agregados celulares. En otros tipos celulares se
ha reportado que estos factores median interacciones homotípicas e incrementan la
expresión de moléculas de adhesión resultando en la formación de esos agregados
(Laudanna y col. 1998; Miura y col. 2001). En las células sin estímulo no se
observaron estas agregaciones por lo cual parece ser un efecto específico de la
estimulación y no un proceso espontáneo.
52
Durante el período de cultivo, monocitos sin estímulo así como CMSP aumentan
espontáneamente la expresión de CD14 (Kruger y col. 1996). Esto mismo se observó
aquí tanto en los monocitos recuperados por columna como en los separados por
adherencia (Fig. 6 y 8). El incremento espontáneo de CD14 aún no se ha
determinando si es un fenómeno fisiológico o si la manipulación o contacto con la
superficie plástica activaría los monocitos incrementando la expresión de CD14
(Kruger y col. 1996).
Un aspecto de gran controversia durante mucho tiempo ha sido el definir como actúa
el PMA sobre la PKC, si el efecto es consecuencia de la activación o de la depleción
de la enzima, debido a que la activación por PMA es irreversible y tanto altas
concentraciones como exposiciones prolongadas depletan las células de PKC. En los
distintos modelos de diferenciación por inducción con esteres de forbol, existen
evidencias que apoyan tanto la depleción de la PKC como el factor determinante de la
transformación celular (Lu y col. 1997) como la adquisición de un fenotipo
transformado en consecuencia de la activación sostenida de PKC (Aihara y col. 1991;
Liao y col. 1994). En este trabajo no se pudo determinar si los cambios observados
ocurrieron en respuesta a la activación o a la depleción. Sin embargo, se ha
demostrado que la regulación negativa de CD14 en monocitos ocurre por la
activación de PKC tanto al estimular con IL-4 y GM-CSF como por PMA (Launer y
col. 1990; Labeta y col. 1993; Kruger y col. 1996). Esta regulación negativa se da
nivel transcripcional, lo cual implica la adquisición de nuevas propiedades, por tanto
resulta mas factible plantear que los cambios observados aquí resultaron de la
activación de PKC.
En otros trabajos, con progenitores CD34+ y monocitos también se ha estudiado el
papel de PKC en la diferenciación a CD utilizando sustancias inhibitorias de esta
enzima (Davis y col. 1998; St Louis y col. 1999; Cejas y col. 2005a). En monocitos
tratados con GM-CSF, IL-4 y TNFα y con el inhibidor bisindolilmaleimida se
53
observo un bloqueo en la sobre-regulación de los marcadores CMH clase I y II,
CD11c, CD40, CD80, CD86 y CD83 y una menor regulación negativa de CD14, la
cual era completa con el tratamiento con citoquinas. Los resultados encontrados aquí
coinciden con la disminución en la regulación negativa de CD14 por la inhibición de
PKC (Fig. 12), pero no con la regulación de marcadores como HLA I (CMH clase I),
HLA-DR (CMH clase II), CD83 y CD86. Parece entonces existir una relación directa
entre la activación/inhibición de PKC y la regulación de CD14, no así con los demás
marcadores que pueden no estar regulados directamente por PKC o en caso de estarlo
la regulación sería distinta. En los monocitos de sangre periférica las isoformas
clásicas de PKCα y β son predominantes (Mamputu y col. 1998; Monick y col.
1998), por lo cual es posible plantear que la regulación de CD14 por PKC sea por
estas isoformas. Esta hipótesis se apoya con el hallazgo reportado en granulocitos, en
los cuales PMA regula negativamente la expresión inducible de CD14 por el LPS,
pero el tratamiento con un inhibidor específico de PKCα y no con un inhibidor para
las demás isoformas revirtió el efecto negativo del PMA (Pedron y col. 2000).
Otro de los marcadores regulados por la activación e inhibición de PKC es CD45.
Aquí se observo una reversión del efecto negativo de la estimulación sobre la
expresión de CD45 con el tratamiento con el péptido quimérico. En CD la
importancia de este marcador durante la diferenciación no se ha definido con
exactitud; autores como Pickl y col (1996) reportan un aumento durante la
diferenciación de CD derivadas de monocitos con citoquinas mientras que Zhou y
col. (1996) indican una disminución de CD45 debido a la adquisición de la expresión
de CD45RO, una isoforma producto de “splicing” diferencial, lo cual se correlaciona
con la maduración de las CD. Deszo y col. (2001) utilizando la línea celular
monocítica U-937 reportaron que CD45 es sobre-regulado con la estimulación de
PKCδ a una concentración de 100 nM de PMA. Además, una reducción en la
expresión de CD45 por transfección de un vector antisentido incrementa la actividad
de PKC, favoreciendo la expresión de marcadores y la adquisición de una morfología
de una célula diferenciada. Los resultados de citometría obtenidos en este trabajo
54
demostraron una dinámica de regulación distinta entre PKC y CD45. La activación de
PKC inducida por el PMA a 100 nM regula negativamente CD45, y el efecto
disminuye con la inhibición de PKC.
Los resultados demostraron que la activación de PKC inducida por una alta
concentración de PMA regula marcadores importantes de la diferenciación de
monocito hacia CD. A una baja concentración de PMA estos cambios no se
observaron. Por lo tanto, la activación de PKC en monocitos, así como en otros
progenitores anteriormente estudiados es importante en la adquisición de un fenotipo
diferenciado y semejante al de CD. Los marcadores CD14 y CD45 parecen estar
regulados por las isoformas clásicas de PKC, al observar por citometría de flujo la
recuperación en la expresión de estos marcadores disminuida notoriamente ante la
estimulación con el PMA. Los demás marcadores parecen no estarlo directamente.
Las moléculas del CMH también son moduladas por la estimulación. La
estabilización de HLA-DR y la regulación negativa de HLA-I, sugieren que estas
células presentarían más eficientemente, en contexto de moléculas de clase II. Esto
seria relevante en la fisiología celular durante el desarrollo de células presentadoras
de antígeno profesionales.
Finalmente, en este trabajo se muestra la utilización del péptido quimérico para
estudiar un proceso de diferenciación celular. Los efectos encontrados sugieren que el
péptido se internaliza e inhibe específicamente la PKC, principal efector durante este
proceso.
55
8. Recomendaciones
La marcación de otras moléculas en las células CD14+, por ejemplo CD11c, CD1 y
Mac-1 sería recomendable para lograr una mejor definición del fenotipo obtenido con
las estimulaciones usadas. En este mismo sentido pruebas complementarias como la
reacción mixta de linfocitos y ensayos de fagocitosis permitirían caracterizar
funcionalmente estas células.
En este trabajo se estableció que un péptido inhibitorio de las isoformas PKCα/β
podía revertir el efecto de la estimulación en la regulación de moléculas como el
CD14 y CD45 entre otras. En trabajos recientes se ha encontrado que la actividad
diferencial entre estas dos isoformas es fundamental en la diferenciación del
monocito hacia célula dendrítica o macrófago (Lin y col. 2007). Otra recomendación
entonces sería determinar las actividades enzimáticas de estas dos isoformas (en
inmunoprecipitados) en los fenotipos observados después de la estimulación de
monocitos con PMA y/o la inhibición con el péptido usado.
56
9. Referencias
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10. Anexos
Anexo 1
DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA DONACIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE PERIFÉRICA PARA EL PROYECTO: Efecto de la inhibición de la proteína quinasa C (PKC) en la diferenciación de monocito a célula dendrítica. I. INVITACIÓN Y PROPÓSITO Está usted invitado a participar como donante de sangre en el estudio: Efecto de la inhibición de la proteína quinasa C (PKC) en la diferenciación de monocito a célula dendrítica. El propósito principal de este proyecto es estudiar la diferenciación celular que es fundamental para la respuesta a diferentes infecciones y enfermedades. II. REQUISITOS PARA PARTICIPAR Si usted participa, se tomará una muestra de sangre periférica de la vena del brazo para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (células blancas) y eritrocitos (células rojas). La cantidad mínima es 7 ml y la máxima será 70 ml. La extracción de la muestra puede causar una pequeña molestia en la parte donde fue extraída: algunas personas pueden sufrir mareo o confusión y más eventualmente un sangrado, sin embargo es muy poco probable una reacción mucho mas seria, como sería el adormecimiento del brazo o una pequeña infección de la piel. Todo el procedimiento se llevará a cabo de una manera aséptica y adecuada por un profesional de la salud. III. LOS POSIBLES BENEFICIOS PARA USTED U OTROS Su participación en este estudio no lo beneficiará a usted directamente en ningún modo. Sin embargo uno de los propósitos de este proyecto es contribuir al conocimiento en el área de las ciencias médicas básicas médicas en Colombia y divulgar los resultados en aras de impulsar grupos a trabajar en áreas de investigación, lo cual genera desarrollo en nuestro país. IV. ALTERNATIVAS DE PARTICIPACIÓN Tiene usted la libertad de descartar esta invitación. V. SEGURIDAD Los riesgos físicos que existen al incorporarse como donante a este proyecto de investigación son solamente los causados por la toma de la muestra de sangre. Estos son mínimos así que el riesgo es pequeño. Si le causara algún daño se le brindarán los auxilios necesarios.
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VI. REEMBOLSOS A USTED No se le pagará a usted por la donación realizada. La donación es totalmente voluntaria y altruista. VII. GASTOS No tendrá que cubrir ningún gasto de colección de la muestra, procesamiento o análisis de su sangre. VIII. CONFIDENCIALIDAD Su identidad no será revelada en ninguna forma o declaración escrita como resultado de su participación en el proyecto. IX. PREGUNTAS O DUDAS Si tiene preguntas o alguna duda sobre esta solicitud o sobre el proyecto en general, por favor remítalas al Departamento de Ciencias Fisiológicas de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia a la médica, Ana María Perdomo Arciniegas o al Doctor Jean Paul Vernot, director del proyecto. X. SU FIRMA ABAJO INDICA QUE USTED HA LEIDO Y ENTENDIDO EL CONSENTIMIENTO INFORMADO, QUE HA TENIDO LA OPORTUNIDAD DE HACER PREGUNTAS, QUE SE LE HA DADO LA INFORMACIÓN MAS PRECISA QUE HA SIDO POSIBLE Y QUE ESTA DE ACUERDO EN PARTICIPAR COMO DONANTE DE UNA MUESTRA DE SANGRE PERIFÉRICA PARA EL PROYECTO MENCIONADO. ____________________ __________________ Firma del donante Firma del testigo ____________________ __________________ Nombre del donante Nombre del testigo ______________________ __________________ Fecha Fecha
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