Embed Size (px)
Citation preview
ESCUELA DE GRADUADOS
TESIS DE MAGÍSTER
JEAN MARY DEZAMOUR
VALDIVIA-CHILE
2013
EFECTO DE LA RAZA Y GENOTIPO SOBRE LA
COMPOSICIÓN GRASA DE LA LECHE EN REBAÑOS
LECHEROS DE LA REGIÓN DE LOS RÍOS
ii
INFORME DE APROBACION DE TESIS DE MAGISTER
La Comisión Evaluadora de Tesis Comunica al Director de la Escuela de Graduados de la Facultad de Ciencias Agrarias que la tesis de Magíster presentada por el candidato
JEAN MARY DEZAMOUR
Ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el 17 de Junio 2013, como requisito para optar al grado de Magíster en ciencias Mención Producción Animal y, para que así conste para todos los efectos firman:
Profesora Patrocinante: Ximena Valderrama Linares _______________
Profesor Copatrocinante: Andrés Carvajal _______________
Profesor Informante:
Daniel Alomar _______________
iii
DEDICATORIA
A mi padre Benjamen Desamours por haber puesto en mí su confianza.
A Marie Ange Pierre, por su incondicional apoyo moral, su cariño y paciencia.
iv
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por haberme dado fuerzas en los momentos más difíciles,
Al Ministerio de Agricultura de Haití,
A la Agencia de Cooperación Internacional de Chile (AGCI), por esta
gran oportunidad de especializarme en Chile,
Al Ing. Agr. Edie Charles,
A la Dirección de INIA Remehue por haberme aceptado en su
institución,
A mi patrocinante, Dr. Andrés Carvajal R. por su ayuda y apoyo
incondicional,
A los investigadores Dr. Emilio Ungerfeld y Dr. (c) Alfredo Lepori,
A todos los profesores del Instituto de Producción Animal (IPA) de la
Universidad Austral de Chile (UACh) en especial: Ximena Valderrama,
Daniel Alomar, Suzanne Hodgkinson, Oscar Balocci,
A todo el personal del Laboratorio de Biotecnología y Calidad de
Alimentos y Medioambiente de INIA Remehue,
A mi familia por haber estado a mi lado durante todo el proceso y por
guiarme por el camino de la educación,
A mis compañeros del Magíster y mis compatriotas haitianos de la UACh,
A los productores y encargados de lechería de los predios que
participaron en este estudio,
A todas y todos que de una manera u otra han contribuido a la realización
de este trabajo.
v
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Páginas
RESUMEN
xi
ABSTRACT
Xii
I INTRODUCCIÓN
1
1.1 Hipótesis
3
1.2 Objetivos
3
2 REVISIÓN DE LITERATURA
4
2.2 Grasa
5
2.3 Ácido Linoleico Conjugado (CLA)
8
2.4 Síntesis del ácido linoleico conjugado (CLA)
9
2.5 Factores que afectan la composición láctea
11
2.6 Factores genéticos que afectan la composición de la grasa láctea 12
3 MATERIALES Y MÉTODOS
17
3.1 Ubicación y duración del trabajo
17
3.2 Animales
17
3.3 Análisis de ácidos grasos en leche
18
3.4 Extracción de DNA y amplificación de fragmentos mediante
PCR 19
3.5 Genotipificación mediante PCR-RFLP
20
3.6 Análisis genético
21
3.7 Análisis estadístico
21
4 PRESENTACIÓN Y DISCUCIÓN DE RESULTADOS 24
4.1 Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas 24
4.2 Producción de leche, porcentaje de grasa y proteína por biotipo 27
según mes de muestreo.
vi
4.3 Efecto de la raza sobre la producción de leche, los porcentajes 29
de grasa y proteína
4.4 Efecto de los polimorfismos SCD1 y DGAT1 sobre la
Producción de leche, los porcentajes de grasa y proteína 30
4.5 Efecto de la raza sobre la composición de la grasa láctea 33
4.6 Efecto del polimorfismo SCD1 A293V sobre la composición de 36
ácidos grasos de la leche
4.7 Efecto del polimorfismo DGAT1 K232A sobre la composición 42
de ácidos grasos de la leche
4.8 Análisis de correlación entre la variables estudiadas 44
5 CONCLUSIONES
45
6 BIBLIOGRAFÍA
46
7 ANEXOS
57
vii
INDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1 Alimentos consumidos por los animales 18
2 Condiciones para la genotipificación de los 20
Polimorfismos DGAT1 y SCD1 mediante PCR
RFLP
3 Número de animales, frecuencias genotípicas y
alélicas para el marcador SCD1 A293V.
24
4 Número de animales, frecuencias genotípicas y 26
alélicas para el marcador DAGT1 K232A.
5 Efecto raza sobre la producción de leche,
porcentaje de grasa y proteína.
30
6 Producción de leche, porcentajes de grasa y
proteína según genotipo para el polimorfismo
SCD1 A293V.
31
7 Producción de leche, porcentajes de grasa y
proteína según genotipo para el polimorfismo
DGAT K232A.
33
8 Efecto de la raza sobre sobre la composición 34
de la grasa.
9 Composición de grasa láctea según los
genotipos del polimorfismo SCD1 A293V en
Julio.
37
10 Composición de la grasa láctea según los
genotipos del polimorfismo SCD1 A293V en
38
Septiembre.
viii
INDICE DE CUADROS
11
Composición de la grasa láctea según el genotipo
SCD1 A293V.
39
12
Composición de la grasa láctea según el
genotipo del polimorfismo DGAT1 K232A.
42
13 Análisis de correlación entre los distintos tipos
de ácidos grasos y los índices de desaturación en
leche.
44
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
1 Evolución del contenido de proteína en la leche 5
según las estaciones del año en las zonas centro y
sur de chile.
2 Evolución del contenido de grasa en la leche según 6
las estaciones del año en las zonas centro y sur de chile.
3 Síntesis del ácido linoleico conjugado (CLA) 10
4 Producción de leche, porcentajes de grasa y proteína 28
por biotipo según mes de muestreo.
x
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
CLA : Ácido Linoleico Conjugado
DGAT1 : Diacilglicerol acil-CoA Aciltransferasa 1
DNA : Ácido Dexosirribonucleico
dNTP : Desoxirribonucleótido trifosfato
FN : Frisón Negro
HF : Holstein-Friesian
J : Jersey
MB : Montbeliarde
MUFA : Ácido Graso Monoinsaturado
OC : Overo Colorado
PCR : Reacción en Cadena de la Polimerasa
PUFA : Ácido Graso Poliinsaturado
RFLP : Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción
SCD1 : Stearoil CoA Desaturasa 1
SFA : Ácido Graso Saturado
SNP : Polimorfismo de Nucleótido Simple
TG : Triglicéridos
UV : Ultravioleta
xi
RESUMEN
La composición de la grasa influye sobre las propiedades tecnológicas de la
leche y determina efectos nutricionales y nutracéuticos que afectan la salud de
los consumidores. Esta composición depende principalmente de factores
nutricionales y genéticos. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto
de la raza y genotipo sobre la composición de la grasa láctea en rebaños
mantenidos bajo un sistema semiextensivo. Mediante la técnica de PCR-RFLP
se genotiparon dos marcadores moleculares (SCD1 A293V y DGAT1 K232A)
en cinco biotipos de bovinos presentes en la región de Los Ríos,
determinando que las poblaciones estaban en equilibrio génico para el
marcador SCD1 siendo el alelo predominante la variante C; mientras que para
el segundo marcador (DGAT1) las poblaciones de bovinos Jersey y Overo
Colorado no estaban en equilibrio, y el alelo predominante fue GC.
A su vez, se determinó el perfil de ácidos grasos de la leche individual y se
evaluó el efecto de los parámetros genéticos sobre la concentración de SFA,
MUFA, PUFA, CLA y Omegas en la población de bovinos Holstein, Jersey y
Frisón negro. A nivel de composición se determinó que el principal tipo de
ácido graso presente en leche fue el SFA. Animales portando el genotipo GG
para el marcador SCD1 presentan una menor proporción de grasa total pero
un mayor porcentaje de MUFA en leche, mientras que aquellos con genotipo
GC/GC para DGAT1 presentan menor contenido de SFA pero con mayor
contenido de CLA. Por otro lado, los animales de raza Holstein-Friesian
presentan un perfil de composición de grasa láctea que podría sugerir una
calidad más saludable para los consumidores. En conjunto, los resultados
muestran que los factores genéticos evaluados (raza y marcadores) están
asociados a la composición de la grasa en leche. Palabras Claves: Bovinos
lecheros, DGAT1, SCD1, composición de ácidos grasos, CLA.
xii
ABSTRACT
Milk fat composition influences the technological properties of milk and also
has several nutritional and nutraceutical effects over the health of consumers.
This composition depends mainly on nutritional and genetic factors. The aim
of this study was to determine the effect of breed and genotype on milk fat
composition in dairy herds maintained under a semi-extensive system at the
Los Ríos region. Two molecular markers (SCD1 A293V and DGAT1 K232A)
were genotyped By PCR-RFLP in five biotypes determining that populations
were in genic equilibrium for both markers with exception of DGAT1 in
Jersey and Overo Colorado populations.
In turn, we determined the fatty acid profile in individual milk samples and
evaluated the effect of genetic parameters on the content of SFA, MUFA,
PUFA, CLA and Omega in Holstein-Friesian, Jersey and Friesian black
breeds. The results showed that the main type of fatty acid present in milk was
the SFA. Animals carrying the GG genotype for the marker SCD1 had a
lower proportion of total fat and a higher percentage of MUFA in milk, while
those with genotype GC/GC for DGAT1 had lower content of SFA but with
higher content of CLA. On the other hand, Holstein-Friesian bovines present
a profile of milk fat composition might suggest a healthier quality for
consumers. Together, the results show that genetic factors (breed, SCD1 and
DGAT1 markers) are associated with the composition of the milk fat.
Keywords: Dairy herds, DGAT1, SCD1, fatty acids composition, CLA.
1
INTRODUCCIÓN
La producción de leche bovina en el sur de Chile es una actividad económica
importante y se basa principalmente en el pastoreo ya que el clima favorece la
disponibilidad de la pradera en buena parte del año. Adicionalmente, algunos
animales son o pueden ser suplementados con granos y/o ensilajes
dependiendo de la disponibilidad de materia seca y el nivel productivo.
En los mamíferos la leche está constituida principalmente por proteínas,
grasas, lactosa y vitaminas, y varios factores afectan su composición, pudiendo
éstos ser de origen animal (como la genética) o externos (alimentación). De
aquí la importancia de estudiar estos factores con objeto de mejorar la
composición y calidad de la leche.
Respecto de la genética, se ha descrito que animales de distintas razas poseen
diferencias respecto a la composición de la leche, incluido el perfil de grasas.
Estas diferencias pueden ser resultado de la presencia y/o expresión de genes
específicos relacionados con la síntesis y composición de la grasa, los cuales
confieren esas características. Pero además, se ha observado que animales de
la misma raza, mantenidos bajo un sistema de manejo y alimentación
semejantes, presentan variabilidad en cuanto a la composición de la grasa
láctea. En este caso, la diferencia puede deberse a la presencia o ausencia de
polimorfismos en los genes relacionados, o incluso en otros de función
distinta.
Un mismo gen o región del ADN puede tener varias formas alélicas, es decir,
presenta zonas de variabilidad denominadas polimorfismos, los cuales son
2
heredables y pueden relacionarse o asociarse a diferentes características
fenotípicas. Estas regiones se denominan marcadores genéticos o moleculares
(SNP, SSR, QTL, etc.), pudiendo ir desde un gen hasta un nucleótido.
En ganadería, estos marcadores pueden ser una excelente herramienta para
identificar animales con un mejor perfil genético para las características de
importancia económica. Estos animales pueden utilizarse como reproductores
y así realizar cruzamientos con mayor certeza aumentando la frecuencia de
genes y/o alelos favorables. Actualmente, los países en desarrollo están
utilizando marcadores genéticos para identificar animales de mayor valor
económico en sus programas de mejoramiento. La utilización de estos
marcadores tiene como ventaja que permiten tener una estimación más exacta
del valor genético del animal con lo cual disminuye el costo de prueba de los
machos reproductores. Así, se ha sugerido que a partir del mejoramiento
genético se puede mejorar la calidad nutricional de la leche (Soyeurt y col.,
2006).
Resultados de investigaciones anteriores han demostrado que determinados
alelos de los genes DGAT1 y SCD1, los cuales participan activamente en la
síntesis de lípidos, influyen en la composición de la grasa de la leche
explicando su variación entre animales alimentados con la misma dieta. Estos
trabajos se han realizado principalmente en animales de raza Holstein-Friesian
pero se desconoce si esos efectos se mantienen en otras razas como algunos
de los presentes en la zona sur de Chile. La validación de esos marcadores en
nuestros rebaños permitirá identificar animales que puedan utilizarse en
programas de mejoramiento con objeto de modificar la composición de la
leche y así la rentabilidad económica de los predios.
3
1.1 Hipótesis.
La raza y polimorfismos en los genes DGAT1 y SCD1 determinan en parte la
composición de la grasa de la leche de bovinos presentes en el sur de Chile.
1.2 Objetivos.
1- Caracterizar la composición de la grasa láctea en rebaños bovinos de
diferentes razas bajo un sistema semiextensivo representativo de la región de
los Ríos.
2- Establecer la existencia de asociación entre la raza y los polimorfismos
SCD1 A293V y DGAT1 K232A y la composición de la grasa láctea.
4
2 REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Componentes de la leche.
La leche es un fluido biológico que se sintetiza en la glándula mamaria de los
mamíferos, siendo una importante fuente nutritiva compuesta por proteínas,
grasas, azúcares, minerales (particularmente Calcio) y vitaminas. En los
bovinos, la leche está constituida aproximadamente por un 87% de agua y
13% de sólidos totales (materia grasa y proteína), valores que pueden variar
según la raza, edad, etapa de lactancia y estado nutricional, entre otros factores
(Manterola, 2011). El principal azúcar de la leche es el disacárido lactosa, el
componente más constante y abundante en la leche con un 4,6% (Linn, 1998),
el cual participa en la regulación del contenido de agua y así el volumen de
leche.
Por su parte, la fracción proteica corresponde a un 3,3% y está constituida
principalmente por caseínas (aprox. un 80%) y el resto por proteínas séricas
como β-lactoglobulina (β-LG), α-lactoalbúmina (α-LA), lactoferrina,
inmunoglobulinas y otras, las cuales tienen importantes efectos biológicos,
además de aportar aminoácidos esenciales para la nutrición (Amiot, 1991).
El porcentaje de proteína presenta una variación estacional. En otoño y
primavera, el porcentaje de proteína es mayor en comparación a las demás
estaciones, como una consecuencia de una disminución de las fibras y
azúcares del alimento en otoño, y un aumento de la proteína en relación a los
niveles energéticos de la pradera en primavera (Valderrama, 2011; Figura 1).
Esta diferencia es producto de la alimentación debido a que durante el verano
5
se dispone pradera con alta fibra y baja en proteína que, junto a las altas
temperaturas afectan el consumo de materia seca y la producción de sólidos;
mientras que en invierno el aporte de la pradera en la ración es mínimo debido
a una baja tasa de crecimiento de la pradera y alto contenido de agua en la
misma (Bachman y col., 1992).
Figura 1. Evolución del contenido de proteína en la leche según las estaciones
del año en las zonas centro y sur de Chile (Extraído de Valderrama, 2011).
2.2 Grasa
La grasa presente en la leche varía entre un 3.5% y 6.0% siendo el
componente más variable, y determina muchas de las propiedades
fisicoquímicas, de manufacturación y organolépticas de la leche.
Principalmente contiene ácidos grasos saturados (SFA; 70%),
monoinsaturados (MUFA; 25%) y poliinsaturados (PUFA; 5%) (Grummer,
1991; Schennink y col., 2008). Los SFA, en general, son mayoritariamente
ácidos grasos de cadena corta y media producidos a partir de ácido acético
6
durante la fermentación ruminal, siendo los principales el ácido mirístico
(C14:0) y el ácido palmítico (C16:0) (Schennink y col., 2008). Por su parte los
MUFA y PUFA son ácidos grasos de cadena media y larga y provienen de la
dieta ingerida por los animales.
Al igual que la proteína, el porcentaje de grasa en leche muestra una variación
estacional siendo mayor en los meses de otoño e invierno en comparación con
primavera y verano (Banni and Martin, 1998; Valderrama, 2011; Figura 2).
Esta variación se debe al bajo contenido de fibras efectivas que contiene la
pradera en los meses de primavera, mientras que en verano las altas
temperaturas y déficit hídrico producen cambio en la calidad de la pradera lo
cual trae consigo un aumento en el contenido de fibras, menor contenido de
proteína y digestibilidad lo que afecta el consumo de materia seca por parte de
las vacas y la producción de sólidos.
Figura 2. Evolución del contenido de grasa en la leche según las estaciones del
año en las zonas centro y sur de Chile (Extraído de Valderrama, 2011).
7
Diversos estudios clínicos realizados en animales modelos indican que dietas
con una alta cantidad de SFA pueden conducir a un aumento en el colesterol
sanguíneo y a un mayor riesgo de aterosclerosis y enfermedades coronarias en
el humano (German y col., 1997). Debido a este efecto negativo de los SFA
sobre la salud humana, la grasa láctea así como otras grasas animales han
tenido una mala reputación. Sin embargo, se ha descrito que no todos los SFA
incrementan el nivel de colesterol sanguíneo en la misma proporción (Arnould
y col., 2009; Bauman and Lock, 2010).
Por otro lado, los MUFA principalmente y también PUFA, disminuyen el
colesterol sérico y la lipoproteína de baja densidad (LDL) reduciendo el riesgo
de desarrollar enfermedades coronarias (Kris-Etherton y col., 1999; Mensink
y col., 2003). Así, se han planteado recomendaciones dietéticas con
combinaciones favorables de lípidos lácteos para la salud humana que
incluyen 8-30% SFA, 60-82% MUFA y 10% PUFA (Hayes and Khosla, 1992;
FAO, 2008).
Los PUFA, además, desempeñan un papel importante en el desarrollo fetal y
el mantenimiento de la salud humana, siendo los omega-3 (C18:3) y omega-6
(C18:2) los más abundantes, y encontrándose en el aceite de linaza, la semilla
de colza, la soja y la grasa de animales alimentados bajo un sistema pastoril
(Jump, 2002). Se ha descrito que los ácidos grasos oleico (C18:1) y alfa-
linolénico (C18:3) pertenecientes a la familia omega-3 tienen propiedades
contra el desarrollo del cáncer y las enfermedades coronarias, mientras que el
ácido linoleico (C18:2), el más importante de la familia omega-6, mejora la
sensibilidad a la insulina reduciendo así la incidencia de diabetes tipo II (Hu y
col., 2001; Lee y col., 2009).
8
2.3 Ácido Linoleico Conjugado (CLA)
Varios autores han descrito que la leche no solo aporta elementos
nutricionales como proteínas, lactosa y ácidos grasos, sino también otras
sustancias con funciones terapéuticas (McGuire, 2000; Haugh y col., 2007;
Bermingham y col., 2008; Brito, 2009; Bauman and Lock 2010, entre otros).
Los alimentos con estas propiedades se denominan funcionales (o
nutracéuticos) y en el caso de la leche destacan el ácido linoleico conjugado
(CLA), ácido oleico, butirato y ácidos omega 3 y 6 (Mele y col., 2007).
Es importante señalar que el CLA es un elemento de la grasa animal que se
encuentra principalmente en carne y leche bovina, y cuya concentración en
estos productos se relaciona con la alimentación de los animales (Bauman and
Lock., 2010).
El CLA corresponde a un PUFA de 18 carbonos (C18) con diferentes
isomerías geométricas las que en orden de importancia en leche son: el
isómero Cis-9, Trans-11 CLA el cual es la forma predominante (75-85%), el
isómero Cis-9, Trans-7 CLA (10%) y el isómero Trans-10, Cis-12 CLA, el cual
representa una baja concentración en la leche de vaca (McGuire, 2000; Belury,
2002; Whale y col., 2004). Se ha descrito que los diferentes isómeros del CLA
tienen efectos favorables para la salud de los consumidores, pero
mayoritariamente debido al isómero Cis-9, Trans-11 CLA. Estos efectos
benéficos son la prevención de enfermedades como el cáncer, diabetes y
aterosclerosis, la reducción de la hipertensión arterial, el aumento de la
respuesta inmune y la mineralización ósea (Bauman y col., 2001; Belury, 2002).
Además, se ha descrito que el CLA influye sobre la síntesis de
9
inmunoglobulinas (IgA, IgG, IgM) y también sobre el descenso de los niveles
de IgE, lo cual trae consigo efectos beneficiosos para prevenir y/o tratar
alergias alimentarias (Belery, 2002).
2.4 Síntesis del ácido linoleico conjugado (CLA).
El CLA presente en la leche tiene dos orígenes. Una porción se origina por la
acción de los microorganismos anaeróbicos del rumen capaces de hidrogenar
los PUFA contenidos en las plantas durante el metabolismo de las mismas,
proceso conocido como ''biohidrogenación ruminal''. En particular, el ácido
linoleico (C18:2 Cis-9, Cis-12) se transforma en ácido esteárico (C18:0)
principalmente por acción de la bacteria Butyrivibrio fibrisolvens, y luego el
esteárico se transforma en ácido linoleico conjugado (Bauman y col., 2001).
La otra fracción de CLA se sintetiza mayoritariamente (70%) de forma
endógena por acción de la enzima delta 9 Desaturasa (SCD-9) en la glándula
mamaria (Bauman y col., 2006); siendo esta vía la más importante para la
retención de CLA en carne y leche de rumiantes.
De acuerdo a Khanal y Dhiman (2004), la síntesis del CLA ocurre en dos
etapas: en la primera se lleva a cabo la biohidrogenación incompleta del ácido
linoleico y ácido linolénico (Bauman y col., 1999); mientras que en la segunda
ocurre la conversión endógena del ácido transvaccénico, un intermediario de
la biohidrogenación. Además, los mismos autores señalan que la
biohidrogenación completa del ácido linoleico y ácido linolenico resulta de la
transformación del ácido esteárico (C18:0) a ácido oleico (Figura 3).
10
Figura 3. Síntesis del ácido linoleico conjugado (CLA) (Extraído y modificado
de Bauman y col., 1999).
Según Gagliostro (2005), los ácidos grasos poliinsaturados como el ácido
linoleico (omega-6) y el ácido α-linolénico (omega-3) son los principales
precursores de CLA. El ácido linoleico se encuentra en abundancia en el silaje
de maíz, en los cereales y en granos oleaginosos, mientras que el ácido α-
linolénico es característico de la pradera. De acuerdo a lo descrito por Bauman
y col. (2010), el contenido de ácido α-linolénico en la grasa láctea es
importante para el crecimiento y desarrollo y es benéfico para mantener la
salud y prevención de enfermedades crónicas incluyendo desórdenes
cardiovasculares.
Estudios epidemiológicos y clínicos han demostrado una relación entre la
ingestión de omega-3 y efectos benéficos en diferentes enfermedades (Candela
11
y col., 2011). Por otro lado, una alta relación entre omega-6/omega-3 está
relacionada con la presencia de enfermedades cardiovasculares mientras que
una proporción menor a 4 reduce la mortalidad causada por dichas
enfermedades (Sretenović y col., 2009).
2.5 Factores que afectan la composición láctea.
Varios factores pueden afectar la composición de la leche, los que pueden ser
propios del animal como la genética, y otros ligados a factores externos del
medio como la alimentación, el manejo zootécnico y manejo sanitario, entre
otros. De acuerdo a Chilliard y col. (2007) y otros autores, la alimentación es
un factor importante que permite modificar la composición de la grasa en
leche. Esto ocurre debido a que gran parte de los precursores utilizados por la
glándula mamaria para la síntesis de ácidos grasos se producen durante la
fermentación ruminal de compuestos lipídicos presentes en la dieta.
Se ha descrito que una dieta basada en consumo de forrajes frescos contiene
mayor cantidad de grasa en comparación con una ración basada en forrajes
conservados y granos (ración totalmente mezclada, TMR) (Rico y col., 2007).
Según Bachman (1992), el tipo y calidad de forraje tienen gran influencia
sobre el porcentaje de grasa en la leche; es importante señalar que la madurez
del forraje es un factor de gran importancia cuando se quiere proporcionar un
adecuado nivel de fibra en la dieta ya sea para mantener o incrementar la grasa
en la leche.
Por ejemplo, en dietas con una baja relación forraje-concentrado se produce
un incremento en la producción del propionato y un descenso en la
12
producción del acetato y butirato, lo que trae consigo una caída en el
contenido total de grasa (Manterola, 2011). Además, la relación forraje-
concentrado debe ajustarse según el nivel alimentación de los animales.
Chilliard y col. (2007) señalan que la participación de la pradera en la
alimentación animal permite obtener mayor contenido de omega-3 y CLA con
una reducción en la concentración de los SFA de 10 a 16 carbonos. Dietas
formuladas para vacas de alta producción contienen mayor proporción de
concentrado con respecto al forraje, lo cual proporciona una fuente de
carbohidratos de fermentación rápida que provoca una caída en el pH
ruminal. Esto conlleva la inhibición de la actividad celulolítica reduciendo así
la disponibilidad de sustratos para la síntesis de grasa al nivel de la glándula
mamaria (Bachman, 1992). Según Manterola (2011), la caída en el pH provoca
una biohidrogenación incompleta de las grasas insaturadas lo que favorece la
absorción de ácidos grasos de cadena larga de configuración Trans, lo cual
conlleva a la inhibición de la síntesis de novo en la glándula mamaria.
2.6 Factores genéticos que afectan la composición de la grasa láctea.
Si bien la alimentación es el principal factor que modifica la grasa de la leche
en bovinos (y en rumiantes en general), la genética es otro factor importante a
considerar. Diversos estudios muestran que existen diferencias entre razas en
cuanto a la concentración de sólidos totales y volúmenes de leche producida.
Por ejemplo, bovinos de la raza Jersey presentan niveles más altos de sólidos
totales (particularmente grasa) en leche en comparación con bovinos de raza
Holstein Friesian (HF), los que se caracterizan por una alta producción de
leche. Asimismo, bovinos Holstein Neozelandeses, una raza seleccionada para
13
pastoreo, producen una leche con un contenido mayor de sólidos totales pero
con volúmenes de producción inferiores en comparación al HF (Manterola,
2011).
Además de estas diferencias por raza, se ha observado que dentro de cada una
de ellas existen animales con distintos contenidos de sólidos totales
incluyendo las grasas, a pesar de tener un manejo y alimentación semejante
(Kelsey y col., 2003). Estas diferencias pueden estar dadas por distintos niveles
de expresión en genes relacionados a la síntesis de ácidos grasos, y/o la
presencia de polimorfismos dentro de estos genes u otras regiones no
codificantes.
Se ha descrito que los genes DGAT1 y SCD1 juegan un papel fundamental en
la composición de la grasa láctea ya que codifican enzimas importantes para la
síntesis de triglicéridos y ácidos grasos (Grisart y col., 2002). Estos genes, en el
bovino, se encuentran localizados en los cromosomas 14 (Grisart y col., 2002;
Winter y col., 2002) y 26 (Chung y cols, 2000; Schennink y col., 2008),
respectivamente.
El gen DGAT1 codifica para la enzima diacilglicerol acil-coA aciltransferasa-1
la cual cataliza el último paso y limitante de la síntesis de los triglicéridos (TG;
Cases y col. 1998; Schennink y col., 2008; Yen y col., 2008; Berry y col., 2010);
estos últimos representan un 98% de los lípidos lácteos (Näslund y col., 2008;
Juhlin y col., 2012). DGAT1 se expresa en el tejido mamario y también en
aquellos que almacenan y sintetizan triglicéridos (por ejemplo, adipocitos).
Estudios realizados en ratones indican que la deficiencia de este gen (dgat1-/-)
no es letal pero disminuye la adiposidad a la mitad y los niveles de TG se
14
reducen significativamente. Además, los animales son resistentes a la obesidad
inducida por una dieta rica en grasa. Por otro lado, su sobreexpresión resulta
en animales con mayor ingesta, mayor sobrepeso y adiposidad (Chi-Liang y
col., 2008).
En relación a la actividad enzimática de DGAT1, Schoonderwoerd y col.
(1990) señalan que es regulada por hormonas y/o el estado nutricional. De
acuerdo a Yen y col. (2008) la administración a ratas de hormonas como
glucagón o adrenalina reduce la actividad de DGAT1 mientras que el
tratamiento con ácidos grasos de cadena larga aumenta la actividad de dicha
enzima.
Por su parte, el gen SCD1 codifica para la enzima delta-9 Desaturasa la cual
participa en la biosíntesis de los ácidos grasos MUFA y en la síntesis del ácido
linoleico conjugado (CLA) (Isla-Trejo y col., 2002; Castillo y col., 2010).
En rumiantes en crecimiento, la enzima SCD1 se encuentra en tejido adiposo
mientras que en lactantes en tejido mamario. La SCD1 se ha considerado
como una enzima lipogénica y su regulación es de importancia fisiológica no
solamente por el papel que desempeña en la síntesis de MUFA sino también
por su patrón de regulación por dieta y hormonas como la insulina (Ntambi,
1999). Se ha demostrado que la actividad enzimática de SCD1 disminuye en el
hígado de ratas durante el ayuno y diabetes, mientras que una dieta con alta
cantidad de carbohidratos o administración de insulina aumenta su actividad.
Por otra parte, una dieta rica en SFA induce la actividad de SCD1 en hígado
de ratas, mientras que dietas con alto contenido de PUFA (por ejemplo, ácido
linoleico) disminuye la actividad de la enzima.
15
Algunos estudios han demostrado que la actividad del gen SCD1 en la
glándula mamaria es diferente entre razas, siendo menor en bovinos Jersey en
comparación con bovinos Holstein-Friesian (Beaulieu and Palmquist, 1995;
Drackley y col., 2001). El gen SCD1 es altamente polimórfico en bovinos
(Taniguchi y col., 2004). Los polimorfismos corresponden a variaciones en la
secuencia de nucleótidos, los cuales se presentan entre miembros de una
misma especie, pudiendo ser una inserción, deleción o cambio de bases. Un
ejemplo de éstos son los Polimorfismos de Nucleótidos Simples (SNPs), en
los cuales hay un cambio de una sola base de la secuencia nucleotídica. Se ha
reportado que algunos polimorfismos en el gen SCD1 están asociados al perfil
de ácidos grasos de la carne y de la leche (Mele y col., 2007; Mioli y cols,
2007).
Por ejemplo, en bovinos de raza Holstein Italiano se ha descrito un efecto
sobre la actividad de la enzima SCD1 y el contenido de MUFA (Mele y col.,
2007) y varios estudios han demostrado una asociación significativa entre el
polimorfismo A293V y la composición de ácidos grasos tanto en la leche
como en la carne (Taniguchi y col., 2004).
Por otro lado, está ampliamente demostrado que el polimorfismo K232A
del gen DGAT1 influye sobre la composición de la leche, alterando la
concentración de la grasa y proteína lácteas en diferentes razas (Grisart y
col., 2002; Grisart y col., 2004; Schennink y col., 2007). Este polimorfismo
explica un 50% de la variación genética del porcentaje de grasa en leche y
su índice de insaturación, y también tiene un efecto fuerte sobre la
composición de la grasa de la leche (Schennink y col., 2008).
16
La variante lisina (K) de este polimorfismo se asocia a un descenso en los
niveles de proteína y producción de leche pero con incrementos en el
porcentaje de grasa láctea (Winter y col., 2002), mientras que la variante
Alanina (A) está ligada a un aumento en el contenido de proteína y mayor
producción de leche, con una caída en la producción de grasa debido a una
síntesis deficiente de triglicéridos en la glándula mamaria. La variante lisina
tiene una mayor actividad enzimática en comparación con la variante alanina
(Grisart y col., 2004). Desde un punto de vista de la salud humana, se ha
propuesto que el incremento en la frecuencia de la variante A en animales que
generan alimentos sería beneficioso para la salud humana debido a su
asociación con un mayor contenido de ácidos grasos insaturados (Schennink y
col., 2007).
17
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Ubicación y duración del trabajo
En este estudio, se utilizaron animales de 5 razas: Holstein-Friesian (HF),
Jersey (J), Montbeliarde (MB), Overo colorado (OC) y Frisón Negro (FN), los
cuales provenían de predios comerciales localizados en las comunas de Máfil,
Paillaco y Río Bueno en la región de los Ríos. Los análisis, se realizaron en el
Laboratorio de Biotecnología, Calidad de Alimentos y Medioambiente del
Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA Remehue), localizado en la
Región de los Lagos entre Mayo 2012 y Enero de 2013.
3.2 Animales
La selección de los animales de cada rebaño se llevó a cabo en base a los
registros genealógicos tomando en cuenta la diversidad paterna de los
animales en estudio, incluyendo para las razas J, MB, OC y FN sólo aquellos
con un porcentaje de genética Holstein menor a un 15%. Los rebaños fueron
alimentados principalmente a pastoreo y suplementados estratégicamente
según época del año (Cuadro 1). Además, los animales contaban con datos de
control lechero y tenían entre 2-4 partos.
18
Cuadro 1. Alimentos consumidos por los animales
3.3 Análisis de ácidos grasos en leche.
De cada animal seleccionado se tomó una muestra de leche individual (80-100
mL) justo antes de la ordeña en los meses de Julio, Septiembre y Noviembre
de 2012. Esta muestra fue almacenada en frío y fue llevada inmediatamente al
laboratorio de Calidad de Alimentos. Brevemente, la muestra fue centrifugada
a 3.000 rpm durante 15 minutos para la separación de la crema y fue
almacenada a 4°C. Una vez obtenida la crema, se pesaron 2 gramos y la grasa
Animales Julio Septiembre Noviembre
Holstein
Pradera Pradera Pradera
Ensilaje de pradera y maíz Ensilaje de pradera Ensilaje de pradera
Maíz roleado y soya en pellet Ensilaje de maíz Ensilaje de maíz
Concentrado (7,9 kg) Concentrado (8,2 kg) Concentrado (8,0 kg)
Jersey
Pradera Pradera Pradera
Ensilaje de pradera Ensilaje de pradera Concentrado (5,9 kg) Concentrado(4,5 kg) Concentrado (4,5 kg)
F. Negro
Pradera Pradera Pradera
Heno (3 kg) Heno (1,4 kg) Heno (0,9 kg)
Sales minerales Sales minerales Sales minerales
Concentrado (5 kg) Concentrado (4 kg) Concentrado (4 kg)
Montbeliarde
Pradera Pradera Pradera
Ensilaje de pradera Ensilaje de pradera
Maíz roleado Maíz roleado Maíz roleado
Concentrado (4 kg) Concentrado (4 kg) Concentrado (4 kg)
Sales minerales Sales minerales Sales minerales
O. Colorado
Pradera Pradera Pradera
Ensilaje de pradera Ensilaje de pradera Concentrado (3 kg) Concentrado (3 kg) Concentrado (3 kg)
19
fue extraída mediante una mezcla de 10 mL de Hexano:Cloroformo (1:1,
vol/vol) y los ácidos grasos fueron metilados mediante esterificación de
acuerdo al método de Berdeaux y col. (1999). Finalmente, el análisis de ácidos
grasos se llevó a cabo mediante cromatografía de gases utilizando un equipo
SHIMADZU GC-201 Plus y los estándares Supelco 37 Comp. y Cis-11
Vaccenic Methyl Ester (Supelco Analytical, USA).
3.4 Extracción de DNA y amplificación de fragmentos mediante PCR.
De cada animal seleccionado se tomó una muestra de sangre (3 mL) mediante
punción de la vena caudal utilizando un sistema venojet conteniendo anti-
coagulante EDTA. Las muestras de sangre fueron mantenidas en frío y
transportadas al Laboratorio de Biotecnología donde fueron congeladas a -
20°C hasta su análisis.
La extracción de DNA genómico se llevó a cabo utilizando un kit comercial
(FAVORGEN BIOTECH, USA) y posteriormente su concentración e
integridad fueron determinadas mediante espectrofotometría a 260 y 280 nm,
y visualización en geles de agarosa al 1% teñidos con GelRed (Biotium, UK)
bajo luz UV. Una vez obtenido el DNA, la amplificación de fragmentos de los
genes DGAT1 y SCD1 se realizó mediante la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) utilizando partidores específicos (Cuadro 2). La secuencia
nucleotídica de los partidores fue obtenida de la literatura o diseñada
utilizando la secuencia descrita en el repositorio GeneBank y los programas
bioinformáticas libres BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), Primer 3
y OligoAnalizer y sintetizadas comercialmente (Omega Biotech, Germany).
20
Brevemente, la amplificación del fragmento de DGAT1 se realizó a partir de
35 ng de DNA en un volumen de 15 µL conteniendo 0,5 U Taq polimerasa
(Fermentas, USA), 0,45 µM de cada partidor, 0,2 mM dNTP’s y 2 mM Mg2+
en buffer PCR 1X. Para la amplificación de los fragmentos de SCD1, se
utilizó 35 ng de DNA en un volumen de 15 µL conteniendo 0,5 U Taq
polimerasa (Fermentas, USA), 0,3 µM de cada partidor, 0,2 mM dNTP’s y 2
mM Mg2+ en buffer PCR 1X. Finalmente, los fragmentos amplificados fueron
visualizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 2-2,5% en buffer
TBE 5X como anteriormente.
Cuadro 2. Partidores y condiciones para la genotipificación de los
polimorfismos de DGAT1 y SCD1 mediante PCR-RFLP.
SNP Partidor TA* ER**
DGAT1 K232A F: 5' TGCCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCC 3'
414 pb CfrI/EaeI R: 5' ACCTGGAGCTGGGTGAGGAACAGC 3'
SCD1 A293V F: 5’ GGATACCGCCCTTATGACAA 3’
725 pb FauI R: 5’ AATACCCTAAGCAGCAGACC 3’
* TA: Tamaño del amplicón
** ER: Enzima de restricción
3.5 Genotipificación mediante PCR-RFLP.
Para la determinación de los genotipos se utilizó la técnica de PCR-RFLP.
Esta técnica se basa en la escisión o corte de un fragmento de DNA de doble
hebra mediante una enzima de restricción (endonucleasa) que reconoce
secuencias específicas. Por tanto, la presencia o ausencia de esa secuencia que
incluye el polimorfismo en estudio genera fragmentos de distintos tamaños
21
que pueden ser identificados mediante electroforesis en gel. Así, los
fragmentos de DGAT1 y SCD1 amplificados mediante PCR fueron digeridos
a 37°C toda la noche con las enzima de restricción CfrI ó EaeI (Fermentas) y
FauI (Fermentas), respectivamente; y los patrones de bandas resultantes
fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 2-2,5% como
anteriormente.
3.6- Análisis genético
Las frecuencias genotípicas y alélicas fueron determinadas mediante conteo
simple, las cuales fueron comparadas con las frecuencias esperadas asumiendo
el estado de equilibrio de Hardy-Weinberg (Smith, 1970). Para establecer la
significancia de la desviación entre las frecuencias observadas y esperadas se
realizó un test de Chi cuadrado con un grado de libertad (nivel de significancia
p< 0,05), mediante el análisis con el programa libre Genepop.
3.7- Análisis estadístico
Es necesario mencionar que debido a dificultades encontradas para realizar los
muestreos correspondientes, pérdidas y/o deterioro de muestras de leche y
algunos parámetros productivos inexistentes, los datos de producción y
composición de leche para las razas Overo Colorado y Montbeliarde no
fueron considerados para el análisis de asociación, y por tanto, sólo se realizó
con bovinos de las razas Holstein-Friesian, Jersey y Frisón Negro.
El análisis de asociación entre razas, genotipos y ácidos grasos de la leche se
llevó a cabo tomando en cuenta exclusivamente el efecto de los genotipos
22
DGAT1 y SCD1, las razas, número de parto y estado de lactancia y sin
interacciones por dos razones fundamentales seguidas. En primer lugar, los
datos de composición de la leche no estuvieron disponibles para todas las
vacas en los tres meses de muestreo, lo que provocó un desbalance de los
datos a analizar, y en segundo lugar la distribución de los genotipos fue muy
desigual entre razas lo que causa falta de ortogonalidad en la información
obtenida.
Para el análisis del perfil de la grasa de la leche se trabajó exclusivamente con
los datos de las razas Holstein-Friesian, Jersey y F. Negro. Las variables de
composición seleccionadas fueron SFA, MUFA, PUFA, CLA, omega-
6/omega-3 y los índices de desaturación C14 y C16, las cuales fueron
determinadas por razas.
El ordenamiento y análisis descriptivo de estos datos de composición se
realizó mediante el programa Microsoft Office Excel 2007. Del perfil de
composición grasa los ácidos grasos individuales fueron agrupados en SFA,
MUFA, PUFA, CLA. Como una medida de la actividad enzimática de SCD1,
se determinaron los índices de desaturación C14 y C16 mediante las formulas:
C14:1/(C14:0+C14:1) y C16:1/(C16:0+C16:1), respectivamente. Además, se
determinó la proporción omega-6/omega-3, un indicador importante para la
salud humana, los cuales fueron utilizados en el análisis de asociación. Este
análisis entre los marcadores genéticos (DGAT1 y SCD1) y el perfil de
composición grasa se realizó mediante el programa informático JMP 10.0.1
SAS Institute (2012), utilizando un modelo lineal que consideró las variables
raza y genotipo (marcador SCD1 y DGAT1) como independientes explicando
el nivel de grasa en leche.
23
El modelo lineal utilizado fue:
Yijklm= µ+Bi Mj+Mk+ Pl+Lm+eijklm
Yijk: variable respuesta (composición grasa)
µ: media de la población
Bi: factor asociado a la raza
Mj: factor asociado al marcador 1
Mk: factor asociado al marcador 2
Pl: número de parto
Lm: días en leche
eijklm: error residual
24
4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
4.1 Determinación de las frecuencias genotípicas y alélicas.
En total se genotiparon 270 vacas con 50-59 animales por raza (Cuadros 3 y
4). Para el polimorfismo SCD1 A293V se observó que las cinco poblaciones
animales estudiadas están en equilibrio de Hardy-Weinberg (X²<3,84 que
implica un p>0,05), siendo el alelo C predominante (mayor frecuencia) en
todos las razas (Cuadro 3).
Cuadro 3. Número de animales y frecuencias genotípicas y alélicas para el
marcador SCD1 A293V.
En la raza Holstein-Friesian, la frecuencia del alelo C fue 0,64 versus 0,36 para
el alelo G, concordando con diversos reportes de bovinos Holstein presentes
en Holanda, Italia, Canadá y otros (Demeter y col., 2009; Mele y col., 2007;
Taniguchi 2004; Clarck y col., 2010). En la raza Jersey se observó una
frecuencia de 0,81 para el alelo C, valor similar a lo descrito por Mioli y col.
(2007) y Kgwatalala y col. (2009) en bovinos Jersey en Italia y Canadá.
Razas N°
Vacas
Frecuencias genotípicas Frecuencias alélicas CC GC GG C G χ²
Holstein 58 21 32 5 0,64 0,36 2,19 Jersey 50 33 15 2 0,81 0,19 1,88 O. Colorado 59 49 10 0 0,92 0,08 0,54 F. Negro 52 42 10 0 0,90 0,10 0,56 Montbeliarde 51 14 29 8 0,56 0,44 1,22 Total 270 - - - - - -
25
Respecto a las razas O. Colorado y F. Negro, las frecuencias para el alelo C
fueron similares (0,92 y 0,90 respectivamente), no encontrándose la variante
GG en la población evaluada. A nuestro saber, éste es el primer estudio de las
frecuencias genéticas del polimorfismo SCD1 en estas razas, no
encontrándose otros reportes en la literatura. Lo mismo ocurre con la raza
Montbeliarde, donde el alelo C predominó levemente con una frecuencia de
0,56 pero si se observó la existencia de animales portando el genotipo GG.
Para el polimorfismo DGAT1 K232A (Cuadro 4) se observó que las
poblaciones de las razas HF, FN y MB se encontraban en equilibrio de Hardy-
Weinberg pero no así las razas J y OC, donde la diferencia entre las
frecuencias encontradas y observadas fue significativa (χ²>3,84). Estos
resultados deben interpretarse con mesura ya que no existe un conocimiento
acabado de los criterios genéticos seleccionados para el desarrollo de cada raza
en Chile, aunque está ampliamente descrito que la raza Jersey se caracteriza
por un alto contenido de sólidos totales en leche (Prendiville y col., 2009). Por
otro lado, no podemos dejar de mencionar que el tamaño de la muestra
pudiera incidir en este parámetro y por tanto, se debiera ampliar la muestra
para tener una conclusión definitiva.
Los resultados de frecuencias muestran que el alelo GC para el marcador
DGAT1 K232A fue predominante en todos los rebaños con excepción de los
bovinos Jersey donde predominó el alelo AA (76%), (Cuadro 4). Es
interesante que el alelo AA se ha asociado fuertemente a un mayor contenido
de grasa en leche y menor producción de leche (Grisart y col., 2002; Tupac-
Yupanqui y col., 2004; Gautier y col., 2007; Banos y col., 2008; Carvajal, 2011,
entre otros), mientras que alelo GC se ha asociado a una mayor producción de
26
litros de leche por lactancia y un menor porcentaje de grasa en leche
(Prendiville y col., 2009). Esto concuerda con los resultados encontrados en
nuestro estudio donde los bovinos HF producen más litros de leche que los
bovinos Jersey pero contienen menos porcentaje de grasa (Figura 4A y B),
corroborando la asociación ya descrita.
Cuadro 4. Número de animales y frecuencias genotípicas y alélicas para el
marcador DGAT1 K232A.
Razas N°
Vacas
Frecuencias genotípicas Frecuencias alélicas
AA/AA GC/AA GC/GC AA GC χ²
Holstein 58 4 30 24 0,33 0,67 1,73 Jersey 50 26 24 0 0,76 0,24 4,97 O. Colorado 59 1 29 29 0,26 0,74 4,31 F. Negro 52 0 3 49 0,03 0,97 0,04 Montbeliarde 51 0 4 47 0,04 0,96 0,08 Total 270 - - - - - -
En la raza Holstein, el genotipo AA/AA se encontró sólo en 4 animales (7%)
mientras que en los bovinos Jersey en 26 (52%), no encontrándose en esta
última raza la variante GC/GC. Esto pudiera ser consecuencia de la fuerte
selección genética para la producción de grasa. Nuestros resultados
concuerdan con lo descrito por varios grupos de investigación (Berry y col.,
2010, Shennink y col., 2008 y Grisart y col., 2002) quienes reportan
frecuencias entre 0,30 y 0,40 para el alelo AA en bovinos HF de Irlanda,
Holanda y Nueva Zelanda. Asimismo, Spelman (2002) y Komisarek (2011)
reportan frecuencias de 0,79 y 0,88 para el alelo AA en bovinos Jersey,
concordando con lo encontrado en nuestro estudio (0,76).
27
Es interesante el hecho que en la población estudiada no encontramos la
variante AA/AA en las razas FN y MB y muy pocos animales tienen el
genotipo AA/GC, obteniendo frecuencias muy bajas para el alelo AA (0,04 y
0,03 respectivamente). Esto concuerda con lo descrito por Spelman y col.
(2002) y Gautier y col. (2007) quienes reportan una frecuencia de 0,04 para el
alelo AA en animales de raza Montbeliarde. Para una población heterogénea
de la raza FN, Carvajal (2011) reportó una frecuencia de 0,32 para este alelo.
Por su parte, en los bovinos O. Colorado la frecuencia del alelo AA fue algo
mayor (0,26), con un único animal (1,7%) portando el genotipo AA/AA, no
existiendo a nuestro entendimiento otros reportes de DGAT1 para este raza.
4.2 Producción de leche, porcentaje de grasa y proteína por raza según mes
de muestreo.
El análisis de los tres parámetros productivos determinó un efecto
significativo (p<0,05) de la fecha de muestreo (Figuras 4A, B y C y Anexos 1,
2 y 3). Respecto de la producción de leche, se observa que los animales de la
raza Holstein-Friesian presentan una mayor producción de leche en
comparación con los demás razas en las tres épocas muestreadas (Julio,
Septiembre y Noviembre; Figura 4A y Anexo 1). Además, se observa que en
los rebaños Holstein y Jersey hay una mayor producción de leche en el mes de
noviembre en comparación a julio y septiembre, mientras que en F. Negro se
observa una respuesta distinta. En relación al porcentaje de grasa en leche
(Figura 4B y Anexo 2) se pudo observar que el valor determinado en
noviembre en los rebaños Holstein y Jersey fue menor al determinado en julio
(esto no se observa para F. Negro). Además, el porcentaje de grasa en la raza
Jersey fue mayor respecto a FN y HF en las tres fechas de muestreo.
28
Figura 4. Producción de leche (A; L/día) y porcentajes de grasa (B) y proteína
(C) en leche en las razas Holstein-Friesian, Jersey y Frisón Negro por mes de
muestreo. Letras (a, b y c) indican significancia dentro de una raza.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Julio Sep Nov
Holstein
Jersey
F. Negro
0
1
2
3
4
5
6
Julio Sep Nov
Holstein
Jersey
F. Negro
0
1
2
3
4
5
6
Julio Sep Nov
Holstein
Jersey
F. Negro
Pro
ducc
ión
de
lech
e (L
/d
ía)
Co
nte
nid
o g
rasa
en
lec
he
(%)
Co
nte
nid
o p
rote
ína
en lec
he
(%)
a a
b
a a
b
b
a
c
a b b
a a a
a a b
a a a
a b b
A
B
C
29
En la figura 4C (y Anexo 3) se presenta el porcentaje de proteína contenido en
leche para las tres razas, pudiendo observar que los valores más altos
corresponden a los bovinos Jersey, sin variación según muestreo, mientras que
para los bovinos Holstein y F- Negro se observó un mayor contenido en los
meses de septiembre y noviembre.
4.3 Efecto de la raza sobre la producción leche y los porcentajes de grasa y
proteína.
El análisis de la producción de leche considerando los datos de los tres
muestreos en conjunto determinó que existe una diferencia significativa
(p<0,05) entre las distintas razas evaluadas (Cuadro 5). Los bovinos de la raza
Holstein-Friesian producen más litros de leche diarios (24,97 L/día)
comparado con los bovinos de raza Jersey y F. Negro (19,15 y 17,74
respectivamente). Este resultado concuerda con lo descrito por diversos
autores (Gibson, 1997; Palladino y col., 2010; Manterola, 2011; Samková y
col., 2012) los cuales describen una mayor producción de leche en animales de
raza Holstein-Friesian como consecuencia de que esta raza ha sido
seleccionada desde hace años para producir grandes volúmenes de leche por
lactancia, aunque en el último tiempo también se ha incorporado al índice de
selección la producción de sólidos totales (Villalobos, 2010).
30
Cuadro 5. Efecto de la raza sobre la producción de leche y porcentajes de
grasa y proteína.
Variable Holstein Jersey F. Negro
P-valor Media± EE Media±EE Media ±EE
Prod. leche (L) 24,97±0,86a 19,15±0,69b 17,74±0,63b 0,0000
% grasa 3,05±0,06a 4,63±0,05b 3,72±0,05c 0,0000 % proteína 3,29±0,03a 3,78±0,02b 3,30±0,02a 0,0000
a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05).
En relación al porcentaje de grasa, los bovinos de raza Jersey mostraron
niveles significativamente mayores respecto a los determinados en bovinos
HF y FN (4,63 en promedio vs 3,05 y 3,72, respectivamente; Cuadro 5). Esta
diferencia es similar a lo descrito por Samková y col. (2012) y resulta de la
selección genética de los rebaños Jersey para este atributo (Gibson, 1997;
Soyeurt y col., 2006; Palladino y col., 2010; Manterola, 2011; entre otros),
mientras que en bovinos Holstein-Friesian la selección genética para una
mayor producción de leche ha disminuido el contenido de grasa (y proteína).
Asimismo, los bovinos Jersey presentaron un mayor contenido de proteína
respecto a los bovinos HF y FN (3,78 vs 3,29 y 3,30, respectivamente; Cuadro
5).
4.4 Efecto de los polimorfismos SCD1 A293V y DGAT1 K232A sobre la
producción leche y los porcentajes de grasa y proteína.
El análisis de los factores que influyen en los parámetros productivos
considerando los datos de las tres razas indicó un efecto de los dos
marcadores genéticos evaluados pero no de las variables número ordinal de
parto ni días en leche. El Cuadro 6 muestra el efecto del polimorfismo SCD1
31
A293V sobre la producción de leche y los porcentajes de grasa y proteína en
leche.
Cuadro 6. Producción de leche, porcentajes de grasa y proteína según
genotipo para el polimorfismo SCD1 A293V.
Variable
Genotipo SCD1
P-valor CC GC GG
Media±EE Media±EE Media±EE
Prod. leche (L) 19,28±0,54a 20.85±0,78a 22,52±2,58a 0,1540 % grasa 4,18±0,05a 3.85±0,07b 3,30±0,23b 0,0000 % proteína 3,56±0,02a 3.55±0,03a 3,28±0,09b 0,0233 a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05).
Los resultados obtenidos para la producción de leche no mostraron
diferencias significativas entre los genotipos para SCD1 (p>0,05)
concordando con los reportes de Kgwatalala y col. (2009) y Clark y col. (2010)
en rebaños Jersey y Holstein-Friesian, respectivamente. Sin embargo,
Macciotta y col. (2008) describen diferencias significativas entre los genotipos
SCD1 para la producción de leche en bovinos Holstein Italiano, con el
genotipo GG asociado a una mayor producción de leche. Es interesante que
nuestros resultados muestran un valor promedio numéricamente mayor para
el alelo GG pero sin significancia probablemente debido al elevado valor del
error estándar (22,52±2,58; Cuadro 6) lo que puede ser efecto de una mayor
variabilidad debido a un bajo número de animales portando ese genotipo
(n=7; Cuadro 3). En relación al porcentaje de grasa, el homocigoto CC se
asoció a un mayor contenido (p<0.05) comparado con los genotipos GC y
GG mientras que el porcentaje de proteína fue significativamente mayor
(p=0,0233) en los animales portando los genotipos CC y GC comparado con
aquellos con el genotipo GG. Estos resultados discrepan de los reportes de la
32
literatura donde se describe un efecto variable o la ausencia del mismo. Por
ejemplo, Kgwatalala y col. (2009) y Macciotta y col. (2008) no observan
diferencias para los genotipos SCD1. Estas diferencias pueden radicar en
varios aspectos, por ejemplo, animales de distinta raza (en nuestro caso
incluyendo 3 razas), tamaño de la población evaluada, variables incluidas en el
modelo de asociación, etc. Además, variables ambientales (es decir de origen
no genético) pueden estar influenciando la respuesta fenotípica como la
alimentación. Todos estos factores son la razón principal para tener que
validar cada marcador en la población de estudio.
Como se aprecia en el Cuadro 7, los genotipos para el polimorfismo DGTA1
K232A no mostraron diferencias significativas (p>0,05) para la producción de
leche pero si sobre el contenido de grasa y proteína. El genotipo AA/AA se
asoció tanto con un mayor contenido de grasa como proteína (p<0,05)
mientras que el genotipo GC/GC con menores contenidos. Estos efectos
tienen implicancia económica ya que el contenido de grasa y proteína son
características productivas con un mayor peso en algunos índices de selección
(Spelman, 2002). Por ejemplo, en Nueva Zelanda se privilegia aquellos
genotipos que aumentan el contenido de grasa, mientras que en Chile se ha
comenzado a pagar un mayor precio por litro de leche que contiene un mayor
contenido de sólidos totales. En cuanto al porcentaje grasa y proteína,
nuestros resultados concuerdan con numerosos reportes que indican que el
genotipo “AA/AA” determina mayor grasa y proteína en leche (Grisart y
col.2002, Spelman, 2002, Taller y cols, 2003 y Gautier y col. 2007; Näslund y
col., 2008; Carvajal, 2011). De acuerdo a Winter y col. (2002) y Schennink y
col. (2007), la presencia de lisina en la posición 232K está fuertemente
33
asociada con un mayor contenido de grasa en leche mientras que la variante
alanina en esta posición se asocia a un menor porcentaje de grasa pero con
una mayor producción de leche. Se ha descrito que la diferencia entre las
variantes se traduce en un cambio aminoacídico el cual confiere distintas
propiedades cinéticas a la proteína, lo que afectaría al menos la biosíntesis de
triglicéridos (Grisart y col., 2004). Así, DGAT1 es uno de los pocos ejemplos
donde un gen mayor determina fuertemente un fenotipo, en este caso, el
porcentaje de grasa en leche.
Cuadro 7. Producción de leche, porcentajes de grasa y proteína según
genotipo para el polimorfismo DGAT1 K232A.
Variables
Genotipo DGAT1
P-valor AA/AA GC/AA GC/GC
Media±EE Media±EE Media±EE
Prod. leche (L) 20,58±0,97a 21,07±0,79a 18,84±0,62a 0,0645
% grasa 4,41±0,11a 3,64±0,10b 3,29±0,09c 0,0000
% proteína 3,75±0,04a 3,43±0,04b 3,21±0,04c 0,0000 a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05).
4.5 Efecto de la raza sobre la composición de la grasa láctea.
El Cuadro 8 muestra la composición de la grasa láctea según raza. Como se ha
descrito en distintas razas (por ejemplo, Schennink y col., 2008) el porcentaje
de SFA fue significativamente mayor (p<0,05) al de MUFA y éste mayor al de
PUFA. El análisis por raza determinó que los bovinos Holstein-Friesian
presentan menor cantidad de SFA y mayores cantidades de MUFA y PUFA
en comparación con los bovinos de raza J y FN. Como se ha descrito en
34
algunos trabajos, el mayor contenido de ácidos grasos insaturados en la leche
de bovinos HF puede ser efecto de una mayor actividad enzimática de la
enzima delta-9 desaturasa en la glándula mamaria (Reh y col. 2004; Soyeurt
and Gengler, 2008).
Cuadro 8. Efecto de la raza sobre la composición de la grasa láctea.
Variable Holstein Jersey F. Negro
P-Valor Media ± EE Media ± EE Media ± EE
SFA (%) 63,41±0,64a 70,19±0,49b 67,08±0,52c 0,0000
MUFA (%) 30,86±0,58a 25,49±0,45b 28,25±0,47c 0,0000
PUFA (%) 3,41±0,07a 2,07±0,05b 2,15±0,06b 0,0000
CLA (%) 0,94±0,05a 0,77±0,04b 0,90±0,04a 0,0100
N6:N3* 4,23±0,13a 2,04±0,10b 1,91±0,11b 0,0000
Índice C14 9,04±0,24a 7,14±0,19b 7,10±0,20b 0,0000
Índice C16 5,32±0,13a 3,34±0,10b 2,77±0,10c 0,0001 a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05). *N6:N3: relación omega-6/omega-3.
Respecto al porcentaje de CLA en leche (Cuadro 8), se observaron diferencias
significativas (p<0,05) entre las razas siendo los bovinos Jersey aquellos con
menor contenido de CLA comparado con las razas HF y FN. Este resultado
corrobora el reporte de White y col. (2001) quienes describen que los bovinos
Holstein poseen mayor contenido de este ácido graso que los animales Jersey,
pudiendo ser resultado de una mayor expresión del gen SCD1 y/o mayor
actividad de su producto, la enzima delta-9 desaturasa (Bauman y Lock (2010).
Sin embargo, Palladino y col. (2010) no muestran variación del contenido de
CLA entre bovinos Holstein-Friesian y Jersey. Es importante señalar que el
contenido de CLA en leche depende fuertemente de la alimentación animal,
35
por ejemplo del contenido de PUFA (Chilliard y col., 2001; Palmquist y col.,
2005; Bauman y Lock, 2010). Según Kelsey y col. (2003), a partir de la
manipulación de la dieta el contenido de CLA en leche puede variar
fuertemente y este efecto se debe a la regulación de la expresión génica de
diversas enzimas lipogénicas, entre ellas SCD1 (Bernard y col., 2008;
Shingfield y col., 2010). Diversos estudios se han enfocado en poder
incrementar el contenido de CLA en la grasa de la leche mediante una
suplementación rica en PUFA (Soyeurt y col., 2008). De acuerdo a Gagliostro
(2005), un manejo nutricional estratégico con un mayor aporte del ácido
linoleico es la vía más efectiva para obtener productos diferenciados en cuanto
al contenido de CLA. Este manejo debe apuntar hacia el incremento en la
producción del ácido trans vaccénico (a través del cambio de la población
microbiana involucrada en la biohidrogenación ruminal). Por ejemplo, la
suplementación con aceite de pescado provoca un descenso en el consumo de
materia seca y la producción de leche pero con un incremento significativo en
el contenido de CLA en leche. Por otro lado, animales alimentados con dietas
similares en relación al contenido de ácidos grasos poseen variaciones
mínimas en el contenido de CLA (Khanal y col., 2004).
En cuanto a la proporción omega-6/omega-3 (Cuadro 8), nuestro estudio
muestra una diferencia significativa (p<0,05) entre las distintas razas con una
mayor relación en los bovinos Holstein-Friesian en comparación con los
bovinos J y FN (4,23 versus 2.04 y 1,91). La proporción omega-6/omega-3
obtenida para los bovinos Holstein-Friesian es similar al descrito por Slot y
col. (2009) en esta misma raza. Se ha propuesto que una relación omega-
6/omega-3 menor a 4 (cuatro) es el valor límite respecto a las propiedades
funcionales o saludables para la salud de los consumidores (Gagliostro, 2005;
36
Candela y col., 2011, entre otros) mientras que una proporción más alta está
asociada a un mayor riesgo presentar enfermedades cardiovasculares
(Simopoulos (2006). Así, nuestros resultados indican que la proporción
omega-6/omega-3 es muy buena en la leche de los animales Jersey y F. Negro
mientras que en los Holstein-Friesian estaría justo por encima del valor límite.
De acuerdo a Haug y col. (2007), la proporción omega6-/omega-3 en leche
bovina es baja y así favorable comparado a la mayoría de otros productos no
marinos.
En relación a los índices de desaturación C14 y C16 el análisis estadístico
determinó diferencias significativas (p<0,05) entre las razas (Cuadro 8),
observando que en los bovinos Holstein-Friesian ambos índices fueron
mayores respecto a los valores encontrados en bovinos J y FN. Este resultado
es similar a los reportes de Schennink y col. (2008) y Soyeurt y col. (2008)
quienes sugieren una menor actividad enzimática de SCD1 en la glándula
mamaria de los animales Jersey. Con respecto a la raza F. Negro, no se conoce
otro reporte relacionado a los índices de desaturación.
4.6 Efecto del polimorfismo SCD1 A293V sobre la composición de ácidos
grasos de la leche.
En el Cuadro 9 se muestra la composición de la grasa en leche, la relación
omega-6/omega-3 y los índices de desaturación C14 y C16 según los
genotipos SCD1 para el mes de julio. Como se puede apreciar, el genotipo
para el polimorfismo SCD1 A293V tiene efecto significativo (p<0,05) sobre el
tipo de ácido graso en leche, la relación omega-6/omega-3 y el índice de
desaturación C16, pero no se observa efecto sobre el contenido de CLA (sí
37
una tendencia) y sobre el índice de desaturación C14. Respecto al contenido
de SFA, el genotipo CC muestra un mayor contenido respecto a GC mientras
que el genotipo GG, cuya frecuencia alélica es muy baja, no difiere
significativamente.
Cuadro 9. Efecto del polimorfismo SCD1 A293V sobre la composición de
ácidos grasos en Julio.
Variable
Julio
P-Valor CC GC GG
Media±EE Media±EE Media±EE
SFA (%) 69,38±0,61a 66,71±0,77b 68,20±2,12ab 0,0239 MUFA (%) 26,02±0,53a 28,45±0,67b 27,02±1,85ab 0,0168 PUFA (%) 1,93±0,09a 2,56±0,11b 2,54±0,32b 0,0001 CLA (%) 0,59±0,03a 0,70±0,03a 0,70±0,10a 0,0752 N6:N3* 2,40±0,18a 3,55±0,23b 3,96±0,62b 0,0001 Índice C14 8,02±0,28a 8,39±0,35a 7,60±0,97a 0,5947 Índice C16 3,63±0,15a 4,55±0,19b 4,62±0,52b 0,0005 a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05).
*N6:N3: relación omega-6/omega-3.
Sin embargo, el análisis de los datos para el muestreo de septiembre para este
mismo marcador (Cuadro 10) muestra una asociación distinta de los genotipos
comparado con el mes de julio. Por ejemplo, para el contenido de SFA el
homocigoto GG presenta un mayor contenido de SFA respecto a los
genotipos CC y GC. Además en el mes de julio, los genotipos tienen un efecto
significativo sobre el contenido de MUFA, el cual no se observa en
septiembre. Este efecto variable del genotipo SCD1 sobre la composición de
grasa de la leche entre julio y septiembre difiere del reporte de Duchemin y
col. (2013) quienes no determinan variación respecto al efecto del marcador
SCD1 A293V. Este mismo efecto variable se determinó en nuestro estudio
38
para el marcador DGAT1 K232A. Por lo tanto, se decidió realizar un análisis
con todos los datos para las tres fechas muestreadas (julio, septiembre y
noviembre).
Cuadro 10. Efecto del polimorfismo SCD1 A293V sobre la composición de ácidos grasos en Septiembre.
Variable
Septiembre P-Valor
CC GC GG
Media ±EE Media ±EE Media ±EE
SFA (%) 65,67±0,74a 64,50±0,9a 76,05±5,04b 0,0665 MUFA (%) 29,29±0,65a 29,81±0,8a 21,93±4,58a 0,1747 PUFA (%) 2,54±0,10a 3,13±0,12b 2,58±0,69ab 0,0018 CLA (%) 1,04±0,06a 1,11±0,07a 0,17±0,41a 0,0762 N6:N3* 2,32±0,16a 2,95±0,19b 11,23±1,09c 0,0001 Índice C14 6,88±0,24a 6,78±0,30a 8,78±1,68a 0,5000 Índice C16 3,29±0,20a 3,97±0,25a 6,18±1,42b 0,0264
a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05).
*N6:N3: relación omega-6/omega-3.
El efecto de los genotipos para SCD1 sobre la composición de la grasa para
los tres muestreos se presenta en el Cuadro 11. El análisis estadístico indica
que el genotipo de SCD1 influye significativamente (p<0,05) sobre todas las
variables estudiadas excepto el porcentaje de CLA y el índice de desaturación
C14. Como se puede apreciar, animales portando el genotipo GG muestran
un mayor contenido de SFA en leche respecto a aquellos que portan el
genotipo CG (71,25 vs 67,01). Asimismo, el genotipo GC se asocia a un
mayor contenido de MUFA comparado con GG pero no difiere del genotipo
CC. Respecto al contenido de PUFA, el genotipo CC fue significativamente
menor de los genotipos GC y GG mientras que no se observan diferencias
entre los genotipos SCD para el porcentaje de CLA en leche ni para el índice
39
de desaturación C14, como se había determinado para el mes de Julio (Cuadro
9). En relación al índice de desaturación C16, el análisis de los genotipos
muestra un efecto significativo observando una mayor actividad para el
genotipo GG. Respecto a la relación omega-6/omega-3, se observan
diferencias significativas (p<0,05) entre los tres genotipos con una menor
proporción para los genotipos CC y CG (ambos por debajo del límite
considerado saludable) mientras que el valor para el homocigoto GG fue
mayor (4,61).
Cuadro 11. Efecto del polimorfismo SCD1 A293V sobre la composición de
ácidos grasos.
a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05). * N6:N3: relación omega-6/omega-3.
En general, nuestros resultados en una población que incluyó bovinos
Holstein-Friesian, Jersey y O. Negros muestran un efecto significativo del
genotipo SCD1 A293V sobre las variables SFA, MUFA, PUFA. Mele y col.
(2007) reportan mayores contenidos de MUFA para los genotipos CC y GC
en animales Holstein Italianos mientras que Mioli y col. (2007) y Kgwatalala y
col. (2009) no encuentran efecto en animales Jersey Canadienses. Es probable
Variable CC GC GG
P-Valor Media±EE Media±EE Media±EE
SFA (%) 68,31±0,38ab 67,01±0,54a 71,25±1,75b 0,0249
MUFA (%) 27,13±0,35ab 28,06±0,48a 24,24±1,56b 0,0381
PUFA (%) 2,18±0,05a 2,59±0,07b 2,53±0,24b 0,0000
CLA (%) 0,83±0,02a 0,87±0,04a 0,68±0,13a 0,3407
N6:N3* 2,08±0,09a 2,71±0,12b 4,61±0,40c 0,0000
Índice C14 7,33±0,14a 7,40±0,20a 7,83±0,65a 0,7469
Índice C16 3,29±0,09a 3,80±0,13b 4,91±0,42c 0,0000
40
que estas diferencias sean resultado de factores ambientales como la dieta. El
perfil de composición de grasas determinado en este estudio muestra que
respecto de GC, el genotipo GG presenta mayor porcentaje de SFA, menor
porcentaje de MUFA y mayor proporción omega-6/omega-3. Si bien la leche
producida por animales con genotipo GG para el marcador SCD1 presenta
menor porcentaje de grasa total respecto al genotipo CC (Cuadro 6), contiene
más grasas saturadas y una mayor relación omega-6/omega-3 (Cuadro 11). En
conjunto, la composición de la leche generada con animales de ese genotipo
sugiere que pudiera ser menos saludable para el consumo humano de acuerdo
a los parámetros nutricionales actualmente reconocidos (Mensik y col., 2003;
Palladino y col., 2010). Esto se basa en que si bien no todos los SFA son
peligrosos para la salud humana, sino que son algunos ácidos grasos
específicos como el láurico (12:0), mirístico (14:0) y palmítico (16:0) los que se
han asociado a mayores niveles de colesterol total y LDL-colesterol y por
tanto en un mayor riesgo aterogénico, estos ácidos grasos son justamente los
más representados en la leche (Bauman and Lock, 2010). Esto enfatiza la
necesidad de conocer el perfil específico de la leche y establecer asociaciones
fuertes (confiables) antes de señalar conclusiones acerca de los beneficios o
problemas asociados a su consumo. En este sentido, este estudio sólo puede
considerarse como preliminar.
Al igual que en este estudio algunos trabajos tampoco muestran efectos
significativos del polimorfismo SCD1 A293V sobre el contenido de CLA en
leche (Mele y col. 2007, Clark y col. 2010, Kgwatalala y col. 2009). Sin
embargo, Schennink y col. (2008) y Duchemin y col., (2013) reportan
diferencias significativas sobre el porcentaje de CLA en bovinos Holstein-
Friesian. De acuerdo a Bauman y col. (2001), la concentración de CLA en
41
leche es muy variable y puede variar significativamente aún entre animales
consumiendo la misma dieta, sugiriendo que la variación puede estar dada por
un factor genético.
Algunos reportes muestran un mayor índice de desaturación C14 para el
homocigoto CC en bovinos Holstein (Mele y col., 2007; Mioli y col., 2007,
Schennink y col., 2008). Sin embargo, en nuestro estudio no observamos
dicho efecto, concordando con el reporte de Kgwatalala y col. (2009). Por
tanto, puede existir algún efecto encubierto como la dieta el que esté
afectando dicha respuesta. Varios trabajos señalan que el índice C14 es el
indicador más apropiado para medir la actividad enzimática de la enzima
delta-9 desaturasa debido a que todo el C14:0 se produce en la glándula
mamaria partir de la síntesis de novo (Mele y col., 2007; Bernard y col., 2008;
Duchemin y col., 2013). Respecto al índice de la actividad de desaturasa C16,
nuestros resultados indican un valor mayor para el genotipo GG concordando
con el reporte de Schennink y col., 2008. Sin embargo, Mele y col. (2007) y
Kgwatalala y col. (2009) no encuentran dicho efecto para este marcador. Estas
diferencias pueden estar señalando que factores ambientales están regulando
la composición de la leche o que otros marcadores genéticos relacionados a
este gen u otros pueden también determinar dicha composición. Por tanto, el
uso de este marcador como herramienta para modificar la composición de la
leche aún debe ser corroborado de forma más exacta.
42
4.7 Efecto del polimorfismo DGAT1 K232A sobre la composición de ácidos
grasos de la leche.
El análisis de este polimorfismo determinó un efecto significativo sobre la
composición de la grasa láctea (Cuadro 12).
Cuadro 12. Composición de la grasa láctea según el genotipo del
polimorfismo DGAT1 K232A.
Variables AA/AA GC/AA GC/GC
P-Valor Media±EE Media±EE Media±EE
SFA (%) 71,21±0,86a 68.55±0,74b 66,81±0,76c 0,0000
MUFA (%) 24,69±0,76a 26.46±0,66a 28,28±0,68b 0,0001
PUFA (%) 2,02±0,11a 2.61±0,10b 2,66±0,10b 0,0000
CLA (%) 0,68±0,06a 0.81±0,05b 0,88±0,05b 0,0202
N6:N3 2,56±0,20a 3.38±0,17b 3,47±0,17b 0,0000
Índice C14 6,85±0,32a 7.58±0,28b 8,14±0,28c 0,0009
Índice C16 3,66±0,20a 4.25±0,18b 4,09±0,18ab 0,0191 a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05).
*N6:N3: relación omega-6/omega-3.
En comparación con los genotipos GC/AA y GC/GC, animales portando el
genotipo AA/AA presentaron un mayor contenido de SFA, menor contenido
de PUFA y CLA, una menor proporción omega-6/omega-3 y un menor
índice de saturación para C14. La mayor proporción de SFA para el genotipo
AA/AA se ha reportado en varios trabajos (Grisart y col., 2002; Spelman,
2002; Schennink y col., 2007). Además, se ha descrito que animales modelo
con genotipo AA/AA sintetizan triglicéridos de forma más rápida que
aquellos que portan el alelo GC/GC (Grisart y col., 2004). Por otra parte,
Juhlin y col. (2012) reportan un efecto significativo del genotipo AA/AA del
43
polimorfismo DGAT1 K232A sobre el contenido de CLA y los ácidos grasos
C16:0 en bovinos Holstein de Suecia, y Schennink y col. (2007) describen un
menor contenido de CLA en la grasa láctea para el homocigoto AA/AA,
concordando con nuestro resultado. Esto pudiera ser efecto de la menor
actividad de la enzima SCD1 como muestra el menor índice de desaturación
C14 y C16. Con respecto a la proporción omega-6/omega-3, el genotipo
AA/AA presenta un menor valor pero de igual forma los otros dos genotipos
también muestran un valor por debajo del valor límite recomendado
(Gagliostro, 2005). Así, los resultados muestran que existe un efecto del
genotipo para este marcador sobre la composición de la leche, el que debiera
evaluarse en otra época de muestreo considerando cambios en la
alimentación, y en una población animal más grande en el sentido de replicarlo
en otros rebaños. Por tanto, con el análisis actual es imposible establecer el
uso específico de este marcador en programas de mejoramiento genético
tendientes a modificar la composición de la grasa láctea.
Desde el punto de vista del genotipo GC/GC, los animales portando este
genotipo producen una leche con menor contenido de SFA y mayor
contenido de MUFA y PUFA, mayor CLA y una proporción omega-
6/omega-3 bajo el límite considerado saludable (4). En conjunto, estos
resultados pueden sugerir que la composición de la leche producida por
animales que portan el genotipo DGAT1 GC/GC pudiera ser más saludable
para el consumo humano. Sin embargo, no se conocen estudios que evalúen el
efecto de la leche producida por animales con un genotipo específico sobre la
salud de los consumidores.
44
4.8 Análisis de correlación entre las variables analizadas.
En el cuadro 13 se puede apreciar la correlación existente entre los distintos
tipos de ácidos grasos de la leche. El análisis indica una alta correlación
negativa entre SFA y MUFA (-0,969). Además, se observa una correlación
positiva de mediana magnitud entre las variables MUFA, PUFA, CLA,
N6/N3 y los índices de desaturación. Sin embargo, los SFA se correlacionan
negativamente con los demás ácidos grasos. Este resultado concuerda con el
reporte de Soyeurt y col. (2008), quienes señalan que el contenido de MUFA y
PUFA se correlacionan negativamente con el SFA, lo que explica que
cualquier variación en los SFA, el principal grupo de ácidos grasos de la leche,
afecte significativamente los otros ácidos grasos.
Cuadro 13. Correlación entre los distintos tipos de ácidos grasos y los índices
de desaturación en leche.
Variables Índice C14 Índice C16 CLA N6:N3 PUFA MUFA SFA
Índice C14 1 0,423 0,162 0,362 0,325 0,175 -0,207
Índice C16
1 0,035 0,553 0,512 0,449 -0,460
CLA
1 0,042 0,437 0,535 -0,578
N6:N3*
1 0,533 0,231 -0,268
PUFA
1 0,556 -0,633
MUFA
1 -0,969
SFA 1
*N6:N3: relación omega-6/omega-3.
45
5- CONCLUSIONES
La metodología de PCR-RFLP permitió genotipificar dos marcadores
moleculares en una población de distintas razas de bovinos lecheros. El
análisis genético determinó que para el marcador SCD1 A293V todas las
poblaciones se encuentran en equilibrio Hardy-Weinberg mientras que para el
marcador DGAT1 K232A las poblaciones de animales Jersey y Overo
Colorado no están en equilibrio.
La composición de la grasa láctea de todas las razas presenta una mayor
concentración de SFA y una menor proporción de MUFA y PUFA, entre
éstos el ácido linoleico conjugado (CLA).
Nuestros resultados podrían sugerir que si bien la leche producida por los
bovinos de raza Holstein-Friesian contiene un menor porcentaje de grasa que
otras, su composición (SFA, MUFA, PUFA, CLA y Omega-6/Omega-3) sería
más saludable para los consumidores. Sin embargo, estos resultados son
preliminares y debieran validarse en un mayor período de tiempo y con un
mayor tamaño de población.
Los dos marcadores evaluados contribuyen a la variación observada en la
composición de la grasa en leche. Sin embargo, se requieren análisis más
definitivos para establecer su uso en un programa futuro de selección genética
bovina para modificar la composición de la grasa láctea.
46
6- BIBLIOGRAFÍA.
Amiot J. 1991. Ciencia y tecnología de la leche. Ed. Acribia. Zaragoza, España.
pp. 21-32.
Arnould VMR and Soyeurt A. 2009. Genetic variability of milk fatty acids. J.
Appl. Genet. 50(1) 29-39.
Bachman KC. 1992. Managing milk composition. In: Large dairy herd management.
pp. 336-346.
Banni S and Martin JC. 1998. Trans fatty acids in human nutrition. Sébedio JL
and Christie WW. The Oily Press, Dundee, Scotland.
Banos G, Woolliams JA, Woodward BW, Forbes AB and Coffey MP. 2008
Impact of Single Nucleotide Polymorphisms in Leptin, Leptin Receptor,
Growth Hormone Receptor, and Diacylglycerol Acyltransferase (DGAT1)
gene loci on milk production, feed, and body energy traits of UK dairy
cows. J. Dairy Sci. 91: 3190-3200.
Bauman DE, Baumgard LH, Corl BA and Griinari JM. 1999. Biosynthesis of
Conjugated linoleic acid in ruminants. Proc. Am Soc. Anim Sci. 1-15.
Bauman DE, Corl BA, Baumgard HH and Griinari JM. 2001. Conjugated
linoleic acid (CLA) and the dairy cow. In: Recent Advances in Animal
Nutrition. Ed. Garnstworthy PC and Wisenab J. Nottingham, UK,
Nottingham University Press; pp. 221-250.
47
Bauman DE and Lock AL. 2010. Milk fatty composition: challenges and
opportunities related to human health. In: Updates on ruminant
production and medicine. Ed. Wittwer y col. World Buiatrics Congress, Chile.
pp. 278-289.
Belury MA. 2002. Dietary conjugated linoleic acid in health: Physiological
effects and mechanisms of action. Ann. Rev. Nutr. 22: 505-531.
Berdeaux O, Márquez G and Dobargane C. 1999. Selection of methylation
procedures for quantitation of short-chain glycerol-bound compounds
formed during thermoxidation. J. Chromatog. 863(2) 171-178.
Bernard L, Leroux C and Chilliard Y. 2008. Expression and nutritional
regulation of lipogenic genes in the ruminant lactating mammary gland. In:
Bioactive Componentes of Milk. Bosze, ed. pp. 67-108.
Berry DP, Howard D, Boyle PO, Waters S, Kearney JF and McCabe M, 2010.
Associations between the K232A polymorphism in the Diacylglycerol-O-
Transferase 1 (DGAT1) gene and performance in Irish Holstein-Friesian
dairy cattle. Irish J. Agricultural Food Research 49: 1-9.
Candela CG, López LMB and Kohen VL. 2011. Importance of a balanced
omega-6/omega-3 ratio for the maintenance of health. Nutritional
recommendations. Nutr. Hosp. 26: 323-329.
Carvajal AM. 2011. Evaluación productiva homologada de genotipos lecheros
del rebaño nacional mediante el uso de herramientas biotecnológicas. En:
Informes Finales Proyectos Fundación para la Innovación Agraria (FIA), Vol. 1, pp.
57-73. Ed. Consorcio Lechero.
48
Cases S, Smith SJ, Zheng Y, Myers HM, Lear SR, Sande E, Novak S, Collins C,
Welch CB, Lusis AJ and Erickson SK. Identification of a gene enconding
an acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase, a key enzyme in triacylglycerol
synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 95: 13018-13023.
Castillo JA, Pabón ML, Olivera and Carulla JE. 2010. Role of stearoyl CoA
desaturase on conjugated linoleic acid concentration in bovine milk. Revista
Colombiana de Ciencias Pecurias 23: 493-500.
Chilliard Y, Ferlay A and Doreau M. 2001. Effect of different types of forages,
animal fat or marine oils in cow’s diet on milk fat secretion and
composition, especially conjugated linoleic acid (CLA) and
polyunsaturated fatty acids. Livestock Production Science 70: 31-48.
Chilliard Y, Glasser F, Enjalbert F, Ferlay A, Bocquier F and Schmidely. 2007.
Recent data on effects on feeding factors on milk fatty acid composition in
cow, goat and ewe. Revista Argentina de Producción Animal 7(3) 197-213.
Chung M, Ha S, Jeong, Bok S, Cho JK, Baik M and Choi Y. 2000. Cloning and
characterization of bovine Stearoyl-CoA Desaturase l cDNA from adipose
tissues. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64:1526-1530.
Clarck LA, Thomson JM, Moore SS and Oba M. 2010. The effect of
Ala293Val single nucleotide polymorphism in the Stearoyl-CoA
Desaturase gene conjugated linoleic acid en concentration in milk fat of
dairy cows. Can. J. Anim. Sci. 90: 575-584.
Conte G, Mele M, Chessa S, Castiglioni B, Serra A, Pagnacco and Secchiari
2010. Diacylglicerol acyltransferase 1, stearoyl-CoA desaturase 1, and
49
sterol regulatory element binding protein 1 gene polymorphisms and milk
fatty acid composition in Italian Brown cattle. J. Dairy Sci. 93: 753-763.
Demeter RM, Schopen GCB, Oude AGJM, Meuwissen MPM and van
Arendonk. 2009. Effects of milk fat composition, DGAT1, and SCD1 on
fertility traits in Dutch Holstein cattle. J. Dairy Sci. 92: 5720-5729.
Dhiman TR, Anand GR, Satter LD and Pariza MW. 1999. Conjugated Linoleic
Acid content of milk from cows feed different diets. J. Dairy Sci. 82: 2146-
2156.
Duchemin S, Bovenhuis H, Stoop WM, Bouwman AC, van Arendok JAM and
Visker MHPW. 2013. Genetic correlation between composition of bovine
milk fat in winter and summer, and DGAT1 and SCD1 by season
interactions. J. Dairy Sci. 96: 592-604.
FAO. 2008. Fats and fatty acids in human nutrition. Report of an expert
consultation. In: FAO Food and Nutrition Paper. 91.
Gagliostro A. 2005. Nutritional control of conjugated linoleic acid (CLA)
content in milk and in natural functional foods. 2. Production of CLA
enriched milk in the dairy cow. Rev. Arg. Prod. Anim. 24 N° 3-4.
Gautier M, Capitan A, Fritz S, Eggen A, Biochard D and Druet T. 2007.
Characterization of the DGAT1 K232A and variable number of tandem
repeat polymorphisms in French dairy cattle. J. Dairy Sci. 90: 2980-2988.
Grisart B, Coppieters W, Farnir F, Karim L, Ford C, Berzi P, Cambisano, Mni
M, Reid S, Simon P, Spelman R, Georges M and Snell R. 2002. Positional
50
candidate cloning of a QTL in dairy cattle: Identification of a missense
mutation in the bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and
composition. Genome Res. 12: 222-231.
Grisart B, Farnir F, Karim L, Cambisano N, Kim J-J, Kvasz A, Mni M, Simon
P, Frere JM, Coppieters W and Georges M. 2004. Genetic and functional
confirmation of the causality of the DGAT1 K232A quantitative trait
nucleotide in affecting milk yield and composition. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 101: 2398-2403.
Grummer RR. 1991. Effect of feed on the composition of milk fat. J. Dairy Sci.
74: 3244-3257.
Haug A, Høstmark AT and Harstad OM. 2007. Bovine milk in human
nutrition - A Review. Lipids in Health and Disease. 6: 1-16.
Hayes KC and Khosla DR. 1992. Dietary fatty acid thresholds and
cholesterolemia. FASEB J. 6:2600-2607.
Hu FB, Manson JE, and Willett WC. 2001. Types of dietary fat and risk of
coronary heart disease: A critical review. J. Am. Coll. Nutr. 20: 5-19.
Isla-Trejo AA, Johnson F and Medrano JF. 2002. Genomic structure and
expression of the bovine Stearoryl-CoA Desaturase gene. pp. 766. In: Proc.
Plant, Animal and Microbe Genomes Conferences, San Diego, CA. www.intl.org.
Juhlin J, Fikse WF, Pickova J and Lundén A. 2012. Association of DGAT1
genotype, fatty acid composition, and concentration of copper in milk
with spontaneous oxidized flavor. J. Dairy Sci. 95: 4610-4617.
51
Jump DB. 2002. The biochemistry of n-3 polyunsaturated fatty acids. J. Biol.
Chem. 277: 8755-8758.
Kelsey JA, Corl BA, Collier RJ and Bauman DE. 2003. The effect of bred,
parity, and stage of lactation on conjugated linoleic acid (CLA) in milk fat
from dairy cows. J. Dairy Sci. 86: 2588-2597
Khanal RC and Dhiman TR. 2004. Biosynthesis of conjugated linoleic acid
(CLA): A Review. Pakistan. J. Nutr. 3: 72-81.
Khanal RC and Olson KC. 2004. Factors affecting Conjugated Linoleic Acid
(CLA) content in milk, meat, and egg: A Review. Pakistan J. Nutr. 3: 82-98.
Kgwatalala PM, Ibeagha-Awemu EM, Mustafa AF and Zhao X. 2009.
Influence of Stearoyl-Coenzyme A Desaturase 1 genotype and stage of
lactation on lactation on fatty acid composition of Canadian Jersey cows. J.
Dairy Sci. 92: 1220-1228.
Komisarek J, Michalak A and Walendowska A. 2011. The effects of
polymorphism in DGAT1, GH and GHR genes on reproduction and
production traits in Jersey cows. Animal Sci. Papers Reports 29: 29-36.
Lawless F, Stanton C, L’Escop P, Devery R, Dillon P and Murphy JJ. 1999.
Influence of breed on bovine milk cis-9, trans-11 conjugated linoleic acid
content. Livestock Production Science 62: 43-49.
Lee JH, O´Keefe JH, Lavie CJ and Harris WS. 2009. Omega-3 fatty acids:
cardiovascular benefits, sources and sustainability. Nature Rev. Cardiology 6:
753-758.
52
Linn JG. 1998. Factors affecting the composition of milk from dairy cows. In:
Designing foods. Ed. National Academic Press, Washington DC. pp. 224-241.
Macciotta NP, Mele M, Conte G, Serra A, Cassandro M, Dal Zotto R, Borlino
AC, Pagnacco G and Secchiari P. 2008. Association between a
polymorphism at the Stearyl CoA Desaturase locus and milk production
traits in Italian Holstein. J. Dairy Sci. 91: 3184-3189.
Manterola H. 2011. Estrategias nutricionales y alimenticias para modificar los
sólidos totales de la leche. En: Circular de Extensión N°36. Departamento de
Producción Animal. Universidad de Chile.
Maxin G, Glasser F, Hurtaud C, Peyraud JL, and Rulquin H. 2011.
Combinated effect Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid, propionate,
and acetate on milk Fat yield and composition in dairy cows. J. Dairy Sci.
94: 2051-2059.
McGuire MA and McGuire MK. 2000. Conjugated linoleic acid (CLA): A
ruminate fatty acid beneficial effects on human health. J. Anim. Sci. 77: 1-8.
Mele M, Conte G, Castiglioni B, Chessa S, Macciotta, NPP, Serra A, Pagnacco
G and Secchiari P. 2007. Stearoyl-Coenzyme A desaturase gene
polymorphism and milk fatty acid composition in Italian Holsteins. J.
Dairy Sci. 90: 4458-4465.
Moioli B, Contarini G, Avalli A, Catillo G, Orrù L, De Matteis G, Masoero G
and Napoletano F. 2007. Short communication: Effect of Stearoyl
Coenzyme A Desaturase polymorphism on fatty acid composition of milk.
J. Dairy Sci. 90: 3553-3558.
53
Näslund J, Fikse WF, Pielberg GR and Lundén A. 2008. Frequency and effect
of the bovine Acyl-CoA: Diacylglycerol Acyltransferase 1 (DGAT1)
K232A polymorphism in Swedish dairy cattle. J. Dairy Sci. 91:2127-2134.
Ntambi JM. 1999. Regulation of Stearoyl-CoA Desaturase by polyunsaturated
fatty acids and Cholesterol. J. Lipid Res. 40: 1549-1558.
Palladino RA, Buckley F, Prendiville R, Murphy JJ, Callan J and Kenny DA.
2010. A comparison between Holstein-Friesian and Jersey dairy cows and
their F1 on milk fatty acid composition under grazing conditions. J. Dairy
Sci.93: 2176-2184.
Prendiville R, Pierce KM and Buckley F, 2009. An evaluation of production
efficiencies among lactating Holstein-Friesian, Jersey, and Jersey x
Holstein-Friesian cows at pasture. J. Dairy Sci. 92: 6176-6185.
Reh WA, Maga EA, Collette NM, Moyer A, Conrad-Brink JS, Taylor SJ,
DePeters EJ, Oppenheim S, Rowe JD, BonDurant RH, Anderson GB and
Murray JD. 2004. Hot Topic: Using a Stearoyl-CoA Desaturase transgene
to alter milk fatty acid composition. J. Dairy Sci. 87: 3510-3514.
Rico JE, Zoot, Moreno B, Pabón ML y Carulla J. 2007. Composición de la
grasa láctea en la sabana de Bogotá con énfasis en ácido ruménico-CLA
cis-9, trans-11. Rev. Col. Cienc. Pec. 20: 1.
Samková E, Špička J, Pešek M, Pelikánová T and Hanuš O. 2012. Animal
factor affecting fatty acid composition of cow milk fat: A review. South
African J. Anim. Sci. 42(2) 83-100.
54
Schennink A, Stoop WM, Visker MH, Heck JM, Bovenhuis H, van der Poel JJ,
van Valenberg HJ and van Arendonk JA. 2007. DGAT1 underlies large
genetic variation in milk-fat composition of dairy cows. Anim. Genet. 38:
467-473.
Schennink A, Heck JM, Bovenhuis H, Visker MH, van Valenberg HJ and van
Arendonk JA. 2008. Milk fatty acid unsaturation: genetic parameters and
effects of Stearoyl-CoA Desaturase (SCD1) and Acyl CoA:Diacylglycerol
Acyltransferase 1 (DGAT1). J. Dairy Sci. 91: 2135-2143.
Shingfield KJ, Bernard L, Leroux C and Chilliard Y. 2010. Role of trans fatty
acids in the nutritional regulation of mammary lipogenesis in ruminants.
Animal 4(7) 1140-1166.
Schoonderwoerd K, Broekhoven-Schokker S, Hulsmann WC and Stam H.
1990. Properties of phosphatidate phosphohydrolase and diacylglycerol
acyltransferase activities in the isolated rat heart. Effect of glucagon,
ischaemia and diabetes. Biochem. J. 268: 487-492.
Shingfield KJ, Ahvenjärvi S, Toivonen V, Ärölä A, Nurmela KVV, Huhtanen
P and Griinari JM. 2003. Effect of dietary fish oil on biohydrogenation of
fatty acids and milk fatty acid content in cows. Anim. Science 77: 165-179.
Simopoulos AP. 2006. Evolutionary aspect of diet, the omega-6/omega-3 ratio
and genetic variation: nutritional implication for chronic diseases. Biomed.
Pharmacotep. 60: 502-507.
55
Slots T, Butler G, Leifert C,Kristensen T, Skibsted LH and Nieksen JH. 2009.
Potencials to differentiate milk composition by different feeding strategies.
J. Dairy Sci. 92: 2057-2066.
Soyeurt H, Dardenne P, Gillon A, Crocquet C, Vanderick S, Mayeres P,
Bertozzi C and Gengler N. 2006. Variation in fatty acid contents of milk
and fat within and across breds. J. Dairy Sci. 89: 4858-4865.
Soyeurt H and Gengler N. 2008. Genetic variability of fatty acids in bovine
milk. Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 12: 203-2010.
Smith CAB. 1970. A note testing the Hardy Weinberg law. Ann. Hum. Genet.
21: 254-276.
Spelman RJ, Ford CA, McElhinney P, Gregory GC and Snell RG. 2002.
Characterization of the DGAT1 gene in the New Zeland dairy population.
J. Dairy Sci. 85: 3514-3517.
Sretenović j L, Pantelić V and Novaković Ţ. 2009. Importance of utilization of
omga-3 fatty acids in human and animal nutrition. Biotech. in Anim.
Husbandry 25: 439-449.
Taniguchi M, Utsugi T, Oyama K, Mannen H, Kobayashi M, Tanabe Y, Ogino
A and Tsuji S. 2004. Genotype of Stearoyl-CoA Desaturase is associated
with fatty acids composition in Japanese Black cattle. Mamm. Genome 14:
142-148.
56
Tupac-Yupanqui I, Baro JA y Dunner S. 2004. Efecto del gen DGAT1 sobre la
cantidad y composición de la leche en la raza bovina frisona española.
Arch. Zootec. 53: 293-299.
Valderrama X. 2011. Mejoramiento de la composición de la leche mediante el
manejo de la alimentación. En: Informes Finales Proyectos Fundación para la
Innovación Agraria (FIA), Vol. 1, pp. 3-20. Ed. Consorcio Lechero.
Walker GP, Dunshea FR and Doyle PT. 2004. Effects of nutrition on the
production and composition of milk fat and protein: A Review. Australian
J. Agricultural Res. 55: 1009-1028.
Winter A, Kramer W, Werner FA, Kollers O, Kata S, Durstewitz S, Buitkamp
G, Womack JE, Thaller G and Fries R. 2002. Association of a lysine-
232/alanine polymorphism in a bovine gene encoding acyl-CoA
Diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) with variation at a quantitative
trait locus for milk fat content. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 9300-9305.
Whale KWJ, Heys SD and Rotondo D. 2004. Conjugated linoleic acids: are
they beneficial or detrimental to health? Prog. Lipid. Res. 43: 553-587.
Yen C-L, Stone SJ, Koliwad S, Harris C and Farese RV Jr. 2008. DGAT
enzymes and triacylglycerol biosynthesis. J. Lipid Res. 49: 2283-2301.
57
7- ANEXOS
Anexo 1. Producción promedio de leche (L) por raza según mes de muestreo.
Raza Julio Sept. Nov
Media Media Media
Holstein 23,12a 23,16a 33,88b
Jersey 18,60a 15,15b 23,76c
F. Negro 16,69a 19,94b 17,23c a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05).
Anexo 2. Porcentaje (%) promedio de grasa en leche por raza según mes de muestreo.
a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05). Anexo 3. Porcentaje (%) promedio de proteína en leche por raza según mes de muestreo.
Raza Julio Sept. Nov.
Media Media Media
Holstein 3,28a 3,35b 3,36b Jersey 3,79a 3,78a 3,78a F. Negro 3,23a 3,31b 3,35b
a,b,c, media con letra diferente de una misma fila difiere significativamente (p<0,05).
Raza Julio Sept. Nov.
Media Media Media
Holstein 3,05a 3,19b 2,91c
Jersey 4,83a 4,62b 4,48b
F. Negro 3,74a 3,72a 3,74a
