EFECTO DE LOS COMPONENTES DE LA PARED CELULAR VEGETAL SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA SUPERÓXIDO

DISMUTASA DE A. brasilense

Manuel Méndez Gómez1, Elda Castro Mercado2, Homero Reyes de la Cruz3, Elda Beltrán Peña4, Ernesto García Pineda5

Eje1. La investigación en las Ciencias Básicas Mesa 3: Ciencias Agrícolas y Biotecnología Palabras Clave: respuesta de defensa, estrés oxidativo, simbiosis. Durante la interacción planta-microorganismo se lleva acabo un dialogo molecular entre estos dos actores, donde se involucra una gran variedad de moléculas como las especies reactivas de oxigeno y componentes de pared celular tanto de la planta como de la bacteria. Los componentes de pared celular de la planta tienen la capacidad de inducir respuestas de defensa en la planta misma. Por su parte, los lipopolisacaridos que forman parte de la pared celular de las bacterias Gram negativas pueden suprimir las respuestas de defensa de las plantas durante la interacción. En este trabajo analizamos el efecto de componentes de la pared celular sobre la actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) de A. brasilense Sp245. Encontramos que la pectina, exudado radical y raíz completa incrementan la actividad de esta enzima. Mientras que el acido poligalacturonico disminuye ligeramente la actividad. Por otro lado, los lipopolisacarios de A. brasilense no afectan la producción de anión superóxido en el sistema radical de la planta. Sin embargo cuando la plántulas fueron tratadas con filtrados del cultivo bacteriano se incrementa ligeramente la producción de esta molécula. Con estos resultados demostramos que la superóxido dismutasa de A. brasilense incrementa su actividad en respuesta a los componentes de pared celular de la planta, posiblemente como un mecanismo de defensa ante el estrés oxidativo generado por la planta durante las primeras etapas de la interacción.

Introducción

Las plantas interactúan con una gran cantidad de microorganismos que pueden tener un efecto positivo o negativo sobre su crecimiento. Las rizobacterias, son un grupo de bacterias que tienen la capacidad de promover el crecimiento vegetal a través de fijar el nitrógeno atmosférico, sintetizar fitohormonas, inducción de resistencia sistémica ante diferentes tipos de estrés, entre otros. Una afectiva interacción planta-rizobacteria requiere un coordinado reconocimiento en que señales moleculares son intercambiados entre ambos actores. Un ejemplo es durante la interacción Rhizobium-leguminosa, en donde la bacteria secreta factores Nod en respuesta a flavonoides liberados por la planta. Este factor Nod inducen la formación de hilos de infección y nódulos en la planta.

Tanto en la interacción patogénica como en la simbiótica, el incremento en la producción de EROs es detectado en los primeros eventos planta-microorganismo y parece ser una respuesta común de las plantas. Esta producción llamada explosión oxidativa puede ser considerada como una señal especifica durante el proceso de interacción (Nanda et al., 2010). A diferencia de las interacciones patogénica, donde la producción de EROs es de dos fases, una baja y seguida por una alta producción; en la interacciones simbióticas la segunda producción parece no tener lugar (Lohar et al 2007).por lo tanto, se podría pensar que estas diferencias podrían actuar como señales especificas para determinar que respuestas puede activar el hospedante hacia el microorganismo. De cualquier manera las bacterias simbióticas son reconocidos como agentes patógenos que desencadenan una respuesta de defensa en la planta. Debido a que las plantas producen EROs durante la interacción con microorganismos, las bacterias poseen mecanismos enzimáticos para contrarrestar los efectos de estas moléculas. Tal es el caso de la SOD que destoxifica al anión superóxido. Un ejemplo muy claro es el incremento en la expresión de genes como la SOD, glutatión reductasa en la bacteria durante la interacción G. diazotrophicus cepa PAL5 y plantas de arroz (Alquéres et al., 2013). Sin embargo en muchos estudios se ha reportado la participación de moléculas como proteínas superficiales y lipopolisacaridos bacteriales en el establecimiento de la interacción ya que se cree que tienen un papel en suprimir los mecanismos de defensa de las plantas (Mithöfer, 2002). Por lo tanto en este trabajo se analizó la actividad de la superóxido dismutasa de A. brasilense durante la interacción con la planta. Para esto se utilizo como modelo de estudio A. brasilense-planta de trigo. Además se analizo el efecto lipopolisacaridos y proteínas superficiales bacteriales sobre la producción de anión superóxido en plantas de trigo.

Objetivo

Analizar el efecto de componentes de pared celular sobre la actividad de la enzima superóxido dismutasa de A. brasilense Sp245.

Objetivos particulares • Analizar el efecto de pectina, acido poligalacturonico, exudados

radicales, raíz completa sobre la actividad de la superóxido dismutasa. • Analizar la producción de anión superóxido en plántulas de trigo durante

el tratamiento con lipopolisacaridos y bacterias previamente tratadas con papaína.

Materiales y Métodos Cepa, medio de cultivo y condiciones de crecimiento de A. brasilense. A. brasilense sp245 fue proporcionada por la Dra. Gladys Alexandre de la Universidad de Tennessee, USA y crecido en medio LB mínimo pH: 7 (Triptona 10 gr/l; extracto de levadura 5 gr/l; NaCl 5 gr/l) suplementado con MgSO4 a 2.5 mM (0.186 gr/l) y ClCa 2.5 mM (.277 gr/l). Al medio de cultivo se le adiciono Tetraciclina a una concentración de 10μg/ml como medio de selección. Se

incubó a 28 ºC con agitación de 180 rpm durante 24 horas. Para el tratamiento con papaína se centrifugo 50 ml del cultivo bacteriano a 3 200 rpm durante 5 minutos. Posteriormente se resuspendió en 45 ml de medio LB mínimo, se adiciono 5 ml de una solución de papaína 1 mM e incubar por 2 horas a 37 ºC en agitación. Cumpliendo el tiempo, se centrifugo y se resuspendio en 50 ml de medio LB mínimo. La papaína se preparo en un buffer que contiene 50 mM de Tris, 0.15 M de NaCl, 2 mM de EDTA a pH: 8. Al momento de disolver la papaína, se adiciona 5 mM de cisteína y se esteriliza con un filtro de 0.2 μm. Por otra parte la solución de papaína se desnaturaliza con autoclave a 15 lb de presión, 121 ºC durante 20 minutos. Para la obtención del filtrado libre de bacterias, el inoculo fue filtrado con una membrana de 0.2 mm. Para el tratamiento con componentes de pared celular, el inoculo fue crecido junto con 1mg/ml de pectina y acido poligalacturonico, 100 mg de raíz completa, 2.4% de exudados de raíz v:v (obtenido de plántulas crecidas en H2O destilada estéril durante 5 días) y100 μM de paracuat, durante 24 h. Condiciones de crecimiento de trigo e infección y d etección de de especies reactivas de oxigeno. Las semillas de trigo variedad NANDA fueron donado por el D.C. Mario González del INIFAP, Celaya. Las semillas fueron desinfectadas con una solución de SDS al 1% durante 3 minutos seguido por una solución de cloro al 1% durante 5 minutos (entre las dos soluciones se enjuaga tres veces con agua destilada estéril). Las semillas desinfectadas se colocaron en cajas petri con algodón y papel filtro húmedo e incubado durante 3 días a 26 ºC en oscuridad. Para los tratamientos, las plántulas se transfirieron en tubos de ensaye conteniendo 2 ml de medio Lb minimo (pH. 7) y posteriormente infectadas con 2 ml de A. brasilense (DO600nm: 0.900) que contiene aproximadamente 2x108 UFC sin tratamiento y previamente tratadas con papaína, 2 ml de papaína desnaturalizada y 2 ml de filtrado. Las muestras se incubaron por 24 h a 25 ºC. Para visualizar la producción de anión superóxido, la raíz de las plántulas de trigo fuero teñidas durante 15 minutos con una solución de NBT al 0.1% disuelto en un buffer de fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5. Extracción de lipopolisacaridos. De un cultivo de 24 horas de crecimiento, se centrifugo y se peso 411 mg de bacteria. Se resuspendio en 15 ml de buffer de Tris-HCL (pH: 8) conteniendo 2 mM de MgCl2. Posteriormente se adiciono 20μl de DNasa de 10kU y 100μl de RNasa de 5μg/ml. Se sonicaron las células a 50 pulsos durante 15 seg y 10 de reposo en hielo por 7 veces. Se incubo a 37 ºC por 2 horas. Se adiciono 20 µl de cloroformo por mg de célula para crear una fase de separación. Agitar e incubar por 10 minutos. Centrifugar a 12 000 g por 10 minutos. Recuperar la fase acuosa. Disolver el extracto de LPS en 23.75 ml de 0.375 M de cloruro de magnesio en etanol absoluto al 95 %. Almacenar a -20 ºC, durante toda la noche, para precipitar los LPS. Centrifugar a 12 000 g por 15 minutos y decantar. Resuspender la pastilla en 1 ml de agua destilada estéril. Por ultimo se liofilizó la muestra para mantenerlos secos a 4º C. Extracción y actividad de SOD de A. brasilense. Para extraer la SOD, se centrifugo 25 ml de cultivo bactriano a 3 200 rpm por 5 minutos. Se resuspendió en 2 ml de buffer de fosfato de potasio 50 mM pH: 7. Posteriormente se sónico a 50 pulsos con intervalos de 15 segundos de

Ab AP Pec Ex Raíz Prq

Ab AP Pec Ex Prq

sonicado y 10 de descanso a 4 ºC, por 7 veces. Se centrifugo a 12 000 rpm por 2 minutos. Se recupera el sobrenadante y se cuantifica la cantidad de proteínas totales por el método de Bradford. La actividad de la SOD se visualizo en geles nativos de poliacrilamida al 8% por la inhibición de la reducción del NBT.

Resultados Efecto de componentes de pared celular. Para simular la interacción A. brasilense-planta de trigo, la bacteria fue crecida durante 24 h junto con diferentes componentes de pared celular. Cumpliendo el tiempo se analizo la actividad de la superóxido dismutasa de la bacteria en geles de poliacrilamida. Como se puede observar, el tratamiento con AP disminuye ligeramente la actividad de esta enzima. Mientras que en el tratamiento con pectina incrementa la actividad de la SOD al igual que con raíz completa y exudados radicales. Para corroborar que el incremento en la actividad de esta enzima es debido a que las bacterias están en estrés, A. brasilense fue crecido con paracuat un compuesto que induce la producción de especies reactivas de oxigeno. El tratamiento con este compuesto incrementa la actividad la actividad de esta enzima (Fig. 1).

Fig. 1. Actividad de la superóxido dismutasa de A. brasilense. Ab: A. brasilense. AP: acido poligalacturonico. Pec: pectina. Ex: exudado. Raíz: raíz completa. Prq: paracuat

Tratamientos

Efecto de proteínas y lipopolisacaridos de A. brasilense sobre la producción de anión superóxido en raíz de trigo. Debido a que algunos componentes de las bacterias pueden afectar la respuesta de defensa de las plantas, se analizo el efecto de proteínas que se encuentran en la superficie de A. brasilense y lipopolisacaridos sobre la producción de anión superóxido en la raíz de plántulas de trigo. El tratamiento con filtrado de bacterias y papaína desnaturalizada no afecta la producción del anión superóxido en las plantas de trigo, mientras que las plantas tratadas con Azospirillum previamente tratadas con papaína reduce la producción de anión superóxido en la parte apical de la raíz de trigo. Este efecto no tiene diferencia con las plantas tratadas con Azospirillum sin tratamiento (Fig. 2). Por lo tanto las proteínas de esta bacteria probablemente no estén participando en la reducción de la producción de anión superóxido en la raíz.

El tratamiento de plántulas con lipopolisacaridos no afecta la producción de anión superóxido en la raíz de trigo (Fig. 3). Por lo tanto, probablemente Azospirillum tiene otro mecanismo para afectar producción de las especies reactivas de oxigeno o el tiempo de tratamiento con estas moléculas no son suficientes para poder observar un efecto.

Fig. 2. Efecto de proteínas de A. brasilense sobre la producción de anión superóxido. +Ab: A. brasilense previamente tratadas con papaína, +Ab: A. brasilense

Fig. 3. Efecto de los lipopolisacaridos sobre la producción de anión superóxido. LPS: Lipopolisacarido

Control Filtrado Papaína +Ab papaína +Ab

Tratamientos

Control LPS 50μg/ml LPS 100μg/ml

Tratamientos

Conclusión Los componentes de pared celular incrementan la actividad de la SOD de A. brasilense sugiriéndonos que durante la interacción A. brasilense-trigo, la planta activa la producción de especies reactivas de oxígeno. Por lo tanto la bacteria activa sistemas antioxidantes para contrarrestar el efecto dañino de estas moléculas. Mientras que las proteínas superficiales y lipopolisacaridos de Azospirillum no participa para modificar la producción del anión superóxido en la raíz en estas condiciones.

Referencias Alquéres S, Meneses C, Rouws L, Rothballer M, Baldani I, Schmid M, Hartmann A. 2013. The Bacterial Superoxide Dismutase and Glutathione Reductase Are Crucial for Endophytic Colonization of Rice Roots by Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5. MPMI. 26 (8), 937–945. Lohar DP, Haridas S, Gantt JS, VandenBosch KA (2007) A transient decrease in reactive oxygen species in roots leads to root hair deformation in the legume-rhizobia symbiosis. New Phytol. 173, 39–49. Mithofer A. 2002. Suppression of plant defence in rhizobia–legume symbiosis. Trends Plant Sci. 7, 440–444. Nanda AK, Andrio E, Marino D, Pauly N, Dunand C. 2010. Reactive oxygen species during plant-microorganism early interactions. J. Integr. Plant Biol. 52(2), 195–204.