Efecto del insecticida diazinón en la expresión génica durante laovogénesis temprana en el ratón.

Carrillo Gómez Edgar José. Laboratorio de Expresión génica. S-248. División de CBS.Departamento Ciencias de la Salud. Universidad autónoma metropolitana.

Asesor: Dr. Edmundo Bonilla González

Marco teórico

La producción industrial actual genera una serie de amenazas para la integridad de lascélulas germinales cuyos riesgos todavía no pueden ser evaluados de forma objetiva. Unade ellas es la incidencia en la capacidad reproductiva humana, hecho denunciado pordiversas organizaciones no gubernamentales que han avisado de los efectos sobre lafertilidad de compuestos como los pesticidas (Bonilla, 2000). Un pesticida es un químicoque mata pestes, una peste es algo o alguien que de alguna manera nos perjudica y de estaslos insectos tienden a ser las mas frecuentes.

La era moderna del control químico de pestes comienza en 1934 con el descubrimiento delas propiedades insecticidas del Dicloro-Difenil-Tricloroetano (DDT) por el químico suizoPaul Miller y su producción comercial inicia en 1943. Los pesticidas sintéticos hancontribuido sustancialmente al mejoramiento de la productividad agrícola en el mundo.Paralelamente, su uso ha tenido efectos adversos que incluyen el deterioro ecológico y eldaño a la salud humana. El potencial tóxico de los plaguicidas es, en buena parte,responsable de esta dicotomía; es decir, su capacidad para destruir plagas es unapoderosa herramienta para el control de las mismas y, a la vez, esta característica loshace potencialmente dañinos para la salud y el medio ambiente.(The ConservationFoundation, 1986). El uso indiscriminado y excesivo de los plaguicidas sintéticos hacausado serios daños ecológicos y daños en la salud humana a largo plazo, y eso ha vueltorelativamente inocuas a especies en serias pestes. Los efectos de los plaguicidas sobre lasalud humana pueden ser divididos en dos categorías: efectos a corto plazo, incluyendoenvenenamiento agudo y enfermedades causadas por relativamente altas dosis yexposiciones accidentales, y a largo plazo efectos sospechados como cáncer, malformaciónde embriones, problemas inmunológicos, enfermedad de Parkinson y otras enfermedadesdegenerativas crónicas (William y woobworth, 1999).

En los EUA existen cerca de 900 plaguicidas registrados de los cuales 37 pertenecen acompuestos organofosforados como el diazinón, clasificado como pesticida de usorestringido (RUP). Los nombres comerciales de este producto incluyen el Basudin, Dazzel,Gardentox, Kayazol, Knox Out, Nucidol y Spectracide. Los efectos tóxicos del diazinón eninsectos, al igual que en mamíferos, son debidos a la inhibición de la acetilcolinesterasa,una enzima necesaria para el funcionamiento apropiado del sistema nervioso central. Aúncon este riesgo, 17 insecticidas organofosforados están registrados en la EPA para usoresidencial. Los organofosforados son considerados como plaguicidas que causan masenvenenamientos agudos a nivel mundial, y de 1993 a 1996 hubieron cerca de 63 000

informes de envenenamiento no intencional por exposición a estos compuestos (NaturalResources Defense Council, 2000). En este sentido los plaguicidas organofosforadoscomo el diazinón resultan particularmente importantes, debido sobre todo al incremento ensu comercialización y al aumento en el comercio de los productos tratados con este tipode sustancias ( Comisión Petroquímica Mexicana-Secretaría de Energía, 1987). Entre losprincipales grupos de plaguicidas que se usan en nuestro país y que son altamente tóxicosse encuentran los organofosforados, organoclorados, triazinas y carbamatos.

Estas circunstancias han llevado a científicos y autoridades a desarrollar un sistema dediagnóstico para determinar de manera sencilla la influencia de cualquier compuesto sobrela fertilidad humana. Esta iniciativa supone un importante avance, puesto que hasta ahorano era posible obtener en laboratorios células germinales diferenciadas a gametos [célulassexuales maduras] a partir de células precursoras.

La gametogénesis es el proceso de diferenciación mediante el cual las células diploides delovario (ovogénesis) o del testículo (espermatogénesis) se transforman en células haploidesespecializadas, ovocitos en la línea femenina, y espermatozoides en la masculina. Lagametogénesis en los mamíferos presenta características particulares según la especie y seproduce por una combinación de divisiones mitóticas y meióticas (Wassarman y Albertini,1994). En las primeras el número cromosómico diploide característico de la especie esmantenido, mientras que a través de la meiosis este número es reducido a la mitad paraproducir los gametos con un número cromosómico haploide.

En el proceso de la ovogénesis (Fig. 1), las ovogonias (2n) se producen a partir de lascélulas germinales primordiales durante las primeras etapas del desarrollo embrionario yposteriormente inician la proliferación mitótica para convertirse en ovocitos primarios. Eneste punto se inicia la primera división meiótica y, en la mayoría de los mamíferos, éstaqueda detenida en la profase I, en el estadio de diploteno, durante todo el periodo fetal yhasta que la hembra alcanza la pubertad. En este largo período en profase I el núcleo delovocito es conocido como vesícula germinal (VG) y sus cromosomas en estado dediploteno difuso pueden inducir una transcripción activa que permite que los ovocitosprimarios, con un diámetro entre 15-20 µm, acumulen macromoléculas que requerirándurante su desarrollo posterior. En este lapso el crecimiento del ovocito depende de quesean mantenidas las uniones comunicantes entre el ovocito y las células somáticasacompañantes, las células de la granulosa o foliculares. Diversos estudios indican que éstasson también las responsables de mantener la detención del ovocito en la etapa de profase I(Jung et al, 1992; Eppig et al, 1993; Salustri et al, 1993).

La transformación de las ovogonias en ovocitos primarios esta acompañada por cambiosnucleares marcados por la entrada en meiosis. Esta se inicia con la síntesis del DNA yduplicación de los centrosomas, análoga a la fase S de las células mitóticas. Cadacromosoma, consiste en dos cromátidas, se aparea con su homólogo, posibilitado elentrecruzamiento entre las cromátidas de los cromosomas apareados, la recombinacióngénica y fundamentalmente, la segregación cromosómica correcta. Después de esta etapa(paquitena), los cromosomas que conforman el bivalente comienzan a separarse,generándose la fase de diploteno. Los ovocitos en diploteno son más grandes que lasovogonias, tienen mayor número de orgánulos citoplásmicos, han llevado la recombinación

génica del DNA de origen paterno y materno, y se caracterizan por la presencia decromosomas difusos rodeados por una membrana nuclear intacta, estadio denominado deVG. Los ovocitos quedan detenidos en este estado del desarrollo alrededor del nacimientodel organismo, y solo continúan su desarrollo en la pubertad, bajo el estímulo de LH, quecausa la disgregación de la membrana nuclear de los ovocitos y su entrada en la fase M(proceso denominado maduración). La cromatina se condensa en pequeños bivalentes quese segregan a dos núcleos hijos. El citoplasma se divide de forma muy asimétrica,produciendo dos ovocitos secundarios con tamaño muy diferente; uno es un pequeñocuerpo polar y el otro es una gran célula con todo el potencial de desarrollo (ovocito desegundo orden). En este momento la meiosis se detiene nuevamente. Los ovocitos desegundo orden son ovulados y la meiosis continua solo si estos son fertilizados; si es así lascromátidas hermanas de cada cromosoma se separan y el citoplasma del ovocitossecundario grande se divide de nuevo asimétricamente dando lugar a un óvulo maduro, yafecundado, y a un segundo corpúsculo polar, cada uno con un número haploide decromosomas. Los pequeños cuerpo polares posteriormente degeneran. (Bonilla E., 2000).

Los ovocitos en crecimiento presentan niveles de síntesis de RNA elevados, y éstosdisminuyen a valores mínimos durante la maduración de los ovocitos. El almacenamientode RNA durante la fase de crecimiento tiene dos funciones. La primera es usar este RNA enel crecimiento, desarrollo y maduración del propio ovocito. La segunda es utilizarlo paramantener el desarrollo del zigoto después de la fertilización, hasta que el genomaembrionario pueda ser expresado (estadio de 2 células en el ratón, 4 células en el cerdo y de4 a 8 células en el humano) (Picton y cols., 1998).

En esta investigación, los ensayos de los compuestos tóxicos se realizan sobre cultivos invitro de células implicadas en la formación de óvulos de pequeños mamíferos como elratón, cuyo proceso es muy similar al de los humanos.

Antecedentes

Durante los últimos años se ha suscitado una preocupación social sobre la saludreproductiva humana. La incidencia de tumores gonadales ha aumentadoconsiderablemente, especialmente en países desarrollados con población caucásica y seestima que una de cada cinco parejas es estéril (Nunziata, 1998). Carlsen y cols. (1992)observaron en un estudio retrospectivo que la concentración de espermatozoides poreyaculado en el hombre ha disminuido de 113 x 106 por mL, en los años 50, a 66 x 106pormL en los años siguientes. Se estima que entre 32 y 34% de los óvulos fertilizados eimplantados no llegan a termino (Zinaman y col., 1996), y que aproximadamente 3% de losniños recién nacidos presentan malformaciones o alguna variación morfológica obioquímica (Shepard, 1986).

El diazinón muestra una toxicidad aguda alta para una amplia variedad de animales,permitiendo un amplio rango de efectos bioquímicos subletales, daño a tejidos y órganosblanco específicos, efectos genotóxicos y citotóxicos, daño reproductivo, e impactosecológicos adversos (Larkin y Tjeerdema, 2000).

Un estudio realizado en pequeños mamíferos con exposición de campo a diazinón muestranque la incidencia de la condición reproductiva se redujo de 20 a 80% y de 33 a 100% enmachos y hembras expuestos a diazinón, respectivamente. Además, la productividadreproductiva, incluyendo el porcentaje de hembras preñadas mostraron un rango denacimientos de 0 a 17% en animales expuestos a diferencia de un 22 a 50% para losanimales testigo (Sheffield y Lochmiller , 2001).

Abd el-Aziz y cols. (1994) en un estudio sobre la influencia del diazinón sobre órganosreproductivos y fertilidad de ratas macho, observaron el decremento en los pesos deórganos genitales y la motilidad asociada con un incremento en el porcentaje de muerte yespermatozoides morfológicamente anormales en ratas tratadas. Al igual que undecremento en los niveles plasmáticos de testosterona en todos los grupos tratados. Laadministración oral del diazinón por 65 días consecutivos decreció el índice de concepciónen ratas hembras no tratadas (acopladas con machos tratados).

Abu-Qare y cols. (2001) observaron que en ratas preñadas tratadas con una única dosiscutánea de 10mg/kg de metilparation y 65mg/kg de diazinón, el metilparationsignificantemente inhibe la acetilcolinesterasa (AChE) maternal y fetal en el cerebro y labutirilcolisterenasa (BuChE) en plasma. El diazinón y la mezcla de diazinón ymetilparation causan menor inhibición comparado con el metilparation solo. El diazinón,solo o en combinación con el metilparation, no inhibe significantemente la BuChE maternalen hígado o en placenta la actividad de la AChE y BuChE. Estos resultados sugieren que laaplicación cutánea de una simple dosis de metilparation y diazinón, solos o encombinación, tienen un fácil acceso hacia los tejidos maternales y fetales, resultando en lainhibición de las enzimas colinesterasas.

Estudios realizados in vitro con linfocitos expuestos a diazinón muestran incremento en elintercambio de cromátidas hermanas (SCE), un marcador de daño cromosómico, ydecremento en el índice replicativo, sugiriendo efectos tóxicos y genótoxicos del diazinón(Hatjian y cols., 2000)

Aunque existen trabajos enfocados sobre la ovogénesis que muestran que el efecto defármacos sobre ésta, altera la expresión de genes involucrados en la cadena respiratoria,transporte intracelular y diferenciación celular de ovocitos fetales de ratón (Bonilla y Delmazo, 2003), todavía no existen trabajos específicos sobre el efecto de los plaguicidas, y enparticular del diazinón, en la expresión génica durante la ovogénesis en mamíferos.

Justificación

Se estima que cerca del 90 % de los pesticidas que usamos nunca alcanzan su destino.Muchos organismos benéficos son envenenados intencionalmente como un resultado. Laorganización de la salud mundial (WHO) estima que 1 millón de personas sufrenenvenenamiento agudo con pesticidas y menos de 20 000 mueren cada año. Menos de dostercios de estos enferman y mueren como resultado de exposiciones de trabajo. Esto es másevidente en países desarrollados donde la gente usa pesticidas sin precauciones apropiadaso sin equipo de protección. El medio millón de toneladas métricas de pesticidas usados enlos Estados Unidos cada año contienen aproximadamente alrededor de 600 ingredientes

activos combinados con mas que presumiblemente 1200 acarreadores inactivos, solventes,preservativos, y otros ingredientes en alrededor de 25 000 productos comerciales. Datos delINEGI (1997) indican que en México se produjeron 68,000 toneladas de pesticidas, y seimportaron de EUA y Canadá alrededor de 60,000, lo que permite estimar que actualmentese utilizan en nuestro país un mínimo de 100,000 toneladas anualmente.

El diazinón ha sido usado significantemente en incremento desde su introducción hace másque cuatro décadas. En el presente nos enfrentamos con las consecuencias en salud yambientales que son en gran parte inseparables de los beneficios de insecticidas. Enconjunto las investigaciones sobre el diazinón son generales, habiéndose distribuido a todoel medio ambiente (Lankin DJ, 2000). Los estudios sobre el riesgo genotóxico de agentesquímicos y farmacológicos sobre las células germinales de mamíferos son escasos, y sellevan a cabo especialmente en los machos, en los que la diferenciación de espermatogoniasa espermatozoides ocurre desde la etapa prepuberal, y se mantiene ininterrumpidamentehasta la vida adulta, y a lo largo de ésta. En las hembras, en cambio, la diferenciación deovogonias a ovocitos de primer orden ocurre en un único proceso de diferenciación que sedesarrolla en la vida fetal, lo que hace que sea relativamente inaccesible a la manipulaciónexperimental, y que la cantidad de material biológico disponible para su análisis sea escaso(Canipari y cols., 1984).

La investigación permitirá realizar un seguimiento completo de las eventuales alteracionesen la expresión génica, así como precisar en cuáles de ellos influye concretamente, cuálesson las dosis críticas o el umbral de acción del tóxico y, por último, sus efectos tanto para elindividuo afectado como para su posible descendencia. El sistema de cultivo in vitro podráser una alternativa que ayude a disminuir radicalmente el número de animales vivos deexperimentación usados en este tipo de pruebas.

Objetivo

Identificar cambios en la expresión génica causados por el insecticida diazinón, en ovocitosfetales de ratón, que permitan acercarnos al esclarecimiento de los mecanismos molecularesdel daño causado por éste agente in vitro.

Hipótesis

Los plaguicidas han mostrado tener impacto sobre organismos diferentes de los que sequiere eliminar y, posiblemente, con mecanismos de acción diferentes de los ya descritos.Este impacto incluye efectos adversos en los sistemas reproductores de algunas especies demamíferos pequeños. Dado que los procesos de gametogénesis, maduración de gametos,fertilización y desarrollo embrionario se encuentran muy conservados en los mamíferos,esperamos encontrar efectos adversos del diazinón sobre estos mismos procesos in vitro enla expresión génica y viabilidad de los ovocitos durante la ovogénesis temprana.

MATERIALES

SOLUCIONES

PBS: NaCl 136 mM, KCl 2.6mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 1.7 mM, pH 7.4.Soluciones DEPC: agua o soluciones tratadas con una solución alcohólica de DEPC al 0.1% (v/v). Se agitó energéticamente y se esterilizó en autoclave.Solución de desnaturalización para transferencia tipo Southern: 1.5 M NaCl, 0.5 MNaOH.Solución de lavado 2X para transferencia tipo Southern: SSC 2X (v/v), SDS 0.1%(v/v).Solución de lisis-RT de ovocitos: mezclar inmediatamente antes de su uso: 10 µl detampón 5X de la retrotranscriptasa,5 µl de DTT 0.1 M, 30 µl de agua DEPC, 2.5 µl deIgepal al 10% (v/v), 2 µl de RNAsin (40 U/µl, Promega), 1 µl de una solución stock denucleótidos 0.5 mM y 0.4 µl de Oligo(dT)17 37.5 µM.Solución de neutralización para transferencia tipo Southern:1 M Tris-HCl pH 7.4, 1.5 M NaCl.Solución de prehibridación e hibridación de filtros con ácidos nucleicos transferidos(CHURCH): NaH2PO4 0.2 M, Na2HPO4 monohidratado 0.3 M, SDS 7% (p/v), BSA 1%(p/v). Suplementar con 1 ml de EDTA 0.5 M pH 8 para un volumen final de 500 ml.Solución stock de diazinón: solución 1mM de diazinón en H2O estéril.SSC 1X: NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM, pH 7.0.Tampón de carga de electroforesis de DNA: glicerol 50% (v/v), SDS 0.1% (v/v), EDTA0.1 M, azul de bromofenol 0.025% (v/v), xilen-cianol 0.025% (v/v).Tampón SM: NaCl 0.1 M, MgSO4 10 mM, TrisHCl 50 mM pH 7.5, gelatina 0.01% (p/v)Esterilizado en autoclave.Tampón TAE: Tris 1.6 M, acetato sódico 0.8 M, EDTA 40 mM, pH 7.2.Tampón TBE: Tris 90 mM, ácido bórico 90mM, EDTA 2 mM, pH 8.0.Tampón TBS: TrisHCl 25 mM, NaCl 136 mM, KCl 2.6 mM, pH 7.5.Tampón TE: TrisHCl 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM pH 8.0.Tampón TES: TrisHCl 10 mM, EDTA 10 mM, SDS 0.2% (p/v), pH 7.5.

MEDIOS DE CULTIVO

Medio de recolección de ovarios: medio MEM (GIBCO 32360-026) suplementado con 1mg/ml de BSA (FR V, SIGMA) y 100 µg/ml de penicilina-estreptomicina.Medio de cultivo de ovocitos: medio Waymouth (GIBCO 31220-023) suplementado con5% (v/v) de suero de caballo y 2.5% (v/v) de suero fetal de bovino.LB: bactotriptona 1 % (p/v), extracto de levadura 0.5% (p/v), NaCl 85 mM, pH 7.5.Esterilizado en autoclaveLB agar: medio LB más agar al 1.5% (p/v). Para cultivos selectivos, el medio fuesuplementado con alguno de los siguientes componentes: -MgSO4: 10 mM -Maltosa: 0.2% (p/v)

-Ampicilina: 50 mg/ml ó 100 mg/ml -Tetraciclina: 12.5 mg/ml -Kanamicina: 25 mg/ml -IPTG: 0.5 mM -X-Gal: 40 mg/ml -Glucosa: 0.2% (p/v)NZY agar: NZ amina 1% (p/v), extracto de levadura 0.5% (p/v), NaCl 85 mM, MgSO4 10mM, pH 7.4, agar 1.5% (p/v). Esterilizado en autoclave.Top agar: NZ amina 1% (p/v), extracto de levadura 0.5% (p/v), NaCl 85 mM, MgSO4 10mM, pH 7.4, agarosa 0.7% (p/v). Esterilizado en autoclave.

ESTIRPES

Bacterias (Stratagene):-XL1-Blue MRF’: D(mcrA)183 D(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1, supE44, thi-I, recAL,gyrA96, relA1, lac, [F’, proAB, lacIZDM15,Tn10(tetr)].

-XLOLR: D(mcrA)183 D(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1, thi-I, recAI, gyrA96, relAI lac[F’, proAB, lacIZDM15, Tn10(tetr)].

Bacteriófagos (Stratagene):-ZAP Express: deriva del fago λ y del plásmido pBluescript.-ExAssist: fago auxiliar (f1) que es capaz de provocar la 4escisión in vivo de ZAPExpress en pBluescript.

Vectores:-pBluescript (Stratagene): contiene una región con dianas únicas para 21 enzimas derestricción distintas, flanqueadas por las regiones promotoras T3 y T7. Tiene resistencia aampicilina (Yanish-Perron y cols., 1985).-pGEM-T easy (Promega): vector empleado para el clonaje de productos de PCRgenerados por Taq polimerasa.

ANIMALES

Ratones:-Mus musculus Swiss

MEMBRANAS Y FILTROS

-Zeta-Probe GT blotting membranes (Bio-Rad No cat: 162-0196): membranas de nylonempleadas para transferir cDNAs, DNAs digeridos de fagos y productos de PCR.

-Protan BA85 (Schleicher & Schuell, No cat: 401124): filtros circulares de nitrocelulosa de132 mm de diámetro y 0.45 µm de poro. Empleados para transferir genotecas plaqueadas.-Hybond-C (Amersham No cat: RPN1787C): filtros circulares de nitrocelulosa de 87 mmde diámetro y 0.45 µm de poro. Empleados para fagos aislados y colonias bacterianas.

COLUMNAS DE CROMATOGRAFÍA-Quick spin sephadex G-50 (Boehringer Mannheim No cat: 1273-973): columnasempleadas para la purificación de sondas de cDNA marcadas radiactivamente.

PRECURSORES RADIACTIVOS[α-32P]-dCTP 3000 Ci/mmol, (Amersham; Redivue)

KITS COMERCIALES

-Gigapack III Gold Packaging extract (Stratagene): extractos usados para empaquetarfagos.-High Pure PCR product purification kit (Roche, No. 1 732 668).-High Pure Plasmid Isolation kit (Roche, No. 1 754 777)

PROGRAMAS INFORMATICOS

Comparación de secuencias nucleicas:

BLAST (Basic Local Alingment Search Tool):http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTPaquete DNA compare

OLINUCLEOTIDOS

-Regiones flanqueantes al punto de clonaje de pBLUESCRIPTy pGEM:

P: TGTAAAACGACGGCCAGTGARP: TGACCATGATTACGCCAAGC

-Oligo(dT)-EcoRI:

ATACCGCTCTGGTGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT

METODOLOGÍA

Tipo de investigación: la investigación realizada fue de tipo longitudinal, prospectiva yexperimental.

Se utilizaron 2 ratones hembra preñadas para realizar los cultivos de ovocitos, de las cualesse obtuvieron aproximadamente 5 embriones hembra por ratón y por cada embrión seobtuvieron 8 ovarios, de los cuales se obtuvieron 100 ovocitos. El experimento se realizópor triplicado. Para el análisis estadístico de los datos se utilizó la t de student con unap<0.05.

La obtención de cDNA para la construcción de sondas se realizó con una metodología quepermite trabajar con 10 ovocitos.

TÉCNICAS

CULTIVO DE OVOCITOS FETALES in vitro

Se llevó a cabo según la metodología descrita (De Felici y Dolci, 1987). Ovarios deembriones de ratón de 17 días post-coito (dpc) fueron disectados en medio de recolección.Cada ovario se cortó en fragmentos de 0.5-1 mm utilizando agujas finas (G 5/8) bajo elestereomicroscopio. Los fragmentos se colocaron en 250 µl de medio de cultivo (vermateriales) en los pozos formados por la adhesión de bloques para cultivos celularesflexiPERM (Heraeus) a placas de Petri de 10 cm, y se incubaron a 37°C en una atmósferacon 5% de CO2. Después de 2-3 días, cuando los explantos de ovario estaban adheridos a laplaca, los bloques flexiPERM fueron retirados, y se añadieron 10 ml de medio de cultivopor placa. Se observó diariamente el crecimiento y desarrollo de los ovocitos. En el día 6 decultivo, la mayoría de los ovocitos alcanzaron el estadio de vesícula germinal, y se aislaronde los explantos de ovario mediante pipeteo repetido hasta que los ovocitos fueronliberados. Estos se lavaron en PBS-DEPC y se almacenaron en tubos para PCR a –70°C (10ovocitos por tubo en 0.5 µl de agua-DEPC).

EFECTO DEL DIAZINÓN EN LA VIABILIDAD DE LOS CULTIVOS DEOVOCITOS

Después de 8 días de cultivo, se contabilizó el número de ovocitos en estadio de vesículagerminal, y fueron tratados durante 24 h con diferentes dosis del agente seleccionado.Después de 24 h de exposición al agente, los cultivos fueron lavados, se añadió medio decultivo fresco y se realizó una nueva cuantificación de los ovocitos. Se obtuvieron losresultados y se analizaron con la t de student.

Con base en los resultados del efecto del diazinón en los cultivos de ovocitos, se seleccionóla dosis a utilizar en el tratamiento de los ovocitos con los que se obtendrán los cDNAs parala construcción de las sondas. Se empleó la dosis que causó un efecto en la viabilidad delos ovocitos cercano al 50%, que nos indicó un efecto importante sobre los ovocitos, pero

aún nos permitió contar con un número suficiente para los análisis de la regulación génica.Dadas las limitaciones existentes para obtener ovocitos cultivados in vitro partiendo deovarios fetales, las sondas de cDNA fueron construidas con una metodología que permitetrabajar con un bajo número de células, según la metodología descrita (10 células sonsuficientes) (Bonilla, 2000).

Síntesis de cDNA para construcción de sondas

La retrotranscripción (RT) se realizó sobre lisados completos de 10 ovocitos para evitar lapérdida de RNA durante su aislamiento. Los ovocitos se lisaron con 4 µl de solución delisis-RT(ver materiales) a 65 °C durante 1 min. Los tubos se incubaron a temperaturaambiente durante 2 min para permitir el anillamiento del oligo(dT)17. Se añadieron 0.8 µlde transcriptasa reversa Superscript II (160 U) 15 u/µl, y la RT se realizó a 37 °C durante15 min. Al término de la reacción, la enzima se inactivó a 65 °C durante 10 min, y los tubosse mantuvieron a 4 °C.

Los extremos 3’ de la primera cadena se extendieron con residuos de desoxiadenosina{poli(dA)} (Figura 2, paso 4) con 10 U de desoxinucleotidil-transferasa terminal (TdT) a37 °C durante 15 min en presencia de dATP 0.10 mM. Finalmente, la TdT se inactivó a 65°C durante 10 min y los tubos se mantuvieron en hielo. La amplificación de las cadenas decDNA con extensiones de poli(dA) se realizó por medio de PCR utilizando un oligo(dT)con una diana de reconocimiento de la enzima EcoRI (Figura 2, paso 5). La reacción sellevó a cabo en un volumen final de 100 µl con 0.4 µl de DNA Taq polimerasa (Promega)5 u/µl. Las condiciones utilizadas para la reacción de PCR fueron: desnaturalización iniciala 94 °C durante 5 min; 25 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 1 min, anillamiento a42 °C durante 2 min, extensión a 72 °C durante 6 min (con un incremento de 10 seg encada ciclo); y extensión final a 72 °C durante 5 min. A continuación, se añadieron 3 µl másde Taq polimerasa, y se realizó una segunda reacción de PCR, con las siguientescondiciones: desnaturalización inicial a 94 °C durante 5 min; 25 ciclos de desnaturalizacióna 94 °C durante 1 min, anillamiento a 42 °C durante 2 min, extensión a 72 °C durante 6min; y extensión final a 72 °C durante 30 min.

Para determinar si la síntesis de cDNA se había desarrollado correctamente, 10 µl de losproductos obtenidos por PCR fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1% enTBE, observando una estela de cDNAs entre 600 y 800 pb (ver resultados). Seguidamente,el cDNA se purificó utilizando el “High Pure PCR Product Purification Kit” de Roche,siguiendo las recomendaciones del proveedor. Los cDNAs se eluyeron en 50 µl de bufferTris 10 mM 8.5. Se utilizó una alícuota de 0.5 µl para su cuantificación mediante placas deBromuro de Etidio (Ver resultados).

Cuantificación de cDNAs mediante placas de Bromuro de Etidio

Para determinar la cantidad (ng/µl) de los cDNAs obtenidos mediante PCR, se prepararonsoluciones estándares de 0, 10, 20, 30, 40 y 50 ng/µl de DNA en un volumen final de 0.5µl colocados en escalera en placas de Bromuro de Etidio. De los cDNAs purificados setomó una alícuota de 0.5 µl y se colocó en la caja con los estándares, la placa se incubó a

37°C por 1h y posteriormente se observó en un visualizador de fluorescencia (Gel Doc1000) para su cuantificación por referencia hacia los estándares.

Titulación de la genoteca de ovocitos control

Para comprobar tanto el número de fagos existentes en la genoteca, ya construida yproporcionada para este estudio trabajo (ver Bonilla, 2000), así como la proporción defagos recombinantes, se incubaron distintas diluciones de la misma (10-1, 10-2, 10-3 y 10-4)con 200 µl de bacterias XL1-Blue (DO600=0.5) en MgSO4 10 mM a 37 °C durante 15 min.Una vez transcurrido este tiempo se añadieron de 2-3 ml de NZY top agar a 45 °C, 15 µl deIPTG 0.5 M (en agua) y 100 µl de X-Gal (50 mg/ml en dimetil-formamida). El cultivo fueextendido en placas con medio LB/Tetraciclina e incubado a 37 °C durante una noche,periodo en el cual aparecen los halos de lisis aislados. Los halos azules corresponden afagos no recombinantes, mientras que los halos blancos a recombinantes. El título de lasgenotecas se midió en unidades formadoras de colonias (pfu) (ver resultados) y resultó delcálculo:

pfu/µl = (no de halos x factor de dilución)/10 µl sembrados.

ANÁLISIS DIFERENCIALES

Con el fin de aislar clones correspondientes a genes que mostraron regulación de suexpresión al ser tratados con diazinón, se realizó un doble análisis diferencial según lametodología descrita (Bonilla, 2000). En el primero, se analizaron 2 000 clones sobre filtrosde nitrocelulosa por duplicado. Una de las réplicas se incubó con una sonda radiactiva decDNAs procedente de ovocitos control, mientras que la otra se incubó con una sondaradiactiva de cDNAs de ovocitos tratados con el diazinón (Figura 3, paso 3). Fueronseleccionados aquellos clones que mostraron señal con la sonda de ovocitos control, perono con la sonda de ovocitos tratados (indicando una disminución de su expresión debida altratamiento), así como los clones que no mostraron señal con la sonda de ovocitos control,pero sí con la de ovocitos tratados (indicando un aumento de su expresión debida altratamiento). Los fagos correspondientes a cDNAs en los que se observó diferencia en señalse aislarán para análisis posteriores (no incluidos en este trabajo).

Marcaje de DNA para las sondas:

Las sondas destinadas a hibridación se marcaron usando el “Ready to go DNA labellingkit” (Amersham). Se partió de 100 ng de DNA y se siguieron las instrucciones comerciales,incorporando en la reacción 30 µCi de α32P-dCTP. Al finalizar el marcaje, las sondas sepasaron por columnas de sephadex G-50 (Boehringer) para separar los nucleótidos noincorporados. Las sondas se desnaturalizaron a 90 °C durante 5 min antes de añadirse a lassoluciones de hibridación.

Transferencia de fagos a filtros

Se sembraron los fagos en placas del mismo modo que para las titulaciones. Se incubaron a37 °C durante 6 h, y después a 4 °C una noche. Se colocó un filtro de nitrocelulosa sobre elcésped bacteriano y se dejó absorber durante 2 min (cuando se hizo su réplica, el filtro semantuvo 4 min sobre la placa). Se tomaron puntos de referencia en el filtro respecto a laplaca. Después, se desnaturalizó el DNA sumergiendo el filtro (invertido respecto a sucolocación en la placa) durante 2 min en solución de desnaturalización, se pasaron a lasolución de neutralización durante 2 min y finalmente se lavaron durante 30 s en Tris-HCl0.2 M pH 8, SSC 2X. Los filtros se secaron sobre papel Whatman 3 MM. Finalmente, elDNA fue fijado a los filtros por irradiación (240 mJ/cm2).

Prehibridación e hibridación de los filtros

Los filtros se prehibridaron a 65 °C durante 2 h en Solución Church (ver materiales). Acontinuación, se añadieron las sondas correspondientes previamente desnaturalizadas, y sehibridó a 65 °C durante una noche. Los filtros se lavaron 2 veces durante 15 min atemperatura ambiente en SSC-2X, SDS-0.1% y luego una vez a 65 °C durante 15 min enSSC-0.1X, SDS-0.1%. Se dejaron secar sobre papel Wathman 3 MM y se expusieron a unapelícula de autorradiografía.

Aislamiento y mantenimiento de los fagos

Después de analizar comparativamente las películas de autorradiografía, cada clon delbacteriófago de interés se guardó, recogiendo con una pipeta Pasteur el tapón de agar sobreel que creció, y se colocó en un tubo eppendorf con 1 ml de buffer SM y 20 µl decloroformo para su posterior análisis (no incluido en este trabajo).

1. Lisado celular 5 3, (RNA)

2. Unión del Oligo(dT)17 -----------TTTT

Transcriptasa reversa

3. Síntesis de la primera cadena de cDNA ------------------------------TTTT

4. Adición de residuos de AAAA-----------------------------TTTT (DNA) poli(dA) con TdT Taq DNA pol

5. Unión del oligo EcoRI-TTTT----------- (dT)-EcoRI y AAAA------------------------------TTTT 1er ciclo de PCR

6. Siguientes ciclos EcoRI-TTTT-------------------------------AAAA de PCR ------------TTTT-EcoRI

EcoRI-TTTT----------- AAAA-------------------------------TTTT

EcoRI-TTTT-------------------------------AAAA-EcoRIEcoRI-AAAA-------------------------------TTTT-EcoRI

DIGESTIÓN con EcoRI

LIGACIÓN a ZAP Express II Digerido con EcoRI

Figura 2. Esquema de la obtención de cDNAs para la construcción de sondas.

1. Placas con 2000 fagos/placa

2. Transferencia por duplicado a filtros de nitrocelulosa

sonda de ovocitos control sonda de ovocitos tratados

3. Hibridación con las respectivas sondas A B

4. Comparación de el patrón de hibridación.

5. Obtención de resultados.

Figura 3. Esquema del desarrollo de los análisis diferenciales utilizados para laidentificación de genes con expresión diferencial en ovocitos control y tratados condiazinón.

A B

Figura 1. Esquema del proceso de ovogénesis en los mamíferos.

RESULTADOS

Efecto del insecticida diazinón sobre la viabilidad de ovocitos fetales

Después de 7 días de cultivo, aproximadamente de 80 a 120 ovocitos en estadio de VGhabían crecido de cada ovario cultivado(ver imagen 8 y 9). A cada uno de los explantos deovario con crecimiento de cierto número de ovocitos en estadio de VG, se le asignó unvalor del 100% al día de su dosificación con diazinón. Los cultivos fueron expuestos adistintas dosis de diazinón (1nM, 500nM, 750nM, 850nM, 950nM y 1µM), la viabilidad delos ovocitos fue evaluada en respuesta a la dosis aguda del agente (24 h de exposición). Elefecto del diazinón en la viabilidad de los ovocitos fetales cultivados in vitro se muestra enla Fig. 4.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

1 nM 500 nM 750 nM 850 nM 950 nM 1microM control

[Diazinón]

% o

voci

tos

viab

les

AntesDespués

Fig. 4. Efecto del diazinón sobre la viabilidad de ovocitos cultivados in vitro. Los cultivos fueron expuestos24 h a diferentes dosis de diazinón en el séptimo día (±1) de cultivo. La viabilidad de los ovocitos fueevaluada mediante el número de ovocitos viables por placa después de su dosificación. Los valoresrepresentan el promedio de mínimo tres experimentos independientes (p<0.05).

El diazinón en una concentración de 1nM no muestra ningún efecto significativo sobre elporcentaje de ovocitos viables en nuestros cultivos. La dosis con una concentración de500nM de diazinón ya muestran que existe un decremento en la población del 21%, peroque no es relevante estadísticamente respecto al control. Para las concentraciones de 750,850 y 950 nM la diferencia ya es significativa, mostrando que el porcentaje de ovocitosviables decrece hasta aproximadamente 34, 33 y 57%, correspondientemente. Para una

concentración de 1µM de diazinón la cantidad de ovocitos viables ya alcanza solo el 30 %,mostrando un decremento significativo en el porcentaje de los mismos. Los ovocitosexpuestos a una concentración de 950 nM de diazinón que alcanzaron un decrementoaproximado al 50% de ovocitos viables, fueron seleccionados para los análisis sobre laexpresión génica.

Comprobación y cuantificación de cDNAs

Después de la lisis total a los ovocitos seleccionados y control, la retrotranscripción y laamplificación de los cDNAs por medio de PCR, 10µl de los productos fueron sometidos aelectroforesis en gel de agarosa para comprobar la presencia de nuestros cDNAs entre 400y 800 pb. El resultado de la comprobación por medio de electroforesis se muestra en lafigura 5. Ambas muestras se corrieron con el marcador de bajo peso molecular (vermateriales), encontrando una banda para cada una de éstas entre las 400 y 800 pb, lo quemostró la correcta retrotranscripción, amplificación de la muestra, y al mismo tiempo lapresencia de los cDNAs en ésta.

Marcador Tratados Control

Fig. 5. Comprobación de la presencia de cDNAs de ovocitos en los productos de PCR. 10 µl de los productosde PCR fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1%, se utilizó un marcador de bajo pesomolecular en escalera (izquierda) para ubicar a los cDNAs de ovocitos tratados con diazinón (centro) yovocitos control (derecha), encontrando a éstos entre las 400 y 800 pb.

Una vez que se comprobó la presencia de cDNAs en ambas muestras, el siguiente paso erasaber la concentración de cDNAs en éstas, y para ello los productos de PCR fueronpurificados y cuantificados. Así, una vez purificados (ver metodología) se utilizaronconcentraciones conocidas de DNA como referencia para la cuantificación, 0.5 µl de lasmuestras se compararon con los estándares, determinándose para ambas, ovocitos tratadosy control, una concentración de 100 ng/µl de cDNA. El resultado de la cuantificación semuestra en la figura 6.

Estándares Tratado Control

10 20 30 40 50

Fig. 6. Cuantificación de cDNA mediante placas de Br-Etd. 0.5 µl de los productos purificados de PCRfueron comparados con concentraciones conocidas de DNA (10, 20, 30, 40 y 50 ng en medio µl) en placascon gel de agarosa y Bromuro de Etidio. Las soluciones estándares se realizaron a partir de una solución stockcon 117.5 ng/µl de DNA. El producto de PCR para ovocitos tratados (centro) muestra una concentración de100 ng/µl al igual que para los ovocitos control (derecha).

Evaluación de la genoteca

Previamente construida (ver metodología), la genoteca de ovocitos fetales de ratón fueevaluada de la manera descrita en la metodología, determinando el título de la misma en486 000 fagos/µl y el porcentaje de fagos recombinantes en .98.7% (ver figura 10). Ya queuna célula se estima que puede estar expresando no mas de 100, 000 transcritos y un tituloadecuado para una genoteca es de aproximadamente 106 fagos/ml (Bonilla E., 2000),nuestra genoteca con un título adecuado y un buen porcentaje de recombinantes fueutilizada para los análisis posteriores.

Genes diferencialmente expresados

Una vez que los fagos de nuestra genoteca fueron desnaturalizados y los clones quecontenían nuestros insertos fueron fijados a las membranas de nitrocelulosa, se hibridaronlas sondas de ovocitos tratados y ovocitos control con cada una de las membranas. Lasseñales detectadas por autoradiografía diferencial, mostraron que el resultado en el patrónde hibridación con los clones en las membranas fue diferente para las sondas de ovocitostratados (expuestos durante 24 h a 950 nM de diazinón) con respecto a las sondas deovocitos control. El resultado en el patrón de hibridación para ambas muestras no semuestra en este trabajo.

DISCUSIÓN

La respuesta a la dosis aguda del insecticida diazinón de ovocitos fetales de ratón in vitrofue analizada en este estudio. Con respecto al efecto de exposición al diazinón durante 24 hsobre la viabilidad de los ovocitos, los resultados muestran que este insecticida tiene efectossobre la viabilidad de los ovocitos in vitro a concentraciones del orden de los nM. Desdeuna concentración de 750 nM de diazinón decrece el porcentaje en la población de ovocitosviables, alcanzando la CL50 a una concentración de 950 nM. Esto sugiere que mas allá delorden de los µM, el efecto citotóxico del diazinón es completamente letal para los ovocitos.Es evidente que el diazinón se encuentra entre los pesticidas más tóxicos y citotóxicos(Bisson M y Hontela A, 2002) comparado con otros pesticidas usados en el país, con unaLD50 en ratas de 300 a 400 mg/kg, mientras que otros pesticidas como el malatión(insecticida organofosforado) y fenoxaprop-etil (herbicida del grupo de los arilo-fenoxi-propionatos), presentan dosis letales de 1000 y 3310 mg/kg, respectivamente. Existeevidencia que muestra que la exposición al diazinón en humanos tiene efectos citotóxicosen linfocitos in vivo e in vitro (Hatjian y cols., 2000) sugiriendo que en personasocupacionalmente expuestas, y debido a la fácil absorción del diazinón por todas las vías enel organismo, las concentraciones utilizadas en este estudio podrían ser alcanzadas in vivo.

Resultados de un estudio en donde se evaluó la translocación de pesticidas desde áreas deaplicación a superficies accesibles al contacto humano (Lewis y cols., 2001), demuestranque los pesticidas organofosforados aplicados en el interior de una casa para el control deinsectos, pueden contribuir tanto como 0.5 µg/kg/día de diazinón, además residuosencontrados en las manos de niños sugieren que el contacto repetido con la boca puedecontribuir tanto como 1-1.5 µg/kg/día. Esto indica que no solo las personasocupacionalmente expuestas están en riesgo de tener contacto con el diazinón, sino tambiénlas personas que utilizan insecticidas continuamente en casa sin ninguna precaución, o queradican en áreas cercanas de aplicación de pesticidas. Hasta ahora no existen datosregistrados que indiquen efectos deletéreos del diazinón a nivel reproductivo. Este estudio,con las concentraciones de diazinón utilizadas, sugiere efectos citotóxicos in vitro enovocitos fetales de ratón .

Por otro lado, la respuesta a la exposición al diazinón podría o no incluir cambios en laexpresión génica de los ovocitos. Al respecto, este estudio realizado in vitro solo comparados patrones de hibridación de clones extraídos de una genoteca de ovocitos fetales deratón, con sondas de ovocitos tratados y ovocitos control, lo que nos permite visualizar ladesregulación de la expresión génica en los ovocitos expuestos a diazinón. Los resultadosde los análisis diferenciales muestran que el patrón de hibridación de las sondas de ovocitoscontrol y ovocitos expuestos a diazinón es distinto, mostrando varios genes que estándesregulando su expresión en los ovocitos al ser expuestos a una concentración de 950 nMde diazinón. Estos resultados muestran un primer análisis diferencial que podría aportardatos incompletos en cuanto a la comparación en el patrón de hibhridación. No obstante,para una segunda comprobación de los resultados, se requerirá de un segundo análisisdiferencial (no incluido en este trabajo), en el cual los clones de cDNAs que corresponden agenes diferencialmente expresados sean aislados y amplificados por PCR y nuevamentehibridados con cDNAs marcados de ovocitos control vs. ovocitos tratados con diazinón.

Sin embargo, con los resultados obtenidos en este estudio se podrían sugerir, que en esteexperimento, bajo las condiciones especificas del trabajo, existen efectos genotóxicos enovocitos fetales de ratón del diazinón in vitro, que implican desregulación en la expresióngénica durante la ovogénesis temprana.

Aunque se tiene evidencia de efectos genotóxicos in vitro del diazinón (Hatjian y cols.,2000), que muestran que los índices replicativos decrecen mientras que el intercambio decromátidas hermanas (SCE) aumenta significativamente en linfocitos expuestos a diazinón.Aún no existen datos registrados en cuanto a la genotoxicidad del insecticida en gametos.

CONCLUSIÓN

El rango de dosis del insecticida diazinón que resulta en efectos tóxicos para organismoscompletos varia ampliamente. En contraste con otros pesticidas, el diazinón presentaefectos tóxicos y se sugieren efectos genotóxicos in vitro. Sin embargo, para asegurar dichagenotoxicidad del diazinón y la expresión diferencial de genes en ovocitos de ratónexpuestos al pesticida se requiere de un segundo análisis diferencial.

Figura 8. Fotografía microscopica (10X) de un explanto de ovario a los 8 días de cultivo.Los ovocitos son las células más grandes y circulares en el explanto en forma radial.

Figura 9. Fotografia microscopica (40X) de ovocitos en cultivo en estado de VG. Losovocitos que alcanzaron el estadio de VG son las células grandes con un núcleo difuso ensu interior (el recuadro en la imagen muestra la VG en un ovocito).

Figura 10. Plaqueo de la genoteca en LB/T. Los fagos que contienen a la genoteca lisan alas XL1-blue en el tapete bacteriano formado halos de lisis. Los halos azules fueronformados por fagos no recombinantes (flecha), los halos transparentes contienen fagosrecombinantes. El número de halos de lisis es igual a la cantidad de fagos en 10µl degenoteca.

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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

IZTAPALAPA

CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

EFECTO DEL INSECTICIDA DIAZINÓN EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DURANTE

LA OVOGÉNESIS TEMPRANA EN EL RATÓN

CARRILLO GÓMEZ EDGAR JOSÉ

DR. EDMUNDO BONILLA GONZÁLEZ

LABORATORIO DE EXPRESIÓN GÉNICA S-248. DIVISIÓN DE CBS. CIENCIAS DE

LA SALUD. UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA-IZTAPALAPA.

6/01/03-6/01/04.