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Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa
Efecto del pH en la actividad enzimática
Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
• pH– También afecta la forma y por lo tanto la tasa de reacción, cada
enzima tiene un pH óptimo.– Éste está entre pH 6 - 8 para la mayoría de las enzimas.– Sin embargo, las enzimas digestivas en el estómago están
diseñadas para trabajar mejor a pH 2 mientras las del intestino tienen un óptimo a pH 8, ambas se ajustan a su medio ambiente.
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Aminoácidos
�no polares
�Polares
�Ácidos
�bases
Las cadenas laterales (grupos R) en aminoácidos pueden ser:
y éstos determinan el comportamiento en agua
Alanina Leucina Valina Isoleucina
Glicina Serina Treonina Asparagina Glutamina
Ác. aspártico Ác. glutámico Cisteína Tirosina
Lisina HistidinaArgenina
Prolina Metionina Fenil alanina Triptofano
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De los 20 amino ácidos, 13 tienen dos grupos ionizables, los grupos alfa-carboxilos y los alfa-amino. Los 7 amino ácidos restantes tienen tres grupos ionizables, debido a que su grupo R también puede ser ionizado.
El pH del ambiente del amino ácido y el pK de los grupos ionizables determinarán la carga asociada con un amino ácido.
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Aminoácidos más comunes en el sitio activo
Cisteina
Serina
Histidina
Aspartato
Glutamato
Lisina
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Ionización de las cadenas lateralesForma que predomina
debajo del pKaForma que predomina
arriba del pKapKa
3.9
Aspartato
1 3162
4.1Glutamato
1 1995
Histidina
6.0
1 25
CH2 COOH CH2 COO
CH2 CH2 COOCH2 CH2 COOH
CH2
N
NH
H
CH2
N
NH
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Cisteina
8.4
101
Tirosina
10.1
500 1
CH2 SH CH2 S
CH2 OCH2 OH
Forma que predomina debajo
del pKa
Forma que predomina arriba
del pKa
pKa
Ionización de las cadenas laterales
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Lisina
10.5
Arginina
12.5
12601
125890 1
CH2 CH2 CH2 CH2 NH3 CH2 CH2 CH2 CH2 NH2
CH2 CH2 CH2 NH CNH2
NH2
CH2 CH2 CH2 NH CNH
NH2
Forma que predomina debajo del pKa
Forma que predomina arriba del pKapKa
Ionización de las cadenas laterales
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Los grupos ionizables en las proteinas frecuentemente tienen valores de pKa perturbados los cuales corresponden al de la identificación del residuo
La perturbación en los pKa es el resultado del hecho de que los grupos ionizables están frecuentemente en un ambiente más hidrofóbico dentro de la proteina y están
involucrados frecuentemente en redes de enlaces hidrógeno
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La Quimotripsina es una enzima digestiva que pertenece a la superfamilia de las serin proteasas. Utiliza un residuo activo de serina para llevar a cabo la hidrólisis en el C-terminal de los aminoácidos aromáticos de otras proteínas. La Quimotripsina es una proteas que enlaza el C-terminal de fenilalanina, triptofano y tirosina en cadenas de péptidos. Tiene especificidad por los aminoácidos aromáticos debido a su bolsa hidrofóbica.
El estudio de su cinética proporciona evidencia de Mecanismo Ping-Pong
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pH Influences Chymotrypsin Activity
5 6 7 8 9 10 11pH
Relative A
ctivity
Ada
pted
from
Dre
ssle
r &
Pot
ter
(199
1) D
isco
verin
g E
nzym
es,p
.162
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Charge R
elay in Active S
ite
Ser195
His 57
Asp 102
H–O–CH2
OC–O -=
Active Ser
H–N N
C C
C
H
H
CH2
Ser195
His 57
Asp 102
-O–CH2
OC–O–H
=
N N–H
C C
C
H
H
CH2
Ada
pted
from
Alb
erts
et a
l (20
02)
Mol
ecul
ar B
iolo
gy o
f the
Cel
l (4e
) p.
158
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Imidazole on Histidine Is Affected by pH
H–N N
C C
C
H
H
H+
pH 6 pH 7
+H–N N–H
C C
C
H
H
Inactive+ Ser
195
His 57
Asp 102
H–O–CH2
OC–O -=
H–N N–H
C C-H
C
CH2
H
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158
Ada
pted
from
Dre
ssle
r &
Pot
ter
(200
0) D
isco
verin
g E
nzym
es,p
.163
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http://glencoe.mheducation.com/sites/dl/free/0078759864/383930/BL_11.html
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El efecto de pH sobre la cinética enzimática en solución K1 K2
−
+
−−
+
−
← →
← →
+
+
+
+
2EEEH
H
H
H
donde: E- denota la forma activa de la enzima E y E2- son formas inactivas obtenidas por protonación y desprotonación del sitio activo. El equilibrio ácido base entre las tres especies E, H+, y E-, requiere
1Ke
eh =−+
2
2
Ke
eh =−
−+
Si e0 denota la concentración total de enzima
−− ++= 20 eeee
la fracción activa 0e
ey
−− = y está dado por
−−
−−
++≡
2eee
ey
+
−−
−+
−−
++=
h
eKe
K
eh
ey
2
1
+
+−
++=
h
K
K
hy
2
1
1
1
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Tomando logaritmos
++−= +
+−
h
K
K
hy 2
1
1loglog
Vmax esta definida como: catkeV 0max = , además sabemos que 0e
ey
−− = , por lo tanto
+
+−
++==
h
K
K
h
ekyekV cat
cat2
1
00max
1
Por lo tanto graficando log Vmax versus pH debe exhibir el mismo comportamiento que log y- versus pH.
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Estimación de pK1 y pK2 más importantes del sitio activo de forma gráfica
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POLYMATH Results 06-26-2007 Nonlinear regression (L-M) Model: vmax = kcat*0.003/(1+pH/pk1+pk2/pH) Variable Ini guess Value 95% confidence kcat 2.0E+04 1.998E+04 29.947656 pk1 4.2 3.3031477 0.0064151 pk2 6.2 8.4916206 0.0164501 Nonlinear regression settings Max # iterations = 64 Precision R^2 = 0.9999999 R^2adj = 0.9999999 Rmsd = 6.776E-05 Variance = 5.624E-08 General Sample size = 7 # Model vars = 3 # Indep vars = 1 # Iterations = 7
Estimación de pK1 y pK2 más importantes del sitio activo por regresión no-lineal
+
+−
++==
h
K
K
h
ekyekV cat
cat2
1
00max
1