EFEITO DE DESINFETANTES HOSPITALARES SOBRE …app.uff.br/riuff/bitstream/1/3403/1/Ferreira, Thaís Gonçalves... · thaÍs gonÇalves ferreira efeito de desinfetantes hospitalares

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE

EFEITO DE DESINFETANTES HOSPITALARES SOBRE CÉLULAS

VEGETATIVAS E ESPOROS DE RIBOTIPOS DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE

ISOLADOS EXCLUSIVAMENTE NO BRASIL

THAÍS GONÇALVES FERREIRA

NITERÓI/RJ

2012





Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos

para a Saúde da Universidade Federal

Fluminense, como requisito parcial para a

obtenção do Grau de Mestre. Área de

Concentração: Interdisciplinar.

Orientadores: Prof. Dr. GERALDO RENATO DE PAULA

Profª. Drª REGINA MARIA C. P. DOMINGUES

NITERÓI/RJ

2012





Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos

para a Saúde da Universidade Federal

Fluminense, como requisito parcial para a

obtenção do Grau de Mestre. Área de

Concentração: Interdisciplinar.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________

Prof. Dr. GERALDO RENATO DE PAULA – Orientador – UFF

______________________________________________________________

Profª. Drª. ELIANE DE OLIVEIRA FERREIRA – UFRJ

______________________________________________________________

Profª. Drª. ILANA TERUSZKIN BALASSIANO – FIOCRUZ

______________________________________________________________

Profª. Drª. LENISE ARNEIRO TEIXEIRA – Revisora – UFF

NITERÓI/RJ

2012

“Trabalhe, como se tudo

dependesse só de ti. Creia, como se

tudo dependesse só do Pai”

(S. Inácio de Loyola)

AGRADECIMENTOS

À Deus, por ter me criado a sua imagem e semelhança, permitindo que pudesse

desenvolver este trabalho e, principalmente, crescer não somente como profissional, mas sim

como pessoa.

Aos meus pais amados, por sempre acreditarem e investirem em meus sonhos,

dando-me, mesmo à distância, todo o carinho e atenção necessários nessa caminhada.

À minha irmãzinha, que mesmo sem saber foi muito importante em todas as

minhas conquistas. Sei que terei a oportunidade de me alegrar muito com as suas também.

Ao meu companheiro, amigo e namorado, Guilherme, por me mostrar um lado

mais leve da vida e dividir de perto todas as etapas de descoberta que passamos e ainda

passaremos. Também a todos seus familiares, que me proporcionam uma vida em família na

Cidade Maravilhosa.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Geraldo Renato de Paula, sou infinitamente grata

pelas oportunidades que me proporcionou, pelos conhecimentos que dividiu comigo e pela

atenção dada para que este trabalho fosse construído.

Às minhas amigas de longa data, Sinara, Vanessa, Dayane, Lívia, Bárbara,

Dalila e Isabela. Algumas estão comigo todos os dias, outras não mais, porém estão em meu

coração e fazendo parte de cada conquista. De modo especial, agradeço minha amiga Thaís,

que por alguma razão, que a razão desconhece, está sempre perto de mim, dando sustentação

aos meus passos.

Às maravilhosas amigas que conquistei neste mestrado, Maria Emília, Lara,

Lidiane, Lívia, Simone, que dividiram comigo as aflições e a satisfação de desenvolver cada

experimento.

À coordenação e aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para a Saúde, pelo apoio e pelos ensinamentos partilhados.

À Profª Drª Regina Maria C. P. Domingues, que me recebeu de braços abertos no

Laboratório de Biologia de Anaeróbios do IMPPG-UFRJ. À Profª Drª Eliane Ferreira, pessoa que

admiro muito e que foi fundamental para que este trabalho pudesse ser desenvolvido. Ao amigo

Joaquim, pela colaboração na realização dos experimentos e por todos os maravilhosos momentos de

descontração. Agradeço ainda a todos os estudantes e professores do Laboratório de Biologia de

Anaeróbios, pela troca constante de experiências.

Às agências de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ); Ministério da Ciência e

Tecnologia (MTC/Pronex) e Ministério da Saúde do Brasil, pelo apoio financeiro para realização deste

trabalho.

RESUMO

INTRODUÇÃO: Clostridium difficile é um importante patógeno entérico e o agente

etiológico da diarreia associada ao C. difficile (CDAD). Pacientes com CDAD excretam uma

grande quantidade de células vegetativas e esporos em suas fezes, levando a contaminação do

ambiente hospitalar e propagação deste patógeno. Este fato pode ser explicado pela resistência

dos esporos a muitos desinfetantes utilizados na rotina de desinfecção hospitalar. O objetivo

deste estudo foi avaliar a atividade de desinfetantes hospitalares contra os esporos e células

vegetativas de C. difficile. Além disso, foram analisados os perfis de proteínas totais das

células vegetativas das cepas de C. difficile, tratadas com os mesmos desinfetantes.

MÉTODOS: Os agentes de limpeza hospitalar Virkon® (peroxigênio), Cloro-Rio® (agente

liberador de cloro ativo), Peresal® (peroxigênio), Riohex® (biguanida), e Cidex Opa®

(aldeído), comumente utilizados em hospitais brasileiros, foram testados contra os esporos das

cepas de C. difficile HU17- ribotipo 133 e SJ1-ribotipo 135, ambos ribotipos encontrados

exclusivamente no Brasil. A cepa hipervirulenta de C. difficile, BI/NAP1/027, foi utilizada

para comparação. Os testes foram realizados de acordo com o método padrão para teste da

atividade esporocida de desinfetantes dos Estados Unidos, ASTM E2414-05. Para a análise do

perfil de proteínas totais, as mesmas cepas de C. difficile, incluindo também a ATCC 9689,

foram crescidas na presença e na ausência de concentração subinibitória dos desinfetantes

citados e submetidas a eletroforese em gel de SDS-PAGE. RESULTADOS: Os agentes

Cloro-Rio® e Cidex Opa® eliminaram completamente os esporos de todas as cepas testadas,

enquanto o Riohex® não exibiu qualquer redução significante. Por outro lado, o Virkon®

reduziu significativamente a concentração de esporos para as cepas HU17-133 e

BI/NAP1/027, mas o mesmo não foi observado com a cepa SJ1-135. O agente Peresal®

eliminou completamente os esporos da cepa HU17-133, mas apenas reduziu a concentração

inicial dos esporos para as cepas C. difficile SJ1-135 e BI/NAP1/027. Os desinfetantes Cloro-

Rio® e Riohex® foram os que mais afetaram a expressão de proteínas em todas as cepas

avaliadas. CONCLUSÕES: Em conjunto, nossos resultados mostraram que o Cloro-Rio® e

Cidex Opa® foram os desinfetantes mais eficazes para eliminação dos esporos de C. difficile.

O estudo das proteínas afetadas pelos desinfetantes poderia ajudar a elucidar a resistência do

C. difficile frente a alguns agentes de limpeza e criar novas alternativas para eliminar e/ou

diminuir a contaminação do ambiente hospitalar por esta bactéria.

Palavras-chave: Clostridium difficile, Esporos, Desinfetantes hospitalares, Proteínas totais.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Clostridium difficile is an important enteric pathogen and the etiological

agent of C. difficile-associated diarrhea (CDAD). Patients with CDAD, excrete a large amount

of vegetative cells and spores in their stools, leading to contamination of the hospital

environment and spread of the pathogen. This fact can be explained by the resistance of

spores to many disinfectants used in hospital routine. The aim of this study was to evaluate

the activity of hospital disinfectants against C. difficile spores and vegetative cells.

Furthermore were analyzed the whole proteins profiles of the vegetative cells of these strains

treated with the same disinfectant. METHODS: The hospital cleaning agents Virkon®

(peroxygen), Cloro-Rio® (chlorine), Peresal® (peroxygen), Riohex® (biguanide), and Cidex

Opa® (aldehyde), usually used in Brazilian hospitals, were tested against C. difficile strains

spores HU17-ribotype 133 and SJ1-ribotype 135, both exclusively Brazilian.

BI/NAP1/ribotype 027 strain was also used for comparison. The tests were performed in

accordance with the standard method for testing the sporicidal activity of disinfectants of the

United States, ASTM E2414-05. For the analysis of whole proteins profile, the strains were

grown in the presence and absence of sub inhibitory concentrations of the disinfectants and

applied on SDS-PAGE gel. RESULTS: Cloro-Rio® and Cidex Opa® completely eliminated

spores of all strains tested, while Riohex® did not show any significant reduction. On the

other hand, Virkon® significantly reduced HU17 and BI/NAP1/027 spores, but the same was

not observed with SJ1 strain. The agent Peresal® completely eliminate the spores of strain

HU17-133, but only reduced the initial concentration of spores for strains SJ1-135 and

BI/NAP1/027. The disinfectants Cloro-Rio® and Riohex® were the most affected protein

expression in all strains evaluated. CONCLUSIONS: Taken together, our results show that

Cloro-Rio® and Cidex Opa® are the most remarkable agents for eliminating spores. The

study of proteins affected by the disinfectant might help to elucidate the resistance of C.

difficile against some cleaning agents and create new alternatives to eliminate and/or reduce

the contamination of the hospital by this bacterium.

Keywords: Clostridium difficile, Spores, Hospital disinfectants, Whole proteins.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA, f. 17

2. REVISÃO DA LITERATURA, f. 19

2.1 HISTÓRICO E EPIDEMIOLOGIA DO Clostridium difficile, f. 19

2.2 C. difficile: CARACTERÍSTICAS E FATORES DE VIRULÊNCIA, f. 21

2.3 ANTIBIÓTICOS E A INFECÇÃO PELO C. difficile, f. 25

2.4 ASPECTOS CLÍNICOS E DIAGNÓSTICO PARA CDAD, f. 27

2.5 FATORES DE RISCO PARA CDAD, f. 28

2.6 TRATAMENTO E PERSPECTIVAS PARA CDAD, f. 29

2.7 MEDIDAS DE CONTROLE E PREVENÇÃO DAS INFECÇÕES POR C. difficile, f. 31

2.8 OS DESINFETANTES HOSPITALARES E O C. difficile, f. 32

2.8.1 Algumas características dos desinfetantes avaliados no estudo, f. 34

3. OBJETIVOS, f. 38

3.1 OBJETIVO GERAL, f. 38

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, f. 38

4. METODOLOGIA, f. 39

4.1 CEPAS BACTERIANAS, f. 39

4.2 DESINFETANTES, f. 40

4.3 CRESCIMENTO DAS CEPAS E PREPARO DOS ESPOROS, f. 41

4.3.1 Observação visual dos esporos, f. 41

4.4 TESTE DA ATIVIDADE ESPOROCIDA DOS DESINFETANTES, f. 42

4.4.1 Cálculo dos esporos sobreviventes, f. 44

4.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÍNIMA INIBITÓRIA, f. 44

4.6 EXTRAÇÃO E ANÁLISE DAS PROTEÍNAS TOTAIS, f. 45

4.6.1 Obtenção dos extratos proteicos, f. 45

4.6.2 Dosagem das proteínas totais pelo Método Bradford, f. 45

4.6.3 Eletroforese, f. 45

4.6.4 Revelação, f. 46

4.6.5 Análise, f. 47

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 47

5. RESULTADOS, f. 48

5.1 CRESCIMENTO DAS CEPAS E PREPARO DOS ESPOROS, f. 48

5.2 TESTE DA ATIVIDADE ESPOROCIDA DOS DESINFETANTES, f. 50

5.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÍNIMA INIBITÓRIA, f. 53

5.4 EXTRAÇÃO E ANÁLISE DAS PROTEÍNAS TOTAIS, f. 53

6. DISCUSSÃO, f. 65

7. CONCLUSÕES, f. 79

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, f. 81

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Patogênese da diarréia associada a C. difficile (CDAD) (adaptada de POUTANEN

& SIMOR, 2004), f. 23

Figura 2: Ilustração do locus de patogenicidade (PaLoc) das cepas de C. difficile, f. 24

Figura 3: Estrutura dos esporos de C. difficile (A e B), após sete dias de incubação em um

meio sólido (PERMPOONPATTANA et al., 2011), f. 25

Figura 4: O efeito dos antibióticos sobre a microbiota intestinal normal e o risco para a

infecção por C. difficile (adaptada de RUPNIK et al., 2009), f. 26

Figura 5: Modelo para as várias manifestações clínicas possíveis pela aquisição do C.

difficile (adaptada de RUPNIK et al., 2009), f. 27

Figura 6: Esquema para o teste da atividade esporocida dos desinfetantes (adaptada de

ASTM E2414-5, 2005), f. 43

Figura 7: Esporos de C. difficile observados após a coloração de Wirtz-Conklin, f. 49

Figura 8: Log10 da contagem de esporos viáveis antes e após serem tratados com os

desinfetantes Riohex®, Cidex Opa®, Cloro Rio®, Peresal® e Virkon®, nas concentrações e

tempos indicados pelos fabricantes, para as cepas C. difficile: HU17-133, BI/NAP1/027 e

SJ1-135, f. 51

Figura 9: Porcentagem da redução do Log10 da contagem de UFCs, provenientes da

germinação dos esporos, das cepas HU17-133, BI/NAP1/027 e SJ1-135 de C. difficile,

tratadas com os desinfetantes Riohex®, Cidex Opa®, Cloro Rio®, Peresal® e Virkon®, f. 52

Figura 10: Perfis eletroforéticos das proteínas totais de quatro cepas C. difficile: SJ1-135,

BI/NAP1/027, HU17-133 e ATCC 9689, f. 54

Figura 11: (I) Perfis eletroforéticos de proteínas totais da cepa C. difficile ATCC 9689 em gel

SDS-PAGE, antes (Padrão) e após ser tratada com concentração submínima inibitória dos

desinfetantes Virkon®, Cidex Opa®, Peresal®, Cloro Rio® e Riohex®; (II) Gráficos

referentes à comparação densitométrica, através de análise automatizada, do Padrão versus a

cepa tratada com cada um dos cinco desinfetantes. *Proteínas que sofreram alteração após o

tratamento com desinfetante, f. 55

Figura 12: (I) Perfis eletroforéticos de proteínas totais da cepa C. difficile HU17-133 em gel






Figura 13: (I) Perfis eletroforéticos de proteínas totais da cepa C. difficile BI/NAP1/027 em

gel SDS-PAGE, antes (Padrão) e após ser tratada com concentração submínima inibitória dos





Figura 14: (I) Perfis eletroforéticos de proteínas totais da cepa C. difficile SJ1-135 em gel






Figura 15: Materiais testados e compatíveis com o desinfetante Cidex Opa® (orto-

ftalaldeído), de acordo com o fabricante (Johnson & Johnson), f. 77

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Desinfetantes hospitalares testados frente aos ribotipos de C. difficile encontrados

no Brasil, f. 40

Tabela 2: Resultados da Concentração Mínima Inibitória (CMI), como uma proporção da

concentração recomendada pelos fabricantes dos desinfetantes selecionados, para células

vegetativas de C. difficile, f. 53

Tabela 3: Proteínas (representadas por seus pesos moleculares) das cepas C. difficile ATCC

9689, HU17-133, BI/NAP1/027 e SJ1-135, que sofreram alterações em sua densidade após

tratamento com os desinfetantes Virkon®, Cidex®, Peresal®, Cloro Rio® e Riohex®, f. 63

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

- BHI-PRAS: do inglês “Brain Heart Infusion – pre-reduced anaerobically and sterilized”

(caldo de infusão de cérebro e coração – pré-reduzido e esterilizado em anaerobiose)

- CCFA: do inglês “cycloserine-cefoxitin-fructose agar” (ciclosserina-cefoxitina-frutose agar)

- CDAD: do inglês “Clostridium difficile-associated diarrhea” (diarréia associada a

Clostridium difficile)

- CDC: do inglês “Centers for Disease Control and Prevention” (Centro de Controle e

Prevenção de Doença)

- CDI: do inglês “Clostridium difficile infections” (infecções associadas ao Clostridium

difficile)

- CDT: toxina binária produzida por C. difficile

- cdtA: gene que codifica a subunidade enzimática A da toxina binária produzida por C.

difficile

- CdtA: proteína correspondente à subunidade A da toxina binária produzida por C. difficile

- cdtB: gene que codifica a subunidade ligante B da toxina binária produzida por C. difficile

- CdtB: proteína correspondente à subunidade ligante B da toxina binária produzida por C.

difficile

- CdtLoc: região gênica que codifica a toxina binária produzida por C. difficile

- CMI: concentração mínima inibitória

- CLSI: do inglês “Clinical Laboratory Standards Institute” (Instituto de Padronização dos

Laboratórios Clínicos)

- codY: gene que codifica um regulador global da expressão de diversos genes bacterianos

- CodY: proteína que atua como regulador global da expressão de diversos genes bacterianos

- CPM: colite pseudomembranosa

- DNA: do inglês “deoxyribonucleic acid” (ácido desoxirribonucléico)

- ESI-Q-TOF: do inglês “Electro Spray Ionisation-Quadrupole-Time of Flight”

- FDA: do inglês “Food and Drug Administration” (Administração de Alimentos e Drogas)

- Fiocruz: Fundação Oswaldo Cruz

- gyrB: gene que codifica a subunidade B da enzima DNA girase

- HUCFF: Hospital Universitário Clementino Fraga Filho

- IPEC: Instituto de Pesquisa Evandro Chagas

- Kb: quilobases

- LB: Caldo Luria-Bertani

- mA: miliampère

- mg: miligramas

- µg: micrograma

- mL: mililitro

- µL: microlitro

- MRSA: do inglês “Methicillin-resistant Staphylococcus aureus” (Staphylococcus aureus

resistente a meticilina)

- MS: Ministério da Saúde

- OPA: 1,2- benzenodicarboxaldeído

- PAA: ácido peracético

- PaLoc: do inglês “pathogenicity locus” (região gênica que compreende os genes associados

a produção e regulação das toxinas A e B de C. difficile)

- PFGE: do inglês “pulsed-field gel electrophoresis” (eletroforese em campo pulsado)

- pH: potencial hidrogeniônico

- REA: do inglês “restriction endonuclease analysis” (análise de fragmentos gerados por

endonucleases de restrição)

- SDS-PAGE: do inglês “sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis”

(eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio)

- SlpA: do inglês “surface layer protein” A (proteína de superfície A)

- tcdA: gene que codifica a enterotoxina A produzida por C. difficile

- TcdA: proteína correspondente à enterotoxina A produzida por C. difficile

- tcdB: gene que codifica a enterotoxina B produzida por C. difficile

- TcdB: proteína correspondente à enterotoxina B produzida por C. difficile

- tcdC: gene que codifica o regulador negativo da expressão das enterotoxinas A e B

produzidas por C. difficile

- tcdE: gene que codifica uma proteína responsável pela liberação extracelular das

enterotoxinas A e B produzidas por C. difficile

- tcdR: gene que codifica o regulador positivo da expressão das enterotoxinas A e B

produzidas por C. difficile

- TcdR: proteína que regula positivamente a expressão das enterotoxinas A e B produzidas

por C. difficile

- UFC: unidades formadoras de colônia

- UFRJ: Universidade Federal do Rio de Janeiro

- UTI: unidade de terapia intensiva

- V: volts

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

Clostridium difficile é considerado um dos principais agentes etiológicos da diarréia

bacteriana associada ao uso de antimicrobianos, sendo portanto um importante patógeno

nosocomial e significante causa de morbidade e mortalidade, apesar de existirem métodos

razoavelmente adequados para o seu diagnóstico e tratamento. Este microrganismo e a sua

capacidade toxigênica são conhecidos desde 1935, mas seu reconhecimento como um

importante patógeno humano não foi estabelecido até 1977. Nos últimos anos, o papel das

infecções associadas ao C. difficile tem obtido súbito aumento interesse (BARTLETT, 2009).

A CDAD (do inglês “Clostridium difficile-associated diarrhea”) é favorecida pela

supressão da microbiota intestinal anfibiôntica durante ou após a antibioticoterapia

(THOMAS et al., 2003), idade avançada (POUTANEN et al., 2004), terapia para tratamento

de câncer (BLOT et al., 2003), imunossupressão, e ainda, infecções com outros patógenos

gastrointestinais (HIRSCHHOM et al., 1994). É importante salientar que a recorrência da

doença é frequentemente observada (WILCOX & SPENCER, 1992).

Pacientes com CDAD excretam em suas fezes grande quantidade não apenas de

células vegetativas, mas também de esporos do patógeno (KAATZ et al., 1988). Este evento

acarreta a contaminação do meio ao seu redor, o que torna o ambiente hospitalar um dos mais

importantes reservatórios e áreas de transmissão de esporos de C. difficile (GERDING, 1995).

Devido à sua maior resistência a condições adversas, os esporos podem persistir no ambiente

hospitalar por períodos muito mais longos do que sua forma vegetativa, a qual é sensível a

presença do oxigênio (KRAMER et al., 2006). A transmissão entre os pacientes, através de

superfícies contaminadas, bem como das mãos dos profissionais relacionados ao do cuidado

com a saúde, tem sido apontada como o mais importante mecanismos de aquisição do C.

difficile durante surtos de CDAD (SAMORE et al., 1996).

18

Os esporos de C. difficile são conhecidamente resistentes a maioria dos

germicidas utilizados na rotina hospitalar, podendo persistir por muitos meses no

ambiente (RUSSEL et al., 1999). Além disso, cepas de C. difficile genotipicamente

distintas, em alguns casos, podem exibir respostas diferentes quando tratadas com o

mesmo desinfetante (WILCOX & FAWLEY, 2000). Com relação a tal evidência,

existem ainda poucos dados sobre a melhor forma de descontaminação do ambiente

hospitalar no que se refere as cepas de C. difficile, especialmente no Brasil. Em nosso

país, existem poucos trabalhos sobre C. difficile, dentre estes, os publicados por nosso

grupo detectaram cepas do patógeno correspondentes à ribotipos nunca antes

documentados, sendo, até o momento, exclusivamente brasileiros (ALCIDES et al.,

2007; BALASSIANO et al., 2009, 2010 e 2011). Tais ribotipos utilizados em nossos

estudos, ainda não haviam sido testados quanto a sua susceptibilidade frente a

desinfetantes hospitalares.

Como a maioria dos casos de infecção por C. difficile ocorrem após a

hospitalização prolongada (WHEELDON et al., 2008), é de grande importância a

determinação de agentes que sejam capazes de eliminar esses esporos de forma eficaz.

Assim sendo, faz-se necessário estudos que tenham por objetivo avaliar a atividade

esporocida de desinfetantes normalmente utilizados nas instituições hospitalares,

determinando sua eficiência contra esporos de C. difficile, de forma a otimizar o

controle da infecção cruzada por este microrganismo

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 HISTÓRICO E EPIDEMIOLOGIA DO Clostridium difficile

C. difficile foi descrito pela primeira vez em 1935, como parte da microbiota intestinal

de recém-nascidos. Embora a forma grave da doença causada pelo microrganismo, a colite

pseudomembranosa (PMC), tenha sido descrita primeiramente em 1893, o C. difficile não foi

identificado como o agente causador da doença humana até 1978 (BARTLETT et al., 1994).

Esta demora se justifica pela dificuldade em se obter um meio seletivo para o microrganismo,

dada as condições críticas de se conseguir seu isolamento em laboratório, sendo desenvolvido

apenas no final da década de 1970 por GEORGE e colaboradores (1979) e denominado

ciclosserina-cefoxitina-frutose-ágar (CCFA, do inglês “cycloserine-cefoxitin-fructose agar”),

possibilitando a associação de C. difficile a processos infecciosos específicos e o

desenvolvimento de estudos relacionadas à epidemiologia das infecções associadas a C.

difficile (CDI).

Atualmente o C. difficile é considerado um patógeno hospitalar emergente e tem sido

freqüentemente associado a surtos nosocomais. Diversas metodologias de tipagem molecular

têm sido empregadas na caracterização das cepas de C. difficile, em especial naquelas

potencialmente envolvidas em surtos nosocomiais. Nos últimos anos, foi detectada uma cepa

hipervirulenta de C. difficile denominada BI/NAP1/027. Esta terminologia reflete as

diferentes técnicas que foram utilizadas em sua caracterização: classe BI, de acordo com a

análise de fragmentos de restrição (REA, do inglês “restriction endonuclease analysis”);

NAP1 (do inglês, “North American Pulsotype 1”), com base no perfil obtido na eletroforese

20

de campo pulsado (PFGE, do inglês “pulsed-field gel electrophoresis”); e ribotipo 027,

quando foi utilizada a técnica de ribotipagem (O’CONNOR et al., 2009).

Vários surtos relacionados a esta cepa foram relatados na América do Norte e Europa

(GOORHUIS et al., 2007). Os primeiros surtos de infecção foram observados no Canadá, e a

província de Quebec foi a primeira e mais gravemente afetada (PEPIN et al., 2004). Nos

Estados Unidos, os casos de infecção pelo patógeno em questão têm sido relatados em pelo

menos 38 estados e há uma estimativa que cerca de 15.000 à 20.000 pacientes morrem de

doença relacionada ao C. difficile no país a cada ano (RUPNIK et al., 2009). Em 2007, a cepa

BI/NAP/027 foi detectada em 11 países europeus (KUIJPER et al., 2007). Além destes, países

da Ásia, América Latina e a Austrália também já relataram a presença do C. difficile (KATO

et al., 2007; RILEY et al., 2009; QUESADA-GÓMEZ et al., 2010).

O crescimento da taxa de CDAD foi largamente atribuído à presença da cepa

BI/NAP1/027, mas não está limitado à disseminação apenas desta. Dependendo do país,

outras cepas (por exemplo, ribotipos 001, 053, 078 e 106) podem ser muitas vezes associadas

a surtos e a casos graves da doença (BORGMANN et al., 2008). Além disso, devido à falta de

programas de vigilância nacional com relação a surtos pelo patógeno, em muitos países, como

é o caso do Brasil, atualmente é difícil estimar com exatidão a incidência do C. difficile no

mundo (KUIJPER et al., 2008). Agrega-se ainda, a importância da padronização das

metodologias empregadas na tipagem das cepas encontradas, para que possa haver um

intercâmbio eficaz de informação entre os laboratórios de diferentes países e instituições.

No Brasil, ainda são raros os relatos da presença do C. difficile nos hospitais, e da

dispersão de tipos clonais específicos do patógeno (ALCIDES et al., 2007; SOUZA-DIAS et

al., 2010). A detecção de bactérias anaeróbias não é um procedimento de rotina em

laboratórios clínicos brasileiros, principalmente devido à carência de tecnologias e infra-

estrutura para seu cultivo, favorecendo assim a sub-notificação de CDAD (BALASSIANO et

al., 2009). Além disso, existem poucos grupos de pesquisa dedicados ao estudo de

microrganismos anaeróbios no país. Nos últimos anos porém, BALASSIANO e colaboradores

(2009, 2010 e 2011) observaram a incidência de CDAD e a dispersão de tipos clonais de C.

difficile entre hospitais da cidade do Rio de Janeiro. Em seu trabalho de 2009, a autora relatou

a propagação do patógeno no Instituto de Pesquisa Evandro Chagas (IPEC, Fiocruz), com três

tipos geneticamente relacionados, envolvidos em casos de CDAD. Já em seu trabalho de

2010, no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF-UFRJ), foi demonstrada a

21

prevalência do ribotipo 133, exclusivamente brasileiro e já encontrado há 11 anos por

ALCIDES e colaboradores (2007). Em outro trabalho de BALASSIANO e colaboradores

(2011), foi verificado numa unidade de terapia intensiva (UTI) de um hospital terciário

privado do Rio de Janeiro a presença do ribotipo 135, também exclusivamente brasileiro,

além de outros. Em nenhuma das unidades hospitalares brasileiras estudadas foi encontrada a

cepa hipervirulenta BI/NAP1/027, embora boa parte das cepas isoladas sejam produtoras de

toxinas e potencialmente responsáveis pela CDAD, além de resistentes à fluoroquinolonas. O

Brasil ainda carece consideravelmente de dados epidemiológicos com relação ao C. difficile.

2.2 C. difficile: CARACTERÍSTICAS E FATORES DE VIRULÊNCIA

C. difficile é um bacilo Gram-positivo, anaeróbio estrito, móvel e formador de esporos

(MADIGAN et al., 2000). É capaz de liquefazer a gelatina, mas não outras proteínas, como as

do leite e da carne. Não produz lecitinase, tampouco lipase. É fermentador de glicose, frutose,

manitol e manose (FERREIRA et al., 2003).

Quando um indivíduo susceptível faz uso de antimicrobianos, ocorre uma perturbação

da microbiota anfibiôntica (BORRIELLO et al., 1984), resultando em um favorecimento para

a colonização do organismo pelo C. difficile. Tal colonização ocorre inicialmente através das

proteínas de superfície (CALABI et al., 2002). A seguir, os enterócitos são danificados

devido a ação das toxinas do C. difficile, resultando em mudanças no citoesquelo, liberação de

fluidos e produtos inflamatórios (RUPNIK at al., 2003). A patogênese da CDAD é ilustrada

na Figura 1.

Alguns dos principais fatores de virulência do C. difficile incluem:

- Proteínas de superfície: essas proteínas são importantes na aderência do microrganismo à

mucosa intestinal, podendo induzir a resposta inflamatória e a produção de anticorpos no

hospedeiro (AUSIELLO et al., 2006). Foi demonstrado que a proteína de camada superficial

A, SlpA (do inglês “surface layer proteins”), desempenha um papel importante tanto na

colonização inicial do intestino pelo patógeno, quanto na reação inflamatória subseqüente,

sendo a principal proteína de superfície apresentada pelo C. difficile (CALABI et al., 2002).

- Toxinas: o principal fator de virulência associado ao C. difficile são duas potentes toxinas –

toxina A, ou TcdA e toxina B, ou TcdB. Ambas são citotóxicas, causando o rompimento das

22

junções comunicantes e a desestruturação do citoesqueleto de actina, resultando em uma

diminuição da resistência transepitelial, acúmulo de fluido e destruição do epitélio intestinal

(KELLY et al., 1994; THELESTAM & CHAVES-OLARTE, 2000). Tais toxinas também

causam a liberação de vários mediadores inflamatórios das células do epitélio intestinal,

mastócitos e macrófagos (LINEVSKY et al., 1997). Estas toxinas afetam os nervos entéricos

e neurônios sensoriais, promovendo um influxo de células inflamatórias, o que agrava a

secreção de fluido, a inflamação intestinal e a transmigração de neutrófilos (POTHOULAKIS

et al., 2000). Estas toxinas possuem tropismo diferente pela membrana celular do hospedeiro,

sendo que a TcdA se liga mais efetivamente ao sítio apical das células do hospedeiro, e a

TcdB se liga a um receptor ainda desconhecido sobre o sítio basolateral dessas células

(THELESTAM et al., 2000).

23

Figura 1: Patogênese da diarréia associada ao C. difficile (CDAD). As células vegetativas de

C. difficile produzem as toxinas A e B e enzimas hidrolíticas (1). A liberação local das toxinas

A e B leva a produção de fator α de necrose tumoral e interleucinas pró-inflamatórias,

aumentando a permeabilidade vascular, o recrutamento de neutrófilos e monócitos (2),

rompendo as junções celulares epiteliais (3) e gerando a apoptose da célula (4). A produção

local de enzimas hidrolíticas leva à degradação do tecido conjuntivo, o que culmina com a

colite, formação de pseudomembranas (5) e diarréia aquosa (adaptada de POUTANEN SM &

SIMOR AE, 2004).

24

É interessante salientar que os genes que codificam a TcdA e a TcdB (o tcdA e o tcdB,

respectivamente) localizam-se em um “locus de patogenicidade” (Figura 2), denominado de

PaLoc (19,6 Kb) (do inglês “pathogenicity locus”), o qual está presente na mesma região do

cromossoma de todas cepas patogênicas de C. difficile. A produção das toxinas A e B depende

das cepas e dos fatores ambientais, tais como a oferta de nutrientes (por exemplo, glicose,

aminoácidos e biotina), temperatura e a presença de concentrações sub-inibitórias de

antibióticos (DUPUY et al., 2008; SAXTON et al., 2009). Os genes tcdR e tcdC, também são

responsáveis pela regulação da expressão dos genes das toxinas A e B, sendo que o primeiro

codifica um regulador positivo (MANI & DUPUI, 2001), e o segundo um regulador negativo

(MATAMOUROS et al., 2007). Ambos estão compreendidos no PaLoc, além do gene tcdE,

que codifica uma proteína que facilita a liberação de TcdA e TcdB da célula bacteriana.

Existem ainda alguns reguladores fora da região de PaLoc, como o CodY (DINEEN et al.,

2007).

Figura 2: Ilustração do locus de patogenicidade (PaLoc) das cepas de C. difficile.

Além das toxinas TcdA e TcdB, algumas cepas de C. difficile, como a BI/NAP1/027,

podem produzir a toxina binária, CDT, (SPIGAGLIA et al., 2002). Seu papel na patogênese

do C. difficile ainda não está bem esclarecido (BARBUT et al., 2005; MCELLISTREM et al.,

2005). A CDT é composta por duas proteínas, CdtA e CdtB, as quais são codificadas pelos

genes cdtA e cdtB, respectivamente (STUBBS et al., 2000). Estes genes não se encontram em

PaLoc, e sim num “locus” específico no cromossoma, denominado CdtLoc, que também

contém o gene regulador cdtR (CARTER et al., 2007).

- Produção de esporos: C. difficile tem a capacidade de produzir esporos. Estes são

altamente resistentes à dessecação, a temperaturas extremas e a muitos desinfetantes

normalmente utilizados na rotina hospitalar. Devido a estas características de resistência,

podem sobreviver no meio ambiente por um longo período de tempo (SAMORE et al., 1996;

VERITY et al., 2001). Deste modo, são facilmente transferidos de pessoa para pessoa no

meio hospitalar (VONBERG et al., 2008). Observou-se que algumas cepas epidêmicas de C.

25

difficile possuem capacidade maior de esporulação in vitro que outras cepas não relacionadas

à surtos (FAWLEY et al., 2007). A estrutura dos esporos do C. difficile pode ser observada na

Figura 3.

Figura 3: Estrutura dos esporos de C. difficile (A e B), após sete dias de incubação em um

meio sólido, observados através de microscopia confocal. Em B, características estruturais

básicas encontradas em um endosporo maduro: CR, núcleo; GCW, parede celular

germinativa; CX, córtex; CT, revestimento (adaptada de PERMPOONPATTAMA et al.,

2011).

2.3 ANTIBIÓTICOS E A INFECÇÃO PELO C. difficile

É sabido que os antibióticos são amplamente utilizados no cenário hospitalar.

Aproximadamente 25% a 40% dos pacientes hospitalizados utilizam este medicamento no

decorrer de sua internação (FISHMAN et al., 2006). No entanto, o uso clínico de

antimicrobianos pode gerar consequências individuais, onerando o tratamento,

potencializando as reações adversas ou falhas terapêuticas; e coletivas, podendo levar à

seleção e a disseminação de cepas resistentes (MAGALHÃES & CARVALHO, 2003).

A infecção por C. difficile ocorre quando a microbiota intestinal sofre uma supressão,

acarretada principalmente pelo uso de antibióticos (RUPNIK et al., 2009) (Figura 4).

Indivíduos saudáveis, dotados de microbiota intestinal íntegra, geralmente são resistentes à

26

colonização pelo patógeno (POUTANEN & SIMOR, 2004). A diarréia é um efeito colateral

comum na administração de antibióticos, sendo o C. difficile responsável pela maioria – cerca

de 15 à 30% dos casos graves de diarréia associada ao uso do medicamento (MUTO et al.,

2005) –, incluindo o desenvolvimento da colite pseudomembranosa (CPM) (CHANG et al.,

2000) – inflamação do cólon, caracterizada pelo aparecimento de placas esbranquiçadas,

chamadas de pseudomembranas. Os mecanismos pelos quais a administração de antibióticos

leva ao desenvolvimento de CDAD não são totalmente claros. É sabido que o intestino

humano é colonizado por uma comunidade diversificada de microrganismos que realizam

uma simbiose complexa com seu hospedeiro. Tal comunidade pode ser afetada pelo uso de

antibióticos, e então favorecer a colonização pelo C. difficile (CHANG et al., 2000). Tal

hipótese ainda está sendo avaliada, sendo a mais aceita até o momento.

Figura 4 – O efeito dos antibióticos sobre a microbiota intestinal normal e o risco para a

infecção por C. difficile (adaptada de RUPNIK et al., 2009).

A suscetibilidade das cepas de C. difficile aos antibióticos, incluindo cepas

epidêmicas, está mudando. Historicamente, os tipos mais prevalentes em populações humanas

são resistentes a clindamicina (JOHNSON et al., 1999; LABBE et al., 2008). Com o

surgimento e propagação da cepa BI/NAP1/027, a resistência às fluoroquinolonas também foi

documentada (MCDONALD et al., 2005). Embora todas as classes de antimicrobianos

possam, a princípio, estar envolvidas no processo supressão da microbiota intestinal,

propiciando a colonização pelo C. difficile, geralmente os principais indutores são aqueles de

27

amplo espectro, tais como as próprias clindamicina e fluoroquinolonas, além das penicilinas e

cefalosporinas.

Um importante método de controle para surtos anteriores de CDAD foi a restrição do

uso de antimicrobianos, implicados como fatores de risco para doença. Não se sabe

exatamente se uma restrição em grande escala do uso dessas substâncias pode retardar a

propagação geográfica da cepa BI/NAP1/027 (BOYCE et al., 2007).

2.4 ASPECTOS CLÍNICOS E DIAGNÓSTICO PARA CDAD

As manifestações clínicas geradas pela infecção por C. difficile podem variar desde o

estado de portador assintomático, encontrado em bebês e adultos, a colites fulminantes (cerca

de 3% dos pacientes) com megacólon e perfurações do colón (Figura 5) (RUBIN et al., 1995).

Figura 5: Modelo para as várias manifestações clínicas possíveis pela aquisição do C.

difficile (adaptada de RUPNIK et al., 2009).

A CDAD normalmente ocorre de quatro a nove dias após o início da terapia

antimicrobiana. Aparentemente, cerca de 25% dos pacientes que fazem a retirada do

antimicrobiano em uso, regridem a CDAD de forma espontânea (FERREIRA et al., 2003).

A suspeita para infecção por C. difficile se dá por sintomas de diarréia aquosa

explosiva, de cor esverdeada, com odor fétido ou sanguinolenta, acompanhada de cólicas

28

abdominais, mas não é suficientemente acurada para definir um diagnóstico (BARTLETT et

al., 2008), embora possa ser importante para definir um possível isolamento do paciente,

especialmente em hospitais cujo o diagnóstico laboratorial rápido não se encontra disponível

(JOHANSEN et al., 2002; WILCOX, 2007). Ocasionalmente, os pacientes podem

experimentar sangramento oculto no cólon. Outras manifestações comuns incluem febre alta,

náuseas, anorexia, mal-estar, desidratação e delírio (VAISHNAVI, 2010).

O diagnóstico precoce é fundamental para prevenir complicações da CDAD e a sua

transmissão. Vários “kits” comerciais para detecção de toxina nas fezes (imunoensaios

enzimáticos e ensaios de membrana) estão disponíveis. São de rápida realização e de alta

especificidade, embora apresentem uma sensibilidade questionável (RUSSMANN et al.,

2007). Porém, alguns “kits” que detectam apenas a TcdA, não são adequados para a rotina de

diagnóstico microbiológico para a infecção por C. difficile, uma vez que eles não detectam

cepas patogênicas que são negativas para TcdA (TcdA-/TcdB

+) (DEPITRE et al., 1993;

COHEN et al., 1998).

2.5 FATORES DE RISCO PARA CDAD

O uso de antibióticos é apontado como o mais importante fator de risco para CDI

entre todos existentes (RUPNIK et al., 2009). Embora os antimicrobianos mais

frequentemente implicados na pré-disposição à infecção pelo C. difficile sejam as

fluoroquinolonas, clindamicina, cefalosporinas e penicilinas, todos antibióticos, incluindo o

metronidazol e a vancomicina, podem predispor o paciente ao C. difficile (JOHNSON et al.,

1999; GAYNES et al, 2004; LOO et al., 2005; MUTO et al., 2005; PEPIN et al., 2005;

HOOKMAN et al., 2009). O risco para CDAD, em pacientes hospitalizados que recebem

antibióticos, pode ser agravado por doenças co-existentes, que necessitam de tratamento com

agentes redutores da acidez estomacal, tais como bloqueadores H2 e inibidores da bomba de

prótons (YEARSLEY et al., 2006; CADLE et al., 2007; JUMP et al., 2007). A terapia com

inibidores da bomba de prótons também está associada com um risco aumentado de colite em

infecções recorrentes com C. difficile. Os pacientes que recebem estes medicamentos podem

ter 4,17 vezes mais chances do retorno da infecção do que aqueles que não o fizeram, segundo

o estudo de CADLE e colaboradores (2007). DIAL e colaboradores (2005) observaram uma

elevada taxa de CDAD entre doentes em uso de anti-inflamatórios não esteroidais.

29

ELIXHAUSER e colaboradores (2008) apontaram que um dos desafios para um

diagnóstico preciso da CDAD é que comumente pacientes que adquirem C. difficile possuem

várias co-morbidades. Neste estudo, foi identificado que alguns pacientes hospitalizados com

CDAD tinham mais de 10 co-morbidades diagnosticadas, contra 6 daqueles negativos para

CDAD. As infecções mais encontradas junto à CDAD são: septicemia, pneumonia, infecção

do trato urinário e infecção de pele, onde o uso de antibióticos seria difícil de evitar.

Muitos pacientes pós-transplantados encontram-se em uso de medicamentos

imunosupressores, o que constitui um risco adicional para a aquisição do C. difficile.

ZIRING e colaboradores (2004) observaram uma incidência de 5,5% de casos de colite por C.

difficile em 702 receptores de transplante de rim e pâncreas. Além disso, uma incidência de 12

à 13% de doença causada por C. difficile foi relatada por CHAKRABARTI e colaboradores

(2000), em pacientes transplantados de medula óssea, no qual a magnitude da

imunossupressão é maior e a profilaxia antimicrobiana é padrão. Infelizmente a incidência de

infecção por C. difficile também tem aumentado entre os pacientes pós-cirúrgicos, sendo

mais prevalente após operações de emergência e entre pacientes submetidos à secção

intestinal (ZEREY et al., 2007). A incidência e as taxas de mortalidade altas em indivíduos

idosos também estão associados ao sistema imune, uma vez que estes pacientes não possuem

uma resposta imunológica de IgG anti-TcdA satisfatória quando expostos às toxinas do

patógeno pela primeira vez. Esta carência de resposta imune também tem sido associada com

uma maior taxa de recorrência da doença (KYNE et al., 2000 e 2001). A infecção pelo C.

difficile tem sido bem documentada quando nenhum antibiótico é dado em pacientes

recebendo quimioterapia contra câncer (TASLIM, 2009). É importante salientar que a

maioria destes pacientes se mantêm hospitalizados por um longo período, de modo que muito

provavelmente adquiriram este patógeno do ambiente hospitalar. A hospitalização, por si só,

constitui fator de risco para CDAD, porque reúne vários riscos para a infecção, incluindo a

exposição à antibióticos, ambiente fortemente contaminado por esporos, uma possível

higienização inadequada das mãos pelos profissionais de saúde, além de uma população

altamente suscetível de pacientes idosos e imunodeprimidos (RUPNIK et al., 2009).

2.6 TRATAMENTO E PERSPECTIVAS PARA CDAD

Ao iniciar o tratamento para CDAD a primeira medida a ser adotada, se possível, é a

retirada do antimicrobiano, que provavelmente alterou a microbiota intestinal propiciando a

30

instalação do C. difficile. Em um estudo, 41% dos pacientes que permaneceram em uso de

antibióticos durante o tratamento da CDAD com metronidazol, não obtiveram sucesso em tal

tratamento quando comparados com aqueles em que o antibiótico foi suspenso (MODENA et

al., 2006). A terapêutica deve ser realizada oralmente, se possível, e continuada por pelo

menos 10 dias. Para condições tais como megacólon e íleo tóxico, rotas alternativas, como a

administração de vancomicina por via enteral através de uma sonda nasogástrica e/ou

diretamente no cólon como um enema, poderão ser utilizadas (PASIC, 1993;

APISARNTHANARAK et al., 2002). Finalmente, a remoção cirúrgica do cólon pode ser uma

alternativa para melhorar a sobrevida de pacientes com CDAC fulminante (AAS et al., 2003;

DOBSON et al., 2003; LAMONTAGNE et al., 2007).

Os dois principais agentes utilizados no tratamento da CDAD são o metronidazol e a

vancomicia, através da via oral (SILVA et al., 1981; ZAR et al., 2007). Ensaios clínicos

randomizados demonstraram taxas de resposta equivalente a mais de 90% com uma ou outra

droga (TEASLEY et al., 1983; WENISCH et al., 1996). Como o custo para o tratamento com

metronidazol é consideravelmente menor do que com a vancomicina oral e, possivelmente,

menos provável de promover a seleção de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina, é

recomendado o metronidazol como tratamento de primeira linha para CDAD (GERDING et

al., 1995). No entanto, preocupações sobre recentes falhas no tratamento com o metronidazol,

particularmente em casos de doença grave, vêm sendo levantadas (MUSHER et al, 2005;

PEPIN et al., 2005). Em um ensaio randomizado duplo-cego, avaliando o uso de

metronidazol versus vancomicina para CDAD, foram encontradas taxas de cura equivalentes

para CDAD leve (98% e 90% para vancomicina e metronidazol, respectivamente). Contudo,

para doença grave, a taxa de cura foi significativamente mais elevada para vancomicina

(97%) do que para o metronidazol (76%) (ZAR et al., 2007). Em um estudo recente,

comparando a eficácia da toxina aglutinante “tolevamer” à vancomicina ou metronidazol para

CDAD, revelou que a vancomicina mostrou-se superior ao metronidazol para doença grave,

com uma taxa de sucesso clínico de 85% para a vancomicina, contra 65% para o metronidazol

(LOUIE et al., 2007). Sendo assim, a vancomicina pode ser preferida como tratamento inicial

para pacientes com fatores de risco associados e/ou complicações associadas a CDI, tais como

internação em unidade de terapia intensiva, baixo nível de albumina, febre, leucocitose,

diarréia profusa e elevação da creatinina (FERNANDEZ et al., 2004; PEPIN, 2008;).

Um dos mais difíceis desafios para o tratamento da infecção por C. difficile é a gestão

das recorrências múltiplas. Entre 15% a 35% dos pacientes com um primeiro episódio de

31

CDAD, têm recaídas dentro de dois meses (BARBUT et al., 2008). Uma primeira recorrência

coloca os pacientes em alto risco de recorrências subseqüentes (MCFARLAND et al., 1999).

Uma resposta imunitária adequada para a TcdA, durante o primeiro episódio da infecção por

C. difficile, fornece proteção contra uma possível recorrência (KYNE et al., 2005). Entre 20%

e 50% das recorrências são causadas por novas cepas de C. difficile, indicando que, na

verdade, houve uma re-infecção ao invés de uma recidiva da infecção original (JOHNSON et

al., 1989; O’NEILL et al., 1991). Além disso, estes números sugerem que muitos casos

podem ser evitados através de uma boa adesão à medidas de controle para conter infecções

hospitalares (BARBUT et al., 2000).

Novos agentes para o tratamento de múltiplas recidivas e infecções fulminantes pelo

C. difficile são amplamente necessários, e várias abordagens estão sob investigação, incluindo

o uso de novos antibióticos – tais como a Nitazoxanida, que já tem uso para outras infecções

gastrointestinais, e foi tão eficaz quanto o metronidazol em um estudo duplo-cego

randomizado em pacientes hospitalizados com CDAD (MUSHER et al., 2006); a Rifaximina,

que é utilizada em combinação com a vancomicina, embora sua monoterapia já tenha

apresentado casos de resistência (JOHNSON et al., 2007); a droga em investigação OPT-80

(Difimicina) apresentou resultados promissores no tratamento de pacientes com CDAD e

baixas taxas de recorrência no ensaio clínico de fase 2; e a Ramoplanina, comparada

favoravelmente à vancomicina para CDAD em um ensaio clínico de fase 2 (PULLMAN et

al., 2004)

2.7 MEDIDAS DE CONTROLE E PREVENÇÃO DAS INFECÇÕES POR C. difficile

As medidas de controle para prevenir a CDI em hospitais são de dois principais tipos:

aquelas que visam prevenir que os esporos do patógeno atinjam o paciente, e aquelas que

reduzem o risco de infecção se o paciente ingerir o microrganismo. A transmissão do C.

difficile em hospitais tem sido observada através da aglomeração de casos, em um mesmo

período e local, por cepas idênticas, além da aquisição promovida pela proximidade entre

pacientes contaminados e sadios (MCFARLAND et al., 1989; CHANG & NELSON, 2000).

Com freqüência é relatada a contaminação das mãos dos profissionais da saúde e do ambiente

hospitalar com esporos de C. difficile (DUBBERKE et al., 2007). Pacientes com CDAD

devem ser colocados em precaução de contato, alojados em quartos individuais com banheiro

privativo ou, se não for possível, ao menos em quartos em que os outros pacientes também

32

sejam CDAD positivos (SIEGEL et al., 2007). Deveriam ser utilizados utensílios

descartáveis, ou equipamentos não críticos dedicados ao paciente. O uso de luvas e jalecos

pelos profissionais da saúde é uma medida de controle que tem sido comprovada na redução

da propagação do C. difficile em hospitais. Estes devem ser colocados antes de se entrar no

quarto de um paciente com CDAD e removido logo na saída, seguido por higienização das

mãos (JOHNSONS et al., 1990).

A restrição ao uso de antimicrobianos é outro potencial mecanismo de controle e

prevenção para a infecção pelo C. difficile. No estudo de VALIQUETTE e colaboradores

(2007), as taxas de infecção pelo C. difficile diminuíram substancialmente em associação com

a restrição do uso de cefalosporinas de primeira (21%), segunda (93%), e terceira geração

(79%), clindamicina (87%), macrolídeos (78%) e ciprofloxacino (29%). Assim sendo,

minimizar o uso inadequado de antibióticos parece ser considerado um elemento importante

para o controle da CDAD.

2.8 OS DESINFETANTES HOSPITALARES E O C. difficile

Os desinfetantes são normalmente classificados segundo o nível de ação, que é

caracterizado como a capacidade de destruir os microrganismos, incluindo: desinfecção de

alto, intermediário e baixo nível (SPAULDING et al., 1977). A desinfecção de alto nível é

caracterizada pela ação dos desinfetantes sobre formas vegetativas, esporos bacterianos

(normalmente os mais resistentes), fungos e vírus envelopados ou não. Quanto à desinfecção

de nível intermediário, engloba atividade tuberculocida, bactericida, fungicida e virucida,

porém não esporocida. A desinfecção de baixo nível, por sua vez, apresenta atividade sobre

formas vegetativas da maioria das bactérias, além de fungos e vírus não envelopados

(FAVERO & BOND, 1991; MCDONNELL, 2007).

Os agentes utilizados no controle do crescimento microbiano são divididos,

principalmente, em desinfetantes e anti-sépticos. O primeiro é utilizado em superfícies

inanimadas, uma vez que são bastante tóxicos, enquanto o segundo se caracteriza pela

utilização em tecidos vivos, pois não exercem toxicidade sobre estes.

A presença de matéria orgânica pode, em alguns casos, alterar ou mesmo inativar a

atividade de determinados desinfetantes. A interferência na ação do agente pode acontecer,

principalmente, por meio de reação química, gerando complexo com capacidade germicida

diminuída, ou até nula. Casos como esse ocorrem, por exemplo, com desinfetantes a base de

33

cloro e iodo. Além de propiciar a reação de formação do complexo, a matéria orgânica

também pode agir como uma barreira protetora dos microrganismos, impedindo fisicamente o

ataque dos desinfetantes. A matéria orgânica pode ser encontrada na forma de soro, sangue,

pus ou material fecal (LEWIS & ARENS, 1995; MUSCARELLA, 1995).

Fatores como a falta de atividade antimicrobiana intrínseca do desinfetante, escolha

equivocada do agente de desinfecção, presença de patógenos resistentes, realização de uma

diluição incorreta do desinfetante, duração inadequada da desinfecção, contato físico

ineficiente entre o desinfetante e os microrganismos, ou mesmo o uso de um agente de

desinfecção contaminado, podem resultar em uma desinfecção inadequada de dispositivos

médicos ou superfícies, aumentando a propensão de infecções hospitalares (RUTALA &

COLE, 1984).

Os processos de desinfecção e esterilização, assim como outras técnicas assépticas,

constituem procedimentos importantes para o controle e prevenção das infecções hospitalares.

Logo, é necessária a avaliação criteriosa da atividade antimicrobiana dos produtos utilizados,

a fim comprovar sua eficiência para a realidade a que se destina, e assegurar a não veiculação

de microrganismos através desses produtos (DUARTE et al., 2009).

De acordo com o Centers for Disease Control and Prevention (CDC), em seu Guia

para Desinfecção e Esterilização em Instalações de Cuidado a Saúde (RUTALA & WEBER,

2008), os desinfetantes são produzidos em fórmula única ou em combinação, como é o caso

de alguns produtos a base de ácido peracético, que trazem em sua composição o peróxido de

hidrogênio em associação. Em muitas situações, um determinado produto é projetado para

uma finalidade específica e deve então ser utilizado da maneira correta e especificada pelo

fabricante. Assim, os usuários devem ler atentamente os rótulos para garantir a seleção do

produto correto para o uso pretendido, além de aplicá-lo de modo eficiente.

O ambiente hospitalar é considerado um dos mais importantes reservatórios e área de

transmissão para os esporos de C. difficile (KAATZ et al., 1988; MCFARLAND et al., 1990;

SAMORE et al., 1996; WHEELDON et al., 2008). O aumento da incidência para CDI e a

morbidade, mortalidade e custos assistenciais associados a esta, têm criado a clara

necessidade de métodos de desinfecção ambiental efetivos e aplicáveis à rotina hospitalar

(WILCOX et al., 2010). Diversos autores defendem que a redução da carga de esporos de C.

difficile em ambientes hospitalares, através de métodos melhorados de limpeza, podem

reduzir a ocorrência de CDI nosocomiais (KAATZ et al., 1988; MAYFIELD et al., 2000;

WILCOX & FAWLEY, 2003; MCMULLEN et al., 2007; DUMFORD et al., 2009).

34

Pacientes infectados com o C. difficile excretam uma grande quantidade de células

vegetativas, bem como esporos em suas fezes (WILCOX, 2003). Episódios freqüentes de

diarréia, típico na CDAD, aumentam o risco de contaminação ambiental com o C. difficile, a

qual pode estar ligado ao número de pacientes portadores de CDAD (PEREZ et al., 2005) e

ao tempo de internação (POUTANEN & SIMOR, 2004). Os estudos de MCFARLAND e

colaboradores (1989) confirmam estes dados, relatando que os quartos dos pacientes com

infecção pelo C. difficile e diarréia ativa, têm as maiores taxas de contaminação (acima de

50%), seguido pelos quartos dos pacientes que são colonizados pela bactéria, mas não têm

diarréia (cerca de 25%), e os quartos de pacientes que não estão colonizados pelo patógeno

(menos de 10%).

Os esporos podem permanecer viáveis por muitos meses sobre as superfícies

contaminadas (VERITY et al., 2001) e freqüentemente ser recuperados de amostras

ambientais (HOTA B, 2004). Tal contaminação ambiental tem sido apontada na propagação

da CDAD (GERDING et al., 1995; VERETY et al., 2001; POUTANEN & SIMOR, 2004),

quer diretamente, quer através das mãos dos profissionais de saúde.

Os esporos de C. difficile também são resistentes aos agentes de desinfecção

comumente utilizados na limpeza de superfícies hospitalares, tais como detergentes

tradicionais, alcoóis e agentes de limpeza baseados em quaternário de amônio, mesmo nas

concentrações indicadas para o uso (OMIDBAKHSH, 2010). Assim sendo, sua eliminação

dos quartos e banheiros de pacientes com CDAD requer a seleção e uso de agentes com

atividade esporocida (PEREZ et al., 2005).

Embora ainda haja grande divergência quanto à concentração e tempo requeridos para

resultados de desinfecção satisfatórios, estudos recentes apontam que soluções liberadoras de

cloro ativo, tais como hipoclorito de sódio, possuem atividade significativa na redução da

contaminação das superfícies com esporos de C. difficile, e assim, contribuem para a queda

nas taxas de infecção hospitalar pelo patógeno (MAYFIELD et al., 2000; WILCOX et al.,

2003).

2.8.1 Algumas características dos desinfetantes avaliados no estudo:

VIRKON® (monopersulfato de potássio, BBraun): possui a fórmula molecular

K2SO4.KHSO4.2KHSO5. Trata-se de um peroxigênio, sendo um agente oxidante. É

considerado um desinfetante hospitalar de amplo espectro, e indicado para a manutenção

35

de ambientes higiênicos reduzindo significativamente a transmissão de microrganismos

patogênicos através do contato com a superfície de equipamentos. Não é inativado pela

presença de matéria orgânica. Seu mecanismo de ação é explicado pela oxidação das

ligações de enxofre das proteínas e enzimas do microrganismo alvo, provocando uma

ruptura no funcionamento da membrana das células, e conseqüente rompimento da parede

celular. Constitui-se de um pó para preparo com água, tendo a solução final uma coloração

rosa que pode permanecer ativa por até sete dias, sendo assim um agente estável. Possui

um bom perfil de segurança, sendo não tóxico e não irritante, além de biodegradável.

Segundo o fabricante, proporciona a desinfecção rápida e de alto nível de superfícies

contaminadas por vírus transmitidos pelo sangue, como Hepatite, HIV, Norovírus,

Coronavírus, bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (E. coli e Estafilococos – cepas

MRSA), além fungos (B BRAUN, 2011). Os dados na literatura sobre a atividade deste

desinfetante frente os esporos de C. difficile são bastante recentes e, segundo as pesquisas

de DAWSON e colaboradores (2011), há uma diferença de suscetibilidade ao agente

dependendo do ribotipo da cepa testada.

CLORO-RIO® (hipoclorito de sódio, Rioquímica): possui a fórmula química molecular

NaOCl. É considerado o desinfetante mais amplamente utilizado, possuindo baixo custo,

ação rápida, não deixando resíduos tóxicos, além de não ser afetado pela dureza da água

(RUTALA & WEBER, 1997). Possui amplo espectro de atividade antimicrobiana,

inclusive promovendo a remoção de biofilmes de superfícies (MERRITT et al., 2000).

Algumas de suas desvantagens incluem sua alta instabilidade, sua inativação na presença

de matéria orgânica, sua ação corrosiva em concentrações altas (> 500 ppm),

principalmente de metais e tecidos, além de poderem liberar gases tóxicos de cloro

quando misturados com amônia ou ácido (GAPANY-GAPANAVICIUS et al., 1982;

MRVOS et al., 1993). O mecanismo exato pelo qual o cloro livre destrói os

microrganismos ainda não foi elucidado. A inativação pelo cloro pode resultar de uma

série de fatores, tais como: oxidação de enzimas sulfidril e aminoácidos, perda de

conteúdo intracelular, absorção diminuída de nutrientes, inibição da síntese protéica,

diminuição do consumo de oxigênio, oxidação dos componentes respiratórios e quebras

no DNA (DYCHDALA, 2001; GERBA & RUSIN, 2001). O uso de hipoclorito de sódio é

recomendado pelo CDC durante surtos de CDI (CDC, 2005).

36

RIOHEX® (digluconato de clorexidina, Rioquímica): possui a fórmula química

molecular C22H30Cl2N10. Caracteriza-se por ser um detergente catiônico, da classe das

bis-biguanidas, e ainda um anti-séptico químico com ação sobre bactérias Gram-

positivas, Gram-negativas, fungos, leveduras e vírus lipofílicos (TORTORA et al.,

2000). Como digluconato, é um antimicrobiano de características desinfetantes e

sanitizantes. Eficaz contra Salmonella spp., Listeria spp., Clostridium spp., E. coli,

Staphylococcus spp. e Pseudomonas spp. O seu mecanismo de ação é explicado pela

atração da molécula catiônica da clorexidina pela carga negativa da superfície

bacteriana, sendo adsorvida à membrana celular por interações eletrostáticas. Desse

modo, quando em concentrações mais elevadas, ela acaba por acarretar a precipitação

e coagulação das proteínas citoplasmáticas e morte bacteriana e, quando numa

concentração mais baixa, a integridade da membrana celular é alterada, resultando em

extravasamento dos componentes bacterianos de baixo peso molecular (LAWRENCE,

1960; HUGO & LONGWORTH, 1964; DAVES & HULL, 1973). A clorexidina não é

tóxica aos tecidos (a absorção pela mucosa e pele é mínima), não causa resistência

microbiana, não é volátil (característica que garante sua estabilidade) é não é poluente

(DAVIES & HULL, 1973). Segundo o fabricante, é indicada na assepsia pré-

operatória, assepsia do campo operatório, em instrumentos cirúrgicos, além do uso na

lavagem das mãos pelos profissionais de saúde. GERDING e colaboradores (2008)

relataram sua mais pronunciada atividade, com relação ao sabão neutro, na remoção

de esporos de C. difficile das mãos dos profissionais da saúde. A solução é ainda

apontada como bem mais efetiva que o álcool gel na desinfecção das mãos

(LEISCHNER et al., 2005).

CIDEX OPA® (orto-ftalaldeído, Johnson & Johnson): possui a fórmula química

molecular C5H8O2. Trata-se de um desinfetante de alto nível, apresentando

propriedades micobactericida, bactericida, fungicida e virucida. Tem sido indicado por

diversos autores como um possível substituto para o glutaraldeído, principalmente no

que se refere à desinfecção de endoscópios (WALSH et al., 1999; AKAMATSU et al.,

2005;). Suas vantagens com relação ao desinfetante incluem: excelente estabilidade

em ampla faixa de pH (3 a 9), não é irritante para os olhos e vias aéreas, não requer

vigilância da exposição, possui odor quase imperceptível e não exige ativação. Ele

contém 0,55% de 1,2-benzenodicarboxaldeído (OPA). O mecanismo de ação do

37

agente envolve sua capacidade de reagir fortemente com as aminas primárias e

estabilizar, razoavelmente, a membrana externa e paredes celulares de organismos

vegetativos. Esta característica provavelmente é responsável por parte, mas não

necessariamente por toda, sua ação letal (WALSH et al., 1999). OPA parece eliminar

esporos bacterianos pelo bloqueio do processo de germinação. Além disso, é eficaz

contra diversos microrganismos, incluindo micobactérias resistentes ao glutaraldeído

(GREGORY et al., 1999; CABRERA-MARTINEZ et al., 2002). Pode causar a

mancha da pele, roupas e superfícies, embora seja bastante compatível com diversas

superfícies metálicas e plásticas. Trata-se de uma substância consideravelmente

estável, podendo ser fracionada para uso por até 14 dias, e resistente à matéria

orgânica (Johnson & Johnson). Não foram encontrados relatos na literatura sobre a

ação deste desinfetante sobre cepas C. difficile.

PERESAL® (ácido peracético, Profilática): possui a fórmula química molecular

C2H4O3. Este fabricante produz e comercializa o produto combinado com peróxido de

hidrogênio. O ácido peracético (PAA) é o biocida mais potente do grupo dos

peróxidos de hidrogênio. Trata-se de um esterilizante químico líquido e desinfetante

de alto nível, apresentando atividade esporocida, bactericida, tuberculocida, virucida e

fugicida, em concentrações inferiores à 0,35%, em temperatura ambiente. O ácido

peracético é declarado como agente não tóxico, não alergênico e considerado irritante

leve. Possui formulação inibidora de corrosão, desenvolvida para compatibilizar seu

efeito ácido com os artigos da área odonto-médico-hospitalar. WHEELDON e

colaboradores (2008), assim como outros autores (BLOCK, 2004; CARTER &

BARRY, 2011), encontraram resultados que sugerem a atividade esporocida do ácido

peracético sobre determinadas cepas C. difficile.

Como a maioria dos casos de infecção por C. difficile ocorrem após a hospitalização,

vê-se necessária a avaliação e determinação de agentes que sejam capazes de eliminar esses

esporos presentes no ambiente de uma forma eficaz, com o objetivo de otimizar a eficiência

dos procedimentos de desinfecção ambiental e garantir assim a segurança dos pacientes no

que se refere à contaminação e infecção pelo C. difficile.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wheeldon%20LJ%22%5BAuthor%5D

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a eficácia de desinfetantes utilizados no Hospital Universitário Antônio Pedro

(UFF) e no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (UFRJ), na eliminação de células

vegetativas e esporos de ribotipos de C. difficile encontrados exclusivamente do Brasil.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar a concentração mínima inibitória (CMI) dos desinfetantes frequentemente

utilizados na desinfecção dos ambientes dos hospitais citados, para células vegetativas

das cepas de C. difficile selecionadas;

Testar a atividade esporocida dos desinfetantes frente as cepas C. difficile indicadas;

Analisar estatisticamente a ocorrência de diferença no perfil de sensibilidade, de

acordo com os ribotipos, para as cepas C. difficile quando tratadas com o mesmo

desinfetante;

Analisar e comparar o perfil de proteínas totais das células vegetativas das cepas de C.

difficile selecionadas na ausência e na presença de concentrações subinibitórias dos

desinfetantes testados.

4. METODOLOGIA

4.1 CEPAS BACTERIANAS

Foram selecionadas sete cepas de C. difficile para o teste da CMI dos desinfetantes,

sendo elas: uma cepa hiper-virulenta (BI/NAP1/027), uma cepa padrão ATCC 9689, quatro

cepas clínicas do ribotipo exclusivamente brasileiro 133 (HU09-133, HU11-133, HU14-133 e

HU17-133) e uma cepa clínica do ribotipo 135 (SJ1-135), também exclusivamente brasileiro.

Três dessas cepas (BI/NAP1/027, HU17-133 e SJ1-135) foram selecionadas para a atividade

esporocida dos desinfetantes. Quatro cepas (BI/NAP1/027, ATCC 9689, HU17-133 e SJ1-

135) foram incluídas no procedimento de extração e análise de proteínas totais.

Todas as cepas estudas fazem parte da Coleção de Culturas do Laboratório de Biologia

de Anaeróbios, do Departamento de Microbiologia Médica do Instituto de Microbiologia

Profº Paulo de Góes, UFRJ.

40

4.2 DESINFETANTES

Os desinfetantes hospitalares avaliados neste estudo estão descritos na Tabela 1.

Tabela 1: Desinfetantes hospitalares testados frente aos ribotipos de C. difficile encontrados

no Brasil.

Nome

Comercial Virkon® Cloro Rio® Riohex® Cidex

Opa®

Peresal®

Fabricante B Braun Rioquímica Rioquímica Johnson &

Johnson

Profilática

Composição

Original

Monopersulfato

de potássio

Hipoclorito de

sódio

Digluconato

de clorexidina

Orto-

ftalaldeído

Ácido peracético com

peróxido de hidrogênio

Tipo de

biocida

Peroxigênio Agente

liberador de

cloro ativo

Bis-biguanida

catiônica

Aldeído Peroxigênio

Concentração

Original

* 1,2% 2% 0,55% 4% de ácido peracético

e 26% de peróxido de

hidrogênio

Concentração

Testada

1% 1,2% 2% 0,55% 0,5%

Lote 10080013 R1100071 R1100164 200410229 5020AP0001

Data de

Fabricação

Agosto/2010 Janeiro/2011 Janeiro/2011 Abril/2010 Janeiro/2010

Data de

Validade

Agosto/2013 Julho/2011 Janeiro/2014 Abril/2012 Janeiro/2012

Tempo de

Contato

10 minutos 10 minutos 3 minutos 30 minutos 10 minutos

*Trata-se de um pó puro de monopersulfato de potássio.

As diluições necessárias para a utilização dos desinfetantes, segundo as

recomendações do fabricante e da rotina hospitalar, foram realizadas com água estéril

destilada, imediatamente antes dos experimentos. Antes de abrir as embalagens contendo os

desinfetantes, estas foram agitadas e a área ao redor da tampa do recipiente foi higienizada

com etanol 70%. Os agentes de limpeza foram mantidos ao abrigo da luz e à temperatura

entre 25 a 30ºC.

41

4.3 CRESCIMENTO DAS CEPAS E PREPARO DOS ESPOROS

Para promover o crescimento das cepas selecionadas para o estudo, cada uma delas foi

transferida para um tubo contendo 4,0 mL de caldo BHI-PRAS (do inglês “Brain Heart

Infusion – pre-reduced anaerobically and sterilized”) e incubadas em ambiente de

anaerobiose por 24 horas, à temperatura de 37ºC. Alíquotas de 200µL do crescimento de cada

amostra foram então aplicadas em placas de três poços contendo ágar BHI (200µL por poço,

sendo cerca de quatro placas para cada cepa). Em seguida, estas culturas foram incubadas em

anaerobiose, à 37ºC por sete dias, a fim de se obter esporos.

Os esporos foram recuperados através da lavagem de cada poço das placas com 1 mL

de água destilada estéril gelada. A suspensão obtida foi centrifugada à 8000 xg por 15

minutos, sendo concentrada ao máximo possível. O sedimento obtido foi lavado três vezes

com água gelada estéril, centrifugando-se o material da mesma maneira descrita

anteriormente. O sedimento final foi então resuspendido em cerca de 500µL de água estéril, e

estocado à 4 ºC em ambiente de aerobiose, facilitando assim a eliminação de formas

vegetativas das cepas C. difficile. As amostras foram incubadas a 80 ºC por 10 minutos,

também a fim de eliminar as células vegetativas (PEREZ et al., 2005).

A concentração de esporos viáveis foi determinada através de diluições sucessivas, de

10-1

à 10-5

da concentração inicial da suspensão de esporos, espalhando-se 10µL destas

diluições sobre placas de ágar BHI acrescido de 0,25% de sal biliar contendo taurocolato de

sódio, importante na promoção da germinação dos esporos, e mantidas em ambiente de

anaerobiose por 5 dias à 37ºC.

4.3.1 Observação visual dos esporos

A inspeção visual dos esporos obtidos, e a possível presença de células vegetativas, foi

avaliada utilizando-se o método de coloração de Wirtz-Conklin (MURRAY et al., 1999),

seguida de observação em microscópio ótico. Neste método, os esporos são corados em verde

e as células vegetativas em vermelho. Para realizar a coloração fez-se um esfregaço da

suspensão de esporos sobre a lâmina, seguido de aquecimento gentil para fixação do material.

Logo, o esfregaço foi coberto com uma solução de verde de malaquita 5%. A lâmina foi então

aquecida gentilmente até o aparecimento de algumas bolhas e mantida em repouso por cerca

de 3 à 6 minutos. Após este período foi lavada com água corrente. A seguir, foi adicionado o

contra-corante safranina aquosa 0,5%, por 30 segundos. Decorrido este tempo, a lâmina foi

42

novamente rinsada com água corrente. Finalmente, a lâmina foi seca à temperatura ambiente

para posterior exame em microscópio ótico sob aumento de 400-100X (BEATRIZ et al.,

2006).

4.4 TESTE DA ATIVIDADE ESPOROCIDA DOS DESINFETANTES

Os testes realizados para descontaminação de superfície e recuperação de esporos

foram adaptados do método padrão para teste da atividade esporocida de desinfetantes,

preconizado nos Estados Unidos (ASTM E2414-05). A superfície utilizada para alojar os

esporos, a serem submetidos aos desinfetantes, consistiu de suportes (pequenos pedaços de

vidro de 0,5 cm2), previamente lavados com extran, rinsados com água e etanol 70% e, por

fim, esterilizados em autoclave (121ºC por 15 minutos). Os suportes receberam 10µL de uma

suspensão de esporos (em água destilada) contendo aproximadamente entre 4 x 106 a 5 x 10

7

esporos/mL. Estes foram mantidos em temperatura ambiente por cerca de 10 à 20 horas

(“overnight”) para secagem.

O suporte com esporos aderidos foi inserido dentro de um tubo eppendorf (1,5 mL)

rotulado de tubo A. Logo, 400µL do desinfetante testado foi adicionado a este tubo,

certificando-se de que o suporte estivesse totalmente submerso no líquido. Todo experimento

foi realizado em triplicata e à temperatura ambiente. O suporte controle foi submerso em água

estéril destilada, nas mesmas condições dadas ao desinfetante. Os suportes com esporos

aderidos permaneceram submersos pelo tempo indicado pelos fabricantes dos desinfetantes

avaliados. Após este tempo de incubação, acrescentou-se 600µL de caldo LB (Luria-Bertani)

– este caldo gelado tem demonstrado ser um bom neutralizante para várias formulações

desinfetantes (SAGRIPANTI & BONIFACINO, 1996 e 1999) –, acrescido de uma

combinação de 3% de Tween 80 (indicado como inativante específico de várias formulações,

tais como clorexidina em conjunto com a lecitina), 0,3% de lecitina, 0,1% de histidina

(mostrado como inativante específico de aldeídos), 0,5% de tiossulfato de sódio (indicado

como inativante específico de compostos clorados) (PINTO et al., 2003) e 1% de lauril

sulfato de sódio. Esta combinação, aqui denominada de caldo LB composto, foi utilizada

porque se mostrou efetiva na neutralização de qualquer atividade antimicrobiana de uma

variedade de desinfetantes, além de não ter sido tóxica para organismos testados (HOREJSH

& KAMPF, 2010). Assim, o tubo A foi agitado no vortex durante 1 minuto, por 2 vezes. A

seguir, o suporte foi imediatamente transferido (com o auxílio de uma pinça estéril) para um

43

novo microtubo (1,5 mL), rotulado de tubo B, contendo 400µL de água estéril a temperatura

ambiente e levado ao ultrassom por 20 segundos, seguido de agitação no vortex durante 1

minuto, por 2 vezes. O fluido remanescente no tubo A, contendo os esporos retirados do

suporte por incubação com água (controle) ou desinfetante, era considerado como Fração A,

para dados de posteriores cálculos. Após a agitação do Tubo B, foi adicionado 600µL de

caldo LB composto gelado e levado ao vortex rapidamente. Imediatamente, o suporte foi

conduzido (novamente com o auxílio de uma pinça estéril) a um novo microtubo (1,5 mL),

rotulado de Tubo C, contendo 400µL de caldo LB composto à temperatura ambiente.

Semelhante ao que ocorreu com o Tubo A, o fluido remanescente no Tubo B, contendo os

esporos retirados do suporte pela agitação em ultrassom e vortex, foi considerado como

Fração B, para dados de posteriores cálculos. O Tubo C, com o suporte submerso em caldo

LB composto, foi então incubado por 30 minutos à 37ºC em um agitador, seguido de agitação

no vortex 2 vezes por 1 minuto. Semelhante ao que ocorreu com os Tubos A e B, o fluido do

Tubo C, contendo os esporos retirados do suporte pela agitação por 30 minutos e vortex, foi

considerado como Fração C, para dados de posteriores cálculos. Assim sendo, os fluidos

contidos nos Tubos A, B e C, correspondem as frações A, B e C. A Figura 6 ilustra o

procedimento descrito.

Figura 6: Esquema para o teste da atividade esporocida dos desinfetantes (adaptada de ASTM

E2414-5, 2005).

Os esporos sobreviventes de cada fração foram enumerados por diluição em série e

espalhados sobre placas de ágar BHI acrescido de 0,25% de sal biliar contendo taurocolato de

sódio, importante na promoção da germinação dos esporos. As placas receberam 100 µL de

44

cada fração, diluídas conforme a concentração de esporos contida na suspensão inicial, e

foram mantidas em ambiente de anaerobiose por 5 dias à 37ºC. Normalmente estando entre 4

x 104 a 5 x 10

7 esporos/mL, as diluições seguiram da seguinte maneira: Frações A, B e C não

diluídas e diluídas em 1:10. A adequada contagem de Unidades Formadoras de Colônia

(UFC) no controle foi obtida após o plaqueamento de 100µL das Frações A, B e C diluídas

em 1:10 e 1:100.

4.4.1 Cálculo dos Esporos Sobreviventes

A contagem dos esporos viáveis totais, recuperados para cada suporte, foi obtida pela

soma das UFCs obtidas na Fração A, B e C. A redução do Log10 dos esporos viáveis devido à

exposição aos desinfetantes, foi medido pela comparação do número de UFCs obtidas após a

exposição a estes produtos, com as UFCs obtidas no teste controle, onde o desinfetante foi

substituído por água estéril.

4.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÍNIMA INIBITÓRIA (CMI)

Para a preparação das células vegetativas, foi retirada uma alíquota de 200µL de um

crescimento (24 horas/ 37ºC) em caldo BHI-PRAS, sob condições anaeróbias, e inoculada em

caldo Brucella. Este caldo foi incubado durante 6 horas, à 37ºC, em ambiente de anaerobiose,

e o crescimento foi ajustado para a densidade de 0,5 McFarland. As CMI foram determinadas

pelo método de diluição em ágar, seguindo as recomendações do CLSI (do inglês “Clinical

Laboratory Standards Institute”, 2010). Com auxílio de replicador de Steers, as culturas

foram inoculadas sobre as placas de ágar sangue, contendo diferentes concentrações dos

desinfetantes (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 e 1/256 da concentração original) e, ainda,

sem o agente de limpeza, para controle de crescimento. Logo, as placas foram incubadas em

anaerobiose por 48 horas a 37ºC. Fez-se o controle de contaminantes aeróbicos mantendo

uma placa em ambiente de aerobiose por 48 horas à 37ºC. As CMI foram determinadas como

a menor concentração do desinfetante que inibiu o crescimento das cepas.

45

4.6 EXTRAÇÃO E ANÁLISE DAS PROTEÍNAS TOTAIS

4.6.1 Obtenção dos extratos proteicos

As cepas de C. difficile foram cultivadas em ágar sangue suplementado, encubados em

anaerobiose por 48 horas à 37ºC, na ausência e na presença de concentração submínima

inibitória dos desinfetantes testados. Foi realizada então uma raspagem de aproximadamente

10 mg do crescimento bacteriano, com alça bacteriológica, e este suspenso em 100µL de uma

solução de lisozima 3mg/mL. Após uma breve agitação, a massa bacteriana foi levada ao

banho-maria à 37ºC por 2 horas. A dosagem das proteínas obtidas foi realizada através do

método de Bradford.

4.6.2 Dosagem das proteínas totais pelo Método de Bradford (GUERLAVA, 1998)

Inicialmente, gerou-se uma curva padrão de proteínas (absorvância x concentração de

proteínas em µg/mL) através da leitura, em espectrofotômetro, de soluções de albumina em

várias concentrações (0,125; 0,250; 0,500; 0,750; 1,000; 1,500 e 2,000 mg/mL), acrescidas de

125µL da solução reagente de Bradford, utilizando comprimento de onda de 595 nm. A

seguir, 2,5µL de cada solução de proteínas que se desejava dosar, foi acrescida de 125µL do

reagente de Bradford, mantendo-se o contato por 30 minutos à temperatura ambiente, e

medida sua absorvância em espectrofotômetro. Todo experimento foi realizado em duplicata e

em comprimento de onda de 595 nm. Assim, as medidas de absorvância obtidas foram

plotadas no gráfico de curva padrão, através da equação da reta gerada, a fim de se obter a

concentração de proteínas em cada amostra.

4.6.3 Eletroforese

As análises de SDS-PAGE (do inglês “sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis”) foram realizadas segundo LAEMMLI (1970), em géis descontínuos de bis-

acrilamida, utilizando tampão de corrida Tris-glicina (Tris 0,1M, Glicina 1M e SDS 0,5%).

Alíquotas equivalentes a uma quantidade de 15µg de proteína foram adicionadas a 10µL de

tampão de amostra para proteínas (2,5% de Tris-HCl 0,5M, pH 6,8; 4% de SDS 10%; 2% de

glicerol; 1% de azul de bromofenol 1% e 1% de 2-mercaptoetanol) e fervida à 100ºC por 5

minutos. Logo, os extratos protéicos foram aplicados nos reservatórios do gel de

empacotamento, contendo 4% de bis-acrilamida, preparado com tampão Tris-HCl 0,5 M, pH

46

6.8. O gel de separação foi preparado com 12% de bis-acrilamida, em tampão Tris-HCl a 1,5

M, pH 8,8.

Foram realizadas eletroforeses de quatro géis, correspondentes às cepas ATCC 9689,

BI/NAP1/027, HU17-133 e SJ1-135, onde em cada gel foram incluídos: um padrão de peso

molecular de proteínas (220 à 10 kDa; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), para controle da

corrida; amostra de cada cepa não tratada com os desinfetantes (padrão); e amostras da

mesma cepa tratadas com concentrações subinibitórias dos desinfetantes (correspondentes à

50% do valor encontrado para CMI) Virkon®, Cloro Rio®, Riohex®, Cidex Opa® e

Peresal®, a fim de que os perfis de proteínas totais fossem comparados. Além destes, também

realizou-se a eletroforese de um gel contendo as quatro cepas não tratadas com os

desinfetantes, a fim de se observar as diferenças no perfil de proteínas totais inerentes à cada

ribotipo testado.

As eletroforeses foram realizadas no sistema Mini Protean II (Bio-Rad Laboratories;

Hercules, CA, USA) sob aplicação de uma corrente constante de 100V e 20 mA. Após

concluída a eletroforese, o gel obtido foi corado através do método de impregnação pela prata.

4.6.4 Revelação

Para revelação do gel de proteínas totais obtido, utilizou-se o método de impregnação

pela prata (OAKLEY et al., 1980). Inicialmente, o gel foi colocado em contato com uma

solução fixadora (40% de metanol e 10% de ácido acético) por 30 minutos, seguido pela

lavagem sob agitação (dentro de uma placa de Petri de vidro) com água destilada, por 5

minutos. O procedimento de lavagem foi repetido por, no mínimo, cinco vezes. Em seguida, o

gel foi mantido sob agitação numa solução de glutaraldeído 10%, pelo tempo de 30 minutos.

Decorrido este tempo, o gel foi lavado como descrito anteriormente. A coloração com a prata

acontecia pelo preparo de uma solução contendo 0,7 mL de hidróxido de amônio 25% e 10,5

mL de hidróxido de sódio 0,72%, onde foi imediatamente acrescentado gota a gota solução de

nitrato de prata 19,4%, agitando-se continuamente, até ser observada uma turvação, de cor

marrom claro na solução, ponto em que se completava o volume para 50 mL, com água

destilada. A solução final foi então vertida sobre o gel, mantido sob agitação por 7 minutos.

Decorrido este tempo, o gel foi lavado como já descrito. Neste momento, foi acrescentada a

solução reveladora (0,04% de ácido acético e 0,05% de formaldeído) e observado o

aparecimento de cor, corresponde às proteínas. Assim que a coloração desejada foi obtida, a

47

reação foi interrompida pela adição de solução de ácido acético 5%. Finalmente, os géis

foram envolvidos em papel celofane e secos à temperatura ambiente por aproximadamente 24

horas.

4.6.5 Análise

Os géis de proteínas totais obtidos foram analisados através de inspeção visual e pelo

programa de bioinformática BioNumerics (Applied Maths).

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

O teste estatístico aplicado para comparação da contagem de esporos viáveis no

controle versus aqueles que foram tratados com desinfetantes, foi o teste T Students. No caso

da comparação da sensibilidade das cepas a cada desinfetante, utilizou-se o teste de variância

(ANOVA). Todos os testes estatísticos utilizados foram realizados através do programa

Graphpad Prism (v5), com um intervalo de confiança de 95% (p ≤ 0,05).

5. RESULTADOS

5.1 CRESCIMENTO DAS CEPAS E PREPARO DOS ESPOROS

A concentração inicial de esporos, obtidos para cada cepa avaliada no teste da

atividade esporocida dos desinfetantes, foram: 7,0 x 106

esporos/mL para HU17-133; 4,6 x

106 para SJ1-135 e 3,9 x 10

6 para BI/NAP1/027. As preparações de esporos são ilustradas na

Figura 7.

49

Figura 7: Esporos de C. difficile observados após a coloração de Wirtz-Conklin. A: lâmina

contendo células vegetativas (coradas em vermelho); B: esporos (corados em verde) da cepa

HU17-133; C: esporos da cepa SJ1-135. As lâminas B e C apresentam restos celulares ao

fundo. Aumento de 400-100X.

50

5.2 TESTE DA ATIVIDADE ESPOROCIDA DOS DESINFETANTES

Os resultados da contagem de UFCs obtidas para as cepas C. difficile HU17-133,

BI/NAP1/027 e SJ1-135, após o teste com os desinfetantes Riohex®, Cidex Opa®, Cloro

Rio®, Peresal® e Virkon®, equivalente aos esporos sobreviventes e germinados, foi

comparada com a contagem das UFCs obtidas nos testes controle, e ilustrados na Figura 8. Os

resultados da contagem de UFCs é dada em Log10 e a significância na diferença de contagem

dos controles e testes foi verificada através do teste T de Students. Nenhum desvio padrão foi

superior à 0,54.

Os desinfetantes Cidex Opa® e Cloro Rio® eliminaram completamente os esporos de

C. difficile para todas as cepas testadas, enquanto o anti-séptico Riohex® não demonstrou

redução significativa na contagem de UFC em relação ao controle (p > 0,05), para as cepas

em questão. Quanto ao agente de limpeza Virkon®, este reduziu de modo significativo os

esporos das cepas C. difficile HU17-133 (p < 0,0001) e BI/NAP1/027 (p = 0,0002), não

ocorrendo o mesmo para cepa SJ1-135 (p > 0,05). Já o desinfetante Peresal®, eliminou

completamente os esporos da cepa HU17-133, e reduziu de modo significativo os

pertencentes às cepas BI/NAP1/027 (p = 0,0028) e SJ1-135 (p < 0,0001) de C. difficile.

51

Rio

hex

Cid

ex

Clo

ro R

io

Per

esal

Virko

n

0

1

2

3

4

5

6 ns

********

***

HU17-133A)L

og

10

da

co

nta

ge

m d

e U

FC

s

Rio

hex

Cid

ex

Clo

ro R

io

Per

esal

Virko

n

0

1

2

3

4

5 ns

*

**

******

BI/NAP1/027B)

Lo

g1

0d

a c

on

tag

em

de

UF

Cs

Rio

hex

Cid

ex

Clo

ro R

io

Per

esal

Virko

n

0

1

2

3

4

5

6

SJ1-135

ns

*** ***

ns

**

C)

Lo

g1

0d

a c

on

tag

em

de

UF

Cs

Figura 8: Log10 da contagem de esporos viáveis antes (controle, em preto) e após (teste, em

branco) serem tratados com os desinfetantes Riohex®, Cidex Opa®, Cloro Rio®, Peresal® e

Virkon®, nas concentrações e tempos indicados pelos fabricantes, para as cepas C. difficile:

HU17-133 (A), BI/NAP1/027 (B) e SJ1-135 (C). As barras de erro indicam o desvio padrão.

As diferenças estatisticamente significativas foram marcadas com o símbolo * (p ≤ 0,05 e >

0,0002), ** (p ≤ 0,0002) e *** quando houve eliminação completa dos esporos. Uma

diferença não significativa está representada com a sigla ns.

A Figura 9 demonstra a porcentagem de redução do Log10 da contagem de UFC para

cada cepa testada com os desinfetantes avaliados no estudo. Esse gráfico permite melhor

visualização da variação da sensibilidade entre as cepas C. difficile HU17-133, BI/NAP1/027

e SJ1-135, frente a cada desinfetante.

52

Rio

hex

Cid

ex

Clo

ro R

io

Per

esal

Virk

on

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ns

ns ns ^

^̂

% d

a r

ed

uç

ão

do

Lo

g1

0d

a

co

nta

ge

m d

e U

FC

s

Figura 9: Porcentagem da redução do Log10 da contagem de UFCs, provenientes da

germinação dos esporos, das cepas HU17-133 ( ), BI/NAP1/027 ( ) e SJ1-135 ( ) de

C. difficile, tratadas com os desinfetantes Riohex®, Cidex Opa®, Cloro Rio®, Peresal® e

Virkon®. A verificação da significância da diferença na sensibilidade das três cepas frente a

cada desinfetante, foi realizada através da análise de variância (two-way ANOVA), sendo não

significante (ns, p > 0,05), significante com p < 0,002 (^) e significante com p < 0,0001 (^^).

De acordo com os resultados e tratamentos estatísticos (ANOVA), as três cepas

testadas não exibem sensibilidade diferenciada (p > 0,05) no que se refere aos desinfetantes

Riohex®, Cidex Opa® e Cloro Rio®. Quanto aos desinfetantes Peresal® e Virkon®,

observou-se que as cepas C. difficile em teste obtiveram resultados de sensibilidade

diferenciada (p = 0,0018 e p < 0,0001, respectivamente) quando tratadas com os mesmos. No

caso do Virkon®, a cepa SJ1-135 apresentou o menor nível de sensibilidade entre as três

cepas testadas, tendo uma redução de apenas 1,66% do Log10 da contagem de UFC após o

teste, enquanto a cepa HU17-133 e BI/NAP1/027 obtiveram 45,04% e 37,23%,

respectivamente. Já o desinfetante Peresal®, eliminou completamente os esporos da cepa

HU17-133, ao passo que para as cepas BI/NAP1/027 e SJ1-135 houve uma redução do Log10

da contagem de UFCs de 52,81% para primeira e 54,00% para segunda.

53

5.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO MÍNIMA INIBITÓRIA (CMI)

A CMI para os cinco agentes de limpeza testados frente às cepas de C. difficile

selecionadas são mostradas na Tabela 2. O crescimento das células vegetativas de C. difficile

foi inibido pelos desinfetantes Cloro Rio® e Virkon®, e pelo anti-séptico Riohex®, em

concentrações consideravelmente menores que as recomendadas pelos fabricantes para uso na

rotina de desinfecção do ambiente hospitalar e, no caso do Riohex®, para desinfecção das

mãos dos profissionais da saúde e assepsia pré-operatória. O desinfetante Peresal® não foi

capaz de impedir o crescimento do microrganismo, mesmo na maior concentração testada

(0,05%). O agente de limpeza Cidex Opa®, que é comercializado já na concentração indicada

para o uso, também não foi capaz de impedir o crescimento do microrganismo, provavelmente

devido a diluição de 1:10 inerente à técnica utilizada para a determinação da CMI.

Tabela 2: Resultados da Concentração Mínima Inibitória (CMI), como uma proporção da

concentração recomendada pelos fabricantes, dos desinfetantes selecionados para células

vegetativas de C. difficile.

Cepas Desinfetantes

C. difficile (concentração inicial)

CLORO RIO®

(0,12%)

PERESAL ®

(0,5%)

VIRKON ®

(1%)

RIOHEX®

(0,2%)

CIDEX OPA®

(0,055%)

BI/NAP1/027 1/2 * 1/4 1/128 **

ATCC9689 1/2 * 1/4 1/128 **

SJ1-135 1/2 * 1/4 1/128 **

HU09-133 1/2 * 1/4 1/128 **

HU11-133 1/2 * 1/4 1/64 **

HU14-133 1/2 * 1/4 1/128 **

HU17-133 1/2 * 1/4 1/128 **

*Não impediu o crescimento, mesmo na maior concentração avaliada (0,5%);

** Não impediu o crescimento devido a problema inerente à técnica utilizada.

5.4 EXTRAÇÃO E ANÁLISE DAS PROTEÍNAS TOTAIS

Para análise do perfil eletroforético de proteínas totais foram selecionadas quatro

cepas C. difficile de ribotipos diferentes, incluindo os ribotipos brasileiros 133 e 135. No

primeiro gel SDS-PAGE obtido (Figura 10) constam as cepas SJ1-135, BI/NAP1/027, HU17-

135 e ATCC 9689 não tratadas com desinfetantes. De acordo com a inspeção visual, é

54

possível perceber uma considerável variabilidade das quatro cepas com relação aos seus perfis

de proteínas totais. A cepa SJ1-135 assemelha-se com a cepa HU17-133, ambos ribotipos

exclusivamente brasileiros, tendo diferenças visíveis em proteínas com cerca de 50 e 35 kDa.

A cepa hiper-virulenta BI/NAP1/027 assemelha-se consideravelmente com a cepa padrão

ATCC 9689.

Figura 10: Perfis eletroforéticos das proteínas totais de quatro cepas C. difficile: SJ1-135,

BI/NAP1/027, HU17-133 e ATCC 9689.

A seguir, cada cepa mencionada anteriormente foi tratada com concentração

submínima inibitória (correspondente à 50% da CMI) dos desinfetantes Virkon®, Cloro Rio®

e Riohex®, enquanto para o Cidex Opa® e Peresal® utilizou-se as concentrações de 0,055%

e 0,5%, respectivamente, a fim de se verificar uma possível modificação no perfil

eletroforético das proteínas totais promovido por este tratamento. As Figuras 11, 12, 13 e 14

exibem os perfis eletroforéticos de proteínas totais antes e após o tratamento com cada

desinfetante citado, para as cepas ATCC 9689, HU17-133, BI/NAP1/027 e SJ1-135,

respectivamente.

Os perfis eletroforéticos de proteínas totais obtidos foram avaliados através da

inspeção visual do gel SDS-PAGE e ainda por meio de análise automatizada, onde foi gerado

um gráfico com duas curvas sobrepostas, uma correspondente a cepa não tratada com

desinfetante (denominada Padrão) e a outra pela respectiva cepa tratada com cada agente de

limpeza. O gráfico permitiu a análise densitométrica das bandas de proteínas, onde a diferença

55

da área sobre a curva de cada um dos picos (representantes das proteínas), corresponde a

modificação da expressão de uma determinada proteína, comparada ao padrão, quando a cepa

foi tratada com o desinfetante.

Assim, de acordo com a análise visual e automatizada, foi possível perceber que a

cepa ATCC 9689 não sofreu alterações no seu perfil proteico quando tratada com os

desinfetantes Virkon® e Cidex Opa®, tendo uma pequena modificação devido ao uso do

Peresal®, que diminuiu a expressão da proteína de ≈ 80 kDa. No entanto, o agente de

limpeza Cloro Rio® gerou diversas modificações no perfil protéico da cepa em questão,

aumentando substancialmente a expressão das proteínas de ≈ 53 kDa e ≈ 35 kDa, e

diminuindo as de ≈ 100 kDa, ≈ 80 kDa, ≈ 60 kDa, ≈ 42 kDa, ≈ 27 kDa e ≈ 22 kDa. Com

relação ao agente Riohex®, este foi capaz de aumentar a densidade das proteínas de ≈ 53 kDa

e ≈ 15 kDa, e diminuir de modo sutil a das proteínas de ≈ 80 kDa e ≈ 60 kDa.

56

Figura 11: (I) Perfis eletroforéticos de proteínas totais da cepa C. difficile ATCC 9689 em gel



referentes à comparação densitométrica, através de análise automatizada, do Padrão (linhas

vermelhas) versus a cepa tratada com cada um dos cinco desinfetantes (linhas azuis).

*Proteínas que sofreram alteração após o tratamento com desinfetante.

No caso da cepa HU17-133, os desinfetantes Cidex Opa® e Peresal® não provocaram

alteração do perfil protéico. O agente Virkon® aumentou a densidade das proteínas de ≈ 60

57

kDa e ≈ 50 kDa. Novamente, o desinfetante Cloro Rio® foi responsável por grande parte das

mudanças observadas, aumentando a densidade das proteínas de ≈ 50 kDa, ≈ 35 kDa e ≈ 20

kDa, enquanto diminuiu a densidade das proteínas de ≈ 100 kDa, ≈ 70 kDa, ≈ 60 kDa e 15

kDa. Com relação ao agente Riohex®, este foi capaz de aumentar a densidade das proteínas

de ≈ 70 kDa, ≈ 60 kDa, ≈ 50 kDa e ≈ 35 kDa e diminuir a da proteína de ≈ 20 kDa.

58

Figura 12: (I) Perfis eletroforéticos de proteínas totais da cepa C. difficile HU17-133 em gel






A cepa hiper-virulenta BI/NAP1/027 foi a que demonstrou maior número de

alterações quando tratada com os diversos desinfetantes testados. O agente químico Virkon®,

aumentou a densidade das proteínas de ≈ 220 kDa e ≈ 100 kDa, enquanto reduziu a das

proteínas com ≈ 60 a 70 kDa e ≈ 42 kDa. Já o desinfetante Cidex Opa®, aumentou a

expressão da proteína de ≈ 220 kDa e diminuiu a das proteínas com ≈ 60 a 70 kDa, ≈ 50 kDa

e ≈ 35 kDa. Quanto ao Peresal®, este foi capaz de induzir modificações aumentando a

densidade da proteína de ≈ 220 kDa e diminuindo a das proteínas com ≈ 60 a 70 kDa e ≈ 42

59

kDa. O desinfetante Cloro Rio®, semelhante ao que ocorreu com as cepas C. difficile ATCC

9689 e HU17-133, demonstrou o maior número de modificações observadas. Ele aumentou a

expressão das proteínas de ≈ 220 kDa, ≈ 130 kDa, ≈ 100 kDa e ≈ 52 kDa, enquanto diminuiu

a expressão das proteínas com ≈ 60 a 70 kDa. O agente de limpeza Riohex® gerou alterações

nas proteínas de ≈ 100 kDa, ≈ 60 a 70 kDa e ≈ 33 kDa, diminuindo a densidade de todas em

relação ao padrão.

60

Figura 13: (I) Perfis eletroforéticos de proteínas totais da cepa C. difficile BI/NAP1/027 em

gel SDS-PAGE, antes (Padrão) e após ser tratada com concentração submínima inibitória dos





Finalmente, a inspeção visual do gel SDS-PAGE e a análise automatizada para a cepa

SJ1-135 demonstrou que o desinfetante Virkon® não provocou nenhuma alteração do perfil

de proteínas totais. Por outro lado, os agentes de limpeza Cidex Opa® e Peresal®

aumentaram a densidade da proteína de ≈ 45 kDa. Já o Cloro Rio®, diminuiu a expressão das

proteínas de ≈ 100 kDa e ≈ 60 kDa. O desinfetante Riohex® provocou a diminuição da

61

densidade das proteínas de ≈ 100 kDa, ≈ 22 kDa e ≈ 18 kDa, enquanto aumentou a densidade

das proteínas de ≈ 18 kDa e ≈ 13 kDa.

62

Figura 14: (I) Perfis eletroforéticos de proteínas totais da cepa C. difficile SJ1-135 em gel






Para uma melhor compreensão dos resultados como um todo, os dados foram

condensados na Tabela 3. Através da análise desta tabela, é possível verificar mais facilmente

as proteínas que podem ter sido afetadas por mais de um desinfetante para mesma cepa e

aquelas que sofreram mudanças mais expressivas.

63

Tabela 3: Proteínas (representadas por seus pesos moleculares) das cepas de C. difficile

ATCC 9689, HU17-133, BI/NAP1/027 e SJ1-135, que sofreram alterações em sua densidade

após tratamento com os desinfetantes Virkon®, Cidex Opa®, Peresal®, Cloro Rio® e

Riohex®.

Cepas

Desinfetantes

ATCC 9689

(kDa)

HU17-133

(kDa)

BI/NAP1/027

(kDa)

SJ1-135

(kDa)

Virkon®

___ ↑ 60, 53 ↑ 220, 100,

↓ 60-70*, 42

___

Cidex Opa®

___ ___ ↑ 220

↓ 60-70*, 50, 35

↑ 45

Peresal®

↓ 80 ___ ↑ 220

↓ 60-70*, 42

↑ 45

Cloro Rio®

↑ 53*, 35

↓ 100, 80, 60,

42*, 27, 22

↑ 53*, 35, 20*

↓ 100*, 70, 60*,

15

↑ 220, 130, 100,

52

↓ 60-70*

↓ 100, 60

Riohex®

↑ 53*, 15

↓ 80, 60

↑ 70, 60, 53, 35

↓ 20, 15

↓ 100*, 60-70*,

33

↑ 48, 13

↓ 100*, 22*, 18

* Proteínas que sofreram mudanças mais expressivas quando tratadas com os desinfetantes;

Em negrito: proteínas que sofreram alteração por mais de um desinfetante;

↑: proteínas que tiveram sua densidade aumentada;

↓: proteínas que tiveram sua densidade diminuída.

No caso da cepa C. difficile ATCC 9689, a proteína de aproximadamente 80 kDa, por

exemplo, teve sua densidade diminuída na presença de três desinfetantes: Peresal®, Cloro

Rio® e Riohex®. De modo semelhante, a proteína de ≈ 53 kDa teve sua expressão aumentada

na presença do Cloro Rio ® e do Riohex®, enquanto a proteína de ≈ 60 kDa teve sua

expressão diminuída pelos mesmos agentes de limpeza.

Para cepa HU17-133, as proteínas de ≈ 60 kDa e 53 kDa sofreram alteração na

presença dos desinfetantes Virkon®, Cloro Rio® e Riohex®. Ao passo que as proteínas de ≈

70 kDa, 35 kDa, 20 kDa e 15 kDa, foram modificadas quando a cepa foi tratada apenas com

os últimos dois agentes citados.

No caso da cepa hiper-virulenta BI/NAP1/027, três proteínas com peso de ≈ 60 à 70

kDa foram fortemente afetadas, tendo sua densidade diminuída, por todos desinfetantes

testados. Uma proteína de ≈ 220 kDa só não foi alterada pelo desinfetante Riohex. Os agentes

64

de limpeza Virkon®, Cloro Rio® e Riohex® modificaram a expressão da proteína de ≈ 100

kDa. De modo semelhante as já citadas, a proteína de ≈ 42 kDa teve sua densidade diminuída

na presença do Virkon® e do Peresal®.

Finalmente, a cepa SJ1-135 teve proteínas de ≈ 45 kDa afetadas pela presença dos

agentes de limpeza Cidex Opa® e Peresal®, que aumentaram a densidade, e outra de ≈ 100

kDa que teve a densidade diminuída quando a cepa recebeu tratamento com os desinfetantes

Cloro Rio® e Riohex®.

6. DISCUSSÃO

Clostridium difficile é bem documentado como o principal agente etiológico envolvido

na diarréia associada ao uso de antimicrobianos, sendo responsável por aproximadamente 15 a

20% dos casos, além de ser a causa primária da colite pseudomembranosa (BORRIELLO et

al., 1990; CERQUETTI et al., 2000; HURLEY et al., 2002). Devem ser consideradas

realidades preocupantes com relação à infecção pelo patógeno, o considerável aumento do

tempo de permanência dos pacientes no hospital, fato este que pode levar a contaminação de

outros pacientes, e a reinfecção daqueles que já foram acometidos pela CDI, além dos altos

custos advindos desta situação (WILCOX et al., 1996).

A prevenção efetiva e o controle da propagação da CDI nosocomial permanece como

um desafio, agravado nos últimos anos pela consolidação do C. difficile como um dos

principais patógenos adquiridos em hospitais (FAWLEY et al., 2005; OMIDBAKHSH et al.,

2010). Uma medida essencial na prevenção desta infecção é proteger o paciente da aquisição

inicial do microrganismo (RUPNIK et al., 2009). Neste aspecto, a eficácia de desinfetantes

contra os esporos de C. difficile constitui uma estratégia extremamente importante no controle

da CDI (SAMORE et al., 1996).

A contaminação ambiental com esporos de C. difficile é uma fonte potencial para

aquisição da doença no cenário hospitalar. A rápida identificação e tratamento dos pacientes

são fatores essenciais na redução da quantidade de esporos liberados no ambiente, uma vez

que o grau de contaminação está diretamente relacionado com a duração dos sintomas dos

portadores da CDI (DUBBERKE et al., 2008). A desinfecção do ambiente e dos utensílios do

paciente com CDAD é dificultada pela característica de resistência dos esporos a diversos

produtos padronizados na rotina de limpeza dos hospitais. Este fato permite a permanência do

66

patógeno no ambiente por muitos meses (HOTA B, 2004; PEREZ et al, 2005; DAWSON et

al., 2011).

Alguns produtos rotineiramente utilizados na desinfecção já foram testados sem

sucesso frente aos esporos C. difficile, incluindo álcool 70%, compostos de quaternário de

amônio e peróxido de hidrogênio (OMIDBAKHSH, 2010). Sabendo destas informações, tais

agentes de limpeza não foram incluídos neste trabalho, assim como: o glutaraldeído, que

depende de um tempo de contato de 3 à 10 horas para atividade esporocida (SCOTT &

GORMAN, 2001), fator que dificulta seu uso na rotina, além de ser altamente tóxico e não

adequado para desinfecção de superfícies (TAKIGAWA & ENDO, 2006), local este que é

alvo do trabalho em questão; e o formaldeído, que também possui ação lenta, é carcinogênico

(IARC, 2009) e altamente tóxico (POHANISH, 2008).

Assim, priorizou-se neste estudo a utilização de desinfetantes, e um anti-séptico

(Riohex®), que fossem amplamente utilizados no cenário hospitalar, nas concentrações e

tempos de contato indicados pelos fabricantes, a fim de gerar uma proximidade máxima com

a realidade da rotina de desinfecção destes estabelecimentos. Como todos os testes seguiram

as orientações de uso estabelecidas pelos fabricantes, nossos resultados poderiam ser válidos

também no que se refere à utilização em condições seguras quanto à intoxicação da equipe de

limpeza, pacientes e profissionais responsáveis pelo cuidado.

O uso de suportes, no caso de vidro, para aderir os esporos em suspensão e a secagem

desta suspensão sobre o mesmo por cerca de 24 horas, é importante para mimetizar a

realidade das superfícies hospitalares contaminadas. Testes da atividade esporocida de

desinfetantes realizados com esporos em suspensão, tendem a gerar resultados mais

favoráveis na eliminação dessas formas de vida. A inativação de microrganismos secos sobre

superfícies é menos facilmente alcançada que em suspensão (BLOCK et al., 2000; BLOCK,

2004). Fato este comprovado nos estudos de VOHRA & POXTON (2011), onde todos os

desinfetantes testados (entre eles o Virkon® e um agente liberador de cloro ativo) foram

eficazes contra os esporos quando estes encontravam-se em suspensão, ao passo que quando

tal suspensão de esporos era posta em suportes de diversos materiais (tais como alumínio,

vidro, azulejo e plástico) e secas à temperatura ambiente por várias horas, a atividade dos

desinfetantes não foi a mesma, sendo bem menos pronunciada.

67

Quanto às cepas, foram selecionadas duas de ribotipos encontrados exclusivamente no

Brasil, HU17-133 e SJ1-135, uma vez que não há relatos na literatura de testes da atividade

esporocida de desinfetantes frente a estes ribotipos; e uma cepa hiper-virulenta, BI/NAP1/027,

a fim de gerar um padrão de comparação, já que esta última encontra-se presente em diversos

estudos vinculados à ação esporocida de agentes de limpeza (HOREJSH & KAMPF, 2010;

DAWSON et al., 2011; VOHRA & POXTON, 2011). A atividade de agentes de limpeza

sobre cepas C. difficile, particularmente os esporos, tem sido pobremente estudada, e os

poucos estudos disponíveis usualmente examinam apenas uma cepa do patógeno, que pode

não ser representativa da sensibilidade dos vários ribotipos existentes (RUTALA et al., 1993;

BLOCK, 2004; PEREZ et al., 2005; FAWLEY et al., 2007; WHEELDON et al., 2008;

HOREJSH & KAMPF, 2010).

A escolha das cepas brasileiras também teve como propósito avaliar ribotipos que

estivessem de fato presentes nos hospitais nacionais. De acordo com o estudo de

BALASSIANO e colaboradores (2010), o ribotipo 133 foi encontrado em 50% dos isolados

do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, além de ter sido também detectado no

Hospital Casa de Saúde São José, juntamente com o ribotipo 135 (BALASSIANO et al.,

2011). Há de se destacar ainda, que os ribotipos 133 e 135 haviam sido encontrados

previamente, pelo mesmo grupo, no ano de 1999, em pacientes infantis (ALCIDES et al.,

2007)

A concentração inicial de esporos, obtidas para as cepas HU17-133, SJ1-135 e

BI/NAP1/027, foi elevada e apropriada para o desenvolvimento dos testes. PEREZ e

colaboradores (2005) relatam a dificuldade de se obter altas concentrações de esporos em

laboratório, fator limitante para as pesquisas com desinfetantes. Neste trabalho, a cepa ATCC

9689 estava inicialmente incluída, porém, mesmo utilizando idêntica metodologia para

obtenção de esporos usada para as demais, esta cepa exibiu concentração muito baixa de

esporos, inviável para o desenvolvimento do teste de atividade esporocida. Este fato pode ser

explicado através de achados de outras pesquisas em que diferentes taxas de esporulação

foram verificadas para cepas de C. difficile genotipicamente distintas (WILCOX &

FAWLEY, 2000). Os autores também relataram que a capacidade de esporulação foi

aumentada quando as cepas de C. difficile testadas foram expostas a concentrações

submínimas inibitórias de alguns agentes de limpeza, tais como detergentes, compostos de

quaternário de amônio (FAWLEY et al., 2005) e compostos desprovidos de cloro ativo em

sua composição (WILCOX & FAWLEY, 2000). Eles sugeriram que a capacidade de

68

esporulação aumentada, em respostas a certos estresses ambientais, pode ser um fator de

virulência associado com a propagação e persistência de algumas cepas de C. difficile no

ambiente hospitalar.

Embora a suspensão inicial de esporos tenha passado por todos os processos

requeridos para a eliminação das células vegetativas, tais como aquecimento, lavagens e

armazenamento em aerobiose e temperatura de 4ºC, a técnica utilizada não permite a retirada

completa dos restos celulares da suspensão (e células vegetativas não viáveis), que podem ser

observados na Figura 7. Fato este que não compromete os posteriores experimentos

realizados.

Neste estudo, o anti-sépico Riohex®, uma bis-biguanina catiônica que tem como

princípio ativo o digluconato de clorexidina, não apresentou atividade significativa contra os

esporos de nenhuma das cepas avaliadas, obtendo uma redução do Log10 de esporos viáveis

inferior à 10% para as cepas HU17-133 e SJ1-135, e de 12% para cepa BI/NAP/027. Segundo

o teste de variância (ANOVA), também não foi encontrada uma diferença significativa na

sensibilidade entre as três cepas frente ao anti-séptico.

Esses resultados eram esperados, uma vez que o anti-séptico não tem ação esporocida

especificada. DAWSON e colaboradores (2011) relataram que o anti-séptico foi efetivo na

eliminação dos esporos de cepas de C. difficile dos ribotipos 012, 017 e 027, sendo o último

mais resistente com relação aos demais. Porém, o produto foi utilizado na concentração de

50%, ao passo que, no Brasil, ele é comercializado na concentração de 2%. Além disso, o

estudo utilizou um tempo de contato de 30 minutos e ocorreu em suspensão, enquanto nossos

experimentos utilizaram o tempo de 3 minutos, indicado pelo fabricante, e suporte de vidro

com suspensão de esporos seca por cerca de 24 horas. Optou-se por investigar o digluconato

de clorexidina porque este agente é amplamente utilizado no cenário hospitalar para

desinfecção das mãos dos profissionais de saúde, além do uso na assepsia pré-operatória.

Assim, de acordo com as características de uso, o tempo de 3 minutos é mais condizente com

a realidade de desinfecção e lavagem das mãos dos profissionais da saúde.

Nossas pesquisas revelaram que o Riohex® foi efetivo na eliminação de C. difficile na

forma vegetativa, sendo a CMI de 1/128 da concentração inicial do produto (correspondente a

concentração de aproximadamente 0,016% ou 160 ppm). Embora o produto em questão não

tenha tido atividade eficaz contra os esporos de C. difficile, alguns autores sugerem que a

69

fricção física das mãos durante o uso de álcool 70% (agente de limpeza que não possui

atividade esporocida), teoricamente poderia diminuir a carga bacteriana das mãos (KNIGHT

et al., 2010), podendo esta característica ser verdade também para o Riohex® . Um estudo

examinando o efeito antibacteriano de certos anti-sépticos encontrou que o efeito mecânico da

fricção produziu redução da concentração bacteriana nas mãos (MESSAGER et al., 2004).

De acordo com os resultados obtidos, o Riohex® não é capaz de eliminar esporos de

C. diffile. Sabendo que este anti-séptico é um dos mais utilizados na rotina de desinfecção das

mãos, juntamente com o álcool 70%, a maneira mais eficaz para a proteção dos pacientes e

trabalhadores da saúde é o uso de luvas, como barreira física. É importante mencionar que a

combinação de uma rigorosa higiene das mãos com a precaução de contato diminuiu a

incidência de CDI em cerca de 80% nos estudos de JOHNSON e colaboradores (1990).

Foram testados dois agentes oxidantes, o peroxigênio Virkon® e o produto a base de

ácido peracético e peróxido de hidrogênio, Peresal®. O agente de limpeza Virkon®

(monopersulfato de potássio), foi capaz de reduzir em menos de 50% a concentração inicial

de esporos para as cepas HU17-133 e BI/NAP1/027, ao passo que reduziu apenas cerca de

1,7% para a cepa SJ1-135. Através do teste ANOVA foi possível confirmar que a cepa SJ1-

135 foi significativamente menos sensível que as demais frente ao desinfetante.

Em seus estudos, VOHRA & POXTON (2011) utilizaram metodologia muito

semelhante a usada nesta pesquisa, inclusive fazendo uso de suportes de vidro para alojar os

esporos de C. difficile e tempo de contato de 10 minutos. Corroborando com nossos

resultados, o autor encontrou porcentagens de queda da concentração de esporos inferiores à

50% para todas as cepas testadas contra o Virkon® (ribotipos 106, 001 e 027), sendo o

ribotipo 106 o menos sensível entre os demais. O mesmo autor testou suportes de diferentes

materiais, tais como alumínio, plástico, azulejo, e vinil, uma vez que há suspeita de que

diferentes superfícies podem interferir na ação do desinfetante e na recuperação dos esporos

(FAWLEY, 2007). As menores concentrações de esporos viáveis encontradas pelo autor,

recuperados após o teste com os desinfetantes, foi justamente na superfície de vidro, enquanto

a maior porcentagem foi encontrada na de alumínio. Esses dados indicam que a superfície de

vidro poderia estar simulando o pior caso, característica relevante para testes da atividade

esporocida de desinfetantes. A alta concentração inicial das suspensões de esporos utilizadas

também estaria simulando o pior caso, uma vez que estima-se que pacientes com CDAD

70

excretam entre 1 x 104 e 1 x 10

7 esporos por grama de fezes (MULLIGAN et al., 1984; BEST

et al., 2010).

DAWSON e colaboradores (2011) também testaram a eficiência do Virkon® frente

aos esporos de C. difficile, encontrando mais uma vez porcentagens inferiores à 50% para

redução da carga de esporos, mesmo desenvolvendo os testes com um tempo de contato de 30

minutos e em suspensão, não utilizando suportes como superfície para alojar os esporos. Os

resultados encontrados em nossos estudos não se mostraram diferentes daqueles encontrados

por outros autores, revelando que o Virkon® pode não ser uma opção eficaz para desinfecção

de superfícies contaminadas com esporos C. difficile.

As células vegetativas das cepas de C. difficile também foram testadas frente ao

desinfetante Virkon®. Ele foi eficaz contra todas as cepas testadas, com uma CMI referente à

1/4 da concentração original (correspondente a 0,25% ou 2500 ppm do composto ativo).

Outro estudo encontrou resultado idêntico testando as cepas C. difficile de ribotipo 027 e 001

(VOHRA & POXTON, 2011). Porém, é bem sabido que as células vegetativas do

microrganismo não sobrevivem em ambiente de aerobiose (FERREIRA et al., 2003), não

constituindo grande risco para contaminação e dispersão do patógeno no ambiente.

Para o segundo agente oxidante testado, Peresal®, nenhum esporo viável da cepa

HU17-133 foi recuperado até os limites de detecção da metodologia utilizada. O peróxido de

hidrogênio, também presente na composição do produto, parece auxiliar na eliminação dos

esporos pela interferência direta sobre a camada de revestimento que os envolve, tornando-os

não viáveis (SEBAIHIA et al., 2006).

Por outro lado, o agente reduziu a carga de esporos em menos de 55% para as cepas

BI/NAP1/027 e SJ1-135. O teste de variância (ANOVA) comprovou que a cepa HU17-133

foi significativamente mais sensível que as demais quando testada com este agente de

limpeza. Outros estudos já testaram a atividade esporocida contra cepas C. difficile para o

desinfetante em questão. Nos estudos de BLOCK (2004), o agente de limpeza a base de ácido

peracético avaliado demonstrou reduzir em cerca de 6 Log10 a contagem inicial de esporos

viáveis. Considerando que a carga inicial de esporos era de aproximadamente 5 x 106, pode-se

dizer que o autor encontrou uma redução muito próxima de 100%. Porém, este resultado foi

obtido utilizando-se suportes de aço inoxidável, enquanto a substituição do material por PVC

(policloreto de vinila), gerou uma resposta muito diferente, alcançando uma redução inferior à

71

50% da contagem de esporos viáveis. O autor testou apenas uma cepa de C. difficile, podendo

esta não ser representativa para todas as variantes genéticas existentes. Além disso, a

concentração de ácido peracético utilizada foi de 0,26%, bastante superior a utilizada em

nossos experimentos, onde o fabricante indicava o uso da solução diluída à 0,5%, valor este

que correspondia à 0,02% de ácido peracético.

Em seus estudos, WULLT e colaboradores (2003) também utilizaram o ácido

peracético na concentração de 0,26%, porém com os esporos em suspensão e com tempo de

contato de 15 minutos. O autor encontrou uma redução de aproximadamente 100%,

considerando os limites de detecção do teste, não havendo diferenças na sensibilidade entre as

4 cepas C. difficile testadas.

Em um terceiro estudo, esporos das cepas C. difficile dos ribotipos 012, 017 e 027,

também foram tratadas com ácido peracético (DAWSON et al., 2011). O agente de limpeza

foi avaliado nas concentrações de 0,81%, 1%, 1,62% e 2%, não sendo recuperado nenhum

esporo em qualquer uma das concentrações testadas. Esta pesquisa não utilizou suportes para

mimetizar superfícies, desenvolvendo os testes somente em suspensão, e pelo tempo de

contato de 30 minutos.

Desta forma, embora os três estudos citados tenham encontrado taxas muito elevadas

de redução da carga de esporos, ou mesmo eliminação completa, as metodologias utilizadas

pelos autores diferem muito da conduzida em nossos experimentos, seja pelo tempo

prolongado de contato ou pela não utilização de suportes mimetizando superfícies, parâmetros

esses que se afastam da realidade da rotina de desinfecção hospitalar. O resultado mais

próximos ao encontrado em nossos estudos foi o de BLOCK (2004) ao utilizar suportes de

PVC com suspensão seca de esporos, embora seu produto fosse mais concentrado que o

utilizado em nossas pesquisas.

Considerando que somente um dos ribotipos testados (133) foi altamente sensível ao

desinfetante, pode não ser interessante utilizá-lo na rotina de desinfecção hospitalar com o

propósito de eliminar esporos de C. difficile. Testes utilizando concentrações maiores de

Peresal® que a preconizada pelo fabricante, como por exemplo a de 0,26% experimentada por

BLOCK (2004) e WULLT (2003), poderiam exibir resultados melhorados na redução da

carga de esporos.

72

É importante mencionar ainda que o desinfetante em questão não foi capaz de inibir o

crescimento das células vegetativas no teste da CMI, mesmo na maior concentração testada.

Este resultado é curioso, uma vez que o agente de limpeza, tanto o ácido peracético, quanto o

peróxido de hidrogênio presentes na fórmula, não são inativados na presença de matéria

orgânica (tal como o sangue utilizado no experimento) ou mesmo pela alteração do pH

(SOUZA et al., 2005). Assim, uma possível explicação para o fato pode estar vinculada a alta

instabilidade do composto, que se decompõe facilmente em água, oxigênio e dióxido de

carbono (GEHR et al., 2002), e uma vez entrando em contato com o ágar a aproximadamente

50ºC, necessário no método de diluição em ágar para determinação da CMI, essa

decomposição pode ter sido favorecida e acelerada, inativando o composto.

Nenhum esporo viável, para todas as cepas C. difficile avaliadas no estudo, foi

recuperado, até os limites de detecção da metodologia utilizada, quando tais cepas foram

tratadas com os desinfetantes Cloro Rio® - agente liberador de cloro ativo a base de

hipoclorito de sódio – e Cidex Opa®, agente a base de orto-ftalaldeído.

Atualmente se tem como base que soluções liberadoras de cloro ativo, tais como as de

hipoclorito de sódio, reduzem significativamente a contaminação pelos esporos e,

consequentemente, as taxas de infecção pelo C. difficile, podendo ser escolhidas para a

descontaminação de superfícies hospitalares (MAYFIELD et al., 2000; WILCOX et al.,

2003). Este agente de limpeza vem sendo avaliado em diversos estudos de atividade

esporocida. PEREZ e colaboradores (2005) relataram que para encontrar uma redução ≥ 6

log10 na contagem de esporos viáveis, correspondente a uma taxa próxima de 100% no estudo,

sobre superfícies de aço inoxidável, utilizando hipoclorito de sódio numa concentração de

1000 ppm, um tempo de contato de aproximadamente 10 a 20 minutos foi necessário.

Já WHEELDON e colaboradores (2008) demonstraram que 15 à 30 minutos de

contato na mesma concentração de hipoclorito de sódio utilizada por PEREZ, reduziu apenas

em cerca de 2.76 à 2.96 log10 a contagem de esporos viáveis, mostrando assim variações entre

diferentes experimentos. Nos estudos conduzidos por UNGURS e colaboradores (2011),

fazendo uso de suportes de aço inoxidável, foi obtida a eliminação total dos esporos

utilizando-se o hipoclorito de sódio à 6000 ppm, por um tempo de contato de 20 minutos.

A pesquisa conduzida por VOHRA & POXTON (2011), foi a que mais se aproximou,

com relação a metodologia utilizada, dos nossos estudos. Estes autores relataram a eliminação

73

total dos esporos de cepas C. difficile pertencentes aos ribotipos 106, 001 e 027, quando estas

foram tratadas com hipoclorito de sódio pelo tempo de 10 minutos e utilizando suportes de

vidro para alojar os esporos, assim como foi feito em nossos ensaios.

As diferenças encontradas nos vários estudos citados podem estar vinculadas não

somente às diversas metodologias aplicadas, mas também às diferentes cepas de C. difficile

analisadas (UNGURS et al., 2011). Embora a concentração de hipoclorito de sódio utilizada

em nossos experimentos seja superior àquelas testadas nos estudos mencionados, ela está de

acordo com o especificado pelo Manual de Processamento de Artigos e Superfícies em

Estabelecimentos de Saúde, do Ministério da Saúde (BRASIL/MS, 1994), que preconiza o

uso do agente de limpeza na concentração de 1% (equivalente à 10.000 ppm) para desinfecção

de superfícies em hospitais brasileiros.

Apesar do rótulo do Cloro Rio® constar que a concentração original do produto era de

1% (correspondente à 10.000 ppm), ou seja, pronto para o uso, a verificação através de ensaio

de titulação realizado pela empresa Baktron (Rio de Janeiro, RJ, Brasil), revelou que a

concentração real era de 12.000 ppm. Assim, simulando uma situação de uso na rotina

hospitalar, em que o produto não seria diluído, já que dizia-se pronto para o uso, o Cloro

Rio® foi avaliado sem sofrer diluição.

O desinfetante em questão é amplamente utilizado no cenário hospitalar devido a

algumas características favoráveis que incluem o baixo custo, a facilidade de obtenção, uma

vez que diversas indústrias comercializam o agente de limpeza, e o amplo espectro de ação

(RUTALA & WEBER, 1997; OMIDBAKHSH, 2010). Além dessas vantagens, existem

estudos documentando a queda das taxas de infecção pelo C. difficile em hospitais, após ser

adotada uma rotina de desinfecção utilizando agentes liberadores de cloro ativo. WILCOX e

colaboradores (2003) demonstraram uma correlação significante entre o uso de um germicida

contendo cloro ativo (dicloroisocianurato) e a redução na incidência de CDI em 1 de 2

hospitais avaliados. MAYFIELD e colaboradores (2000) relataram uma diminuição

significativa nos casos de CDI em uma unidade de transplante de medula óssea após a

implementação de um regime de limpeza baseado no uso de agentes com cloro ativo em sua

composição. É importante mencionar ainda que a incidência de CDI retornou aos níveis

iniciais após a reintrodução do uso do desinfetante original, composto a base de quaternário

de amônio.

74

Apesar do hipoclorito de sódio possuir evidências que justifiquem seu uso como

desinfetante para eliminar esporos C. difficile de superfícies hospitalares, algumas de suas

desvantagens e limitações devem ser levadas em consideração. O desinfetante em questão é

altamente inativado na presença de matéria orgânica (tais como sangue e fezes), sujidade

comumente encontrada no cenário hospitalar, principalmente em banheiros, justamente onde

pacientes portadores da CDAD eliminam grande quantidade de esporos durante a defecação

(SPRINGTHORPE & SATTAR, 2005) e ainda, por matéria natural não proteica e alguns

plásticos. Portanto, a concentração de cloro disponível no processo de desinfecção deve ser

alta o suficiente para satisfazer a demanda de cloro ocasionada pela carga orgânica que pode

estar presente, e para fornecer cloro residual suficiente para eliminação dos microrganismos.

Este fenômeno deve ser cuidadosamente considerado antes de qualquer aplicação.

Embora algumas variações possam ser observadas, em geral, um longo tempo de

exposição ou uma alta concentração de cloro ativo são necessárias para obter um grau elevado

de atividade esporocida com o hipoclorito de sódio (BLOCK, 2004; PEREZ et al., 2005;

WHEELDON et al., 2008; BARBUT et al., 2009). Contudo, ambos requerimentos citados

são preocupantes quando considerados os efeitos tóxicos para os profissionais envolvidos na

limpeza, além da propriedade corrosiva do agente, que pode danificar a superfície que está

sendo desinfetada (UNGURS et al., 2011). Mas, diante de um surto de CDI, avaliando a

situação de custo-benefício – danos a superfícies e toxicidade aos profissionais da limpeza

versus contenção do surto ocasionado pelo C. difficile – e considerando ainda que tal

procedimento terá uma duração relativamente curta e determinada, as condições mencionadas

podem ser desejadas.

UNGURS e colaboradores (2011) relataram que a atividade do esporocida pode ser

mantida, quando da presença de matéria orgânica, se houver uma pré-lavagem da superfície

com detergentes, para removê-la antes do uso do agente de limpeza que contém cloro ativo. O

mesmo estudo concluiu que a ação mecânica durante a limpeza, também melhora

significativamente as taxas de redução da carga de esporos promovida pelo desinfetante em

questão.

Ainda com relação aos hipocloritos, sabe-se que são muito instáveis, tendo sua

estabilidade dependente de fatores como a concentração, temperatura, pH e luz. Soluções

mais concentradas, com cerca de 100.000 ppm (ou 10%), são mais estáveis (DONNELL &

RUSSELL, 1999), porém, exigem diluição no momento do uso, e este procedimento poderia

75

favorecer erros de concentração quando a equipe de limpeza não é adequadamente treinada. A

fim de melhorar a estabilidade das soluções contendo cloro ativo, foram desenvolvidas

formulação com detergentes, que aumentam o pH da solução e desse modo melhoram a

estabilidade. Em contrapartida, é sabido que ocorre uma considerável perda da atividade

microbicida do agente com o aumento do pH (RIDEAL & EVANS, 1921; RUDOLPH &

LEVINE, 1941).

De modo interessante OMIDBAKHSH (2010) verificou quanto tempo uma solução de

hipoclorito de sódio à 5000 ppm levaria para secar sobre diversas superfícies (bancada,

interior do vaso sanitário, superfície do vaso sanitário, azulejos e pia do banheiro). Em média,

a substância levou cerca de 4 a 5 minutos para secar completamente, tanto nas superfícies

horizontais quanto nas verticais. Considerando que, como em nossos estudos, o autor, em um

teste independente da secagem, encontrou uma eliminação completa dos esporos de C.

difficile com um tempo de contato de 10 minutos, uma secagem de 4 a 5 minutos não estaria

permitindo o período de contato necessário para morte dos esporos. Assim, ele sugere que na

rotina de desinfecção hospitalar uma reaplicação do produto seja feita após secagem, pois

dessa maneira o desinfetante atenderia os 10 minutos de contato requeridos para a ação

esporocida.

Os resultados da CMI do Cloro Rio® foram de igual valor para as células vegetativas

de todas as cepas de C. difficile estudadas, aproximadamente 1/2 da concentração inicial do

desinfetante (correspondente à 0,06% ou 600 ppm de cloro ativo). Os testes envolvendo a

exposição de células vegetativas aos agentes de limpeza evidenciaram resultados muito

diferentes daqueles obtidos nos experimentos com os esporos, assim como ocorreu nos

estudos de FAWLEY e colaboradores (2007), e VOHRA & POXTON (2011).

Como já mencionado, o desinfetante Cidex Opa® demonstrou ser altamente eficaz

contra os esporos das cepas de C. difficile avaliadas em nosso estudo. Trata-se de um

dialdeído aromático, primeiramente utilizado como agente cromofóbico para sistemas de

cromatografia, e só mais tarde aplicado como desinfetante (BLUNDELL & BRYDON, 1987).

Sua utilização como agente de limpeza foi impulsionada pelas desvantagens existentes na

utilização do glutaraldeído, que também é um dialdeído, porém não aromático. O

glutaraldeído há tempos é amplamente utilizado na desinfecção de endoscópios

(BRUCKNER, 1986), mas seu potencial efeito mutagênico e carcinogênico (HUGO &

RUSSELL, 1999), bem como irritação da pele e dos olhos, além de desordens respiratórias

76

(RUSSELL, 1994), que acabam por gerar riscos para os profissionais da saúde e equipe de

limpeza, associados ao aumento da frequência de cepas de Mycobacterium chelonae e M.

massiliense resistentes ao desinfetante (GRIFFITHS et al., 1997), apontaram para a clara

necessidade de sua substituição. No estado do Rio de Janeiro, esta substância está proibida

para uso por determinação do Secretário de Estado de Saúde e Defesa Civil, Sergio Cortes

(SESDEC 431/2008).

Desse modo, o agente de limpeza a base de orto-ftalaldeído tem ganhado destaque,

uma vez que é mais seguro com relação à toxicidade (AYAKI et al., 2007; IWASAWA et al.,

2011), além de ser um composto bastante estável, não necessitar de ativação para o uso e não

ser inativado na presença de matéria orgânica (ALFA & SITTER, 1994). A atividade do

Cidex Opa® vem sendo avaliada com sucesso para diversas bactérias, tais como Escherichia

coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella

enterica, Mycobacterium spp, entre outras (AKAMATSU et al., 2005; BRIDIER et al., 2011).

Após muitas pesquisas, foi verificado que ainda não há nenhum estudo publicado com

relação à atividade do orto-ftalaldeído para qualquer espécie de Clostridium existente. Além

disso, a atividade esporocida do Cidex Opa® foi avaliada somente para a bactéria Bacillus

subtilis, microrganismo considerado padrão para testes da atividade esporocida de

desinfetantes (WALSH et al., 1999). Diferentemente dos resultados obtidos em nossos

estudos com os esporos de C. difficile, o Cidex Opa® à 0,55% não demonstrou atividade

esporocida para o Bacillus subtilis. Porém, esporos de B. subtilis costumam ser mais

resistentes à ação de desinfetantes que os esporos de C. difficile (RUSSEL, 1999), como já

demonstrado para agentes liberadores de cloro ativo e para o glutaraldeído (BOUCHER

RMG, 1974).

Sua utilização na desinfecção de alto nível para endoscópios tem sido defendida por

diversos autores, mas sua aplicabilidade para desinfecção de superfícies hospitalares ainda

não vem sendo abordada. De acordo com o fabricante, o orto-ftalaldeído possui excelente

compatibilidade com diversos materiais (Figura 15).

77

Figura 15: Materiais testados e compatíveis com o desinfetante Cidex Opa® (orto-

ftalaldeído), de acordo com o fabricante (Johnson & Johnson).

AKAMATSU e colaboradores (2005) também testaram alguns dos materiais que

constam na Figura 15, submersos em orto-ftalaldeído por no mínimo 168 horas, não

encontrando qualquer vestígio de dano. Assim, a utilização deste agente de limpeza também

na desinfecção de superfícies, tais como aquelas que podem ser potenciais fontes de

contaminação por esporos de C. difficile, poderia ser melhor explorada.

Os resultados obtidos no tratamento das cepas com concentração submínima inibitória

dos desinfetantes Virkon®, Cloro Rio®, Cidex Opa®, Riohex® e Peresal®, demonstraram

diversas modificações no perfil de proteínas totais para as cepas C. difficile avaliadas,

principalmente no que se refere ao aumento ou diminuição da densidade das bandas de

proteínas, visualizadas nos géis de SDS-PAGE e através da análise automatizada. Suspeita-se

que essas diferenças podem estar vinculadas a uma adaptação ao estresse, ou mesmo a

mecanismos de resistência aos desinfetantes testados.

Algumas bactérias possuem a habilidade de adaptar-se ao estresse provocado por

agente químico ou de outra natureza (STORTZ & HENGGE-ARONIS, 2000). GOULD

(1989) apontou que as células vegetativas reagem homeostaticamente ao estresse de diversas

maneiras, como por exemplo, através da ativação da expressão de grupos de genes latentes

após a exposição ao estresse oxidativo. Esta característica poderia explicar as modificações

observadas no perfil de proteínas totais de nossas cepas.

78

A resistência aos agentes biocidas tem sido amplamente estudada para bactérias. Os

principais mecanismos são associados à redução da captação da substância, através da

impermeabilidade e/ou produção de bombas de efluxo (RUSSELLL & CHOPRA, 1996). Há

também a possibilidade de ocorrer mutação, degradação enzimática do biocida ou mesmo um

grande aumento da produção do sítio alvo do desinfetante (do inglês “overproduction of

target”) (RUSSELL, 2002).

A propagação global da CDI tem evidenciado a importância de outros ribotipos, tais

como o 50 e o 176 (NY et al., 2011), os quais exibem um alto nível de similaridade

evolucionária com o ribotipo 027 (HE et al., 2010). Análises evolucionárias do C. difficile

revelaram que esta bactéria tem um genoma altamente dinâmico, compreendendo perda e/ou

ganho de genes, rearranjos e mutações pontuais. As linhagens altamente epidêmicas de C.

difficile têm evoluído de modo independente; portanto as cepas hiper-virulentas 027, 017 e

012 são geneticamente distintas. Este fato pode explicar as diferenças observadas na

suscetibilidade aos desinfetantes. A evolução independente é aparente com a aquisição da

resistência à fluoroquinolona; um subtipo do ribotipo 027 contém uma mutação em gyrB, o

qual codifica resistência intrínseca a fluoroquinolonas (DAWSON et al., 2011).

Esta ligação genética e evolutiva pode também estar ocorrendo na resistência aos

desinfetantes. O sequenciamento genômico para cepa R20291 (ribotipo 027) revelou um

número único de bombas de efluxo e transportadores ABC para este microrganismo hiper-

virulento, os quais podem estar desempenhando um papel importante na resistência a biocidas

(STABLER et al., 2009). Assim, as proteínas que exibiram diferenças após o tratamento com

os desinfetantes testados poderiam estar vinculadas a algum mecanismo de resistência aos

biocidas citados.

Esses questionamentos só poderão ser esclarecidos após a continuidade das pesquisas

com as proteínas que foram modificadas. Pretendemos prosseguir com o trabalho buscando

respostas por meio da identificação dessas proteínas, através da análise por ESI-Q-TOF

associado à espectrometria de massa. (do inglês “Electro Spray Ionisation-Quadrupole-Time-

of-Flight Mass Spectrometry”).

7. CONCLUSÕES

- Nenhum esporo viável foi recuperado, quando as cepas de C. difficile foram tratadas

com os desinfetantes Cidex Opa® e Cloro Rio®. Deste modo, ambos poderiam ser utilizados

na rotina de desinfecção hospitalar para eliminação de formas esporuladas deste

microrganismo. O desinfetante Virkon® apenas reduziu a concentração original de esporos,

exibindo uma redução Log10 da contagem de UFCs inferior à 50% para todas as cepas C.

difficile testadas. Nenhum esporo da cepa HU17-133 foi recuperado quando esta foi tratada

com o Peresal®, porém o agente apenas reduziu a concentração original de esporos para as

cepas SJ1-135 e BI/NAP1/027, sendo a redução do Log10 inferior à 55% para ambas. O agente

de limpeza Riohex® não exerceu atividade esporocida significante frente as cepas de C.

difficile, sendo a redução do Log10 da contagem de UFCs inferior à 12% para todas testadas.

Logo, este anti-séptico pode não ser indicado para desinfecção das mãos de profissionais da

saúde que lidam com pacientes portadores da CDAD.

- Os desinfetantes Cloro Rio®, Virkon® e Riohex® foram eficazes na inibição do

crescimento das células vegetativas de todas as cepas C. difficile avaliadas, necessitando de

concentrações consideravelmente inferiores às preconizadas pelo fabricante para o uso na

rotina de desinfecção. As CMIs dos desinfetantes Cidex Opa® e Peresal® não puderam ser

obtidas devido a limitações inerentes metodologia empregada neste tipo de teste.

- De modo geral, os diferentes ribotipos de C. difficile avaliados exibiram

sensibilidade semelhante frente aos desinfetantes, exceto pela cepa SJ1-135, que foi

significativamente menos sensível que as demais quando tratada com o Virkon®, e a cepa

HU17-133, que se mostrou mais sensível que as outras frente ao agente de limpeza Peresal®.

80

- O perfil de proteínas totais para as células vegetativas dos ribotipos C. difficile

avaliados neste estudo, mostraram diferenças marcantes principalmente quando as cepas

foram tratadas com os desinfetantes Cloro Rio® e Riohex®.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AAS, J.; GESSERT, C. E.; BAKKEN, J. S. Recurrent Clostridium difficile colitis: case series

involving 18 patients treated with donor stool administered via a nasogastric tube. Clin. Infect.

Dis., 36 (5): 580–585, 2003.

AKAMATSU, T.; MINEMOTO, M.; UYEDA, M. Evaluation of the antimicrobial activity and

materials compatibility of orthophthalaldehyde as a high-level disinfectant. J. Int. Med. Res., 33

(2): 178-187, 2005.

ALCIDES, A.P.; BRAZIER, J.S.; PINTO, L.J.; BALASSIANO, I.T.; BOENTE, R.F.; DE PAULA,

G.R.; FERREIRA, E.O.; AVELAR, K.E.; MIRANDA, K.R.; FERREIRA, M.C.; DOMINGUES, .RM.

New PCR ribotypes of Clostridium difficile detected in children in Brazil: prevalent types of

Clostridium difficile in Brazil. Antonie Van Leeuwenhoek, 92 (1): 53-59, 2007.

ALFA, M.J. & SITTER, D.L. In-hospital evaluation of ortho-phthalaldehyde as a high level

disinfectant for flexible endoscopes. J. Hosp. Infect., 26 (1): 15-26, 1994.

APISARNTHANARAK, A.; RAZAVI, B.; MUNDY, L.M. Adjunctive intracolonic vancomycin for

severe Clostridium difficile colitis: case series and review of the literature. Clin. Infect. Dis., 35

(6): 690-696, 2002.

ASTM E2414 – 5. Standard test method for quantitative sporicidal three-step method (TSM) to

determine sporocidal eddicacy of liquids, liquid sprays, and vapor or gases on contaminated

carrier surfaces. EUA, 2005.

AUSIELLO, C.M. Surface layer proteins from Clostridium difficile induce inflammatory and

regulatory cytokines in human monocytes and dendritic cells. Microbes. Infect., 8 (11): 2640-

2646, 2006.

AYAKI, M.; SHIMADA, K.; YAGUCHI, S.; KOIDE, R.; IWASAWA, A. Corneal ad conjunctival

toxicity of disinfectnts assessing safety for use with ophthalmic surgical instruments. Regul.

Toxicol. Pharmacol., 48 (3): 292-295, 2007.

B BRAUN. Produtos para desinfecção de superfícies: VIRKON. Disponível em:

<http://www.bbraun.com.br/cps/rde/xchg/bbraunbr/hs.xsl/products.html?id=00020741690000000540

&prid=PRID00005551>. Acesso em: 26 de março de 2011.

BALASSIANO, I.T.; MIRANDA, K.R.; BOENTE, R.F.; PAUER, H.; OLIVEIRA, I.C.; SANTOS-

FILHO, J; AMORIM, E.L.; CANINÉ, G.A.; SOUZA, C.F.; GOMES, M.Z.; FERREIRA, E.O.;

BRAZIER, J.S. & DOMINGUES, R.M.C.P. Characterization of Clostridium difficile strains

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Alcides%20AP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brazier%20JS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pinto%20LJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Balassiano%20IT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boente%20RF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22de%20Paula%20GR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22de%20Paula%20GR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ferreira%20EO%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Avelar%20KE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miranda%20KR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ferreira%20MC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Domingues%20RM%22%5BAuthor%5D

http://www.bbraun.com.br/cps/rde/xchg/bbraunbr/hs.xsl/products.html?id=00020741690000000540&prid=PRID00005551

http://www.bbraun.com.br/cps/rde/xchg/bbraunbr/hs.xsl/products.html?id=00020741690000000540&prid=PRID00005551

82

isolated from immunosuppressed inpatients in a hospital in Rio de Janeiro, Brazil. Anaerobe, 15

(3): 61-64, 2009.

BALASSIANO, I.T.; SANTOS-FILHO, J; OLIVEIRA, M.P.B.; RAMOS, M.C.; JAPIASSU, A.M.;

REIS, A.M.; FERREIRA, E.O.; BRAZIER, J.S. & DOMINGUES, R.M.C.P. An outbreak case of

Clostridium difficile-associated diarrhea among elderly inpatients of an intensive care unit of a

tertiary hospital in Rio de Janeiro, Brazil. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 68 (4): 449-455, 2010.

BALASSIANO, I.T.; SANTOS-FILHO, J; VITAL-BRASIL, J.M.; NOUÉR, S.A.; SOUZA, C.F.;

FERREIRA, E.O.; BRAZIER, J.S. & DOMINGUES, R.M.C.P. Detection of cross-infection

associated to a Brazilian PCR-ribotype of Clostridium difficile in a university hospital in Rio de

Janeiro, Brazil. Antonie Van Leeuwenhoek, 99 (2): 249-255, 2011.

BARBUT, F. Clostridium difficile infections: an unexpected re-emergence. Pathol. Biol. (Paris), 56

(1): 6-9, 2008.

BARBUT, F.; RICHARD, A.; HAMADI, K.; CHOMETTE, V.; BURGHOFFER, B.; PETIT, J.C.

Epidemiology of recurrences or reinfections of Clostridium difficile-associated diarrhea. J. Clin.

Microbiol., 38 (6): 2386-2388, 2000.

BARBUT, F.; DECRÉ, D.; LALANDE, V.; BURGHOFFER, B.; NOUSSAIR, L.; GIGANDON,

A.; ESPINASSE, F.; RASKINE, L.; ROBERT, J.; MANGEOL, A.; BRANGER, C.; PETIT, J.C.

Clinical features of Clostridium difficile-associated diarrhoea due to binary toxin (actin-specific

ADP-ribosyltransferase)-producing strains. J. Med. Microbiol., 54 (Pt 2): 181-185, 2005.

BARBUT. F.; MENUET, D.; VERACHTEN, M.; GIROU, E. Comparison of the efficacy of a

hydrogen peroxide dry-mist disinfection system and sodium hypochlorite solution for

eradication of Clostridium difficile spores. Infect. Control. Hosp. Epidemiol., 30 (6): 507-514, 2009.

BARTLETT, J.G. & GERDING, D.N. Clinical recognition and diagnosis of Clostridium difficile

infection. Clin. Infect. Dis, 46 (1): 12-18, 2008.

BARTLETT, J.G. Clostridium difficile infection: historic review. Anaerobe, 15 (6): 227-229, 2009.

BARTLETT, J.G. Clostridium difficile: history of its role as an enteric pathogen and the current

state of knowledge about the organism. Clin. Infect. Dis., 18 (Suppl 4): S265-S272, 1994.

BEATRIS, A. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2006.

BEST, E.L.; FAWLEY, W.N.; PARNELL, P.; WILCOX, M.H. The potential for airbone dispersal

os Clostridium difficile from symptomatic patients. Clin. Infect. Dis., 50 (11): 1450-1457, 2010.

BLOCK, C. The effect of perasafe and sodium dichloroisocyanurate (NaDCC) against spores of

Clostridium difficile and bacillus atrophaeus on stainless steel and polyvinyl chloride surfaces. J.

Hosp. Infect., 57 (2): 144-148, 2004.

BLOCK, C.; ROBENSHTOK, E.; SIMHON, A.; SHAPIRO, M. Evaluation of chlorhexidine and

povidone iodine activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-

resistant Enterococcus faecalis using a surface test. J. Hosp. Infect., 46 (2): 147-152, 2000.

BLOT, E.; ESCANDE, M.C.; BESSON, D.; BARBUT, F.; GRANPEIX, C.; ASSELAIN,

B.; FALCOU, M.C.; POUILLART, P. Outbreak of Clostridium difficile-related diarrhoea in an

adult oncology unit: risk factors and microbiological characteristics. J. Hosp. Infect., 53 (3): 187-

92, 2003.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Barbut%20F%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Decr%C3%A9%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lalande%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Burghoffer%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Noussair%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gigandon%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gigandon%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Espinasse%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Raskine%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Robert%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mangeol%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Branger%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Petit%20JC%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Menuet%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Verachten%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Girou%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bartlett%20JG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Blot%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Escande%20MC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Besson%20D%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Granpeix%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Asselain%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Asselain%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Falcou%20MC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pouillart%20P%22%5BAuthor%5D

83

BLUNDELL, G. & BRYDON, W.G. High performance liquid chromatography of plasma

aminoacids using ortho-pthalaldehyde derivatisation. Clin. Chim. Acta, 170 (1): 79-84, 1987.

BORGMANN, S.; KIST, M.; JAKOBIAK, T.; REIL, M.; SCHOLZ, E.; VON EICHEL-STREIBER,

C.; GRUBER, H.; BRAZIER, J.S.; SCHULTE, B. Increased number of Clostridium difficile

infections and prevalence of Clostridium difficile PCR ribotype 001 in southern Germany. Euro.

Surveill., 13 (49). pii: 19057, 2008.

BORRIELLO, S.P.; WELCH, A.R.; LARSON, H.E.; BARCLAY. F. Diarrhoea and simultaneous

excretion of Clostridium difficile cytotoxin and C perfringens enterotoxin. Lancet., 2 (8413): 1218,

1984.

BOYCE, J.M.; HAVILL, N.L.; OTTER, J.A.; ADAMS, N.M. Widespread environmental

contamination associated with patients with diarrhea and methicillin-resistant Staphylococcus

aureus colonization of the gastrointestinal tract. Infect. Control Hosp. Epidemiol., 28 (10): 1142-

1147, 2007.

BRASIL. Ministério da Saúde. Coordenação de Controle de Infecção Hospitalar. Processamento de

Artigos e Superfícies em Estabelecimentos de Saúde. 2ª ed., Brasília: 1994. Disponível em:

<http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/superficie.pdf>. Acessado em 20 de fevereiro de 2011.

BRIDIER, A.; BRIANDET, R.; THOMAS, V.; DUBOIS-BRISSONNET, F. Comparative biocidal

activity of peracetic acid, benzalkonium chloride and ortho-phthalaldehyde on 77 bacterial

strains. J. Hosp. Infect., 78 (3): 208-213, 2011.

BRUCKNER, N.I. Cidex Plus 28-day solution: a new stabilized alkaline glutaraldehyde

disinfecting and sterilizing solution. ASEPSIS: The Infection Control Forum Second Quarter, 8: 22-

24, 1986.

CABRERA-MARTINEZ, R.M.; SETLOW B.; SETLOW, P. Studies on the mechanisms of the

sporicidal action of ortho-phthalaldehyde. J. Appl. Microbiol., 92 (4): 675-680, 2002.

CADLE, R.M.; MANSOURI, M.D.; LOGAN, N.; KUDVA, D.R.; MUSHER, D.M. Association of

proton-pump inhibitors with outcomes in Clostridium difficile colitis. Am. J. Health Syst. Pharm.,

64 (22): 2359-2363, 2007.

CALABI, E. & FAIRWEATHER, N. Patterns of sequence conservation in the S-layer proteins

and related sequences in Clostridium difficile. J. Bacteriol., 184 (14): 3886-3897, 2002a.

CALABI, E.; CALABI, F.; PHILLIPS, A.D.; FAIRWEATHER, N.F. Binding of Clostridium difficile

surface layer proteins to gastrointestinal tissues. Infect. Immun., 70 (10): 5770-5778, 2002b.

CARTER, G.P.; LYRAS, D.; ALLEN, D.L.; MACKIN, K.E.; HOWARTH, P.M.; O'CONNOR,

J.R; ROOD, J.I. Binary toxin production in Clostridium difficile is regulated by CdtR, a LytTR

family response regulator. J. Bacteriol., 189 (20): 7290-7301, 2007.

CARTER, Y. & BARRY, D. Tackling Clostridium difficile with environmental cleaning. Nurs.

Times, 107 (36): 22-25.

CDC (Centers for Disease Control and Prevention). Information for healthcare providers.

Atualizado em 22 de julho 2005. Disponível em

<http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/id_CdiffFAQ_HCP.html>. Acessado em 8 de abril de 2011.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Borriello%20SP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Welch%20AR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Larson%20HE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Barclay%20F%22%5BAuthor%5D

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/superficie.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carter%20GP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lyras%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Allen%20DL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mackin%20KE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Howarth%20PM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22O'Connor%20JR%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rood%20JI%22%5BAuthor%5D

84

CDC (Centers for Disease Control and Prevention). Severe Clostridium difficile-associated disease in

populations previously at low risk—four states, 2005. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep., 54 (47):

1201-1205, 2005.

CERQUETTI, M.; MOLINARI, A.; SEBASTIANELLI, A.; DIOCIAIUTI, M.; PETRUZZELLI, R.;

CAPO, C.; MASTRANTONIO, P. Characterization of surface layer proteins from different

Clostridium difficile clinical isolates. Microb. Pathog., 28 (6): 363-372, 2000.

CHAKRABARTI, S.; LEES, A.; JONES, S.G.; MILLIGAN, D.W. Clostridium difficile infection in

allogeneic stem cell transplant recipients is associated with severe graft-versus-host disease and

non-relapse mortality. Bone Marrow Transplant, 26 (8): 871-876, 2000.

CHANG, V.T. & NELSON, K. The role of physical proximity in nosocomial diarrhea. Clin. Infect.

Dis., 31 (3): 717-722, 2000.

CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial

Susceptibility Testing: Nineteenth Informational Supplement M100-S20. CLSI, Wayne, PA, USA,

2010.

COHEN, S.H.; TANG, Y.J.; HANSEN, B.; SILVA, J. JR. Isolation of a toxin B-deficient mutant

strain of Clostridium difficile in a case of recurrent C. difficile-associated diarrhea. Clin. Infect.

Dis., 26 (2): 410-412, 1998.

DAVIES, R.M. & HULL, P.S. Plaque inhibition and distribution of chlorhexidine in beagle dogs.

J. Periodontal Res. Suppl. 12: 22-27, 1973.

DAWSON, L.F.; VALIENTE, E.; DONAHUE, E.H.; BIRCHENOUGH, G.; WREN, B.W.

Hypervirulent Clostridium difficile PCR-ribotypes exhibit resistance to widely used

disinfectants. PLoS One, 6 (10): e25754, 2011.

DEPITRE, C.; AVESANI, V.; DELMÉE, M.; CORTHIER, G. Detection of Clostridium difficile

toxins in stools. Comparison between a new enzyme immunoassay for toxin A and other routine

tests. Gastroenterol. Clin. Biol.,17 (4): 283-286, 1993.

DIAL, S.; ALRASADI, K.; MANOUKIAN, C.; HUANG, A. & MENZIES, D. Risk of Clostridium

difficile diarrhea among hospital in patients prescribed proton pump inhibitors: cohort and

case-control studies. Can. Med. Assoc. J., 171 (1): 33-38, 2004.

DIAL, S.; DELANEY, J.A.; BARKUN, A.N.; SUISSA, S. Use of gastric acid-suppressive agents

and the risk of community-acquired Clostridium difficile-associated disease. JAMA, 294 (23):

2989-2995, 2005.

DINEEN, S.S.; VILLAPAKKAM, A.C.; NORDMAN, J.T.; SONENSHEIN, A.L. Repression of

Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol., 66 (1): 206-219, 2007.

DOBSON, G.; HICKEY, C.; TRINDER, J. Clostridium difficile colitis causing toxic megacolon,

severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Intensive Care Med., 29 (6): 1030, 2003.

DUARTE, R.S.; LOURENÇO, M.C.; FONSECA, L.D.; LEÃO, S.C.; AMORIM, E.D.; et al.

Epidemic of postsurgical infections caused by Mycobacterium massiliense. J. Clin. Microbiol., 47

(7): 2149-2155, 2009.

DUBBERKE, E.R.; BUTLER, A.M.; RESKE, K.A. Attributable outcomes of endemic Clostridium

difficile- associated disease in nonsurgical patients. Emerg. Infect. Dis., 14 (7): 1031-1038, 2008.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cohen%20SH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tang%20YJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hansen%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Silva%20J%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Depitre%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Avesani%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Delm%C3%A9e%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Corthier%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dineen%20SS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Villapakkam%20AC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nordman%20JT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sonenshein%20AL%22%5BAuthor%5D

85

DUBBERKE, E.R.; RESKE, K.A.; NOBLE-WANG, J.; THOMPSON, A.; KILLGORE, G.;

MAYFIELD, J.L.; CAMINS, B.; WOELTJE, K.; MCDONALD, J.R.; MCDONALD, L.C.; FRASER,

V.J. Prevalence of Clostridium difficile environmental contamination and strain variability in

multiple health care facilities. Am. J. Infect. Control., 35 (5): 315-318, 2007.

DUMFORD, D.M.; NERANDZIC, M.M.; ECKSTEIN, B.C.; DONSKEY, C.J. What is on that

keyboard? Detecting hidden environmental reservoirs of Clostridium difficile during an

outbreak associated with North American pulsed-field gel electrophoresis type I strains. Am. J.

Infect Control, 37 (1): 15-19, 2009.

DUPUY, B.; GOVIND, R.; ANTUNES, A.; MATAMOUROS, S. Clostridium difficile toxin

synthesis is negatively regulated by TcdC. J. Med. Microbiol., 57 (6): 685-689, 2008.

DYCHDALA, G.R. Chlorine and chlorine compounds. In: Block, S.S., ed. Disinfection,

sterilization, and preservation. Philadelphia: Lippincott Williams & Willkins, 135-157, 2011.

ELIXHAUSER, A. (AHRQ); JHUNG, M.A. (Centers for Disease Control and Prevention).

Clostridium difficile-Associated Disease in U.S. Hospitals, 1993-2005. HCUP Statistical Brief, 2008.

Disponível em <Agency for Healthcare Research and Quality, Rockville, MD. Disponível em

<http://www.hcup-us.ahrq.gov/reports/statbriefs/sb50.pdf>. Acessado em: 20 de março de 2011.

FAVERO, M.S. & BOND, W.W. Chemical disinfection of medical and surgical materials. In:

Block, S.S. Desinfection, sterilization and preservation, 4th ed. Philadelphia: Lea and Febiger, 617-

641, 1991.

FAWLEY, W.N.; PARNELL, P.; VERITY, P.; FREEMAN, J.; WILCOX, M.N. Molecular

epidemiology of endemic Clostridium difficile infection and the significance of subtypes of the

United Kingdom epidemic strains (PCR ribotype I). J. Clin. Microbiol., 43 (6): 2685-2696, 2005

FAWLEY, W.N.; UNDERWOOD, S.; FREEMAN, J.; BAINES, S.D.; SAXTON, K.;

STEPHENSON, K.; OWENS, C.R.JR.; WILCOX, M.H. Efficacy of hospital cleaning agents and

germicides against epidemic Clostridium difficile strains. Infect. Cont. Hosp. Epidem., 28 (8): 920-

925, 2007.

FERNANDEZ, A.; ANAND, G.; FRIEDENBERG, F. Factors associated with failure of

metronidazole in Clostridium difficile-associated disease. J. Clin. Gastroenterol., 38 (5): 414 418,

2004.

FERREIRA, M.C.S.; DOMINGUES, R.M.C.P. AND UZEDA, M. Manual de Bacteriologia de

Anaeróbios. Rio de Janeiro, 2003.

FISHMAN, M. Antimicrobial stewardship. Am. J. Med., 119 (6): 53-61, 2006.

GAPANY-GAPANAVICIUS, M.; YELLIN, A.; ALMOG, S.; TIROSH, M. Pneumomediastinum. A

complication of chlorine exposure from mixing household cleaning agents. JAMA, 248 (3): 349-

350, 1982.

GAYNES, R.; RIMLAND, D.; KILLUM, E.; LOWERY, H.K.; JOHNSON, T.M., KILLGORE,

G.; TENOVER, F.C. Outbreak of Clostridium difficile infection in a long-term care facility:

association with gatifloxacin use. Clin. Infect. Dis., 38 (5): 640–645, 2004.

GEHR. Peracetic acid as a disinfectant for municipal wastewaters: encouraging performance

results from physicochemical as well as biological effluents, 2002.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fraser%20VJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fraser%20VJ%22%5BAuthor%5D

http://www.hcup-us.ahrq.gov/reports/statbriefs/sb50.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gaynes%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rimland%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Killum%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lowery%20HK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Johnson%20TM%202nd%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Killgore%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Killgore%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tenover%20FC%22%5BAuthor%5D

86

GEORGE, W.L., SUTTER, V.L., CITRON, D. AND FINEGOLD, S.M. Selective and differential

medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol., 9 (2): 214-219, 1979.

GERBA, C.P. & RUSIN, P. Relationship between the use of antiseptics/disinfectants and the

development of antimicrobial resistence. In: Rutala, W.A., ed. Disinfection, sterilization and

antisepsis: principles and practices in healthcare facilities, DC: Association for Professional in

Infection Control and Epidemiology, 187-194, 2001.

GERDING, D.D.N.; JOHNSON, S.S.; PETERSON, L.L.R.; MULLIGAN, M.M.E.; SILVA, J.J.

Clostridium difficile associated diarrhea and colitis. Infect. Control. Hosp. Epidemiol., 16 (8): 459-

477, 1995.

GERDING, D.N.; MUTO, C.A.; OWENS, R.C. JR. Measures to control and prevent Clostridium

difficile infection. Clin. Infect. Dis., 46 (suppl. 1): S43-49, 2008.

GOORHUIS, A.; VAN DER KOOI, T.; VAESSEN, N.; DEKKER, F.W.; VAN DEN BERG,

R.; HARMANUS, C.; VAN DEN HOF, S.; NOTERMANS, D.W.; KUIJPER, E.J. Spread and

epidemiology of Clostridium difficile polymerase chain reaction ribotype 027/toxinotype III in

The Netherlands. Clin. Infect. Dis., 45 (6): 695-703, 2007.

GOULD, G.W. Heat-induced injury and inactivation. In: Mechanisms of action of food

preservation procedures, Elsevier Applied Science, London: 11-42, 1989.

GREGORY, A.W. & SCHAALJE, G.B; SMART, J.D.; ROBISON, R.A. The mycobactericidal

efficacy of ortho-phthalaldehyde and the comparative resistances of Mycobacterium bovis,

Micobacterium terrae, and Mycobacterium chelonae. Infect. Control Hosp. Epidemiol., 20 (5):

324-330, 1999.

GRIFFITHS, P.A.; BABB, J.R.; BRADLEY, C.R.; FRAISE, A.P. Glutaraldehyde-resistant

Micobacterium chelonae from endoscope washer disinfectors. J. Appl. Microbiol., 82 (4): 519-526,

1997.

GUERLAVA, P.; IZAC, V.; THOLOZAN, J.L. Comparison of different methods of cell lysis and

protein measurements in Clostridium perfringens: application to the cell volume determination.

Curr. Microbiol., 36 (3): 131-135, 1998.

HE, M; SEBAIHIA, M.; LAWEY, T.D.; STABLER, R.A.; DAWSON, L.F.; Evolutionary dynamics

of Clostridium difficile over short and long time scales. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107 (16): 7527-

7532, 2010.

HIRSCHHORN, L.; TRNKA, Y.; ONDERDONK, A.; LEE, M.; PLATT, R. Epidemiology of

community-acquired Clostridium difficile-associated diarrhea. J. Infect. Dis., 169 (1):127-133,

1994.

HOOKMAN, P. & BARKIN, J.S. Clostridium difficile associated infection, diarrhea and Colitis.

World. J. Gastroenterol., 15 (13): 1554-1580, 2009.

HOREJSH, D. & KAMPF, G. Efficacy of three surface disinfectants against spores of Clostridium

difficile ribotype 027. Int. J. Hyg. Environ. Health, 214 (2): 172-174, 2010.

HOTA B. Contamination, disinfection, and cross-colonization: are hospital surfaces reservoirs

for nosocomial infection? Clin. Infect. Dis., 39 (8):1182-1189, 2004.

HUGO, W.B. & LONGWORTH, A.R. Some aspects of the mode of action of chlorhexidine. J.

Pharm. Pharmacol., 16: 655-662, 1964.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gerding%20DN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Muto%20CA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Owens%20RC%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Goorhuis%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20der%20Kooi%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vaessen%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dekker%20FW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20den%20Berg%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20den%20Berg%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Harmanus%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20den%20Hof%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Notermans%20DW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kuijper%20EJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hookman%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Barkin%20JS%22%5BAuthor%5D

87

HUGO, W.B. & RUSSEL, A.D. Types of antimicrobial Agents. In: Russel, A.D.; Hugo, W.B.;

Ayliffe, G.A. (ed). Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization. Oxford,

Blackwell Scientific Publication, 8: 1065-1982, 1999.

HURLEY, B.W. & NGUYEN, C.C. The spectrum of pseudomembranous enterocolitis and

antibiotic-associated diarrhea. Arch. Intern. Med., 162 (19): 2177-2184, 2002.

International Agency for Research on Cancer (IARC), World Health Organization. World Health

Organization. Disponível em: <http://www.iarc.fr>. Acessado em 20 de janeiro de 2009.

IWASAWA, A.; NIWANO, Y.; KOHNO, M.; AYAKI, M. Bactericidal effects and Cytotoxicity of

new aromatic dialdehyde disinfectants (ortho-phthalaldehyde). Biocontrol Sci., 16 (4): 165-170,

2011.

JOHANSEN, A.; VASISHTA, S.; EDISON, P; HOSEN, I. Clostridium difficile associated diarrhea:

how good are nurses at identifying the disease? Age Ageing, 31 (6): 487-488, 2002.

JOHNSON & JOHNSON. Cidex Opa®: Desinfetante hospitalar para artigos semi-críticos.

Manual explicativo do produto. Disponível em: <

http://www.riscobiologico.org/lista/20090413_01.pdf>. Acessado em 15 de março de 2011.

JOHNSON, S.; GERDING, D.N.; OLSON, M.M.; WEILER, M.D.; HUGHES, R.A.; CLABOTS,

C.R.; PETERSON, L.R. Prospective, controlled study of vinyl glove use to interrupt Clostridium

difficile nosocomial transmission. Am. J. Med., 88 (2): 137-140, 1990.

JOHNSON, S.; SCHRIEVER, C.; GALANG, M.; KELLY, C.P.; GERDING, D.N. Interruption of

recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea episodes by serial therapy with vancomycin

and rifaximin. Clin. Infect. Dis., 44 (6): 846-848, 2007.

JOHNSON, S.; ADELMANN, A.; CLABOTS, C.R.; PETERSON, L.R.; GERDING, D.N.

Recurrences of Clostridium difficile diarrhea not caused by the original infecting organism. J.

Infect. Dis., 159 (2): 340-343, 1989.

JOHNSON, S.; SAMORE, M.H.; FARROW, K.A.; KILLGORE, G.E.; TENOVER, F.C.; LYRAS,

D.; ROOD, J.I.; DEGIROLAMI, P.; BALTCH, A.L.; RAFFERTY, M.E.; PEAR, S.M.; GERDING,

D.N. Epidemics of diarrhea caused by a clindamycin-resistant strain of Clostridium difficile in

four hospitals. N. Engl. J. Med., 341 (22): 1645–1651, 1999.

JUMP, R.L.; PULTZ, M.J.; DONSKEY, C.J. Vegetative Clostridium difficile survives in room air

on moist surfaces and in gastric contents with reduced acidity: a potential mechanism to explain

the association between proton pump inhibitors and C. difficile-associated diarrhea? Antimicrob.

Agents Chemother., 51 (8): 2883-2887, 2007.

KAATZ, G.W.; GITLIN, S.D.; SCHABERG, D.R.; WILSON, K.H.; KAUFFMAN, C.A.; SEO,

S.M.; FEKETY, R. Acquisition of Clostridium difficile from the hospital environment. Am. J.

Epidemiol., 127 (6): 1289-1294, 1988.

KATO, H.; ITO, Y.; VAN DEN BERG, R.J.; KUIJPER, E.J.; ARAKAWA, Y. First isolation of

Clostridium difficile 027 in Japan. Euro. Surveill., 12 (1): E070111.3, 2007.

KELLY, C.P.; POTHOULAKIS, C.; LAMONT, J.T. Clostridium difficile colitis. N. Engl. J. Med.,

330 (4): 257-262, 1994.

KNIGHT, N.; STRAIT, T.; ANTHONY, N.; LOVELL, P.; NORTON, H.J.; SAUTTER, R.;

SCOBEY, M. Clostridium difficile colitis: a retrospective study of incidence and severity before

http://www.iarc.fr/

http://www.riscobiologico.org/lista/20090413_01.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Johnson%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Adelmann%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Clabots%20CR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Peterson%20LR%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Samore%20MH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Farrow%20KA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Killgore%20GE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tenover%20FC%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rood%20JI%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22DeGirolami%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Baltch%20AL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rafferty%20ME%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pear%20SM%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kaatz%20GW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gitlin%20SD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schaberg%20DR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wilson%20KH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kauffman%20CA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Seo%20SM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Seo%20SM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fekety%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kato%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ito%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20den%20Berg%20RJ%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Arakawa%20Y%22%5BAuthor%5D

88

and after institution of an alcohol-based hand rub policy. Am. J. Infect. Control, 38 (7): 523-528,

2010.

KRAMER, A.; SCHWEBKE, I.; KAMPF, G. How long do nosocomial pathogens persist on

inanimate surfaces? A systematic review. BMC Infect. Dis., 6: 130, 2006.

KUIJPER, E.J.; BARBUT, F.; BRAZIER, J.S.; KLEINKAUF, N.; ECKMANNS, T.; LAMBERT,

M.L.; DRUDY, D., FITZPATRICK F, WIUFF C, BROWN DJ, COIA JE, PITUCH H, REICHERT

P, EVEN J, MOSSONG J, WIDMER AF,OLSEN KE, ALLERBERGER F, NOTERMANS

DW, DELMÉE M, COIGNARD B, WILCOX M, PATEL B, FREI R, NAGY E, BOUZA E, MARIN

M, AKERLUND T, VIROLAINEN-JULKUNEN A, LYYTIKÄINEN O, KOTILA

S,INGEBRETSEN A, SMYTH B, ROONEY P, POXTON IR, MONNET DL. Update of Clostridium

difficile infection due to PCR ribotype 027 in Europe, 2008. Euro. Surveill., 13 (31) pii: 18942,

2008.

KUIJPER, E.J.; VAN DISSEL, J.T.; WILCOX, M.H. Clostridium difficile: changing epidemiology

and new treatment options. Curr. Opin. Infect. Dis., 20 (4): 376-383, 2007.

KYNE, L.; WARNY, M.; QAMAR, A. & KELLY, C. P. Association between antibody response to

toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet, 357 (9251): 189–

193, 2001.

KYNE, L.; WARNY, M.; QAMAR, A.; KELLY, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium

difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. N. Engl. J. Med., 342 (6): 390-397,

2000.

KYNE, L.; SOUGIOULTZIS, S.; DRUDY, D.; KEATES, S.; MAROO, S.; POTHOULAKIS,

C.; GIANNASCA, P.J.; LEE, C.K.; WARNY, M.; MONATH, T.P.; KELLY, C.P. Clostridium

difficile toxoid vaccine in recurrent C. difficile-associated diarrhea. Gastroenterology, 128 (3):

764-770, 2005.

LABBÉ, A.C.; POIRIER, L.; MACCANNELL, D.; LOUIE, T.; SAVOIE, M.; BÉLIVEAU,

C.; LAVERDIÈRE, M.; PÉPIN, J. Clostridium difficile infections in a Canadian tertiary care

hospital before and during a regional epidemic associated with the BI/NAP1/027 strain. Antimicrob. Agents. Chemother., 52 (9): 3180-3187, 2008.

LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature, 15: 227 (5259): 680-685, 1970.

LAMONTAGNE, F.; LABBE, A.C.; HAECK, O.; LESUR, O.; LALANCETTE, M.; PATINO, C.;

LEBLANC, M.; LAVERDIERE, M.; PEPIN, J. Impact of emergency colectomy on survival of

patients with fulminant Clostridium difficile colitis during an epidemic caused by a hypervirulent

strain. Ann. Surg., 245 (2): 267-272, 2007.

LEISCHNER, J.; JOHNSON, S.; SAMBOL, S.; PARADA, J.; GERDING, D. Effect of alcohol hand

gels and chlorhexidine hand wash in removing spores of Clostridium difficile (CD) from hands [abstract LB-29]. In: Program and abstracts of the 45th Annual Interscience Conference on

Antimicrobials and Chemotherapy (Washington, DC). 2005.

LEWIS, D.L. & ARENS, M. Resistance of microorganisms to disinfection in dental and medical

devices. Nat. Med., 1 (9): 956-958, 1995.

LINEVSKY, J.K.; POTHOULAKIS, C.; KEATES, S.; WARNY, M.; KEATES, A.C.; LAMONT,

J.T.; KELLY, C.P. IL-8 release and neutrophil activation by Clostridium difficile toxin-exposed

human monocytes. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 273 (6): 1333-1340, 1997.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kramer%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schwebke%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kampf%20G%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brazier%20JS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kleinkauf%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Eckmanns%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lambert%20ML%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lambert%20ML%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Drudy%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fitzpatrick%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wiuff%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brown%20DJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Coia%20JE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pituch%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reichert%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reichert%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Even%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mossong%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Widmer%20AF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Olsen%20KE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Allerberger%20F%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Delm%C3%A9e%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Coignard%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wilcox%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Patel%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Frei%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nagy%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bouza%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Marin%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Marin%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Akerlund%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Virolainen-Julkunen%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lyytik%C3%A4inen%20O%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kotila%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kotila%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ingebretsen%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Smyth%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rooney%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Poxton%20IR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Monnet%20DL%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Dissel%20JT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wilcox%20MH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kyne%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sougioultzis%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Drudy%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Keates%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maroo%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pothoulakis%20C%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Giannasca%20PJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lee%20CK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Warny%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Monath%20TP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kelly%20CP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Labb%C3%A9%20AC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Poirier%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maccannell%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Louie%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Savoie%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22B%C3%A9liveau%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22B%C3%A9liveau%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Laverdi%C3%A8re%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22P%C3%A9pin%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Linevsky%20JK%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Keates%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Warny%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Keates%20AC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lamont%20JT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lamont%20JT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kelly%20CP%22%5BAuthor%5D

89

LOO, V.G.; POIRIER, L.; MILLER, M.A.; OUGHTON, M.; LIBMAN, M.D.; MICHAUD,

S.; BOURGAULT, A.M.; NGUYEN, T.; FRENETTE, C.; KELLY, M.; VIBIEN, A.; BRASSARD,

P.; FENN, S.; DEWAR, K.; HUDSON, T.J; HORN, R.; RENÉ, P.; MONCZAK, Y.; DASCAL, A. A

predominantly clonal multiinstitutional outbreak of Clostridium difficile associated diarrhea

with high morbidity and mortality. N. Engl. J. Med., 353 (23): 2442–2449, 2005.

LOUIE, T.; GERSON, M.; GRIMARD, D.; JOHNSON, S.; POIRIER, A.; WEISS, K.; PEPPE, J.;

DONOVAN, J.; DAVIDSON, D. Results of a phase III trial comparing tolevamer, vancomycin

and metronidazole in patients with Clostridium difficile-associated diarrhea (CDAD). Em

Programs and Abstracts of the 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and

Chemotherapy; Chicago IL. American Society for Microbiology, Setembro 17-20, 2007.

MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M. AND PARKER, J. Brock Biology of Microorganisms. 9th

ed., 2000. Prentice-Hall. New Jersey.

MAGALHÃES, S.M.S. & CARVALHO, W.S. Reações Adversas a Medicamentos. In: GOMES,

M.J.V.M. & REIS, A.M.M. (Org). Ciências Farmacêuticas: Uma Abordagem em Farmácia Hospitalar.

São Paulo: Atheneu, 125-145, 2003.

MANI, N.; DUPUY, B. Regulation of toxin synthesis in Clostridium difficile by an alternative

RNA polymerase sigma factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 98 (10): 5844-5849, 2001.

MATAMOUROS, S.; ENGLAND, P.; DUPUY, B. Clostridium difficile toxin expression is

inhibited by the novel regulator TcdC. Mol. Microbiol., 64 (5): 1274-1288, 2007.

MAYFIELD, J. L.; LEET, T.; MILLER, J.; MUNDY, L. M. Environmental control to reduce

transmission of Clostridium difficile. Clin. Infect. Dis., 31 (4): 995-1000, 2000.

MCDONALD, L.C; KILLGORE, G.E.; THOMPSON, A.; OWENS, R.C. JR.; KAZAKOVA,

S.V.; SAMBOL, S.P.; JOHNSON, S.; GERDING, D.N. An epidemic, toxin gene-variant strain of

Clostridium difficile. N. Engl. J. Med., 353 (23): 2433-2441, 2005.

MCDONNELL, G. & RUSSELL, A.D. Antiseptic and disinfectants: activity, action, and

resistance. Clin. Microbiol. Rev., 12 (1): 147-179, 1999.

MCDONNELL, G.E. Antisepsis, disinfection, and sterilization: types, action, and resistance. ASM

Press. Washington, D.C., 2007.

MCELLISTREM, M.C.; CARMAN, R.J.; GERDING, D.N.; GENHEIMER, C.W.; ZHENG, L. A

hospital outbreak of Clostridium difficile disease associated with isolates carrying binary toxin

genes. Clin. Infect. Dis., 40 (2): 265-272, 2005.

MCFARLAND, L.V.; MULLIGAN, M.E.; KWOK, R.Y.; STAMM, W.E. Nosocomial acquisition of

Clostridium difficile infection. N. Engl. J. Med., 320 (4): 204-210, 1989.

MCFARLAND, L.V.; SURAWICZ, C.M.; RUBIN, M.; FEKETY, R.; ELMER, G.W.;

GREENBERG, R.N. Recurrent Clostridium difficile disease: epidemiology and clinical

characteristics. Infect. Control. Hosp. Epidemiol., 20 (1): 43-50, 1999.

MCFARLAND, L.V.; SURAWICZ, C.M.; STAMM, W.E. Risk factors for Clostridium difficile

carriage and C. difficile-associated diarrhea in a cohort of hospitalized patients. J. Infect. Dis.,

162 (3): 678-684, 1990.

MCMULLEN, K.M.; ZACK, J.; COOPERSMITH, C.M.; KOLLEF, M.; DUBBERKE, E.;

WARREN, D.K. Use of hypochlorite solution to decrease rates of Clostridium difficile-associated

diarrhea. Infect Control Hosp. Epidemiol., 28 (2): 205-207, 2007.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Loo%20VG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Poirier%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miller%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oughton%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Libman%20MD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Michaud%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Michaud%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bourgault%20AM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nguyen%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Frenette%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kelly%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vibien%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brassard%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brassard%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fenn%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dewar%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hudson%20TJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Horn%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ren%C3%A9%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Monczak%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dascal%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mani%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dupuy%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Matamouros%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22England%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dupuy%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McDonald%20LC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Killgore%20GE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thompson%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Owens%20RC%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kazakova%20SV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kazakova%20SV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sambol%20SP%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McEllistrem%20MC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carman%20RJ%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Genheimer%20CW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zheng%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McFarland%20LV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Surawicz%20CM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stamm%20WE%22%5BAuthor%5D

90

MERRITT, K.; HITCHINS, V.M.; BROWN, S.A. Safety and cleaning of medical materials and

devices. J. Biomed. Mater. Res., 53 (2): 131-136, 2000.

MESSAGER, S.; GODDARD, P.A.; DETTMAR, P.W.; MAILLARD, J.Y. Comparison of two in

vivo and two ex vivo tests to assess the antibacterial activity or several antiseptics. J. Hosp.

Infect., 58 (2): 115-121, 2004.

MODENA, S.; GOLLAMUDI, S.; FRIEDENBERG F. Continuation of antibiotics is associated

with failure of metronidazole for Clostridium difficile-associated diarrhea. J. Clin. Gastroenterol.,

40 (1): 49-54, 2006.

MRVOS, R.; DEAN, B.S.; KRENZELOK, E.P. Home exposures to chlorine/chloramine gas:

review of 216 cases. South. Med. J., 86: 654-657, 1993.

MULLIGAN, M.E.; CITRON, D.; GABAY, E.; KIRBY, B.D.; GEORGE, W.L. Alterations in

human fecal flora, including ingrown of Clostridium difficile, related to cefoxitin therapy.

Antimicrob. Agents Chemoter, 26 (3): 343-346, 1984.

MURRAY, P.R.; BARON, E.J.; PFALLER, M.A.; TENOVER, F.C; YOLKEN, R.H. Manual of

clinical microbiology, 7th ed. ASM Press, Washington, D.C., p. 1678, 1999.

MUSCARELLA, L.F. Sterilizing dental equipament. Nat. Med., 1: 1223-1225, 1995.

MUSHER, D.M.; ASLAM, S.; LOGAN, N.; NALLACHERU, S.; BHAILA, I.; BORCHERT, F.;

HAMILL, R.J. Relatively poor outcome after treatment of Clostridium difficile colitis with

metronidazole. Clin. Infect. Dis., 40 (11): 1586-1590, 2005.

MUSHER, D.M.; LOGAN, N.; HAMILL, R.J.; DUPONT, H.L.; LENTNEK, A.; GUPTA, A.;

ROSSIGNOL, J.F. Nitazoxanide for the treatment of Clostridium difficile colitis. Clin. Infect. Dis.,

43 (4): 421-427, 2006.

MUTO, C.A.; POKRYWKA, M.; SHUTT, K.; MENDELSOHN, A.B.; NOURI, K.; POSEY,

K.; ROBERTS, T.; CROYLE, K.; KRYSTOFIAK, S.; PATEL-BROWN, S.; PASCULLE,

A.W.; PATERSON, D.L.; SAUL, M.; HARRISON, L.H. A large outbreak of Clostridium difficile-

associated disease with an unexpected proportion of deaths and colectomies at a teaching

hospital following increased fluoroquinolone use. Infect. Control Hosp. Epidemiol., 26 (3): 273–

280, 2005.

NY, O.; PITUCH, H.; MATJKOVÁ, J.; OBUCH-WOSZCZATYNSKI, P.; KUIJPER, E.J.

Clostridium difficile PCR ribotype 176 in the Czech Republic and Poland. The Lancet, 377 (9775):

1407, 2011.

OAKLEY, B.R.; KIRSCH, D.R.; MORRIS, N.R. A simplified ultrasensitive silver stain for

detecting proteins in polyacrylamide gels. Anal. Biochem., 105 (2): 361-363, 1980.

O'CONNOR, J.R.; JOHNSON, S.; GERDING, D.N. Clostridium difficile infection caused by the

epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology, 136 (6): 1913-1924, 2009.

OMIDBAKHSH, N. Evaluation of sporicidal activities of selected environmental surface

disinfectants: carrier tests with the spores of Clostridium difficile and its surrogates. Am. J.

Infect. Control, 38 (9): 718-722, 2010.

O'NEILL, G.L.; BEAMAN, M.H.; RILEY, T.V. Relapse versus reinfection with Clostridium

difficile. Epidemiol Infect., 107 (3): 627-635, 1991.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Muto%20CA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pokrywka%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shutt%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mendelsohn%20AB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nouri%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Posey%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Posey%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Roberts%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Croyle%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Krystofiak%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Patel-Brown%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pasculle%20AW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pasculle%20AW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Paterson%20DL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Saul%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Harrison%20LH%22%5BAuthor%5D




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22O'Neill%20GL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Beaman%20MH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Riley%20TV%22%5BAuthor%5D

91

PASIC, M.; JOST, R.; CARREL, T.; VON SEGESSER, L.; TURINA, M. Intracolonic vancomycin

for pseudomembranous colitis. N. Engl. J. Med., 329 (8): 583, 1993.

PEPIN, J. Vancomycin for the treatment of Clostridium difficile Infection: for whom is this

expensive bullet really magic? Clin. Infect. Dis., 46 (10): 1493-1498, 2008.

PEPIN, J.; ALARY, M.E.; VALIQUETTE, L.; RAICHE, E.; RUEL, J.; FULOP, K.; GODIN, D.;

BOURASSA, C. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in

Quebec, Canada. Clin. Infect. Dis., 40 (11):1591-1597, 2005.

PEPIN, J.; VALIQUETTE, L.; ALARY, M.E.; VILLEMURE, P.; PELLETIER, A.; FORGET, K.;

PEPIN, K.; CHOUINARD, D. Clostridium difficile-associated diarrhea in a region of Quebec from

1991 to 2003: a changing pattern of disease severity. CMAJ, 171 (5):466-472, 2004.

PEREZ, J.; SPRINGTHORPE, S.; SATTAR, S. A. Activity of selected oxidizing microbicides

against the spores of Clostridium difficile: relevance to environmental control. Am. J. Infect.

Control, 33 (6): 320-325, 2005.

PERMPOONPATTAMA, P.; TOLLS, E.H.; NADEM, R.; TAN, S.; BRISSON, A.; CUTTING, S.M.

Surface layers of Clostridium difficile endospore. J. Bacteriol., 193 (23): 6461-6470, 2011.

PINTO, T. J. A.; KANEKO, T.M.; OHARA, M. T. Eficácia de Conservantes. Controle Biológico de

Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos. São Paulo: Atheneu, 219-252, 2003.

POHANISH, R.P. Sittig’s handbook of toxic and hazardous chemicals and carcinogens. Norwich,

NY: William Andrew Inc; 2008.

POTHOULAKIS, C. Effects of Clostridium difficile toxins on epithelial cell barrier. Ann. NY

Acad. Sci., 915: 347-356, 2000.

POUTANEN, S. M. & SIMOR, A. E. Clostridium difficile-associated diarrhea in adults. Can. Med.

Assoc. J., 171 (1): 51-58, 2004.

PULLMAN, J.; PRIETO, J.; LEACH, T.S. Ramoplanin vs. vancomycin in the treatment of

Clostridium difficile diarrhea: a phase 2 study. Em Program and Abstracts of the 44th Interscience

Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy; Washington, DC. American Society for

Microbiology, Outubro 30 - Novembro 2, 2004.

QUESADA-GÓMEZ, C.; RODRÍGUEZ, C.; GAMBOA-CORONADO MDEL, M.; RODRÍGUEZ-

CAVALLINI, E.; DU, T.; MULVEY, M.R.; VILLALOBOS-ZÚÑIGA, M.; BOZA-CORDERO, R.

Emergence of Clostridium difficile NAP1 in Latin America. J. Clin. Microbiol., 48 (2): 669-670,

2010.

RIDEAL, E.K; EVANS, U.R.; The effect of alkalinity on the use of hypochlorites. J. Soc. Chem.

Ind., 40: 64-66, 1921. In OMIDBAKHSH, N. Evaluation of sporicidal activities of selected

environmental surface disinfectants: carrier tests with the spores of Clostridium difficile and its

surrogates. Am. J. Infect. Control, 38 (9): 718-722, 2010.

RILEY, T.V.; THEAN, S.; HOOL, G.; GOLLEDGE, C.L. First Australian isolation of epidemic

Clostridium difficile PCR ribotype 027. Med. J. Aust., 190 (12): 706-708, 2009.

RUBIN, M.S.; BODENSTEIN, L.E.; KENT, K.C. Severe Clostridium difficile colitis. Dis. Colon.

Rectum., 38 (4): 350-354, 1995.

RUDOLPH, A.; LEVINE, M. Factors affecting the germicidal efficiency of hypochlorite solutions.

Ames (IA): lowa Engineering Experiment Station, lowa State College, 40: 1-48, 1941. In

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pasic%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jost%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carrel%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Von%20Segesser%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Turina%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pepin%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Quesada-G%C3%B3mez%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rodr%C3%ADguez%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gamboa-Coronado%20Mdel%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rodr%C3%ADguez-Cavallini%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rodr%C3%ADguez-Cavallini%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Du%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mulvey%20MR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Villalobos-Z%C3%BA%C3%B1iga%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boza-Cordero%20R%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thean%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hool%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Golledge%20CL%22%5BAuthor%5D

92

OMIDBAKHSH, N. Evaluation of sporicidal activities of selected environmental surface

disinfectants: carrier tests with the spores of Clostridium difficile and its surrogates. Am. J. Infect.

Control, 38 (9): 718-722, 2010.

RÜSSMANN, H.; PANTHEL, K.; BADER, R.C.; SCHMITT, C.; SCHAUMANN, R. Evaluation of

three rapid assays for detection of Clostridium difficile toxin A and toxin B in stool specimens.

Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 26 (2):115-119, 2007.

RUPNIK, M.; KATO, N.; GRABNAR, M; KATO, H. New types of toxin A-negative, toxin B-

positive strains among Clostridium difficile isolates from Asia. J. Clin. Microbiol., 41 (3): 1118-

1125, 2003.

RUPNIK, M.; WILCOX, M.H.; GERDING, D.N. Clostridium difficile infection: new developments

in epidemiology and pathogenesis. Nature, 7: 526-536, 2009.

RUSSEL, A.D. & CHOPRA, I. Understanding antibacterial action and resistance. 2th ed. Ellis

Horwood, Chichester, UK.

RUSSELL, A.D. Bacterial resistance to disinfectants: present knowledge and future problems. J.

Hosp. Infect., 43: 57-68, 1999

RUSSELL, A.D. Glutaraldehyde: its current status and uses. Infect control hospital Epidemiology.

15 (11): 724-733, 1994.

RUSSELL, A.D. Introduction of biocides into clinical practice and impact on antibiotic

resistance. J. Appl. Microbiol., 92 Suppl: 121S-135S, 2002.

RUTALA, W.A. & COLE, E.C. Antiseptics and disinfectants-safe and effective? Infect. Control, 5

(5): 215-218, 1984.

RUTALA, W.A. & WEBER, D.J. Uses of inorganic hypochlorite (bleach) in health-care facilities.

Clin. Microbiol. Rev., 10 (4): 597–610, 1997.

RUTALA, W.A.; WEBER, D.J.; HICPAC (Healthcare Infection Control Practices Advisory

Committee). Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities. CDC, 2008.

RUTALA, W.A.; GERGEN, M.F.; WEBER, D.J. Inactivation of Clostridium difficile spores by

disinfectants. Infect Control Hosp. Epidemiol., 14 (1): 36-39, 1993.

SAGRIPANTI, J. & BONIFACINO, A. Bacterial spores survive treatment with commercial

sterilants and disinfectants. Appl. & Environ. Microbiol., 65 (9): 4255-4260, 1999.

SAGRIPANTI, J. & BONIFACINO, A. Comparative sporicidal effect on liquid chemical

germicides on three medical devices contaminated with spores of bacillus subtilis. Am. J. Infect.

Control., 24 (5): 346-371, 1996.

SAMORE, M.H.; VENKATARAMAN, L.; DEGIROLAMI, P.C.; ARBEIT, R.D.; KARCHMER,

A.W. Clinical and molecular epidemiology of sporadic and clustered cases of nosocomial

Clostridium difficile diarrhea. Am. J. Med., 100 (1): 32-40, 1996.

SAMORE, M.H.; VENKATARAMAN, L.; DEGIROLAMI, P.C.; ARBEIT, R.D.; KARCHMER,

A.W. Clinical and molecular epidemiology of sporadic and clustered cases of nosocomial

Clostridium difficile diarrhea. Am. J. Med., 100 (1): 32-40, 1996.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22R%C3%BCssmann%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Panthel%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bader%20RC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schmitt%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schaumann%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Russell%20AD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rutala%20WA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gergen%20MF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Weber%20DJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Samore%20MH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Venkataraman%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22DeGirolami%20PC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Arbeit%20RD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Karchmer%20AW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Karchmer%20AW%22%5BAuthor%5D

93

SAXTON, K.; BAINES, S. D.; FREEMAN, J.; O’CONNOR, R. & WILCOX, M. H. Effects of

exposure of Clostridium difficile PCR ribotypes 027 and 001 to fluoroquinolones in a human gut

model. Antimicrob. Agents Chemother., 53 (2): 412-420, 2009.

SCOTT, E.M.; GORMAN, S.P.; Glutaraldehyde. In: Block, S.S. Disinfection, sterilization, and

preservation. 5 th ed Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins; p. 361-382, 2001.

SEBAIHIA, M.; WREN, B.W.; MULLANY, P.; FAIRWEATHER, N.F.; MINTON, N. The

multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nat. Genet., 38 (7): 779-786, 2006.

SESDEC (Secretaria de Estado de Saúde e Defesa Civil). Resolução nº 431, de 29 de agosto de 2008.

Suspensão cautelar do uso da solução de glutaraldeído a 2% como desinfetante de médio e alto nível e

esterilizante, para artigos médicos no âmbito do Estado do Rio de Janeiro e dá outras providências.

Diário Oficial do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, 2008.

SIEGEL, J.D.; RHINEHART, E.; JACKSON, M.; CHIARELLO, L. Healthcare Infection Control

Practices Advisory Committee: Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of

Infectious Agents in Healthcare Settings 2007. Disponível em

<http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/guidelines/Isolation2007.pdf>. Acessado em 15 de fevereiro de

2011.

SILVA, J. JR.; BATTS, D.H.; FEKETY, R.; PLOUFFE, J.F.; RIFKIN, G.D.; BAIRD, I. Treatment of

Clostridium difficile colitis and diarrhea with vancomycin. Am. J. Med., 71 (5): 815-822, 1981.

SOUZA DIAS, M.B.; YAMASHIRO, J.; BORRASCA, V.L.; STEMPLIUK, V.A.; ARAÚJO,

M.R.; COSTA, S.F.; LEVIN, A.S. Pseudo-outbreak of Clostridium difficile associated diarrhea

(CDAD) in a tertiary-care hospital. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 52 (3): 133-137, 2010.

SOUZA, J.B. & DANIEL, L.A. Comparação entre hipoclorito de sódio e ácido peracético na

inativação de E. coli colifagos e C. perfringens em água com elevada concentração de matéria

orgânica. Engenharia Sanitária e Ambiental, 10 (2), 205.

SPAULDING, E.H.; CUNDY, K.R.; TURNER, F.J. Chemical disinfection of medical and surgical

materials. In: Block, S.S. (ed). Disinfection, sterilization and preservation, 2ª ed. Philadelphia, Lea e

Febiger, 654-684, 1977.

SPIGAGLIA, P.; MASTRANTONIO P. Molecular analysis of the pathogenicity locus and

polymorphism in the putative negative regulator of toxin production (TcdC) among Clostridium

difficile clinical isolates. J. Clin. Microbiol., 40 (9): 3470-3475, 2002.

SPRINGTHORPE, V.S. & SATTAR, S. A. Carrier tests to assess microbicidal activities of

chemical disinfectants for use on medical devices and environmental surfaces. J AOAC, 88 (1):

188-201, 2005.

STABLER, R.; HE, M.; DAWSON, L.; MARTIN, M.; VALIENT, E. Comparative genome and

phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a

hypervirulent bacterium. Genome Biol., 10 (9): R102, 2009.

STORTZ, G. & HENGGE-ARONIS, R. Preface. In Bacterial Stress Responses (Stortz, G. &

Hengge-Aronis, R., Eds), pp. xiii–xiv. ASM Press, Washington, DC, USA, 2000.

STUBBS, S.; RUPNIK, M.; GIBERT, M.; BRAZIER, J.; DUERDEN, B.; POPOFF, M. Production

of actin-specific ADP-ribosyltransferase (binary toxin) by strains of Clostridium difficile. FEMS

Microbiol. Lett., 186 (2): 307-312, 2000.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Silva%20J%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Batts%20DH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fekety%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Plouffe%20JF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rifkin%20GD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Baird%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Souza%20Dias%20MB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yamashiro%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Borrasca%20VL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stempliuk%20VA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ara%C3%BAjo%20MR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ara%C3%BAjo%20MR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Costa%20SF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Levin%20AS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mastrantonio%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stubbs%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rupnik%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gibert%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brazier%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Duerden%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Popoff%20M%22%5BAuthor%5D

94

TAKIGAWA, T.; ENDO, Y. Effects of glutaraldehyde exposure on human health. J. Occup.

Health, 48 (2): 75-87, 2006.

TASLIM, H. Clostridium difficile infection in the elderly. Acta Med. Indones, 41 (3): 148-151,

2009.

TEASLEY, D.G.; GERDING, D.N.; OLSON, M.M.; PETERSON, L.R; GEBHARD, R.L.;

SCHWARTZ, M.J.; LEE, J.T. Prospective randomised trial of metronidazole versus vancomycin

for Clostridium difficile associated diarrhoea and colitis. Lancet, 2 (8385): 1043-1046, 1983.

THELESTAM, M. & CHAVES-OLARTE, E. Cytotoxic effects of the Clostridium difficile toxins.

Curr. Top. Microbiol. Immunol., 250: 85–96, 2000.

THOMAS, C.; STEVENSON, M.; RILEY, T.V. Antibiotics and hospital-acquired Clostridium

difficile-associated diarrhoea: a systematic review. J. Antimicrob. Chemother., 51 (6): 1339-1350,

2003.

UNGURS, M.; WAND, M.; VASSEY, M.; O’BRIEN, S.; DIXON, D.; WALKER, J.; SUTTON, M.

The effectiveness of sodium dichloroisocyanurate treatments against Clostridium difficile spores

contaminating stainless steel. Am. J. Infect. Control., 1-7, 2011.

VAISHNAVI, C. Clinical spectrum & pathogenesis of Clostridium difficile associated diseases.

Indian J. Med. Res., 131:487-499, 2010.

VALIQUETTE, L.; COSSETTE, B.; GARANT, M. P.; DIAB, H.; PEPIN, J. Impact of a reduction

in the use of high risk antibiotics on the course of an epidemic of Clostridium difficile associated

disease caused by the hypervirulent NAP1/027 strain. Clin. Infect. Dis., 45 (2), 112-121, 2007.

VERITY, P.; WILCOX, M.H.; FAWLEY, W.; PARNALL, P. Prospective evaluation of

environmental contamination by Clostridium difficile in isolation side rooms. J. Hosp. Infect.,49

(3): 204-209, 2001.

VOHRA, P.; POXTON, I.R. Efficacy of decontaminants and disinfectants against Clostridium

difficile. J. Med. Microbiol., 60 (8): 1218-1224, 2011.

VONBERG, R.P.; KUIJPER, E.J.; WILCOX, M,H,; BARBUT, F.; TÜLL, P.; GASTMEIER,

P.; EUROPEAN C. difficile-Infection CONTROL GROUP; EUROPEAN CENTRE FOR DISEASE

PREVENTION AND CONTROL (ECDC); VAN DEN BROEK, P.J.; COLVILLE, A.; COIGNARD,

B.; DAHA, T.; DEBAST, S.; DUERDEN, B.I.; VAN DEN HOF, S.; VAN DER KOOI,

T.; MAARLEVELD, H.J.; NAGY, E.; NOTERMANS, D.W.; O'DRISCOLL J.; PATEL, B.; STONE,

S.; WIUFF, C. Infection control measures to limit the spread of Clostridium difficile. Clin.

Microbiol. Infect., 14 Suppl 5: 2-20, 2008.

WALSH, S.E.; MAILLARD, J.Y.; SIMONS, C.; RUSSELL, A.D. Studies on the mechanisms of the

antibacterial action of ortho-phthalaldehyde. J. Appl. Microbiol., 87 (5): 702-710, 1999.

WENISCH, C.; PARSCHALK, B.; HASENHUNDL, M.; HIRSCHL, A.M.; GRANINGER, W.

Comparison of vancomycin, teicoplanin, metronidazole, and fusidic acid for the treatment of

Clostridium difficile-associated diarrhea. Clin. Infect. Dis., 22 (5): 813-818, 1996.

WHEELDON, L.J.; WORTHINGTON, T.; HILTON, A.C.; LAMBERT, P.A.; ELLIOTT, T.S.

Sporicidal activity of two disinfectants against Clostridium difficile spores. Br. J. Nurs., 17 (5):

316-320, 2008.

WILCOX, M.H. & FAWLEY, W.N. Hospital disinfectants and spore formation by Clostridium

difficile. Lancet., 356 (9238): 1324, 2000.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thomas%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stevenson%20M%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vaishnavi%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vonberg%20RP%22%5BAuthor%5D




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22T%C3%BCll%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gastmeier%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gastmeier%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22European%20C%20difficile-Infection%20Control%20Group%22%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22European%20Centre%20for%20Disease%20Prevention%20and%20Control%20(ECDC)%22%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22European%20Centre%20for%20Disease%20Prevention%20and%20Control%20(ECDC)%22%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20den%20Broek%20PJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Colville%20A%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Daha%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Debast%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Duerden%20BI%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20den%20Hof%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20der%20Kooi%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20der%20Kooi%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maarleveld%20HJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nagy%20E%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22O'Driscoll%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Patel%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stone%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stone%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wiuff%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wheeldon%20LJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Worthington%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hilton%20AC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lambert%20PA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Elliott%20TS%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fawley%20WN%22%5BAuthor%5D

95

WILCOX, M.H. & SPENCER, R.C. Clostridium difficile infection: responses, relapses and re-

infections. J. Hosp. Infect., 22 (2): 85-92, 1992.

WILCOX, M.H.; CUNNIFFE, J.G.; TRUNDLE, C.; REDPATH, C. Financial burden of hospital-

acquired Clostridium difficile infection. J. Hosp. Infect., 34 (1): 23-30, 1996.

WILCOX, M.H.; FRAISE, A.P.; BRADLEY, C.R.; WALKER, J.; FINCH, R.G. Sporicides for

Clostridium difficile: the devil is in the detail. J. Hosp. Infect., 77 (3): 187-188, 2010.

WILCOX, M.H.; FAWLEY, W.N.; WIGGLESWORTH, N.; PARNELL, P.; VERITY,

P.; FREEMAN, J. Comparison of effect of detergent versus hypochlorite cleaning on

environmental contamination and incidence of Clostridium difficile infection. J. Hosp. Infect., 54

(2): 109-114, 2003.

WULT, M.; ODENHOLT, I.; WALDER, M. Activity of three disinfectants and acidified nitrite

against Clostridium difficile spores. Infect. Control. Hosp. Epidemiol., 24 (10): 765-768, 2003.

YEARSLEY, K.A.; GILBY, L.J.; RAMADAS, A.V.; KUBIAK, E.M.; FONE, D.L.; ALLISON, M.C.

Proton pump inhibitor therapy is a risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhoea.

Aliment. Pharmacol. Ther., 24 (4): 613-619, 2006.

ZAR, F. A.; BAKKANAGARI, S. R.; MOORTHI, K. M. & DAVIS, M. B. A comparison of

vancomycin and metronidazole for the treatment of Clostridium difficile-associated diarrhea,

stratified by disease severity. Clin. Infect. Dis., 45 (3): 302–307, 2007.

ZEREY, M.; PATON, B.L.; LINCOURT, A.E.; GERSIN, K.S.; KERCHER, K.W.; HENIFORD, B.T.

The burden of Clostridium difficile in surgical patients in the United States. Surg. Infect.

(Larchmt), 8 (6): 557-566, 2007.

ZIRING, D.; TRAN, R.; EDELSTEIN, S.; MCDIARMID, S.V.; VARGAS, J.; CORTINA,

G.; GAJJAR, N.; CHING, N.; CHERRY, J.; KROGSTAD, P.; RENZ, J.F.; FONDEVILA,

C.; BUSUTTIL, R.W.; FARMER, D.G. Infectious enteritis after intestinal transplantation:

incidence, timing, and outcome. Transplant Proc, 36 (2): 379-380, 2004.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spencer%20RC%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fawley%20WN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wigglesworth%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Parnell%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Verity%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Verity%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Freeman%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ziring%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tran%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Edelstein%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McDiarmid%20SV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vargas%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cortina%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cortina%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gajjar%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ching%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cherry%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Krogstad%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Renz%20JF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fondevila%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fondevila%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Busuttil%20RW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Farmer%20DG%22%5BAuthor%5D

Documents

EFEITO DE DESINFETANTES HOSPITALARES SOBRE …app.uff.br/riuff/bitstream/1/3403/1/Ferreira, Thaís Gonçalves... · thaÍs gonÇalves ferreira efeito de desinfetantes hospitalares