平成16～17年度の研究では大脳皮質－線条体スライス培養を用いて、NMDA処置による神経細胞傷害時のアストロサイトでのケモカイン産生誘導機構に関する研究を、平成

18～19年度の研究では海馬スライス培養系を用いて、レーザーによる組織傷害時およびNMDA処置による神経細胞傷害時のミクログリアの形態変化と傷害部位への集積のメカニ

ズムに関する研究を行った。

平成16～17年度の研究では、NMDA処置による神経細胞傷害時によりアストロサイトでケモカインMCP-1およびCINC-1（J. Pharmacol. Sci., in press）の産生が誘導されることを明らかにした。これらケモカインの産生誘導における

MAPKの関与について検討し、MEK-ERK系の活性化が重要であることを明らかにした。神経細胞傷害時のERKの活性化について pERK免疫染色により詳細に解析したところ、NMDA処置開始5分後から15分後まではERKの活性化は神経細胞で観察されるが、30分後では神経での活性化は減退し、かわりにアストロサイトにおいて活性化が観察された。

このアストロサイトでのERK活性化は持続的であり、24時間後においても観察された。MEK阻害薬であるU0126をNMDA処置開始3時間後に添加してもMCP-1産生の有意な

抑制が観察された（下図）。さらに、15時間後から添加した場合でも、27時間後での培地中MCP-1量は部分的ではあるものの有意に減少した。一方、NMDA処置開始15分後および30分後にU0126をwashoutした場合には、神経細胞でのERK活性化は抑制されたが、アストロサイトでのERK活性化およびMCP-1産生誘導は抑制されなかった。以上の結果から、NMDAによる神経細胞傷害時におけるMCP-1産生誘導にはアストロサイトでの持続的なERK活性化が重要な役割を果たしていること、神経細胞でのERK活性化はアストロサイトでのERK活性化やMCP-1産生に関与していないことが明らかとなった。

MCP-1産生調節におけるATP受容体シグナルの役割についても検討した。ATPおよびその水解抵抗性アナログATPγSはともに、一過性にアストロサイトにおけるMCP-1の産生を誘導した。細胞内情報伝達をMAPキナーゼに着目して検討したところ、ATPγSによるMCP-1産生もMEK阻害薬により有意に抑制され、また、ATPγS処置によってERKのリン酸化が亢進した。一方、p38 MAPキナーゼ阻害薬により27時間後の培地中MCP-1量は有意に増加した。ATPγS処置後のMCP-1産生を経時的に検討した結果、SB203580存

脳内ケモカインによるグリア－ニューロン機能連関の時間的・空間的調節機能の解明リアルタイム観察法を駆使した神経細胞傷害によるグリア細胞活性化機構の解明

南　雅文、片山貴博北海道大学　大学院薬学研究院　薬理学研究室

神経伝達物質を介したグリア－ニューロン相互調節機構に関する研究A01-3 公募

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図　神経細胞傷害によるMCP-1産生誘導NMDA誘発神経細胞傷害によるアストロサイトでのMCP-1産生誘導には、アストロサイトでのMEK-ERK系の持続的な活性化が重要である。

在下では、非存在下と比較してMCP-1産生がより長時間にわたり持続することが明らかとなった。以上より、脳スライ

ス培養系でのATPγSによるMCP-1産生誘導は、ERKおよびp38 MAPキナーゼによって相反的に調節されていることが明らかとなった（J. Neurosci. Res., in press）。平成18～19年度の研究では、IbaI-EGFPマウス（本特定領域研究班の高坂新一先生より供与を受けた）より作成した

海馬スライス培養を用いて組織中でのミクログリア形態変化

および動態をリアルタイムで観察できる実験系を構築し研究

を行った。共焦点顕微鏡観察下にレーザー照射により組織傷

害を与えると、傷害直後からミクログリアは急速に傷害部位

に向かって突起を伸長させ、この突起伸長は30分程度で収束した。P2プリン受容体の阻害薬であるReactive Blue 2およびATP分解酵素であるapyraseによりミクログリア突起伸長が有意に抑制された。一方、cAMP のアナログであるdibutyryl cAMPを処置したところ、突起の伸長が抑制された。これらの結果より、局所組織傷害時には傷害によって細

胞外へと漏出したATPがミクログリア突起伸長を惹起すること、また、細胞内では細胞内情報伝達分子であるcAMPがミクログリアの突起伸長を抑制的に調節することが示唆され

た。

次に、NMDAによる神経細胞傷害時のミクログリアの集積および神経細胞貪食を、錐体細胞層におけるEGFP蛍光（ミクログリア）の集積およびPI陽性細胞（傷害された神経細胞）の消失を指標として経時的に検討した。EGFPで標識されたミクログリアは、観察開始直後には培養海馬スライス

上にほぼ均一に分布していたが、時間とともに神経細胞層へ

の集積が観察された。この集積はNMDA処置後3日後から見られ、5-6日後をピークとしていた。詳細な検討を行ったところ、傷害された神経細胞がミクログリアにより貪食、除

去される様子が観察された。リポソームに封入したクロドロ

ネートを処置することによりミクログリアを除去した培養海

馬スライスでは、PI蛍光の減少が抑制された。これらの結果より、神経細胞層に集積したミクログリアにより、傷害され

た神経細胞が貪食されていることが示された。このミクログ

リアの集積および神経細胞貪食はapyrase処置により抑制されなかったことから、NMDA誘発神経細胞傷害時のミクログリア集積および神経細胞貪食には細胞外ATPを介した細胞間情報伝達は必須ではないことが示唆された。

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別項１

別項２

別項３

別項４

別項５

別項６

別項７

別項８

別項９

別項10

最終研究成果報告書