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1
新規ヌクレアーゼ耐性人工核酸アプタマーの創製とその応用
群馬大学 大学院 工学研究科
准教授 桒原 正靖
2
研究背景
RNA libraryDNA library
インビトロセレクション
AptamerDNA aptamer
RibozymeDNAzyme
R
R R
Modified DNAzyme
Modified DNA aptamer
R
R
R
Modified DNA library
R R
R RR
R
R
R
R
R
R
R
R
R
RR
R
Diagnostic agents
Reagents
Application toolsApplication tools
Drugs
インビトロセレクション
3
I. 酵素反応による人工核酸(修飾DNA)の効率的な生成方法の開発
→ Kuwahara et al., Nucleic Acids Res., (2008), 36, 4257. etc.II. 酵素反応における人工核酸(修飾DNA)生成過程の速度論的解析
→ Kuwahara et al., Nucleic Acids Res., (2006), 34, 5383. etc.III. 機能性人工核酸の創出法の開発(インビトロ・セレクション法の応用)
→ Shoji & Kuwahara et al., J. Am. Chem. Soc., (2007), 129, 1456. etc.
Modified DNA
R R
R RR
R
R
R
R
R
R
R
R
R
RR
Rin vitroselection
Natural DNA
PolymeraseReaction
Research III
Reseaech I (mdDNA preparation) & Research II (reaction mechanism)
O
OH
-4O9 P3O
N
HN
O
O + dATP
dGTP
dCTP
新技術の基となる研究成果・技術
4
初期DNAライブラリー(1012~14 種類)DNAライブラリー
インビトロセレクション
選ばれたDNA分子
ポリメラーゼ反応
PCRによる増幅
アフィニティーカラムによる選別
O
O
OPO-
O
Base
インビトロ・セレクション法
5
人工核酸を用いたインビトロ・セレクション法
R R
R RR
R
RR
R
R
R
R
RR
RR
R
RR
RRR RR
RR
RO
O
OPO-
O
RBase
初期DNAライブラリー(1012~14 種類)
人工核酸ライブラリー
ポリメラーゼ反応
ポリメラーゼ反応
PCRによる増幅
アフィニティーカラムによる選別
選ばれた人工核酸分子
インビトロセレクション
6
従来技術とその問題点
抗体と類似の活性をもつ機能性分子としてDNAアプタマーやアプタマーは十数年前から着目されている。国内外の研究グループによって、医薬・診断薬への実用化が試みられているが、ヌクレアーゼによる分解が問題となっている。
ヌクレアーゼ耐性の向上については、SELEX法でアプタマーを得た後で化学修飾を施すという方法(ポスト修飾)が多用されている。しかし、アプタマーは高次構造によってその機能が発揮されているので、ポスト修飾の際に得られたアプタマーの活性を損なわないように分子構造を最適化する必要がある。
→ 予め核酸分子に化学修飾を施した人工核酸のライブラリの中からアプタマーを選別する方法の開発(本法)
7
新技術の特徴・従来技術との比較
8
さまざまな化学構造の人工核酸
Glycerol nucleic acid (GNA)
BasePOO-
O
O
H
BasePOO-
O
O
H
Tsai C. et al.Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. (2007)
O
BasePOO-
O
BasePOO-
O
O
O
O
Threose nucleic acid (TNA)
Chaput J. C. et al.J. Am. Chem. Soc.
(2003)
O
BaseOPO
O-
O
BaseOO
O-
O
O
OP
O
Bridged nucleic acid (BNA)
Kuwahara M. et al.Nucleic Acids Res.
(2008)
BaseOPO
O-
BaseOP
OO
O-
O
Cyclohexenyl nucleic Acid (CeNA)
Kempeneers V. et al.Nucleic Acids Res.
(2005)
Andreola M. et al.Eur. J. Biochem.
(2000)
O
BaseOPO
S-
O
O
BaseOP
OO
S-
Phosphorothioate ODN (PS-ODN)
Deoxyribonucleic acid(DNA)
~~
A T
C G
N
NN
NH2
OHO
HN
NO
O NH
O~~
~~ ~~
O
BaseOPO
O-
O
O
BaseOP
OO
O-
NH
NN
O
NH2
N
NO
NH2 NH2
9
5'-FAM-GGCGTTGAGTGAGTGAATGAGTGAGT-OR-3'
ODN‐M:X = 2′‐NHCH2‐4′ODN‐Q :X = 2′‐CH(Ph)OCH2‐4′
:X = 2′‐CH2OCH2‐4′
ODN‐L ODN‐K :X = 2′‐CH2‐
4′
ODN1 :R = H
~~ TO
OOHX
OPO
O
R = ~~ H or
1 2 3 4 5
6 7 8 9
Lanes 1,6: ODN12: ODN1 + TTP, 1h, 0.125U/μL3: ODN1 + KTP, 1h, 0.125U/μL4: ODN1 + LTP, 1h, 0.125U/μL5: ODN1 + MTP, 1h, 0.125U/μL7: ODN1 + QTP, 1h, 0.125U/μL8: ODN1 + QTP, 2h, 10U/μL9: ODN1 + QTP, 3h, 10U/μL
37 oC
N
O
OH
OPO-
O
O
O
OH
OPO-
O
OO
O
OH
OPO-
O
ONH
O
OH
OPO-
O
OO
OPO-
OOP-O
O-
OOP
O-
OOP
O-
O-OOP
O-
OOP
O-
O-O OP
O-
OOP
O-
O-O
NH
O
O N
NH
O
O N
NH
O
O N
NH
O
O
MTPLTP QTPKTP
Addition Reaction
TdT架橋型ヌクレオチドが3′末端に付加されたDNA
“ヌクレアーゼ耐性化”
DNA・ 機能性核酸DNAアプタマーDNAザイムなど・ ジーン
酵素的付加によるDNAのヌクレアーゼ耐性化
Terminal deoxynucleotidylTransferase (TdT)
10
N
O
OH
OPO-
O
O
O
OH
OPO-
O
OO
O
OH
OPO-
O
ONH
O
OH
OPO-
O
OO
OPO-
OOP-O
O-
OOP
O-
OOP
O-
O-OOP
O-
OOP
O-
O-O OP
O-
OOP
O-
O-O
NH
O
O N
NH
O
O N
NH
O
O N
NH
O
O
MTPLTP QTPKTP
架橋型ヌクレオチドが3′末端に付加されたDNA
“ヌクレアーゼ耐性化”
DNA・ 機能性核酸DNAアプタマーDNAザイムなど・ ジーン
酵素的付加によるDNAのヌクレアーゼ耐性化
Terminal deoxynucleotidylTransferase (TdT)
Nuclease Reaction
Phosphodiesterase I
Addition Reaction
TdT
11
ODN1 ODN‐K ODN‐L ODN‐M ODN‐Q1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Phosphodiesterase I, 37 oC, 0 → 120 min
修飾ODNのヌクレアーゼ耐性評価
020406080
100
0Reaction time (min)
60 120
ODN1ODN‐K ODN‐L
ODN‐M
ODN‐Q
Amou
nt of intact O
DN (%
)
5'-FAM-GGCGTTGAGTGAGT-GAATGAGTGAGT-OR-3'
ODN‐M:X = 2′‐NHCH2‐4′ODN‐Q :X = 2′‐CH(Ph)OCH2‐4′:X = 2′‐CH2OCH2‐4′ODN‐L
ODN‐K :X = 2′‐CH2‐4′
ODN1 :R = H~~ TO
OOHX
OPO
O
R = ~~ H or
ODN v0 (%/min) Relative rate
ODN1 103 736ODN-K 7.1 51ODN-L 2.7 19ODN-M 0.32 2.3ODN-Q 0.14 1
12
ポリメラーゼ反応による糖部位修飾人工核酸の生成
KTP
O
T
O
OPO-
HO
OO
PO
OPO
-OO- O-
MTP
O
T
OHO N
H
OPO-
OO
PO
OPO
-OO- O-
LTP
O
T
OHO O
OPO-
OO
PO
OPO
-OO- O-
DNAポリメラーゼ天然型DNA鋳型鎖
伸長鎖修飾ヌクレオシド三リン酸(dNTPmd)
13
ポリメラーゼによる糖修飾人工核酸の合成
Lanes1:P,TN’,TTP(NEG)2:P,TN’,TTP(POG)3:P,TN’,KTP4:P,TN’,LTP5:P,TN’,MTPM:Marker(+0~12bases)
Reaction conditionDenature : 1.5 minAnnealing: 0.5 minExtension: 10 min
KTP
O
T
O
OPO-
HO
OO
PO
OPO
-OO- O-
MTP
O
T
OHO N
H
OPO-
OO
PO
OPO
-OO- O-
LTP
O
T
OHO O
OPO-
OO
PO
OPO
-OO- O-
LaneKOD Dash
High conc.
LanePhusion
X 10High conc.
X 10
1 2 3 4 5 M
1 2 3 4 5 MFull-length
Primer
Full-length
Primer+ 3+ 2
+ 3+ 2
14
想定される業界
•利用者・対象
製薬メーカー,食品メーカー,
バイオ関連企業等
•市場規模
抗体医薬・診断薬の場合
→数兆円の市場規模(世界市場)
想定される用途
治療薬,診断薬,検査薬,研究試薬など
15
実用化に向けた課題
• 現在、塩基修飾人工核酸アプタマーについては方法論が確立が済み。
• 特に、ヌクレアーゼ耐性の高い架橋型ヌクレオチドを含む人工核酸について、アプタマー作製技術の開発に注力している。
• 実用化に向けて、人工核酸アプタマーを短期間で作製できるよう改良する必要もあり。
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企業への期待
• 未解決の人工核酸アプタマー作製の迅速化については、システムの自動化や分離技術の高性能化等により克服できると考えている。
• 作製した人工核酸アプタマーの臨床評価の実施や製品化が可能な企業。
• 医薬、診断薬、バイオ関連試薬メーカとの連携、共同研究を希望。
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称
• 出願番号• 出願人• 発明者
• 発明の名称
• 出願番号• 出願人• 発明者
:新規核酸誘導体およびそれを用いたヌクレアーゼ耐性核酸の調製方法
:PCT/JP2009/064522:科学技術振興機構:桒原正靖,小比賀聡
:5位置換ピリミジンヌクレオシド誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法
:特許第4119976号:群馬大学:澤井宏明,桒原正靖
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産学連携の経歴
• 2004年-2008年 JST戦略的創造研究推進事業
さきがけ「構造機能と計測分析」に採択
• 2008年-2009年 NEDO産業技術研究助成事業
若手グラント(ステージⅠ)に採択
• 2010年-2011年 NEDO産業技術研究助成事業
若手グラント(ステージⅡ)に採択
19
群馬大学TLO
TEL 0277-30-1171~1175
FAX 0277-30-1178
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