Eine neue effiziente PCR-Methode zur akkuraten Bestimmung ... · Kultur Feces Se 30-50% Sp ≤ 100% Positives Ergebnis ist Aussagekräftig, hohe Spezifität, gute Bestätigung eines

IDEXX Bovine Diagnostics

RUMINANTS

WIEDERKÄUER

RUMINANTS

RUMIANTES

反刍动物

反芻動物

© 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.

Standardized. Streamlined. Efficient.

RealPCR MAP DNA Test

Eine neue effiziente PCR-Methode zur akkuraten

Bestimmung von Mycobacterium avium subsp.

(MAP)

1 © 2016 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved.


RealPCR bei IDEXX (CAG)

• Die molekulardiagnostik Labore von IDEXX in Sacramento und Ludwigsburg, nutzen die

modulare RealPCR Plattform seit 2007.

• Bisher sind 200 RealPCR tests entwickelt worden für die IDEXX Referenzlabore Weltweit. In

Ludwigsburg werden pro Jahr etwa 350.000 Proben in 2 MioTests untersucht.

• Das modulare Konzept der RealPCR Platform wird nun in der IDEXX Livestock, Poultry,

and Dairy Division für Kunden verfügbar gemacht.

“Die modulare RealPCR Plattform, reduziert die Kosten

der Analysen, durch verringerten Arbeitsaufwandt,

geringere Investitionen in Maschinen und die effizientere

Nutzung der Reagenzien.”

Christian Leutenegger, DrVetMed, PhD, FVH, Head of

Molecular Diagnostics, IDEXX Molecular Diagnostics

Laboratory



Detection Mix

RNA

Master Mix

Positivkontrolle

DNA

Master Mix

Detection Mix

DNA or RNA Master Mix

spezifische Positivkontrolle

traditionelle Real-time PCR IDEXX modulares System

RealPCR – gemeinsame Reagenzien

spezifisch

gemeinsam

Detection Mix: Primer und Sonden für Zielsequenz und interne

Probenkontrolle

Master Mix: Enzyme und Nukleotide

Positivkontrolle



10 Jahre Erfahrung mit der modularen RealPCR Plattform

traditionelle real-time PCR kits IDEXX RealPCR

Detektions

mix

Positiv

kontrolle

Negativ

kontrolle

Gemeinsame Reagenzien

RNA / DNA

master mix

Zielspezifisch



Standardisiertes PCR-Programm

• Ein Programm für alle RNA und DNA Zielsequenzen

• Unterschiedliche Tests in einem PCR lauf (70min)

• weniger Fehler aufgrund unterschiedlicher PCR Programme

• geringerer Schulungsaufwand für Personal

Real-time PCR Schritte Temperatur Zeit Zyklen

reverse Transkription 50°C 15 min 1

initiales denaturieren 95°C 1 min 1

Amplifikation 95°C

60°C

15 sec

30 sec

45

erhöhter Durchsatz mit der RealPCR Plattform



RealPCR MAP DNA Test Ablauf Optimierte pre-extraction zur standardisierten MAP Detektion



Sensitivität und Spezifizität

Analytische Sensitivität <10 Kopien

Sample status Sample number IDEXX RealPCR

MAP Discrepant

Diagnostic

sensitivity

Confirmed

positives

164 162 2 98.8%

Confirmed

negatives

226 224 2 99.1%

Bestätigte positive and negative Proben aus Europa und Nordamerika

Exklusivität wurde durch testen von 24 Proben verschiedener Mycobacteria

Spezies bzw. Bakterien und Viren bestätig, basierend auf den vVrgaben des FLI

Es wurde keine unspezifische Amplifikation festgestellt



Schwach positive Proben Vergleich zu anderen Tests

• Zwei schwach positive Proben wurden vor der Extraktion in negativen Proben verdünnt

• Die Proben wurden mit IDEXX RealPCR und dem PCR-Test eines anderen Herstellers

getestet

No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct

0

10

20

30

40

50

Neat 1:10 1:100 1:1K Neat 1:10 1:100 1:1K

Sample 1 Sample 2

Ct V

alu

es

Vergleich

RealPCR MAP Other PCR



MAP Testing

Test Probentyp Performance Pro’s Con’s

Kultur Feces Se 30-50%

Sp ≤ 100%

Positives Ergebnis ist

Aussagekräftig, hohe

Spezifität, gute Bestätigung

eines Befundes

Bis zu 14 Wochen, schwache

Sensitivität in jungen bzw.

subklinischen Tieren und

schwachen/mittleren Exkretierern

PCR Feces Se 30-70%

Sp ≤ 100%

schnell, hohe spezifität,

positives Ergebnis

Aussagekräftig

Schwache Sensitivität in in

jungen bzw. subklinischen Tieren

Tankmilch Guter Indikator für MAP in

Milch

Kaum Informationen zu

Prevalenz, Kontaminationen

möglich

ELISA Blut Se 40-80%

Sp > 99%

Einfach, schnell,

kostengünstig

Blutprobe erforderlich

Milch Se 40-80%

Sp > 99%

Einfacher als Blut, option

häufiger zu testen

Nachverfolgung schwieriger

Tankmilch Se 20-30%

Sp 99%

Güntig und einfach. Zeigt

Anwesenheit von MAP

Poor sensitivity: a negative result

does not mean a lot



Johne‘s Diagnose und Management

• Wiederholte ELISA tests erlauben eine frühere Identifizierung infizierter Tiere

(Nielsen & Ersboll 2006).

• Kühe können wechselnde Ergebnisse aufweisen, dies kann frustrierend sein für

Veterinäre und Halter.

• Jedes einmal positiv getestete Tier sollte als Risiko Tier behandelt werden.

• In Gebiete mit TB Haut Tests, können MAP ELISA Ergebnisse beeinflusst sein.

- Proben für MAP sollten vor dem Test gezogen werden.

- Alternativ können Feces zur analyse mit PCR genutzt werde.

• Kolostrum management: pasteurisieren (60°C for 60 minutes) is zur MAP-Eliminierung

ausreichend. Die morbidität wird signifikant reduziert (Donahue 2012)

• Risko Einschätzung – Tests zur status Etablierung – Tests für Krankheitsmanagement.



Guidelines Johne‘s ELISA und PCR Diagnose

• Status Etablierung

- Herdenstatus (Tankmilch–negative, schließt MAP Anwesenheit nicht aus; Test der

Schlachtiere, Ziel 30 Kühe Screening oder ganze Herde Testen)

• Minimum Tests

- Halbjährig 30 Tiere

- Halbjährig Schlachttiere testen

- Häufiger (vierteljährig) abhängig von Management und Prevalenz

• Kontrollen

- strategische Tests-zur Management Entscheidung:

Transitionsphasen: Laktation, Trockenstehen oder Empfängnis

Minimum: Einzeltest bei Trockenstehphase

• Ideal: Zwei Tests pro Jahr (vor Trockenstehphase und vor Empfängnis)

oder Vierteljährig

• In ganzjährig kalbenden Herden ist ein jährlicher Test pro Tier unzureichend

Use ELISA to Use PCR to

Management Entscheidung

Status etablieren Identifikation von Exkretierern



RealPCR MAP DNA Test

RealPCR MAP DNA Mix

RealPCR ASFV DNA Mix



Dr. Jan van Ooyen

PCR Application Specialist EMEA

IDEXX Livestock, Poultry and Dairy

[email protected]

Thank you!

http://www.google.ch/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAcQjRxqFQoTCIyl9b-M3ccCFYGCPgodKGYAfw&url=http://lbpa.com/portfolio/corporate/office-lab-rd/idexx-laboratories/corporate-office-expansion-renovation&psig=AFQjCNGHeIotx3cfjvKw6W0RIBwRRWmPBw&ust=1441446343235816

mailto:[email protected]




Documents

Eine neue effiziente PCR-Methode zur akkuraten Bestimmung ... · Kultur Feces Se 30-50% Sp ≤ 100% Positives Ergebnis ist Aussagekräftig, hohe Spezifität, gute Bestätigung eines