Eine neue enzymatische Peptidsynthese. 1. Mitteilung

568 HELVETICA CHIMICA ACTA.

83. Eine neue enzymatische Peptidsynthese. 1. Mitteilung

von M. Brenner, H. R. Miiller und R. W. Pfister. (16. 111. 50.)

Die Eiweissynthese in der tierisehen Belle geht wahrscheinlich zum uberwiegenden Teil von prgformierten Aminosauren Bus1). Dem tierisehen und eventuell auch dem pflanzlichen2) Organismus fallt somit die Aufgabe zu, Aminosauren unter fortgesetztem Aufbau von Peptidbindungen CO-NH zu Peptiden und Proteinen zusammenzu- setzen. Uber die Mittel und Wege, welche ihm hierzu zur Verfugung stehen, wissen wir nichts Genaues3). Vorlaufig ist nicht einmal be- kannt, auf welche Weise zwei cc-Aminosiiuren biologisch zum Dipeptid verkniipft werden. Die Aufklarung des Mechanismus, welcher dieser und Bhnlichen Reaktionen zugrunde liegt, bildet ein Hauptproblem der modernen Biochemie.

Von grundlegender Bedeutung fiir jede Betrachtnng der naturlichen Peptidsynthese ist der Umstand, dass die direkte Kondensation zweier Aminosauren zum Dipeptid infolge der aufzuwendenden Ionisierungsarbeit eine endergone Reaktion darstellt4). Ein solcher Prozess verliiuft auch in Gegenwart von Katalysatoren nicht frei- willig. Es ist dementsprechend nie gelungen, ein echtes zwitterionisches Dipeptid oder Tripeptid mit Hilfe irgendeines Fermentes aus Amino- sauren zu synthetisieren. Eine direkte Umkehrung der bekannten enzymatischen Peptidhydrolyse zum Zwecke der Peptidsynthese ist im Reagenzglas nicht moglieh. Wollte man sie in der belebten Natur dennoch postulieren, so wiirde dies sehr weitgehende Annahmen uber die Fahigkeit der Zellen zur direkten oder indirekten Konzentrations- regulierung bedingen5). Der Gedanke hat trotzdem eine grosse Rolle gespieW), ist dann aber, soweit er die niederen Peptide betrifft, auf- gegeben worden').

*) D . Rittenberg & D . Shemin, Ann. Rev. Biochem. 15, 247 (1946); F . Friedberg, T . Winnick & D . M. Greenberg, J. Biol. Chem. 169, 763 (1947); K. Bloch & H. S. Anker, J. Biol. Chem. 169, 765 (1947); H. Borsook, C. L. Deusy, A. J . Haagen-Smit, G. Keighley & P. H . Lowy, J. Biol. Chem. 174, 1041 (1948); P. C . Zumecnik, I . D. Fruntz, R. R. Loftfield & N . L. Stephenson, J. Biol. Chem. 175, 299 (1948).

2, E. H . Street, Adv. Enzymol. 9, 391 (1949). 3, F. Friedberg, T . Winnick & D . M. Greenberg, loc. cit.; P. P. Cohen & R . W .

McGilvery, J. Biol. Chem. 171, 121 (1947); K . Bloch, J. Biol. Chem. 179, 1245 (1949). *) H . Borsook & J . W . Dubnoff, J. Biol. Chem. 132, 307 (1940). 5 , M . Bergmann & J. S. Fruton, Ann. New York Acad. Sci. 45, 409 (1944). 6, J. S. Fruton, in D. E . Green, Currents in Biochemical Research, New York 194G,

') D . Rittenberg & D. Shemin, loc. cit.; P. P . Cohen & R. W. McGilvery, loc. cit. S. 123.

Volumen XXXIII, Fasciculus 111 (1950) - No. 83. 569

M . Bergmann und Mitarbeiter haben gezeigt, dass der Misserfolg bei fermentativen Synthese-Versuchen nicht etwa einem Unvermogen der angewandten Fermente zuzuschreiben ist. Verkleinert man die normalerweise aufzuwendende Ionisierungsarbeit durch geeignete Wahl der Reaktionspartner, so werden enzymatische Synthesen, besonders wenn sich zufolge geringer Loslichkeit der Reaktionsendprodukte noch Verdiinnungs- arbeit gewinnen lasst, im Rahmen der Fermentspezifitat durchfiihrbar. Die nachstehenden Beispiele mogen dies verdeutlichen').

Cystein-Papain Hippursaure + Anilin + Wasser + Hippuryl-anilin (I)*) PH 4,7

Cystein-Papain

pH ca. 5 Benzoyl-L-leucin + L-Leucylanilin + Wasser + Benzoyl-L-leucyl-L-leucyl-anilin

(2)*) *) Kristallisiert wegen Schwerlodichkeit wahrend der Reaktion aus und verhindert

dadurch die Einstellung eines Gleichgewichtes (Gewinnung von Verdiinnungsarbeit).

Es sei hervorgehoben, dass diese Umsetzungen wegen der grossen Energieunter- schiede nicht mit dem Aufbau natiirlicher Di- oder Oligo-Peptide vergleichbar sind und deshalb nicht ohne Einschrankung als Modellreaktionen fur die Peptidsynthese gewertet werden diirfen.

Um der thermodynamischen Aussage uber die Unwahrscheinlich- keit einer direkt,en Kondensation von Aminosauren gerecht zu werden, nimmt man heute an, dass die Peptidsynthese auf dem Umweg uber ,,aktivierte" Zwischenstufen erfolgt. Hierbei ist unter der ,,Ak- tivierung" einer Aminosaure ihre Umwandlung in ein reaktionsfahiges Derivat zu verstehen, das seinerseit,s den weiteren Aufban zum Peptid gewiihrleistet. Eine derartige Umwandlung erfordert naturlich die Zufuhr von Energie. In der Tat haben neuere Forschungen eine Be- ziehung zwischen oxydativem Stoffwechsel und Peptidsynthese erkennen lassen.

Der Nachweis eines solchen Zusammenhanges erfolgte zuerst am Beispiel der enzymatischen Benzoylierung und p-Aminobenzoylierung des Glycins. Obwohl diese Reak- tionen nicht zu Peptiden im engeren Sinne fiihren, sind sie chemisch und energetisch mit dem Aufbau echter Peptide vergleichbar. Von der Synthese der Hippursaure und p- Aminohippursaure in iiberlebendem Lebergewebe ausgehend, haben H. Borsook & J. W. Dubnoff2) sowie P. P. Cohen & R. W. McOilvery3) folgendes gezeigt: Die genannten Ver- bindungen konnen auch in homogenisiertem Gewebe, ja sogar in Gegenwart gewaschener Zelltriimmer gebildet werden, wenn das Fermentsystem der Atmung wenigstens teilweise intakt ist und der notwendige ,,Brennstoff" sowie Luft (Sauerstoff) vorhanden sind. Man weiss, dass unter solchen Bedingungen energiereiche Phosphate entstehen, und muss an- nehmen, dass die beobachtete Acylierung durch dieselben energetisch ermoglicht wird. Verhindert man namlich die Entstehung der Phosphate durch Ausschluss von Sauerstoff, so kommt die Reaktion zum Stillstand. Sie lasst sich dagegen durch einen Zusatz von Adenosintriphosphat (ATP) als Energiespender auch anaerob aufrecht erhalten. dhnliche

l) M . Bergmann & H. Fruenkel-Conrat, J. Biol. Chem. 119,707 (1937); 124,l (1938). Weitere Beispiele in C. L. A . Schmidt, The Chemistry of the Amino Acids and Proteins, Springfield (Ill.) 1945, S. 1084. Vgl. ferner S. W. Fox & C. W. Pettinga, Arch. Biochem. 25, 13 (1950); 8. W.Fox, C. W. Pettinga, J. S. Halverson & H . Wax, Arch. Biochem. 25, 21 (1950).

2, J. Biol. Chem. 168, 397 (1947). loc. cit.


Verhjltnisse hat K. Rloch in der Leber hinsichtlich der Synthese des naturlichen Tripep- tids Glutathion vorgefundenl). J . F . Speck schliesslich gelangt auf Grund seiner Arbeiten uber die Bildung des Glutamins in Gegenwart gercinigter Extrakte aus Taubenleber zu folgender stochiometrischer Formulierung2) :

Glutamat- + NH,f + ATP---- - Glutamin + ADP - *) + Phosphat-- + H+ (3) pH 7,4

*) Adenosin-diphosphat.

Das letzte Beispiel stellt wiederum keine Peptidsynthese im eigentlichen Sinne dar. Es zeigt aber wie die vorhergehenden, dass die Phosphatbindungsenergie am biologischen Aufbau der Peptidbindung bzw. Amidbindung massgeblich beteiligt ist.

Der chemische Vorgang jedoch, welcher die Beziehung zwischen den energiereichen Phospha6en und der Peptidsynthese vermittelt, ist unbekannt. Man weiss nicht, wie ein aktivierter Reaktionspartner zu formulieren ist. Wie noch gezeigt wird, sind mehrere Moglichkeiten denkbar. Es kann sein, dass verschiedene Aktivierungsarten existieren und somit nicht alle Amidbindungen auf dieselbe Weise entstehen. Unterschiede, die zwischen dem Aufbau der Amidbindung im Glutamin und der ebenfalls phosphatabhangigen Acetylierung des Sulfanilamids (die sich in ihrer Sr t noch weiter von der Synthese echter Peptide entfernt als die Glutaminsynthese) beobachtet wurden3), sind vielleiclit als Ausdruek verschiedener Mechanismen zu deuten.

Lipmann u. a. stellen sich die Aktivierung der Aminosiiuren als eine Phosphorylierung der Carhoxylgruppen ~ 7 0 1 ’ ~ ) . Fur die Synthese eines Dipeptids ergiibe sieh auf Grund dieser heute fast adlgemein ak- zeptierten Ansehauung, die naheliegend und plausibel, keineswegs aber zwingend ist, folgendes hypothetisches Schema:

Transphosphor ylierung Aminosaure F NHzCH(R)CO--O-P03H, (4)

NH,CH(R)CO--O--PO,H2 + KH2CH(R’)COOH +

NH&X(R)CO-NHCH(R)COOH + H3P0, (5)

Modellversuche haben bestatigt, dass die Peptidbindung sich durch einen derartigen Vorgang alufbauen lasst : Glycin wird in neu- trarler wasseriger Losung durch Dibenzoylphosphat oder Renzoyl- phenylghosphat spontan zu Hippursaure benzoyliert ”. Weitere experimentelle Stutzen, inshesondere auch solche enzymatischer Art, die auf eine mogliche Lenkung einer Reaktion vom Typus der Glei- chung ( 5 ) hindeuten wiirden, sind unseres Wissens nicht beigebrach t worden.

l) loc. cit. 3, J . F . Speck, loc. cit., S. 1424/25. 4, F . Lipmann, Adv. Enzymol. I, 154 (1941); P. P . Cohen & R. W. McGiZvery, J.

5) H . Chantrefine, Compt. rend. trav. lab. Carlsberg. SBr. chim. 26, 297 (1948),

2, J. Biol. Chem. 179, 1405 (1949).

Biol. Chem. 169, 135 (1947).

Biochim. biophys. Acta 2, 286 (1948), vgl. feriier 4, 484 (1950).

Volumen xxxm, Fasciculus 111 (1950) - No. 83. 571

Es scheint uns bei Erwagungen uber den Aktivierungsmechanis- mus wichtig xu sein, dass das Problem der Reaktionslenkung nicht ubersehen wird. Da die Aktivierung der Aminosiiuren wahrscheinlich nicht geniigt, um die Synthese von Peptiden und Eiweisskorpern wirksam zu steuern, ist anzunehmen, dass die Lenkung einem spe- ziell darauf eingestellten Fermentsystem zufallt. Trifft diese Annahme zu, so sollte sich die Frage der Peptidsynthese auch von der fermentativen Seite her bearbeiten lassen. Die primare Schwierigkeit bei einem solchen Vorgehen besteht natiirlich darin, das betreffende Ferment- system aufzufinden. Dieses ist zur Erfiillung seiner -4ufgabe an zwei Voraussetzungen gebunden, die seine Erkennung erleichtern : es muss einerseits iiber die zur Lenkung notwendige Spezifitat verfugen, und anderseits eine messbare Affinitat zu Peptiden oder Peptid-Derivaten und ,,aktivierten" Aminosauren besitzen. Es ist nun bemerkenswert, dass die proteolytischen Fermente die erste Voraussetzung ganz (Spezifitat) und die zweite sicher zum Teil erfiillen (Affinitat zu Pep- tiden). Ihre Wirkung auf ,,aktive", d. h. potentiell zur Peptidbildung hefiihigte Aminosaurederivate i r t vom Gesichtspunkt der Synthese aus nie iiberpriift worden.

Eigene Untersuchungen i n dieser R ich tung haben zu der in te ressanten Fest ' s te l lung gefiihrt , dass einige spezi- f ische Aminosauren durch Veresterung befahig t werden, i n Gegenwart der Pankreaspro tease Chymotryps in l ) mi t sich selbst un te r Bi ldung von Pep t iden zu reagieren.

Die Fermentreaktion ist in bezug auf die Aminosaure- Seiten- kette und das Ferment spezifisch (Tabelle I) und in auffallendem Gegensatz dazu innerhalb weiter Grenzen von der Natur der alkoho- lischen Esterkomponente unabhangig (Tabelle 2). Im folgenden berichten wir am Beispiel des Methionins, das wir am eingehendsten untersucht haben, uber die Entstehungaweise der Peptide, den qualitativen und halbquantitativen Nachweis von gebildetem Methionin- dipeptid und -tripeptid, sowie uber die Abhangigkeit des Reaktions- bildes von der Zeit, dem pH, der Ester- und der Ferment-Konzentra- tion. Anschliessend sol1 der Befund im Hinblick auf eine mogliche Be- ziehung zum Mechanismus der biologischen Peptidsynthese kurz diskutiert werden.

Die Ents tehungsweise der Pep t ide . An Fermenten standen un8 zur Verfiigung : 1. Kristsllisiertes Chymotrypsin ,,Armour': enthaltend rund 507" Ammoniumsulfatz). 2. Kristttllisiertes Chymotrypsin ,,Lehn & Fink", enthaltend rund 50% Magnesium-

sulfats).

Die Identitat unserer Fermentpraparate mit Chymotrypsin ist nicht endgiiltig

*) Bovine origin, lot 70902. The ArmourLaboratories, Armour & Company, Chicago, 111. 3, Plaut Research Laboratory, Lehn & Fink Products Corp., Bloomfield, NJ .

abgekliirt. Vgl. dazu S. 572 und die Diskussion auf S. 580.


3. Amorphes Chymotrypsin, nach J . H . Northrop') aus viermal umkristallisiertem Chymotrypsinogen dargestellt.

4. Ein durch Dialyse und lyophiles Trocknen aus dem Pankreasenzym der NOVO Terapeutisk Laboratorium AIS, Kopenhagen, nach einer friiher2) angegebenen Vorschrift bereitetes Praparat, das in seiner Wirkung ungefahr dem Chymotrypsin entspricht und im folgenden kurz als ,,danisches Ferment" bezeichnet wird.

5. Kristallisiertes Trypsin ,,Armour", enthaltend rund 50% Magnesi~msulfat~). Die Praparate 1, 2 und 3 zeigten im Verhalten gegen Methioninester qualitativ

keine Unterschiede. Fast alle Versuche, iiber welche wir in dieser Arbeit berichten, sind mit ,,danischem Ferment" oder Chymotrypsin ,,Armour" durchgefiihrt worden.

Tabelle 1. Q u a l i t a t i v e s V e r h a l t e n von E s t e r n vcrschiedener Aminosauren gegen

k r i s t a l l i s i e r t e s C h y m o t r y p s i n u n d k r i s t a l l i s i e r t e s Trypsin').

Ester ~ ~ ~~ ~ ~

DL-Threonin-isopropylester2). . . . . . ~~-Methionin-isopropylester~) . . . . . ~~-Phenylalanin-isopropylester~) . . . . ~-Tyrosin-&thylester~) . . . . . . . . Dt.-Tryptophan-methylester6) . . . . . n~-Valin-isopropylester7) . . . . . . .

+!t

t+

c -t 8 )

-

-

+ I

+ i-+

-+++ ++~+

+ l ~ l + "

-

l) Armour-Praparate, ca. 50% Ammoniumsulfat enthaltend. 2, 100 Teile Ester, 100 Teile Wasser, 10 Teile Ferment, 22O, 40 Stunden.

Diss. E. Sailer, erscheint demnachst. 3, Trockener Ansatz bei 38O (vgl. Text) oder 0,17-m. in Wasser, 5 mg Fer-

ment/lO cm3, 22O, 15 Stunden. 4, Trockener Ansatz bei 38O oder 0,05-m. in Wasser, 3 mg Ferment/lO cm3,

22O, 15 Stunden. 5 ) 0,19-m. in 30-proz. Methanol, 5 mg Ferment/lO em3, 22O, 15 Stunden. Eine

Verseifung wurde auch festgestellt bei c = 0,025-m. in 0,044-m. Phosphatpuffer (pH 8, 30-proz. Methanol), 0,2-0,3 mg Fermcnt-N/cm3, 1 5 O ; der Ester ist unter diesen Bedingungen schon nach 15 Minuten praktiscli vollstiindig umgesetzt.

6, Trockener Ansatz (Helv. 31,1908 [1948]) oder 0J7-m. in 30-proz.Methano1, 5 mg Ferment110 cm3, 30°, 8 Stunden. Diss. E. Sailer, erscheint demnachst.

7 ) Trockener Ansatz bei 38O oder 0,4-m. in Wasser, 10 mg Ferment/lO ?In3,

22O, 18 Stunden. 8) Nur trockener Ansatz. 9) Die Feptide sind in diesem Fall noch nicht identifiziert worden (Dipeptid

Wo besondere Angaben fehlen, sind die Versuche beim Eigen-pH dcr Losun- und Tripeptid ?).

gen durchgcfiihrt worden.

Die in Tabelle 2 zusammengestellten Ester des DL-Methionins gehen mit wenigen Ausnahmen, die sich durch ein hohes Molekular- gewicht ausxeichnen, in Gegenwart von 5% Wasser und 2 % d b i - schem Ferment bzw. 1% krist. Chymotrypsin in ein Gemisch von

l) Cristalline Enzymes, New York 1939. 2, M . Brenner, E. Sailer & V . Kocher, Helv. 31, 1908 (1948). 9 Bovine origin, lot 7291 X.

Volumen xxxrrr, Fasciculus 111 (1950) - No. 83.

Peptidfrak- tion. % der berechneten

Menge4)

573

Verhaltnis Peptidfrak- tion:,&ther-

unlosl.

Tabelle 2l). Pept idbi ldung bei verschiedenen Es te rn des DL-Methionins.

,,dtherunlosliches" ( = Gesamtreaktionsprodukt minus lipoidlosliche Anteile) und Peptid- fraktion ( = wasserunloslicher Anteil am ,,,&therunloslichen") aus 100 Teilen Ester, 5 Tei- len Wasser und 2 Teilen danischem Ferment nach 15-20 Stunden bei 38O. Vgl. experi-

menteller Teil, S. 587.

DL-Methioninester von 2,

Methanol . . . . . . . . Athano1 . . . . . . . . n-Propanol . . . . . . . i-Propanol . . . . . . . Allylalkohol . . . . . . . Methylcellosolve . . . . . n-Butanol . . . . . . . . i-Butanol . . . . . . . . sek. Butylalkohol . . . . n-Amylalkohol . . . . . Giirungsamylalkohol . . . t-Butylcarbinol . . . . . Diathylcarbinol . . . . . 2-MethylpentanoL(4) . . . Cyclohexanol . . . . . . Benzylalkohol . . . . . . Cycloheptanol . . . . . . n-Heptanol-(a) . . . . . n-Octanol . . . . . . . . Phenylathylalkohol. . . . n-Decano13) . . . . . . . n-Undeceno13) . . . . . . Laurylalkohol . . . . . . 7-,&thyl-2-methyl-

undecan01-(4)~) . . . . Oleylalkohol . . . . . .

Sdp. O C/mm

126113 13311 6 135/13 128/11 149116 170114 149114 128/14 145/13 173/16 161/15 151/14 155115 159/13 183/13 129/0,04 154/0,15 175114 156/0,2 152/0,15 151/0,05 166/0,1 158/0,02

I68/0,05 178/0,01 (Zers.)

hherunlosl. % der berechneten Menge4)

50 56 81 91 80 69 67 7

91 65 88 69 81 78 51 84 85 74 79 90 71 4 -

- -

14 13 36 30 30 15 23 ? 39 24 36 37 37 39 14 19 35 31 26 33 17

? -

-

-

0,28 0,23 0,45 0,33 0,37 0,22 0,34 0,39 0,43 0,37 0,41 0,54 0,46 0,50 0,27 0,23 0,41 0,42 0,33 0,37 0,24

? -

-

-

l) Wir danken Fraulein Dr. 8. Nobile fur ihre Hilfe bei der Durchfuhrung dieser Versuche.

2, Die Herstellung der Ester erfolgte zum Teil mit alkoholischer Salzsaure nach Emil Fischer und teils durch Alkoholyse des Methylesters. Zur Darstellung des letzteren ist eine besonders einfache Methode unter Verwendung von Thionyl- chlorid entwickelt worden. Vgl. den experimentellen Teil und die demnachst erscheinende Diss. W . Huber.

3, Reaktionsdauer 2 Tage. 4, Berechnete Menge = L-Methionin in 100 Teilen DL-Ester. Der wasserlosliche Anteil am ,,hitherunloslichen" besteht in allen Fallen

iiberwiegend aus L-Methionin.


schwer liislichen Produbten, freiem L-Methionin und unverandertem Ester uber. Letzterer besteht zur Hauptsache aus der n-3'orm des angewandten Esters und kann aiif u-Methionin verarbeitet werdenl). Die Untersuc,hung der schwerloslichen Produkte hat ergeben, dass sie peptidartig BUS L-Met8hionin aufgebant sind, indeni ihre totale Hy- drolyse zu I,-Methionin2) und ein partieller hydrolytischer Abbau zu 1,-Methionin-peptiden fuhrt 3). Es liegt offenbar ein Gemisch von optisch akt,iven Peptiden und ihren Xstern von der allgemeinen Formel NH,CH( R)CO[NHCH( R)CO],NHC)H( R)COOR' vor, wobei x - 3-105), R! = CH2CH,-&--CH3 und R' = H oder Alkyl ist. Seine Entstehung beruht primar auf einer ferment-induzierten linearen Selbstkondensation der L-Komponenten den racemischen Ester. Die Reaktionskette bricht ab, wenn die Produkte infolge zunehmender Molekulargrosse im Reaktionsmilieu unloslich werden. Nach erfolgter Bildung scheint ein Teil der Peptidester durch sekundare ferments,- tive Einwirkungen auf die Peptidbindungen oder die Estergruppie- rung wieder bis zu einem gewissen Grade hydrolytisch gespalten zu werden. I m Reaktionsprodukt sind jedenfalls geringe Mengen Methionin-Dipeptid und -Tripeptid nachweisbar. Inwiefern aueh das L-Methionin nicht durch direkte Esterverseifung, sondern durch einen Ahbau von Peptiden entsteht, kann vorlaufig nicht entschieden werden. Es ist in diesem Zusammenhang interessant, dass die Inkubation der unloslichen Peptidfraktion aus ,,nassen" Ansatzen (vgl. unten) mit danischem Ferment zu einer langsamen Freisetzung von Dipep- tid und wenig Tripeptid bzw. Methionin fiihrt (22O; p H 7-10, optimal bei 9; Toluol).

Die niederen Ester der Tabelle 2 sind teilweise ziemlich gut wasserloslich. Es ist deshalb moglich, die Fermentreaktion such in wasseriger Losung durchzufuhren. Der Isopropylester, der sich durch eine verhaltnism5issig grosse Bestandigkeit auszeichnet, ist hierzu besonders geeignet. Versetzt man eine gesattigte! etwa 0,34-m. wasserige Losung dieses Esters (pH - 9,2) bei Zimmertemperatur mit etwas krist. Chymotrypsin (ca. 0,Ol mg Protein-N pro mg Methionin-N), so tritt bereits nach einigen Minuten eine Opaleszenz auf, die stiindig ZLI-

nimmt und sich in einer Viertelstunde zu einer starken Triibung ver- dichtet. Nach 30-60 Minuten setzt sich ein flockiger Niederschlag ab, und die uberstehende Losung wird langsam wieder klar (pH - 8). Die Fallung, welche nach griindlichem Waschen mit Wasser und Trocknen gewichtsmassig 15-20 ?& des eingesetzten L-Met,hionins aus- macht', scheint airch hier ein ,,polymer-homologes" Gemisch von L- Methioninpeptiden und ihren Estern zu sein. I n der wiisserigen Lo-

l) M . Brenner & V . Kocher, Helv. 32, 333 (1949). 2, M . Brenner & V . Kocher, Exper. 4, 73 (1948).

Vgl. eine spiitere Abhandlung.

Volumen XXXIII, Fasciculus 111 (1950) - KO. 83. 575

sung befinden sich neben unverandertem D-Ester und freiem L- Methionin betrachtliche Mengen Methionyl-methionin und Methionyl- methionyl-methionin. Dieselbe Reaktion tritt ein, wenn an Stelle von racemischem opt'isch aktiver z-Methionin-isopropylester verwendet wird. Der enantiomorphe D-Ester dagegen ist dem Chymotrypsin gegenuber bestandig.

Ansatze in wasseriger Losung werden bei der weiteren Bespre- chung kurz als ,+ass", solche in Qegenwart von nur wenig Wasser, iias sich im Ester auflost, als ,,trocken" hezeichnet. SBmtliche Resul- tate der Tabelle 2 zum Beispiel beziehen sich auf trockene Ansiitze.

Ester-Ferment- Gemische ohne Wasserzusatz bleiben unverandert. Auch in Hontrollversuchen ohne Ferment und solchen mit hitze- inaktivierten Praparaten ist keine Peptidbildung zu beobachten. Schliesslich bleibt die Synthese ebenfalls aus, wenn man im nassen Ansatz den Ester durch die aquivalente Menge freien DL-Methionins und etwas Natronlauge (pH 8-9) ersetzt.

Qua l i t a t ive r u n d h a l b q u a n t i t a t i v e r Nachweis von Meth ionin-Dipept id u n d -Tr ipept id .

Fur die Auftrennung wasserloslicher Aminosiiure-Peptid-Gemi- sche und die Identifizierung ihrer Komponenten ist die papierchromatographische Methode am besten geeignet. Sie hat uns bei der analytischen Untersuchung der Fermentreaktionslosungen gute Dienste ge- leistet : Methionin, Methionyl-methionin, Di-methionyl-methionin und Methionin-isopropylester werden nach der im experimentellen Teil be- schriebenen Arbeitsweise schon eindimensional vollstiindig vonein- ander getrennt. Die diesen Substanzen entsprechenden, durch Nin- hydrin entwickelten Flecken finden sich auf dem Chromatogramm an charakteristischen Stellen und gestatten deshalb einen Vergleich zwischen Standardmischungen und unbekanntem Material. Die Identifi- zierung der Flecken wird dadurch weiter erleichtert, dass das Methio- nin und seine Derivate von Wasserstoffperoxyd leicht zur Sulfoxyd- und Sulfonstufe oxydiert werden und hierauf im Chromatogramm neue typische Positionen einnehmen. Eine dem experimentellen Teil beigegebene ,,Fleckenkarte" orientiert uber die mit und ohne H,O, ermittelten Stellungen der im vorliegenden Busammenhang interes- sierenden Verbindungen.

Die gunstige gegenseittige Lage der Flecken gestattet es, ihre Grossen und Intensitaten in Verdunnungsreihen bekannter und unbe- kannter Anfangskonzentrationen nach dem Vorschlag von A . Polson visuell miteinander zu vergleichen und auf diese Weise die in Gemi- schen vorhandenen Substanzmengen anniihernd zu bestimmen l). Wir

l) Biochim. biophys. acta 2, 575 (1948). Vgl. auck R. B. Fisher, D. S. Parsons & G. A . Morrison, Nature 161, 764 (1948).


haben uns davon uberzeugt, dass die Methode auch bei massigen Salz- konzentrationen und wechselnden pH-Werten (pH 6-10) fur unsere Bwecke brauchbar bleibt.

Die Figuren 1 und 2 zeigen das Verhalten eines sgnthetischen Gemisches von Methionin, Methionyl-methioninl), Di-methionyl- methionin2) und Methionin-isopropylester, ferner Verdunnungsreihen der beiden Peptide und schliesslich Verdunnungsreihen zweier typi- scher nasser Ansatze von racemischem Isopropylester mit krist. Chy- motrypsin bzw. danischem Ferment beim Eigen-pH der Losungen. Erklgrungen finden sich in den betreffenden Legenden sowie im experimentellen Teil.

Wie man sieht, stimmt das Fleckenmuster der Fermentreaktions- produkte praktisch mit jenem des synthetischen Gemisches uberein. Da sich diese Parallele in den - hier nicht gezeigten Wasserstoff- peroxydchromatogrammen wiederholt, kann kaum ein Zweifel bestehen, dass die Fermentreaktionslosungen das Di- und das Tripeptid des Methionins enthalten. Aus den Fleckenintensitaten Iasst sich fiir die Produkte aus dem Chymotrypsin-Ansatz ein approximatives molares Verhaltnis von Tripeptid : Dipeptid : Methionin von 1 : 0,6 : 9, fur jene aus dem Ansatz mit danischem Ferment ein solches von 1 : 1,3 : 10 ablesen. Auf insgesamt eingesetzten L-Methioninester bezogen, betragen die Ausbeuten (gleiche Reihenfolge) im ersten Fall rund 19, 8 und 59%3), im zweiten Fall rund 19, 1 7 und 64%. Die wasserloslichen Anteile aus trockenen Ansiitzen liefern Chromato- gramme, die sich von den eben besprochenen nur durch eine geringere Intensitat der Peptidflecken unterscheiden. Es aussert sich hierin eine auffallende Abhangigkeit des Reaktionsbildes von der Esterkonzen- tration. Wir werden unten auf diese Beobachtung zuruckkommen.

Uber die praparative Isolierung der Peptide sol1 in einer spateren Abhandlung berichtet werden.

Abhang igke i t des R e a k t i o n s b i l d e s v o n d e r Zei t . (Versuche mit DL-Methionin-isopropylester. )

Verfolgt man den Verlauf der nassen Fermentreaktion papierchromatographisch, so Iasst sich folgendes erkennen : Esterverseifung und Peptidbildung setzen unmittelbar nach der Fermentzugabe ein. Die Mengen an Dipeptid, Tripeptid und Methionin nehmen hierauf standig zu, bis nach etwa 8 Stunden der durch Figur 1 wiedergege- bene Endzustand erreicht wird. Die Bildung schwer loslicher Pro- dukte lasst sich am allmahlichen Auftreten eines Niederschlages erkennen und von da an gewichtsmassig verfolgen. Die Verhaltnisse sind in Tabelle 3 schema,tisch dargestellt.

l) Darstellung nach C . A . Dekker, S. P . Taylor & J . S. Pruton, J. Biol. Chem. 180,

3) Ansserdem entstehen hier rund 14% unlosliche Peptide. 155 (1949). 2, Darstellung : vgl. eine spatere Abhandlung.

Tafel I.

Fig. 1. d = Methionin-isopropylester c = Methionin-Tripeptid

b = Methionin-Dipeptid a = Methionin

Helvetica chimica acta, Vol. XXXIII, Fasc. 111, No. 83 (1950).

Tafe l 11.

Fig. 3.

Legenden :

Fig. 1 : Nr. 1- 5 : Chymotrypsin+ DL-Methionin-isopropylester

Nr. 6- 9: Synthetisches Methionin-Tripeptid: 120 y, 60 y, 30 y , 15 y Nr. 10-13: Synthetisches Methionin-Dipeptid: 80 y, 40 y, 20 y, 10 y

Fig. 2 : Nr. 1- 5 : ,,Dan. Ferment"+ DL-Methionin-isopropylester

Versuchsanordnung vgl. S. 585

Versuchsanordnung vgl. S. 585 Nr. 6: Synthetische Mischung van:

40 y Methionin + 80 y Methionin-Dipeptid + 120 y Methionin-Tripeptid + 57 y DL-Methionin-isopropylester

Nr. 7 - 9: Synthetisches Methionin-Tripeptid: 60 y, 30 y, 15 y Nr. 10-13: Synthetisches Methionin-Dipeptid: 80 y, 40 y , 20 y , 10 y

Fig. 3 : pH-Abhiingigkeit der enzymatischen Pcptidhildung. Versuchsanordnung : 325 mg nL-Methionin-isopropylester; 10 mg ,,dan. Ferment"; 10 em3 H,O Temperatur : 22O, Versuchsdauer: 10 Stunden pH-Einstellung und Kontrolle vgl. experimenteller Teil, S. 588. Beladung der Chromatogramme iiberall 1300 y. Ferner Kontrollversuche K9, K 7 und K 5 ohne Ferment bei pH 9, 7 und 5.

Volumen XXXIII, Fasciculus 111 (1950) - No. 83.

Tabelle 3. S e h e m a t i s c h e Dars te l lu i ig d e s ze i t l i chen Reakt ionsver laufes .

325 mg DL-Methionin-isopropylester, 5 mg kristallisiertes Chymotrypsin (Armour), 10 cm3 Wasser, 22", Eigen-pH der Losung. Die LBnge der Pfeile (++) ist ein willkurliches Mass f iir die visuell abgeschtitzte Fleckengrosse und -intensitat auf Chromatogrammen gleicher

Neladung (1300 y) .

517

-. Zeit in

Min.

2 15 35 65 95

210 390 510

-

--

Beschaffenheit des

Rkts. - Gemisches

klar

Opaleszenz Triibung

Flockung : 9 mg

,, 20mg

I Papierchromatogramm der wasserloslichen Anteile, relative Fleckengrosse

Dipeptid I Tripeptid I Methionin I I I I

I

I *) Vgl. Fig. 1. Gehalt an Dipeptid, Tripeptid und Methionin ungefkhr 10, 23 und I4 mg.

p H - A b h angigkei t d e r P e p t i d bi ldung. (Versuche mit DL-Methionin-isopropylester)

Figur 3 zeigt, dass die Peptidbildung in Gegenwart von danischem Ferment bei pH 10 und insbesondere 9 am ausgepragtesten ist, von dort bis pH 7 langsam abnimmt und bei p H 6 unvermittelt fast vollstiindig verschwindet. Im Gegensatz dazu erstreckt sich der Re- reich der fermentativen Esterverseifung mindestens bis zu p H 5 hin- unter. Dsss hier nicht otwa nur eine spontane Verseifung vorliegt, ergibt aich aus tlem Vergleich mit den fermentfreien Kontrollversuehen K, (pH 9), K, (pH 7) und K5 (pH 5) . Ein quantitativer Vergleich der Methioninflecken ist bei dieser Reihe unzulhssig, weil einerseits die Mengen zu gross sind und anderseits die Fleckengrosse beim Methio- nin salzempfindlicher ist als bei den Peptiden.

Die angegebenen pH-Werte sind mit NaOH oder EC1 eingestellt und wiihrend des Versuches im Hinblick auf Salzeffekte bei der Chromatographie nicht durch Zusatz von Puffern, sondern durch sorg- faltig kontrollierte Laugezugabe innerhalb 0,2 Einheiten konstant ge- halten worden ( Glaselektrode). Entsprechende Versuche mit krist. Chymotrypsin wurden nicht ausgefuhrt, lassen aber ein ahnliches Er- gebnis erwarten.

Das pH ungepufferter, nasser Ansatze liegt anfanglich bei unge- f5hr 9 und sinkt schliesslich auf etwa 8 hinab, fallt also beinahe mit dem Rereich optimaler Peptidbildung zusammen. Da das System uber

37

578 HELVETICA CHI1\IICh ACTA.

eine gewisse Selbstpnfferung verfugt, ist sein Eigen-pH gut reprodu- zierbar und gegen Konzentrationsanderungen oder andere Einflusse wenig empfindlich. Dieser Umstand gestattet es, zwischen pH 8 und 9 auf jede zusatzliche Pufferung zu verzichten und damit die papierchromatographisch lastigen Salzeffekte auszuschliessen. Dement- sprechend sind sowohl die naehstehend besprochenen Experimente uber den Einfluss der Ester- und Ferment-Konzentration, a18 auch jene, die den Figuren 1 und 2 und der Tabelle 3 zugrunde liegen, beim jeweiligen Eigen-pH der Losungen durchgefuhrt worden.

Abhang igke i t des Reak t ionsb i ldes v o n d e r E s t e r - uncl F e r m e n t - Konz e n t ra t ion.

(Versuche mit m-Methionin-isopropylester)

Das Mengenverhaltnis von unloslichen Reaktionsprodukten, wasserloslichen Peptiden und freiem Methionin hangt stark von der Esterkonzentration ab.

1st nur sehr wenig Wasser zugegen (trockener Ansatz), 80 gehen bei vollstandigem Umsatz etwa 15 yo des angewandten racemischen Esters (30 % der L-Komponente) in Peptidester oder Peptide uber, welche in Ather und Wasser unloslich sind. Die restlichen 70 yo L-Kom- ponente werden hauptsachlich in freies L-Methionin umgewandelt. Daneben entstehen kleinere Mengen bisher nicht nntersuchter, lipoid- loslicher Peptidester und sehr wenig wasserlosliches freies Di- und Tripep tid l) .

Tabelle 4 zeigt nun, wie die Rusbeute an diesen wdsserlos~ichen Peptiden in nassen Ansatzen auf Kosten der unloslichen Produkte amteigt, bis sie bei zunehmender Verdunnung im Moment des Ver- schwindens der letzteren ein Maximum erreicht. Verdunnt man noch weiter, so nimmt sie wieder ab, indem nun an Stelle yon Peptiden ver- mehrt Methionin gebildet, wird. Das Maximum liegt in Gegenwart yon 5 mg krist. Chymotrypsin/lO cm3 bei einer Molaritiit von 0,08-0,17, in Gegenwart von 70 mg danischem Ferment/lO em3 bei einer Mola- ritat von 0,17. Wahrend durch das danische Ferment etwa gleich vie1 Di- und Tripeptid gebildet werden, steht beim reineren Chymotrypsin die Tripeptidbildung im Vordergrund (vgl. Figur 1 und 2 sowie Ta- belle 9). Es ist interessant, dass die maximale Totalausbeute an wasserloslichen Peptiden in nassen Ansatzen ungefahr der maximalen Totalausbeute an unloslichen Peptiden in trockenen Rnsatzen entspricht.

Tabelle 5 verniittelt einen qualitativen Eindruck von der Ver- anderung des Reaktionsbildes bei variabler Ferment- und konstanter Ester-Konzentration.

Siehe experimentcller Teil : Beispicl rines trockenen Ansatzes.


Tabelle 4.

579

Abhangigkei t d e s R e a k t i o n s b i l d e s v o n d e r E s t e r - K o n z e n t r a t i o n . DL-Methionin-isopropylester, 5 mg kristallisiertes Chymotrypsin (Armour) l), 10 cm3 Was- ser, 2Z0, 10 Stunden, Eigen-pH der Losung. Chromatogrammbeladung und MaBstab fur

Fleckengrosse wie in Tabelle 3.

Ester -konz. niol/l

0,342) 0,17 0,085 0,042

- Trubung unlosl. Papierchromatogramm der wasserloslichen Anteile,

nach Peptide Min. mg Dipeptid 1 Tripeptid I Methionin

relative Fleckengrosse _.

10 44 --9 -+ a+ 60 18 --+3) t - + 3 ) -- *

--+ +-+ +--------* - -

- - t- + 4- b

I) Mit diinischem Ferment erhalt man ein ahnliches Bild. Es unterscheidet sich nur dadurch, dass schon bei der Esterkonzentration 0J7-m. keine unloslichen Peptide mehr entstehen und die Dipeptidfleeken mit Ausnahme hochster Ferment- konzentrationen (Tabelle 5 ) die Tripeptidflecken an Grosse und Intensitat uber- treffen.

2, Vgl. experimenteller Teil : Beispiel eines nassen Ansatzes. Versuchsdauer 15 Stunden.

Vgl. Fig. 1. Ausbeute an Dipeptid und Tripeptid rund 10 und 23 mg.

Tabelle 5. Abhiingigkei t d e s R e a k t i o n s b i l d e s v o n d e r F e r m e n t - K o n z e n t r a t i o n .

Kristallisiertes Chymotrypsin (Armour), 325 mg DL-Methionin-isopropylester in 10 cm3 Wasser (c = 0,17-m.), 22*, Eigen-pH der Losung. Versuchsdauer 10 Stunden (wasserlosliche Peptide) bzw. 24 Stunden (unloisliche Peptide). Chromatogrammbeladung und

MaBstab fur Fleckengrosse wie in Tabelle 3.

Triibung unlosl. Papierchromatogramm der wasserloslichen Anteile,

ungefiihr mg Dipeptid I Tripeptid I Methionin beginnt nach Peptide relative Fleckengrosse

l) Die Reihe ist unter Verwendung von danischem Ferment bis zu einer Zu- gabe von 80 mg (entsprechend ungefahr 40 mg kristallisiertem Chymotrypsin) weitergefuhrt worden. Die Gesamtausbeute an wasserloslichen Peptiden blieb dabei unveriindert, dagegen war im Verhaltnis Dipeptid : Tripeptid eine Verschiebung zugunsten des letzteren zu beobachten. Unlosliche Peptide werden Tom danisehen Ferment in 0,17-m. Esterlosung nicht mehr gebildet.

z, Vgl. Fig. 1. Ausbeute an Di- und Tripeptid rund 10 und 23 mg. -


Die niederste Ester-Konzent'ration aus Tabelle 4 (0,04-m.) gibt mit 1 mg danischem Ferment/lO em3 (ent,sprechend ungefahr der niedersten Ferment-Konzentration aus Tabelle 5 ) noch namhafte Mengen Dipeptid.

Diskussion. Die vorliegende Mitteilung stutzt sich auf zahlreiche Versuche,

die unter Verwendung von vier verschiedenen Fermentpriiparaten durchgefuhrt worden sind und ohne Ausnahme einen fermentativen Aufbau von Methioninpeptiden erkennen liessen. Zwei diescr Pra- parate sind unter der Rezcichnung ,,kristallisiertes Chymotrypsin" aus dem Handel bezogen und ein drittes nach einer bekannten Vor- schrift l ) zur Herstellung von Chymotrypsin bereitet worden. Es scheint deshalk, berec,htigt zu sein, die entdeckte Fermentwirkung dem Chymotrypsin selbst zuzuschreiben. Nun machen aber S. Knufmnn & E. ATezc.i.ath eine Angabe uber die Chymotrypsinwirkung, die unseren eigenen Reobachtungen widerspricht. Die genannten Autorcn er- wahnen, dass lzrist. Chymotrypsiii den Tyrosin-a'thylcstcr nur sehr langsam verseife2). Unsere Priiiparate dagegen fuliren denselben Ester (L-Form) glatt in freies Tyrosin und weitere Substanzen uber (Tyrosin- Dipeptid und -Tripeptid "!)3). Ihre Benennung als Chymotrypsin erfordert daher noch eine gewisse Uberprufung.

Fur den Augenblick indessen ist die Frage der Identitat unserer Fermente weniger wichtig als die Tatsache ihrer Existenz und ihrer Wirkungsweise. Lctzterc besteht untcr geeigneten Redingungen darin, dass Aminosaureester in niedere freie Peptide ubergehen. Man kann sich vorstellen, dass diese Synthese auf einer primaren Ester-Konden- sation und einem nachfolgenden Abbau gebildeter Peptidester beruht. Obschon diese Vorstell-~mg plansibel erscheint und unsere Ergebnisse zu erklaren vermag, ist noch eine weitere Moglichkeit in Erwagung zu ziehen. Eine t,hermodynaniisc,he Bet'rachtung zeigt namlich, daas Re- aktionen vom Typus

in wasseriger Alaninester + Glycin - Aianylglycin + ROH

Losung

mit einer erheblichen Abnahme der Freien Energie verbunden waren ( A FO,,, ungefahr - 5000 Experimentelle Anhaltspunkte fur

l ) J . H . Northrop, Cristalline Enzymes, New York, 1939. *) Arch. Biochem. 21, 437 (1949). 4, Die Rechnung basiert auf folgenden gberlegungen: a) +NH,CH(CH,)COO- + +NH,CH,COO- + +NH,CH(CH,)CONHCH,COO- + b) +NH,CH(CH,)COO- + NH,CH(CH,)COOH; LIFO - + 7300 cal. c) NH,CH(CH,)COOH + R O H + NH,CH(CH,)COOR + H,O; dFo - + 1500 cal. d ) NH,CH(CH,)COOR + +NH,CH,COO- --f +NH,CH(CH,)CONHCH,COO- +

3, Vgl. Tabelle 1.

H,O; dFo = + 4000 cal.

ROH; dFo - - 5000 cal. Fortsetzung der Anmerkung siehe S. 581.


oder gegen dasVorliegen einer solchen Resktionsweise existieren zur Zeit nicht. Der Nachweis von Peptidestern ist hierbei ohne Beweiskraft, weil die eine Kondensationsart die andere nicht a'uszuschliessen braucht.

Es ist uns bisher nicht gegliickt, die Pept'idsynthese ohne gleichzeitige Bildung von freier Aminosaure zu verwirklichen. Im Fall des Methionins entstehen in nicht zu verdiinnter Losung a,uf einen Ge- wichtsteil Peptide etwa zwei Gewieht,steile freies Methionin. Beim Threonin verschiebt sich das Mengenverhaltnis zugunsten der Pep- tide, beim Phenylalanin und Tyrosin dagegen zugunsten der freien Aminosauren. Tryptophanester scheinen uberhaupt nur verseift zu werden (Tabelle 3 ) . Die relative Peptidausbeute sinkt also in der Reihenfolge Threonin, Methionin, Phenylalanin l ) , Tyrosinl), Trypto- phan. Interessanterweise nehmen die maximalen proteolytischen Koeffizienten (C,,,,) bei der c!hymotryptischen Hydrolyse der entsprechenden Acylaminosaureester in derselben Reihenfolge zu2). Der Abbau, welcher bei unsern Versuchen zu den freien Aminosauren fiihrt, gehorcht' also in bezug auf die Aminosaureseitenkette den von X. Ka,ufmaia d? H . Neu,rath 2, aufgestellten Gesetzmassigkeiten. Damit ist die Entstehungsweise der Aminosauren a,llerdings noch nicht ge- klart. Es kann sowohl eine direkt~e Esterverseifung als a'uch ein Abbsu von Peptiden vorliegen. Im ersteren Fslle wurde das Geschwindig- heitsverhaltnis von Esterverseifung und Peptidsynthese, in1 letzteren jenes von Peptidsynthese und Peptidhydrolyse das Reaktionsbild be- st,immen. Heim Met,hionin ist anzunehmen, dass wenigstens ein Teil der freien Aminosaure aus Peptiden stammt,. Die schwerloslichen Pept,ide lasscn sich hier, wenn such langmm, enzymatisch a,bbauen. E'erncr tritt die Peptidbildung in Ge,genwart roher (pe,ptidasehalt,iger 1 ) Fermenbpriiparatc zugunste,n der Methioninbildung vollig in den Hin t ' e rgr~nd~) .

Im Hinblick auf die ausgepragte Affinita't zwischen unseren Chy- motrypsinen und spezifischen Aminosaureestern einerseits und die

Fortsetzung von Anmerkung 4), S. 580.

a) H. Borsook R: J. W . Dubnoff, J. Biol. Chem. 132, 307 (1940). b) E. J . Cohn & J. T. Edsall, Proteins, Amino Acids and Peptides, New York 1943,

c) W . HuckeZ, Theoret. Grundlagen der organischen Chemie, 4. Aufl., Bd. 2, S. 537, gibt fur die Gleichgewichtskonstante der Methylesterbildung von Fettsauren (ausser Ameisensaure) einen mittleren Wert von I< = 5 an. xhnliche Werte von Veresterungs- konstanten finden sich in P. H . Groggins, Unit Processes in Organic Synthesis, 3. Aufl., New York 1947, S.620ff. Wir nehmen versuchsweise an, dass die Konstante fur die Veresterung einer ungeladenen Aminofettsaure von derselben Grossenordnung sei.

d ) Es ist AP: = AFi- AFi- AF:. Die partielle Ionisierung des Aminosaureesters (pK - 7,7) in neutralem Milieu andert das Ergebnis nur unwesentlich.

l) Die Platze dieser beiden Aminosauren sind moglicherweise zu vertauschen. 2, S. Kaufrnan & H . Neuruth, loc. cit. 3, M . Brenner & V . Kocher, Helv. 32, 333 (1949).

Vgl. zu :

S. 99: log Kz(Alanin) = 5,41.


von Neuurath und Mitarbeitern l) heobachtete AffinitBt zwischen Proteasen und acylierten Aminoestern anderseits stellt sich die Frage einer moglichen biologischen Bedeutung veresterter Aminosiiuren und Peptide. Besteht insbesondere eine Beziehung zwischen der biologischen Peptidsynthese und der aufgcfundenen Fermentreaktion ? Von vornherein ist dies nicht ausgeschlossen. Eine Uberschlagsrechnung zeigt namlich, dass die Phosphatbindungsenergie zur Veresterung von Aminosauren und Peptiden ausreichen diirfte2). Die experimentell sichergestellte Kopplung zwischen Phosphatzerfall und Peptidsyn- these konnte also prinzipiell iiber die intermediare Rildung von Estern erfolgen. Mehr liisst sich vorlaiufig nicht aussagen. Vor alleni bleibt die Natur der hypothctisch als Zwischcnprodukte auftretenden Ester vollig ungekliirt. Die geringe ,,Esterspezifitat" der Fermentreaktion (Tabelle 2 ) liisst hier zahlreiche Moglichkeiten offen. Reim gegen- wiirtigen experimentellen Stand der TTntersuchung ist jedenfalls eine gewisse Zuruckhaltung in der Reurteilung der Ergehnisse geboten. Wahrend die Entdeckung unserer enzymstischen Peptidsynt'hese die erst kiirzlich wieder aufgeworfene Fra,ge einer synthetischen Aufgabe der Prot,easen3) ohm Zweifel in ein neues Licht ruckt, bleibt ihre Be- ziehung zum biologischen Aufbau der Peptidbindung bis auf weiteres eine blosse Arbeitshypothese. Dies gilt um so eher, als die Reaktion bisher erst bei einem einzigen Ferment mit Sicherheit beobachtet worden ist.

Der eine yon uns (1M. Brenner) dankt der J . R. Geigy AG. in Base1 fur die Unter- stutzung dieser Arbeit.

Experimenteller Tei l . 1. Anwendung d e r P a p i e r c h r o m a t o g r a p h i e 4 ) zu r Analyse von Gemivchen

a u s Meth ionin u n d Meth ioninpept iden . a) Methodilr.

Samtliche Chromatogramme sind nach der,,ascending n~ethod"~) mit Whatman-Papier Nr. 1 durchgefuhrt worden (Zylinderhohe 28,5 cm). Als mobile Phase wurden verschiedene, in der Verteilungschromatographie gebrauchliche Losungsmittel, wie Phenol, Butanol, Benzylalkohol u. a. m. ausprobiert. Die besten Resultate erhalt man mit dem System Collidina)/Wasser. Dank der hier giinstigen Lage der Flecken konnen die Analysen eindimensional durchgefuhrt werden. Die Laufzeit unseres Collidins betragt fur eine Hohe von 28 cm bei einer Raumtemperatur von ca. 220 rund 19 Stunden. Anschliessend werden dic Blatter 1 +/-2 Stunden bei 50-60° getrocknet. Entwickelt wird durch Behandlung mit einer 0,'l-proz. Losung von Ninhydrin in n-Butanol + 3-Vol-proz. Eisessig und anschliessendes 15-30minutiges Envarmen auf 50-600.

l) S. Kaufmann & H . Neuralh, loc. cit. z, Nach Fussnote 4, auf Seite 580 erfordert die Veresterung einer AminosBure die

Zufuhr von rund 9000 cal freier Energie. Der Phosphatzerfall dagegen liefert etwa 12000 cal ( F . Lipmann, Adv. Enzymol. I , 99 [1941]).

3, S. W . Fox, C. W. Pettinga, J . S. Halverson & H . Wax, loc. cit. 4 , R. Cmsden, A. H . Gordon & A . J . P. Martin, Biochem. J. 38, 224 (1944). 5 , R. J . WiZZiams & H . Kirby, Science 107, 481 (1948). 6 , ,,Collidin" der Schweiz. Teerindustrie AG., Pratteln, Kp. 164-171O.


b) F l e c k e n k a r t e e iniger D e r i v a t e des Neth ionins .

Die nachfolgende schematische Zusammenstellung (Fig. 4) orientiert uber die Lage der Flecken einiger im vorliegenden Zusammenhang wichtiger Derivate des Methionins. Es handelt sich dabei mehrheitlich um papierchromatographisch neue Substanzen.

583

Fig. 4. F l e c k e n k a r t e l ) e in iger D e r i v a t e d e s Methionins .

Die Kreuze bezeichnen die durchschnittliche Lage der Flecken nach eindimensionalem Chromatographieren in CollidinlWasser. Die Ringe bezeichnen die Stellen, wo die Losun- gen aufgetropft wurden. Flecken, die mit [ij bezeichnet sind, sind in ihren Positionen relativ stark konzentrationsabhangig. Der mit ( x ) bezeichnete Flecken war schwach und unscharf und ist nur zum Vergleich mit Nr. 12 und 15 in diese Ubersicht aufgenommen

worden. Es bedeutet : 1. Methionin-isopropylester. 2. Oxydationsprodukte von Methionin- 3. I isopropylester,). 4. Methionindipeptid-isopropylester. 5. Oxydationsprodukt Ton Methionindipeptid-

6. Unbekannt (vermutl. Methionintetrapeptid). 7. Methionintripeptid.

isopropylester2).

8. Oxydationsprodukte von 9. 1 Methionintripeptidz).

10. Methionindipeptid. 11. Oxydationsprodukte von 12. ! Methionindipeptid2). 13. Methionina). 14. Methionin-sulfoxyd3). 15. Methionin-sulfon3).

l) Vgl. ,,map of the spots" bei C . E. Dent, Biochem. J. 43, 169 (1948). 2, Nach Auftragen der Testsubstanz und anschliessendem Trocknen mit einem

Tropfen 30-proz. H,O, direkt auf dem Papier oxydiert, wiederum getrocknet und chromatographiert. - Auf eine chemische Analyse der Oxydationsprodukte wurde verzichtet. I m Rahmen der vorliegenden Arbeit genugte es, wenn die enzymatisch gebildeten und die synthetisch hergestellten Verbindungen nach der Oxydation papierchromatographisch gleiches Verhalten zeigten. Dies war tatsachlich der Fall.

3, Die Lage dieser Flecken ist bereits von Dent, loc. cit., beschrieben worden. Seine Angaben stimmen trotz verschiedener Methodik und Verwendung anderer Collidin- gemische relativ gut mit unseren RF-Werten uberein.


c) Sa lzef fek te u n d p H - K o n t r o l l e . Permentreaktionen werden in dcr Regel in gcpuffertcr Losung bei konstantem pH

durchgefiihrt. Salzhaltige Losungen lassen sich jedoch schlecht papierchromatographieren. Die Flecken werden verzerrt und schlierenformig (tailing), und die RF-Werte sinken merk- lich. Es ist aus diesem Griinde notig, solche Losungen zu entsalzen. Methoden, die sich hierzu eignen, sind in der Literatur verschiedentlich beschrieben worden’). Wenn immer miiglich wird man aber schon der Einfachheit halber versuchen, die Rcaktionsbedingungen so zu wahlen, dass auf eine Entsalzung verzichtet werden kann.

Unsere Fermentversuche erfordern nun zur Fixierung des pH naturgemass eine starlre Pufferung. Das Mengenverhaltnis zwischen gebildeten Peptiden und zuzufugendem Salz ist dabei auch im besten Falle (Konzentration an DL-Methionin-isopropylester 0J7-m.) derart ungiinstig, dass eine papierchrornatographische Auswertung ohne vorherigc Entsalzung unmoglich wird. Vorversuche mit verschiedenen Puffergemischen licferten schon bei ungenugenden Pufferkonzentrationen unbrauchbare Chromatogramme. Zur Urn - gchung der Entsalzung wurdc dahcr folgende einfache Methode gewahlt.

Die wiisserigc Methionin-isopropylesterlosung (c = OJ7-m. ; pH = 9,2) wird r r i i t Batronlaugc odcr Salzsiiure auf das gcwiinschte pH gebracht (pH-Bereich 5-10), das Ferment zugegeben und der nun sofort einsetzende pH-Abfall durch fortwahrcnde Zu- gabe kleinster Mengen Natronlauge kompensiert (Glaselektrode). Mit einem niagnetischen Ruhrer sorgt nian fur rasche Verteilung dcr Lauge in der wasserigen Losung. Das Reak- tionsgcmisch enthalt auf dicse Wcisc bei Vcrsuchsabbruch relativ geringe Salzmengen und liisst sich gut chromatographiercn. Spcziclle Kontrollversuche mit jeweils entsprechenden NaC1-Konzcntrationcn und pH-Wcrtcn haben hinsichtlich Lage, Intensitat und Grasse der Peptidflecken keincn Salzcffekt erkcnncn lassen. Ein Beispiel findet sich auf Seite 589.

d) Beladung d e r Chromatogramme. Unter der Beladung eines Chromatogrammes verstehen wir die auf das Papicr ge-

brachte Substanzmenge. Diese Grosse ist bei der Analyse von Fermentreaktionslosungen nicht in einfacher Weise bestimmbar. In solchen Fallen geben wir als Beladung diejenige Mengc Methioninester an, welche vor der Reaktion in dem zur Chromatographic aufge- tropften Volumen vorhanden war. Da der Anteil an wasserloslichen Peptiden in Ferment- reaktionsgemischen verglichen mit unverandcrtem D-Ester und entstandeneni L-Rlethio- nin relativ klein ist, und da die Fleckenintensitat der Peptide bei einer gegebenen Sub- stanzmenge von ihrer Molckiilargrosse abhiingt, muss in relativ hohen Konzentrationen chromatographiert werden. Es sind in der Regel bis zu 1300 y Substanz, ausgedruckt als DL-Ester, aufgetragen worden. Um auch bei schwerer loslichen Verbindungen die gewiinsch- te Beladung zu erreichen, werden verdunntere Losungen mehrnials hintereinander auf dieselbe Stelle aufgetropft. Dazwischen wird jedesmal bei 50-60° getrocknet, um ein Aus- cinanderfliessen der Substanz zu verhindern.

In der Regel konnten die Versuchsbedingungen so gestaltet werden, dass sich die wasserige, filtrierte Losung nach Abbruch der E’ermentreaktion ohne vorheriges Konzen- trieren direkt chromatographieren liess.

e) C h r o m a t o g r a p h i e e iner s y n t h e t i s c h e n Mischung u n d Nachweis v o n e n z y m a t i s c h g e b i l d e t e m D i - u n d Tr ipept id . F i g u r 1 u n d 2.

Das papierchromatographische Verhalten von Methionin-Dipeptid und -Tripeptid im Gemisch mit Methionin und Methionin-isopropylester beansprucht im Hinblick auf die Zusammensetzung der Fermentreaktionsgemische besonderes Interesse. Wir haben deshalb eine entsprechende synthetische Mischung chromatographiert und festgestellt, dass die Lage der Peptide durch die genannten Begleitstoffe nicht beeinflusst wird. Aus Eigur 2 geht klar hervor, dass die RF-Werte in der synthetischen Mischung (2 , Nr. 6) mit jerien

l) R. Consden, A . H. Gordon ct A . J . P. Martin, Biochem. J. 41, 590 (1947); A. F. MiiEkr & F . Leuthardt, Helv. 32, 2289 (1949).


der fur sich allein chromatographierten Peptide (2, Nrn. 7--9 und 2, Krn. 10--13) in vergleichbaren Konzentrationsbereichen iibereinstimmen. Die in den Verdiinnungsreihen sichtbaren, kleinen Veranderungen der RF-Werte sind konzentrationsbedingt und gehoren zum normalen Bild der Papierchromatographiel).

Zum Vergleich der Fleckenintensitaten und -grossen sind die Substanzen im Misch- chromatogramm in ungefahr aquimolaren Mengen aufgetragen worden. Man sieht,, dass trotz Aquivalenz der Mengen Flecken von homologen Stoffen nur grob miteinander vergleichbar sind (2, Nr. 6).

Ausdriicklich hingewiesen sei auf die sehr schone Ubereinstimmung zwischen den Chromatogrammen des synthetischen (2, Nr. 6) und des enzymatischen Gemisches (2, Ern. 1-5). Im Verein mit den hier nicht im einzelnen wiedergegebenen Resultaten der Wasserstoffperoxyd-Chromatogramme lassen die Bilder 1 und 2 keinen Zweifel an der Zuordnung der bei Fermcntreaktionsprodukten auftretenden Flecken b und c bestehen : sie miissen auf dem Vorliegen von Methionin-Dipeptid und -Tripeptid beruhen.

f ) K o n z e n t r a t i o n s r e i h e n u n d i h r e Auswer tung: F i g u r 1 u n d 2. 325 mg DL-Methionin-isopropylester in 10 ern3 Wasser (c = 0,17-m, Bildungsopti-

mum fur wasserlosliche Peptide) wurden mit 5 mg kristallisiertem Chymotrypsin (Armour) resp. 10 mg danischem Ferment rund 12 Stunden bei 22O stehengelassen. Man filtrierte von wenigz) unloslichen Reaktionsprodukten ab und chromatographierte mit folgenden abgcstuften Beladungen: Tabelle 6, Figuren 1 und 2. Auf dcnselbcn Papierbogen wurden fcrner abgestufte Mengen von synthetisehem Dipeptid und Tripeptid chromatographiert : Tabelle 7 und 8, Figur 1 und 2.

Tabelle 6. Chromatographie der Reaktionsprodukte aus 325 mg DL-Methionin-isopropylester, 10 em3

Wasser und 5 mg Chymotrypsin bzw. 10 mg danischem Ferment (Fig. 1 und 2).

Reaktions- losung

unverdiinnt

doppdt verd. vierfach verd.

Figur 1 und 2 Nr .

1 2 3 4 A

cm3 aufgetropfte y DL-Methionin- Losung isopropylester

4 x 0,Ol 1300 2 x 0,01 650 1 x 0,Ol 325 1 x 0,01 162 1 x 0,01 81

Vergleicht man nun in den Chromatogrammen die verschiedenen ,,synthetischen" und ,,enzymatischen" Peptidflecken gleicher Lage hinsichtlich Intensitat und Grosse, so ergeben sich aus Figur 1 die Daten der Tabelle 7 und aus Figur 2 die Daten der Tabelle 8.

Unter der Voraussetzung, dass die D-Komponente des racemischen Esters wahrend der Reaktion unverandert bleibt und der gesamte L-Ester in Methionin und Di- bzw. Tripeptid ubergeht, ergibt sich aus dem bei einer Gesamtbeladung von 1300 y ermittelten Anteil von Di- und Tripeptid (40 und 80 y Dipeptid bzw. 90 und 90 y Tripeptid, vgl. Kolonne 3 von Tabelle 7 und 8) das prozentuale und molekulare Verhaltnis der Reaktions- produkte3). Da im ubrigen 1300 y einem Volumen von 0,04 em3 Reaktionslosung ent-

l) R . B. Fisher, D. S. Parsons d G . A . Morrison, Nature 161, 764 (1948). z, Im Falle des Chymotrypsins handelt es sich hier um 15-20 mg, beim danischen

Ferment urn Spuren. 3, Die genannte Voraussetzung ist beim Chymotrypsin-Ansatz nicht ganz erfiillt, in-

dem dort rund 18 mg oder 14% des gesamtenl-Methionins in Form unloslicher Peptide aus- fallen. Bei der Berechnung der Chymotrypsinwerte inTabelle 9 ist dies beriicksichtigtworden.


Tabelle 7. Visueller Vergleich der Flecken aus Figur 1 und ungefahre quantitative Auswcrtung.

13 12 11 10

,,Synthetische" Flecken I

60 120 10 20 40 80

entspr. ,,enzymat." Peptidmengen auf Flecken Chromatoaramm Kr. 1

13 12 11

Tripeptid Nr .

60 120 10 20 40

Dipeptid . ripeptid Dipeptid Nr.

i 70 9

50 74

5,5 23

19

3,6 10

8

Tripeptid Pu'r.

9 8 7 6

____ 3-4 2-3 I -2

what- zungs- weise

90 & 30 y 3 2 1

schat- zungc- weise

40 & 10 y

Tabelle 8. Visueller Vergleich der Flecken aus Figur 2 und ungefahre quantitative Auswertung.

,,Synthetische" Flecken entppr. ,,enzymat." Flecken

Peptidmengen auf tmm Xr. 1

Dipeptid

schat- zungs-

Chromator Dipeptid

Xr. Tripeptid rripeptid

Nr . 9 8 7 6

~-

rripeptid Nr.

3-4 2 -3 1-2

schat- zungs- weisc

90 f 30 y

i weise 80 & 20 y

Tabelle 9. Approximative Zusammensetzung der wasserloslichen Reaktionsprodukte aus 325 mg DL- Methionin-isopropylester, 10 cm3 Wasser und 5 mg Chymotrypsin bzw. 10 mg danischem

Ferment. Fehlergrenze ungeflhr & 30% (Figur 1 und 2).

Tripeptid I Dipeptid I Methionin IThym. I dan. F. I Chym. I dan. F. 1 Chym. 1 dan. -I F.

Zusammensetznng in yo. . . . Anzahl Mole pro Mol Tripeptid Konzentration in Millimol/Liter mg/lO em3 . . . . . . . . . Ausbeute in Yo, bez. auf einge-

setztesl-Methionin') . . . .

21 1 5,5

23

16 1,3 7,1

20

66 10 54 81

64 19 17 59

Der Chymotrypsinansatz liefert neben Methionin, Dipeptid und Tripeptid noch unlosliche Peptide. Ausbeute: 14%. Vgl. Fussnote 3, auf Seite 585.


sprechen (Kolonne 3 von Tabelle 6), Iassen sich auch die Konzentrationen und absoluten Mengen des entstehenden Methionin-Dipeptids und -Tripeptids angeben. Diese Daten sind in Tabelle 9 zusammengestellt. Es sei darauf hingewiesen, dass es sich durchwegs uni Naherungswerte mit einer Fehlergrenze von etwa & 30% handelt.

2. Durchf i ihrung d e r Fermentversuche .

a) Beispiel c ines , , t rockenen" F e r m e n t a n s a t z e s . 8,67 g DL-Methionin-isopropylester, 90 mg kristallisiertes Chymotrypsin (Lehn. &

Fink), enthaltend 50% Magnesiumsulfat, und 420 mg Wasser werden gemischt und 19 Stunden bei 38O aufbewahrt. Man riihrt hierauf das vollig erstarrte Reaktionsgemisch mit 30 cm3 .&her an, zentrifugiert, dekantiert und behandelt noch viermal in gleicher Weise mit je 30 em3 hither. Der unl6sliche Ruckstand wiegt lnfttrocken 3,02 g (89% der Theorie). Er wird gemahlen und in einem Sozleth-Apparat nochmals sechs Stunden mit Ather ausgezogen. Das in der Hiilse euriickbleibende Produkt (2,78 g Aminosaure-Peptid- gemisch) wird mit 4 cm3 Alkohol angefeuchtet und hierauf in 200 cm3 Wasser suspendiert. Man digeriert 6 Stunden, filtriert das Ungeloste ab, wascht griindlich mit Wasser iind trocknet es im Vakuum uber Schwefelsaure. Ausbeute: 1,08 g ,,Peptide".

Alle hitherlosungen werden vereinigt, eingeengt und der zuriickbleibende Rohester (4,7 g) im Hochvakuum destilliert. Die Substanz dunstet ohne eigentliches Sieden bei 69-82O (0,l mm, Bad 94-1120) uber. Man erhalt 3,75 g Ester mit einer Drehung [m]: =

+ 6,16O (unverdiinnt)'). Durch Verseifung mit Salzsaure und Entsauerung mit Aniberlite IR-4B werden daraus 2, l g D-Methionin, [ c L ] ~ = - 21,6O & 0,2O (c = 5 in 6-n. HCI) erhalten. Diese Drehung entspricht einer Mischung von etwa 95% D- und 5% L-Methinion. Zur Gewinnung von optisch reinem Nethionin vg1.2). Der Riickstand von der Destillation des D-Esters enthalt neben wenig Zersetzungsprodukten die bisher nicht untersuchte lipoidlosliche Peptidfraktion (rund 500 me).

Der wasserige Extrakt wird irn Vaknum zur Trockene verdampft. Er enthalt vie1 L-Methionin und wenig wasserlosliche Peptide. Die letzteren lassen sich durch fraktionierte Kristallisation in den Mutterlaugen Ltnreichern. Kocht man den gesamten wasserloslichen Anteil zur Hydrolyse der Peptide mit 20-proz. Salzsaure, so erhalt man nach dem Ab- dampfen der iiberschiissigen Saure und Entsauerung des Hydrochlorids rnit Amberlite IR-4R fast reines L-Methionin: [ C L ] ~ = +22,20 f 0,2O (c = 5 in 6-n. HCl).

Das Resultat ist praktisch identisch, wenn man an Stelle des Lehn & Fink-Praparates Chymotrypsin ,,Armour", amorphes Chymotrypsin oder die doppelte Menge danisches Ferment verwendet.

b) Beispiel e ines , ,nassen" F e r m e n t a n s a t z e s .

5 om3 DL-Methionin-isopropylester werden mit 50 cm3 Wasser 90 Minuten bei Raum- temperatur geschuttelt. Die wasserige Phase des resultierenden Gemisches lasst sich im Scheidetrichter nur schlecht abtrennen. Man erhiilt indessen bei ein- bis zweimaligem Fil- trieren durch Faltenfilter ein vollstandig klares Filtrat. Dasselbe wird, um bei Tempera- turschwankungen eine ubersattigung zu vermeiden, sofort mit 5% Wasser versetzt. Eine so bereitete Losung enthalt im Durchschnitt etwa 4,75 mg N/cm3 (KjeldahE). Dies entspricht einer Esterkonzentration von 65 mg/cms oder 0,34 Mol/Liter.

20 cm3 obiger Losung (1300 mg racemischer Ester) werden rnit der Losung von 10 mg kristallisiertem Chymotrypsin (Armour) in 1 om3 Wasser versetzt und 15 Stunden bei 220 aufbewahrt. Man beobachtet nach 10 Minuten eine deutliche Triibung, nach 30 Miniiten eine starke Triibung und nach 60 Minuten beginnendes Ausflocken eines Nie-

~

l) Die Drehung des Esters ist kein MaDstab fur seine optische Einheitlichkeit, da

2, Helv. 32, 333 (1949). sie durch Spuren von Feuchtigkeit verandert wird. Vgl. 2) .


derschlages. Zur Aufarbeitung wird das Reaktionsgemisch zentrifugiert und die uberstehende Losung vom Ruckstand abdekantiert. Das Dekantat, welches die wasserloslichen Peptide, freies Methionin und unverbrauchten Ester enthalt, wird zur Untersuchung direkt papierchromatographiert. Der Ruckstand wird auf der Zentrifuge dreimal gut mit Wasscr gewasclien (Waschwasser verwerfen) und anschliessend im Vakuum iiber Schwefclsaure bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeute : 88 mg wasserunlosliches Peptidgernisch. Mit amorphem Chymotrppsin und dem Praparat von Lehn & Fink erhalt man bhnliche Resultate.

8,05 8,00 7,98 7,98 T,97 7,98 7,98

c) Beispiel c ines p H - k o n s t a n t e n Vcrsuclies ( p H 8). Vgl. Figur 3.

H a u p t v e r s u c h :

Man bringt die Losung von 325 mg nL-Methionin-isopropylester in 10 em3 Wasser durch vorsichtige Zugabe von 1-n. Salzsaure (0,351 em3) auf pH 8,05 (Glaselektrode, mag- netiseher Ruhrer, lSo) und versetzt anschliessend mit 10 mg danischem Ferment., gelost in 0,25 om3 Wasser. Das pH andert sich zunachst nicht, beginnt d a m aber uriter dcm Einfluss der alsbald einsetzcnden Fermentreaktion langsam abzusinken. Man wartet, bis es unter 8 gefallen ist und stcllt nun durch Zugabe von Lauge wieder auf den Anfangswcrt ein. Diese Korrektur wird jedesmal bis zum Abklingen der Reaktion wicderholt. Lokale Erhohungen der Alkalikonzentration sind hiebei durch kraftiges Ruhren zu vernieiden. Nach Vcrsuchsabbruch wird von Spuren unloslicher Produkte abfiltriert und dirckt chro- matographicrt (Figur 3, p H 8). Die nachstehertde Tabelle 10 orientiert an Hand des Laugeverbrauches uber den zeitlichen Verlauf der Umsetzung.

-

8,05 8,05 8,05 8,06 8,05 8,05

Tabelle 10. Laugeverbrauch bei pH 8l)

_.-

Zeit Stunden

0 1 2 2,5 4 6,2 7,3 9,4

1,25-n. XaOH om3

-~

0,14 0,29 0,44 0,64 0,81 0,95 -

PH vor Zusatz I nach Zusatz

Die zeitliche pH-dnderung hangt bei gegebener Reaktionsgeschwindigkeit vom pH der Losung ab (variable Eigenpufferung). Auch der beobachtete Totalverbrauch an Lauge ist pH-abhangig. Die in der Tabelle angegebencn Werteenthalten keinc Korrektur fur die gleichzeitige spontane Verseifung (vgl. Kon- trollversuch). Zur kinetischen Auswertung sind die Datcn ungeeignet, da ihnen eine Vielzahl von Einzel- vorgangen und Reaktionsprodukten zugrunde liegt. Wir verzichten aus diesem Grunde anf eine detail- lierte Wiedergabe der ubrigen pH-Versuche.

l) Eichung gegen 0,025-m. Phosphat (6,86) und 0,01-m. Borat (9,17).


Kont ro l lversuchc:

Blindversuch ohne Ferment: LLsst man die auf pH 8,05 eingestellte Losung von 325 mg Ester unter den Bedingungen des Hauptversuches 10 Stunden stehen, so sinkt das pH auf 7,97 und die Wiederherstellung des urspriinglichen Wertes erfordert eine Zu- gabe von 0,15 em3 0.25-11. NaOH. Die Analyse crgibt erwartungsgemass das Vorliegen von viel unverandertem Ester und wenig freiem Methionin; Peptide fehlen. Figur 3 zeigt die Chromatogramme entsprechender Versuche bei den pH-Wcrten 5, 7 und 9.

Prufung auf Salzeffekte: 325 mg Ester werden in 10 em3 Wasser gelost und mit 10 mg danischem Ferment in 0,25 em3 Wasser versetzt. Man lasst 10 Stunden bei 220 stehen, filtriert hierauf Spuren ausgeflockter Stoffe ab, chromatographiert eine kleine Probe, setzt zur restlichen Losung 0,35 em3 1-n. HCl und 0,95 em3 0,25-n. NaOH (entsprechend HCI- und NaOH-Zusatz im Hauptversuch) und chromatographiert wieder. Ein Verglcich der Chromatogramme lasst in bezug auf die Lage, Grosse und Intensitat der Peptidfleclren keinen Salzeffekt erkennen. Die im vorliegenden Zusamnienhang weniger interessantcn Methioninflecken bleiben bei pH 8 ebenfalls unverandert. Analoge Experi- mente bei pH 5, 6, 7, 9 und 10 fiihren mit einer Einschrankung zum selben Resultat: die Methioninflecken erfahren im pH-Bereich 5-7 eine geringe Vergrosserung.

d) E i n w i r k u n g v o n kr i s ta l l i s ic r tem Chynio t ryps in (Armour) a u f D - u n d L -

Met hionin - i sopropyles te r .

Als Ausgangsstoffe dienen hier die Hydrochloride der beiden Antipoden (vgl. unten). Ihre wasserigen, 0,085-m. Losungen werden, wie im vorigen Abschnitt beschrieben, mit 0,5-n. Natronlauge auf pH 9 gebracht (Konzentrations- und pH-Optimum fur Bildung wasserloslicher Peptide, vgl. Tabelle 4 und Figur 3). Um das pH nach der Fermentzugabe konstant zu halten, muss beim D-Ester praktisch kein, beim L-Ester dagegen laufend Alkali zugegeben werden. Nach 8 Stunden werden beide Losungen papierchromatographiert.

Es zeigt sich, dass der L-Ester praktisch quantitativ umgesetzt wird und in die bekannten Komponenten Methionin, Dipeptid und Tripeptid ubergeht. Ferner kann zwischen dem Tripeptid- und dem nur noch ganz schwach sichtbaren Ester-Fleck deutlich eine weitere Substanz festgestellt werden, die wir noch nicht identifiziert haben. Mog- licherweise handelt es sich um Methionintetrapeptid. Dieser ,,Tetrapeptidflecken" ist bei Ansatzen, die von racemischem Ester ausgehen, nicht sichtbar, da der zuriickbleibende D-Ester jene Zone auf detn Chromatogramm iiberlagert. - Der D-Ester scheint laut Chromatogramm dem Ferment gegenuber praktisch bestsindig zu sein : Fermentansatz und fermentfreier Kontrollversuch geben identische Bilder (viel Ester, etwas spontan gebildetes Methionin).

e) F e r m e n t a t i v e r A b b a u d e r wasserunlos l ichcn P e p t i d f r a k t i o n .

J e 75 mg nach b) erhaltenes, mit kaltem Wasser gut ausgewaschenes, noch feuchtes Peptidgemisch werden in wenig Wasser suspendiert, die Suspension mit 10 mg danischem Ferment und etwas Pufferlosung (vgl. unten) versetzt und schliesslich mit Wasser auf ein Volumen von 10 em3 gebracht. Man uberschichtet mit einigen Tropfen Toluol und lasst die Gemische (pH 7, 8, 9, 10) neben entsprechenden fermentfreien Kontrollversuchen bei Zimmertemperatur stehen. Da bei diesem Abbau sehr geringe Pufferkonzentrationen zur pH-Fixierung ausrcichcn (Prufung mit Glaselektrode), lronnen Haupt- und Kontroll- versuche ohne Schwierigkeiten papierchromatographisch verglichen werden (Beladung je 4 x 0,Ol cm3 Losung). A19 Puffer dienen:

bei p H 10: 1 9: 1,5 em3 0,05-m. Borat 8: 1 7: 1

em3 0,l-m. Soda-Hydrogencarbonat

ema Veronal (0,716 em3 0,l-m. Veronal-Na+0,284 em3 0,l-n. HCI) em3 Veronal (0,536 em3 0,l-m. Veronal-Na+0,464 em3 0,l-n. HC1)


Nach eintagiger Inkubation ist - optimal bei pH 9, weniger bei 10 und 8, kaum bci 7 - vorwiegend Dipeptid neben wenig Tripeptid und Methionin nachweisbar. Nach weiteren drei Tagen qerstiirkt sich dieses Bild, indem die Chromatogramme nun insbesondere einen intensiven Dipeptidflecken aufweisen (Optimum bei pH 9). Tnteressanterweise sind die Peptide, nicht aber das Methionin, auch in den Chromatogrammen der Kontroll- versuche schwach sichtbar. Das Maximum liegt ebenfalls bei pH 9. Wahrscheinlich handelt es sich hier um einen geringen Abbau durch adsorbierte Fermentspuren. Bemerkenswert ist bei diesen Kontrollversuchen ferner eine Substanz, die bei pH 9 und 10 auftritt, einen ,,Tetrapeptidflecken" ljefert und in den Lnsungcn der Hauptversuche nicht vorkommt. Eine Verbindung mit ahnlichem Verhalten ist bisher einzig im Falle der Chymotrypsin- reaktion mit L-Methionin-isopropylester festgestellt worden (vgl. obigen Abschnitt d)).

Eine mengenmassige Abnahnie dor suspendierten Substanz ist nach vier Tagen trotz des Auftretens wasserloslicher Peptide bei blosser Betrachtung nicht zii erkennen.

3. Beispiele z u r H e r s t e l l u n g d e r Aminosaurees te r .

a) DL-Methionin-methylester n a c h d e r T h i o n y l c h l o r i d - Methode. 14,9 g (0,l Mol) DL-Methionin werden in 30 em3 absolutem Methanol suspendiert.

Man kiihlt mit Eis-Kochsalz und versetzt innert 20 Minuten unt.er standigem Ruhren mit 11,9 g (0,l Mol) destilliertem technischen Thionylchlorid. Das Reaktionsgemisch wird dann gut verschlossen zwei Tage bei 2-5" aufbewahrt. Man verdampft hierauf am Vakuum zur Trockene, versetzt unter Riihren mit 20 g Eis, 100 em3 Ather und 25-proz. wasserigem Ammoniak bis zur Rotung von Phenolphtalein, filtriert eventuel!. und trennt im Scheidetrichter. Die wasserige Losung wird noch 2-3 ma1 mit je 50 em3 Ather extra- hiert und verworfen. Man vereinigt die Atherlosungen, trocknet mit Natriumsulfat, entfernt den Ather auf dcm Wasserbad (Kolonne) und destilliert in1 Vakuum. Es resulticren 13-14 g DL-Methionin-methylester (82% dcr Theorie), Sdp. 12P126"/14 mm.

b) DL-Methionin-isopropylester. Die Darstellung erfolgt mit Isopropanol und Chlorwasserstoff nach der friiher an-

gegebenen Vorschriftl).

c) DL-Methionin-oleylester d u r c h A411roholyse d e s Methylesters . 17 em3 Oleylalkohol (Sdp. 140°/0,02 mm) und 1 em3 einer 5-proz. Losung von Na-

trium in absolutem Methanol werden im Vakuum bis zur Entfernung des Methanols unter Durchleiten von Stickstoff auf 100" erwarmt. Man kiihlt ab, setzt 5 cm3 DL-Methionin- methylester zu, evakuiert von neuem (14 mm) und halt unter weiterem Durchleiten von N, wahrend 2 Stunden auf 65". Zur Aufarbeitung wird in Ather und Wasser aufgenommen, im Scheidetrichter getrennt, die Atherlosung zweimal mit Wasser gewaschen und getrocknet, der &her abdestilliert und der Riickstand im Hochvakuum fraktioniert. Man erhalt unter geringer Zersetzung ca. l o g Oleylester (80% der Theorie) vom Sdp. 179-181°/ 0,Ol mm (Kragenkolben). Das Destillat ist immer mit etwas Methionin-diketopiperazin verunreinigt. Letzteres kann durch Losen des Esters in Petrolather und Filtration dcr Losung nahezu vollstandig entfernt werden. Beim Abdestillieren des Pekolathers bleibt der Oleylester praktisch rein zuruck.

C,,H,,O,KS Ber. C 69,l H 11,35 N 3,51% (399,3) Gef. ,, 69,06 ,, 11,70 ,, 3,43%

d) H y d r o c h l o r i d e d c s L - u n d D-Vethionin-isopSopylesters. Man iibergiesst 1,l g D-Methioninl) mit 10 em3 absolutem Isopropanol. Das Gemisch

wird mit trockenem HC1-Gas gesat.tigt, 25 Minuten am Ruckfliiss gelrocht und hierauf bei 50" Badtemperatur im Vakuum zur Trockene verdampft,. Man wiederholt diesc Operation nach Zusatz von 10 em3 frischem Isopropanol. Der resultierende Kristall-

l) Helv. 32, 333 (1949).

Volumen XXXIII, Fasciculus 111 (1950) - No. 83-84. 591

kuchcn wird in Essigester gelost und das Hydrochlorid durch Zusatz Ton Petrolather zur Kristallisation gebracht. Man erhalt 1,45 g D-Methionin-isopropylester-hydrochlorid (90% der Theorie). Die Substanz schmilzt bei 112--116O, rekristallisiert teilweise und schmilzt endgultig bei 122O (korr., Kofler-Block). Zur Drehung und Analyse wird 12 Stunden uber P,O, am Hochvakuum bei Zimmertemperatur getrocknet.

C8H,,0,NC1S (227,7) Ber. N 6,17% Gef. N 5,96% [a]',' = - 13,0° 2O (c = 1 in Methanol)

Aus L-Methioninl) entsteht in gleicher Weise das L-Methionin-isopropylester- hydrochlorid (N gef. 5,92%). Es schmilzt und dreht (mit umgekchrtem Vorzeichen) wie die D-Form.

Zu s amm enf a s sung. Die Ester des Methionins und einiger anderer spezifischer Amino-

sauren reagieren in Gegenwart von Wasser und kiiuflichen Praparaten von kristallisiertem Chymotrypsin unter Bildung von Peptiden.

Durch sorgfaltige papierchromatographische Analyse ist unter den Reaktionsprodukten aus DL- bzw. L-Methionin-isopropylester Methionyl-methionin und Methionyl-methionyl-methionin nachge- wiesen worden. Unter geeigneten Redingungen werden insgesamt etwa 30% der L-Form des eingesetzten Esters in diese Produkte iiberge- fuhrt; der Rest fallt hauptsiichlich als L-Methionin an.

Die Bildungsweise der Peptide wird diskutiert und ihre mogliche Beziehung zum Mechanismus der biologischen Peptidsynthese erortert.

Im Zusammenhang mit der Ausarbeitung der analytischen Me- thodik ist das papierchromatogra,phische Verhalten einiger Methionin- derivate im Collidin/Wasser- System untersucht worden. Eine Flecken- karte orientiert iiber die erhaltenen Daten.

Organisch-chemische Anstalt der Universitat Basel und Eiweisslaboratorium der Medizinischen

Universitatsklinik, Basel.

84. Beitrag zur Kenntnis einiger Derivate der p- Aminosalicylsaure

von M. Viscontini und J. Pudles. (17. 111. 50.)

Im Laufe von Arbeiten iiber die p-Aminosalicylsiiure haben wir einige neue Produkte erhalten, die nachstehend beschrieben sind. Man erhalt dss Carbathoxyderivat I nach einer Beobachtung, die in unserem Laboratorium gemacht wurde, sehr leicht, indem man Chlor-

I) Helv. 32, 333 (1949).

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Eine neue enzymatische Peptidsynthese. 1. Mitteilung