Albrecht v. Graefes Arch. klin. exp. Ophthal. 184, 218--221 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Eine Schnellmethode fiir die histologische Bearbeitung yon Augen

H. Rosenberger

Augenklinik der Freien Universit~t Berlin im Klinikum Westend (Direktor: Prof. Dr. reed. J. Wollensak)

Eingegangen am 8. Januar 1972

A Quick Method for the His to logica l P r e p a r a t i o n of Eyes

Summary. A simple and quick method for embedding and section cutting of eye globes is reported. I t consits of a combination of the acetone-paraffin embedding method of Matuschka and the Tesafilm method of Rydberg and Ziesmer for micro- tomy difficult material.

Zusammen/assung. Es wird fiber eine schnell und einfach auszuffihrende Methode zum Einbetten und Schneiden yon Augcn berichtet. Sie beruht auf einer Kom- bination der Aceton-Paraffineinbettung nach Matuschka mit der Tesafilm-Methode nach Rydberg und Ziesmer.

Die histologische E i n b e t t u n g von Augen erfolgte langere Zei t in Celloidin. Hierff ir i s t jedoch ein erhebl icher Ze i taufwand n6tig, so dab das kombin ie r t e Cel lo id in-Paraff in-Verfahren nach J a n k o v s k y d a n k b a r begriif~t wurde. D a es jedoch nur in der H a n d des Gefibten gute Er- gebnisse liefert , wurde versueht , eine einfachere und sicher gel ingende Methode zu entwickeln.

Methodik

Fixieren. Bouinsche Flfissigkeit 2--3 Tage (200 ml pro Bulbus). Entwiissern und Einbetten. Auswaschen in Alkohol 70%ig, 12 Std (2mal wech-

seln), Kappen des Bulbus und Entfernen der Linse, Alkohol 80 % ig, 4 Std, Alkohol 90%ig, 4 Std, Alkohol 96 % ig, fiber Nacht, Alkohol abs. I, 4 Std, Alkohol abs. II , 4 Std, Alkohol abs. I I I , fiber Nacht, Accten I, 4 Std, Aceton II, 4 Std, Aceton I I I , fiber Nacht, SpeziM-Paraffin I, 3 Std (Brutschranktemperatur -4-70~ Spezial-Paraffin II , 3 Std (Brutschranktemperatur q-70~ AusgieBcn des Blockes in rechteckige Form, Aufkleben auf Holzkl6tzchen.

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Die ffir die Entw~sserung angegebenen Zeiten stellen Mindestzeiten dar. Ffir die einzelnen Alkohol- und Aceton-Stufen werden mindestens 300 ml Flfissigkeit verwendet. Der Alkohol abs. und das Aceton sollen analysenrein sein. Als Ein- bettungsmedium hat sich das mit Kunststoffen versetzte Paraffin , , t t istoplast" (Fa. Serva, Heidelberg) bew~hrt. Vor seiner Verwendung bel~13t man dieses l~ngere Zeit bei ~-70~ im Brutschrank, da sich die Schneidbarkeit des Paraffins dadurch verbessert. Beim Ubertragen des Gewebes aus dem Aceton ins hefl3e Paraffin kommt es durch Verdampfen des Acetons zum Aufsch~umen. Gelegentlich bleibt eine kleine Gasblase im Bulbus h~ngen, weshalb man zweckm~Bigerweise den Bulbus mit einer angew~rmten Pinzette gelegentlich im Paraffin bewegt.

Zum GieBen des Blockes gelangen groBe Einbettungsr~hmchen zur Verwendung, so dab ein WOrfel yon ca. 4 cm Kantenl~nge entsteht. Vor dem Schneiden bewahrt man den Block mehrere Stunden im Kfihlschrank auf. Wir verwenden das Schlitten- mikrotom 1207 der Fa. Leitz mit quergestelltem, doppelseitig eingespanntem D-Messer und einem Anstellwinkel yon ca. 2 ~ Die Vorderkante des Blocks ist parallel zum Messer ausgerichtet.

Schneiden. Nachdem in iiblieher Weise eine glatte Schnittfl~che in der ge- wiinschten Ebene des Blockes hergestellt ist, klebt man mit kr~ftigem Druck ein Stfick Tesafilm 104 (Fa. Beiersdorf, Hamburg) yon 38 mm Breite blasenfrei auf den Paraffinblock und schneider mit einem schaffen Skalpell die fiberstehenden Teile des Tesafilms sorgf~ltig direkt am Rande des Paraffinblocks ab. Vorteilhaft ist die Verwendung eines entsprechenden Abrollers fiir den Tesafilm (Industrie- abroller fiir Tesafilm Nr. 6080, Fa. Beiersdoff), da hierbei der Tesafilm vor seiner Verwendung zwangsl~ufig gestreckt wird, und sich so der Schnitt sparer weniger stark wSlbt. Das Messer wird sehr langsam, jedoch ohne Unterbrechung durch den Block gezogen. Schnitte yon 6 ~ lassen sich auf diese Weise mfihelos erzielen. Die folgenden zwei Schnitte werden ohne Tesafilm hergestellt und verwoffen.

Voraussetzung ffir das Gelingen ist ein tadellos geschliffencs, yon Paraffinresten vSllig freies D-Messer. AuBerdem bleibt zu beachten, dal3 der Tesafilm keinesfalls i~ber die Seiten des Paraffin-Blockes hinaussteht.

Au/lcleben. Ein Streeken der Schnitte ist nach dieser von Rydberg und Ziesmer angegebenen Methode fiberflfissig. Zum Aufkleben gib~ man etwas Aqua dest. au~ einen dfinn mit EiweiB-Glycerin beschichteten Objekttr~ger und legt den Schnitt mit der Paraffinschicht nach unten luftblasenfrei auf. Dann deckt man einige Lagen Filtrierpapier darfiber und preBt mit einer kleinen Gummirolle den Schnitt kr~ftig an, wobei das austretende Wasser aufgesaugt wird. SchlieBlich wird ein Metallgewich~ yon ca. 400 g aufgelegt, welches den gesamten Schnitt bedeekt und trocknet 48 Std bei ~-42~ im Brutschrank. Die Auflagefl~che des Gewichtes polstert man zweckm~igerweise mit einer dfinnen Platte aus Weich-PVC.

Anstelle yon EiweiB-Glycerin l ~ t sich vorteilhaft auch ChromalaumGelantine nach Pappas verwenden. Die Methode ergibt ein sehr sicheres Haften des Schnittes am Objekttr~ger, auch wenn verh~Itnism~Sig aggressive ReagenslSsungen zur .~wendung kommen. Leider ist das Klebemittel nach der Herstellung nur 48 Std brauchbar.

Weiterverarbeitung. Die aufgeklebten Schnitte werden in Aceton gebracht. Innerhalb yon wenigen Minuten rollt sieh die Tr~gerfolie des Tesafilms ab und sinkt zu Boden. AnschlieBend iibertr~gt man fiir insgesamt 6 S~d oder l~nger in zwei Portionen des technischen LSsungsmittels Teehnicoll 899 (Fa. Beiersdorf), worin die Objekttr~ger gelegentlich bewegt werden sollen, ttierauf folgen Xylol und die Alkoholreihe in der fiblichen Weise. Um ein Quellen des Bindegewebes mit Faltenbildung zu vermeiden, sollen w~Brige LSsungen nach MSglichkeit nut kurz- zeitig einwirken.

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Abb. 1. Serienschnitte eines malignen Melanoms der Aderhaut. Die einzelnen Schnitte wurden numeriert und in ein Briefmarkenalbum eingeordnet. Patient N.N.

Ergebnisse Die so erhaltenen d~innen Schnitte kleben fest am Objekttr/~ger. Die

Netzhaut ist nicht, wie bei den meisten bisherigen Methoden, trichter- fSrmig geschrumpft, sondern liegt meistens dem Pigmentepithel und der Aderhaut-Sklera vSllig an. Die erhaltenen Schnitte kSnnen entweder aufgeklebt werden oder aber in iibersichtlieher Weise wie Briefmarken in ein entspreehendes Album gesteekt werden, was besonders ffir Serien- schnitte vorteilhaft erscheint. Die Numerierung erfolgt miihelos mittels eines Filzschreibers, z.B. ,,Feinmarker" (Fa. Faber-Castell), der wasser- feste Besehriftung erlaubt (Abb. 1).

Diskussion Kelmzeichnend fiir das hier mitgeteilte Verfahren ist die Einbettung

von Bulbi in Paraffin, jedoch wird als In termedium zwischen den Alkoholstufen und dem fliissigen Paraffin Aceton verwendet. Dieses mischt sich im Gegensatz zu den tiblicherweise verwendeten LSsungs- mitteln (Benzol, Terpineol etc.) nicht mit Paraffin, vielmehr verdampft es im heiSen Paraffin. Dieses Verfahren wurde yon Matuschka mit bestem Erfolg bei der Einbettung ganzer Uteri verwendet. Wit konnten feststellen, da$ bei Verwendung dieses Intermediums auch die Schneid- barkeit best immter Augenstrukturen (Hornhaut, Sklera) gtinstig be- einfluSt wird. Leider lassen sich mit der fibhchen Paraffin-Methode an Augenmaterial keine faltenlosen Schnitte erzielen, da sieh die Schnitte im Wasserbad nicht gentigend strecken. Dies ist durch die Vielfalt der Strukturen mit sehr untersehiedhchen physikalischen Eigenschaften be- dingt, die in einem histologischen Schnitt dutch das Auge eng neben- einander liegen.

Schnellmethode ffir die histologische Bearbeitung von Augen 221

t t i e r hflft die Tesaf i lm-Methode yon R y d b e r g und Ziesmer weiter, bei welcher ein St reeken der Schni t t e entf~llt . Die so e rha l tenen M i k r o t o m - S c h n i t t e lassen sieh ohne Schwier igkei ten auf Ob jek t t r~ge r aufkleben. Diese F o r d e r u n g ste]lt sieh im Hinb l i ek auf die ra t ionel le Hers te l lung yon Ser ienschni t ten und deren Vera rbe i tung in modernen F ~ r b e a u t o m a t e n . Dera r t ig hergeste l l te Pr/~parate lassen sich auch vor- t e i lha f t ffir die H i s toau to rad iog raph i e verwenden, da m a n di innere Schni t te als mi t der Cel loidin-Methode erzielt . Dar f iberh inaus is t die Verki i rzung der no twendigen Zeit ffir die E i n b e t t u n g wiehtig, wenn r ad ioak t i ve I so tope mi t kurze r Ha lbwer t sze i t (HWZ) verwende t wer- den, z .B. 8~p mi t einer H W Z yon 14,3 Tagen.

Literatur Jankovsky, F.: Eine Celloidin-Paraffineinbettung ffir Augen. Mikroskopie 14,

157--161 (1959/60). Jung Mikrotom ~Nachrichten: Die Tesafilm-Methode I, 12 (1958). Jung Mikrotom Nachrichten: Die Aceton-Paraffin-Methode 7, 121 (1967). ~atuschka, M. v. : Histologische Technik zur Aufarbeitung ganzer Uteri mit an-

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(1955). Steedman, ILl. F.: Section cutting in microscopy. Springfeld, Ill., USA: Charles

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Dr. med. Hans Rosenberger D-8500 Niirnbcrg, Gensfelder Weg 17 Deutschland