J. Basic Microbiol. 25 (1985) 6, 365-371

(Friedrich-Schiller-Universitjit Jena, Sektion Biologie, Wissenschaftsbereich Allgemeine Mikror biologie und l)Wissenschaftsbereich Mikrobielle Biochemie)

EinfluI3 von Acetat auf die Bildung des Phytoeffektors Tentoxin durch Alternaria alternata ( FR.) KEISSLER

I. HANIL, B. LIEBERMANN~), B. BRUCKNER und B. TROGER

(Received September 8, 1984; revision received November 9, 1984)

The effect of the cosubstrate acetate on the formation of the phytotoxic substance tcntoxin by Alternaria alternata (FR.) KEISSLER was investigated. Acetate was taken up and metabolized during growth. The added acetate stimulated considerably the biosynthesis of tentoxin depending on its concentration and time of introduction. There was an increased incorporation of (U-14C)- glucose into the toxin molecule in the presence of acetate in the medium. The results indicate an induction of the biosynthesis of tentoxin by the precursor acetate, probably mediated through the accumulation of the glycolytic intermediates pyruvate and phosphoenolpyruvate.

Der regulierende Einflu B von Intermediaten des Tricarbonsaure-Zyklus und der Glycolyse auf die Synthese von Sekundiirmetaboliten wurde fur Pilze und Strepto- myceten bereits beschrieben (CHATTBRJEE et al. 1983, PA~OUTOV~ and l t ~ ~ d b ~ ~ 198 1, GLUND et al. 1979). Uber die Ursachen der stimulierenden bzw. hemmenden Wirkung dieser organischen Sauren ist dagegen wenig bekannt. Von einigen Autoren wird die Forderung der Sekundarstoffbildung mit den pH-stabilisierenden Eigerisahaften von Citrat bzw. anderen organischen Sauren erklart (MORTON and MCMILLAN 1954, SCHRO- DER 1978, P A ~ O U T O V ~ and REHLEBK 1981).

Weiterhin scheint Citrat einen regulatorischen EinfluB auf die Aktivitaten einiger ~ahliisselenzyme des Kohlenhydratstoffwechsels, der Glucose-6-Phosphat-Dehydro- genase und der Citrat-Synthase, bei eirier Roihe von Mikroorganismen auszuuben (PA~OUTOV~ and REH~EEK 1981). Dabei ist die Umschaltung vom Primiir- zum Se- kundarmetabolismus offenbar mit eirier Drosselung der Aktivitiit des Tricarbon- skure-Zyklus verbunderi (GLUND et aE. 1970, SHANTHA and MURTHY 1981, GUPTA et a,?. 1977). Da Acetyl-CoA als Precursor fiir viele Sekundarstoffsynthesen dient, kijtinte hier ein Zusammenhang zur riotwendigen Verminderung der Aktivitat des Tricarbonsaure-Zyklus bestehen. Bedingungen, die zu einer Aktivierung des Tri- carbonsiiure-Zyklus fuhren, verringern gleichzeitig den fur Produktsynthesen not- weridigen Pool an Acetyl-CoA (SHANTHA and MURTIIY 1981).

Ziel dieser Arbeit war es, den EinfluS von Intermediaten des Tricarbonsaure-Zyklus und der Glycolyse, speziell von Acetat, auf Wachstum und Produktbildung von Alter- nut-iu ulternutu (FR.) KEISSLEX vergleichend zu untersuchen.

Material und Methoden

Die Untersuchungen wurden mit dem Pilzstamm Alternaria dternata (FR.) KEISSLER i 1248128 (l’ilzkulturensammlung Weimar) durchgefuhrt.

Das Niihrmedium hatte folgende Zusammensetzung (g/l) : Glucose - 40, NaNO, - (5, KH,PO, - 0,2, CaCl, - 0,8, KCl - 0,05, M SO,. 7H,O - 0,15, FeSO, 7H,O - 0,05, ZnSO, 7H,O - 0,02, pH 5,5. Die Intermediate des !fricarbons%ure-Zyklus und der Glycolyse wurden zu Beginn der Kulturfiihrung dem Nihrmedium C-Siquimolar (1,08 g C/1) zugegeben. Die Kultivierung erfolgte emers bei 28 “C.

366 I. HANEL et al.

Die Troc,kenmasse-, Glucose-, Phosphat- und Tentoxinbestimmung in der Nahrlosung wurde wie bei BRUCKNER et a.Z. (1983) beschricben, durchgefiihrt. Die Aktivitatsbestimmung alkalischer Phosphatascn im Kulturfiltrat (in pmol/min - mg) erfolgte nilch BERNT (1970) mit Tris-HCl- Puffer, 0,l M, pH 8,O. Acetat. wurde in der Nahrlosung emymatisch mit Acctatkinase und Hydro- xylamin nach einer Methode von HOLZ und BERGMEYER (1970) bestimmt.

~-Clucose-U-14C und Natriuma~etat-l,2-’~C wurden vom Institut fur Forschung, Herstellung und Anwendung der Radioisotope Prag bzw. vom Zentralinstitnt fiir Kernforschung, MA Radio- aktive Praparate, Dresden (ROTOF) bezogen. Je Variant.e wurden 3 Kolben verwendet und pro Kolbcn 2,35. lo5 Bq Glucose bzw. U,68 - lo4 Bq Acetat eingesetzt. Die Applikation erfolgte jc- weils zum 8. Ku1turt.a.g mit sterilfiltrierter Losung. Die Messung der Radioaktivitiit wurde am Liquid Scintillation Countcr LKB-Wallac 81 000 durchgefuhrt. Tcntoxin wurde nach LIEBER- XANN und OERTEL (1983) jcweils am 10. Kulturtag isoliert. Fur die Bestimmung der spezifischcn Radioaktivitiit des Tentoxins wurde der C,-peak nach Sephadcx C-15-Trennung ohne Randzonen verwendet. Fiir die radiochemisehe Reinheit war einc wcitere Reinigung nicht notig. Die quanti- tative Erfassung des Tcntoxins erfolgte mit Hilfe dcs molarcn Extinktionskoeffizienten bei 286 nni.

Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt, da13 sowohl dic Bilduiig des SekundBrlnetaboliteii Teritoxiii als aueli die gehildete Myceltrockenmasse durch Zugahe von Intermediateri des Tricarbon- saure-Zyklus bew. von Yyruvat oder Acetat zum Nahrmedium unterschiedlich beein- flu& wurden. Fur einen Vergleich des gebildeten Tentoxins in Abhiingigkeit von der eugegebenen eweiten C- urid Eriergiequelle erscheint es daher giinstig, die Tentoxin- konzezitration in Relation zur jeweils gebildeten Myccltrockenmasse (Produktivi- t a t I>) anzugeheri. Die Kultivierung von Altcrnaria alternatci niit Citrat, Malat, Oxal- acetat, Succinat bzw. Bumarat als zweiter C-Quelle fuhrte riach 13 Kulturtageri zu einer mehr oder weniger starken Erhbhung des Biomasse-Ertragskoeffizienten ( Y x p ) uiid war bcsonders bei Citrat mit eineni Abfall der Produktivitat des Mycels zur Tentoxinbildung verbunden, wahrend bei Oxalacetat, Succiiiat und Fuinarat eine entsprechende Erhiihung zu verzeichneii war. or-Ketoglutarat, Acctat urid I’yruvat hatten keineri KinfluB aiif den Biomasse-I1:rtragskoeffizienten, hewirkten aber einc 2--3fachc Steigerung der Produktivitat.

l m weitereri uiitersuchteri wir die W5rkuiig vori Acetat auf die niosynthese des Se- liundiirmetaboliten. Wachstum, YroduktivitLt des Mycels uiid Substratverwertung sind in den Abbildiiiigeri 1 urid 2 dargestellt. Wac.hstnrnsverlauf, Glucose- und Phos- phatverbrauch wurden durch die Zugabe von Acetat kaum beeinflu 13t. Simultan zur Glucoseverwertung crfolgte die des Acetats. Am 13. Kulturtag wareri sowohl die Clu-

Tabelle 1 EinfluD organischw Sauren dcs Trictirbonsiiure-Zyklus sowiu von Pyruvat und Acetat auf die Biomassebildung (Tm), die Tentoxinproduktion, den Biomasscertrag ( Yxls; S bezogen anf die insgesamt eingcsetzte C-Menge) und die I’roduktivitiit des Mycels (P) nach 13 Kulturtagen

ziveitc C- und Tm (g/l) Tcntoxin Yxis ( m g :;;in 103) Energiequelle (mg/l)

- Pumarat Oxalacetat Succinat a-Ket.oglutarat Acetat Pyruvat Malat C itrat

9,82 12,45 12,459 11,40 10,64 10149 10,04 11,88 12,25

75 147 150 140 158 172 202

79 18

0,61 0,73 0,74 0,67 0,62 0,61 0,59 0,70 0,72

73.54 11,83 11,Yd 12,538 14.86 lei39 20.12 6,65 1,47

Tentoxinproduktion durch Alternuria alternata 367

0 5 10 Kultivierungszeit ( d )

Abb. 1 Trockenmasse und Produktbilduiig mit und ohne Natriumacetat-Zugabe (3,7 g/l). - Kontrolle, - - - Zugabe von Acet,at, 0 ProduktivitiLt, x Myceltrockenmasse

Tubelle 2 Tontoxinbildung und Acetatverbrauch in Abhingigkeit vom Zeitpunkt der Zugsbe von Natriurn- acetat zum Kulturmedium

t Kontrolle Zugabe voii Acetilt Zugabe von Acetilt (Tag) ohne Acctat zum 0. Kulturtag zum 3. Kulturtag

~~ -~

Tentoxin Tentoxin En-Acctat Tentoxin Na- Acetat (mg/l) (me/l) W1) (me/[) (g/l)

- - - 3,7

0 3 5 - - 390 - 3,3 8 595 49,O 1 3 6,5 191

1 3 69,O 147,5 0 6 7 4 0

377 - 3,3

- - -

10 35,O 102,o 0,5 30,5 0,4

coRe i n beiden Varianten als auch das Acetat verbraucht. 1)as Auftreten von l’hospha- t asen in der Kulturlijsung zeigte, da13 das dem Mycel zugiirigliche extrazellulare Phosphat limitiert war (MULLER et al. 1983).

Tentoxin wurde in beiden Varianten erstmals am 6. Kulturtag im Kulturfiltrat mchgewiesen. Duruh Acetat,zugabe wurde iiach 13tagiger Kultivierungszeit die doy- pelte Menge an Tentoxin (150 mg/l) im Vergleich zur Kontrolle gebildet. Diese Ten- denz zeigte sich auch bei der Tentoxinbestimmung im Mycel. In der Kontrollvariante wurden 0,27 mg Tentoxin/g Trockenmasse riachgewiesen, wahrend bei Zugabe von Acetat diese Konzentration auf 0,35 mg Tentoxinlg Trockenmasse anstieg.

Die Stimulierung der Tentoxinproduktion ist konzentrationsabhiingig, wobei eine Kurve mit Sattiguiigsoharakter entsteht (Abb. 3). Tabelle 2 zeigt, da5 eine Zugabe

I. HABEL et al. 368

3c - . m - x - z 2c 0

10

$bb. 2

0 5 10 Kulfrvierungszeit [ d )

EinfluB von Acetat auf dic Aufnuhmo von Glucose und Pliospliat sowic das Auftreten von extra- zellularen Phosphatasen. Abnahme yon Acetat im Medium. ___ Kontrolle, - - -Zugabc von Acetat, A Glucose, A Acetat, Phosphut, rn extrazellulLre, alkalische Phosphataseaktivitat

- z I

5 200

Abb. 3 EinfluB der exogenen Acctatkonzentration auf die Produktivitat (in yo) des Mycels von Alternuria I alternatu nach 13 Kulturtagen

7

1 - 1

-u

2 150

I I I I I I

0 1 3 5 Natriurnacetat ( g / l )

des Acetats nur xu Heginn der Fermentation die erwiihnte Wirkung auslijst, wahrerld eine Zugahe am 3. Kulturtag bereits vijllig wirkurigslos ist, obwohl das Acetat in ver- gleiehbarer Weise aus dem Nbhrrnedium verbraucht wird.

Weiterhiri wurde in heiderl Varianten der in vivo-Einbau von uniform radioaktiv markierter Glucose bzw. Acetat vom 8. bis zum 10. Kulturtag untersucht. Durch die analytische Erfassung von Glucose, Acetat und Tentoxin eum Applikations- und Erntezeitpunkt konnten die wirklichen Einbauraten berechnet werden (Tab. 3). Die Einbeziehung der Gesamt-Kohlenstoffquelle ermoglichte den Vergleich der spexifi- schen Einbauraten. Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, daD der absolute Einbau von Acetat

Tentoxinproduktion durch Alternaria alternata 36'3

Tabelle 3 Einbau von U-"C-Glucose und U-**C-Acetat in Tentoxin zwischen dem 8. und 10. Kulturtag

C-Quelle ''C-Precursor absolute Ein- spez. Ein- spez. EBR, appliziert am baurate baurate (EBRc) pro Cesamt- 8. Kulturtag (Yo) (%I C-Quellel) t = O

(g/U

(Yo)

Glc 40,O Glc 0,09 16,3 16,3

Glc 40,O Ac 3,7 Glc 0,21 15,5 17,2

Glc 40,O Ac 3.7 Ac 0,37 2,1 20,9

spez. EBR, - spezifische Einbaurate auf mmol Kohlenstoff berechnet : C-Atome des Precursors ( spez. RA des Precursors - C x m e des Tentoxins

1) Umrechnung der zweiten C-Quelle in Glc- bzw. Ac-Aquivalente (mmol C) ; Berucksichtigung der resultierenden Gesamt-C-Quelle ergibt veranderte spez. RA des Precursors und damit ver- anderte spez. EBRc.

Glc - Glucose, Ac - Natriumacetat, RA - Radioaktivitiit

ins Tentoxin starker ist als der von Glucose, daD aber durch Acetat auch die absolute Einbaurate von Glucose erhoht wird. Die auf ein Millimol Kohlenstoff berechneten und unter Beriicksichtigung der jeweils zweiten Kohlenstoffquelle ermittelten spezi- fischen Einbauraten sind etwa gleich.

spez. RA des gebildeten Tentoxins x 100%) - -_ ______

Diskussion

Nachdem gezeigt werden konnte, daO die exogeiie Yhosphatkonzentration einen ent- scheidenden EinfluB auf die gebildete Tentoxinmenge hat (BRUCKNER et d. 1YS3), erreichten wir durch Zugabe von Acetat znm Niihrmedium eine weitere 8ynthese- Steigerung des Phytoeffektors durch Alternaria alternata. Diese Optimierung der Produktbildung ist deshalb positiv zu bewerten, weil sie durch eine relativ einfache und leicht zugangliche Verbindung erzielt wurde.

Der Einbau von radioaktiv markierter Glucose bzw. Acetat zwischen dem El. und 10. Kulturtag beweist einerseits, daD Acetat besser als Glucose fur die Tentoxin- syrithese verwertet wird. Andererseits ist ersichtlich, da13 durch Acetat die Verwer- turig der Glucose fur die Bildung des Phytoeffektors wesentlich erhoht wird. Dagegen bewirkt Acetat keine Mobilisierung endogener Kohlenstoffquellen, wie aus den kor- rigierten Einbauraten zu sehen ist. Es muD darauf hingewiesen werden, daD eine m6g- liche regulatorische Wirkung von Acetat und der Einbau beider Kohlenstoffquellen in der ldiophase begrifflich nicht vermischt werden diirfen. Die Einbauversuche mit markierten Substraten zeigen unabhilngig vori der Acetatwirkung, daD die Biosyn- these des Yhytoeffektors nur zum Teil direkt aus Glucose und Acetat erfolgt (1/5-1/6). Offensichtlich wird der Hauptteil aus endogenen C-Quellen gebildet.

Aretat bedingt auch keine bessere Freisetzung des Tentoxins ails dem Mycel, wie aus den Phytoeffektorkonzentrationen in der Trockenmasse vergleichbarer Kulturen erkennbar ist.

DaS die Acetatwirkung nur bei Zugabe zu Beginn der Fermentation auftritt, deutet auf eine Induktorwirkung hin. Die Induktion ist ein bekannter Regulationstyp des l'rimiirstoffwechsels und auch als Kontrollmechanismus bei der Sekundarmetabolit- 24 J. Basic Microbiol. $3; (19P5) 6

370 I. HANEL et at.

synthese aiuutreffen. Schwierig ist es mitunter, eiiie echte Induktion von einem Yre- cursoreffekt zu utiterscheiden. Nach MABTIN (1977) wirken Induktoren niir dann auf die Produktbildung, wenn sie in der Wachstumsphase zugegeben werden. Precursoren stimuliereri auch bei Zugabe in der Idiophase.

Bei AZternarin alternatu (PR.) KEISSLER verlaufeti Wachstum uiid Produktbildung uiiter den gcgeheiieri Kulturbedingutigeri in zwei I’hasen. Die erste Phase (0. -6. Kul- turtag) ist durch schnelle Biornassezunahme, ausgeglicherie Utilisatiori von Glucose und Phosphat, sowie durch fehleride Produktbildung gekeruizeichnet. Mit Beginri der zweitcri Phase, in der die Biomassezunahme deutlich larigsamer verlituft, setzt die Bildung vori Tentoxin ein (Abb. 1 und 2). Acetat zu Beginn der Fermentation zuge- geben, koiintc zu einem Anstau von Pyruvat und Yhosphoenolpyruvat fiihren, die beide als Vorstufeii fur Amitiosauren des Peptids Tentoxin dieneii (speziell Alaniii und Yhenylalaniti). Aiif diese Weise wird die Bildung einer oder mehrerer Amitio- sauren in der ersten Phase (Trophophase) verstarkt, die dann als Induktor(en) fur Synthetasen der Toxinhildung in der Idiophase dienen, so daB verstarkt Glucose als auch Acetat selbst fur die Produktbildung verwertet werden (s. radioaktive Einbau- versuche). Diese Hypothese wird durch die Tatsache unterstiitzt, dab Yyruvat eben- falls die Tentoxinausbeute betrLchtlich steigert (Tab. 1 ). Da13 die Acetatwirkung bei Zugabc zum 3. Kulturtag bereits erlischt (Tab. 2), widerspricht scheinbar den Vor- stellungen zur Tnduktorwirkung von MARTIN (1977, s. 0.)) konnte aber durch eine sequentielle Induktion erklart werden. Evcntuell sind die N-Methylaminosauren letztes Glied dieser Kctte. Unklar bleibt auch, warum Acetat in der Idiophase besser fur die Toxinbildiing verwertet wird als Glucose.

Ein anderes Reispiel fur die Induktorwirkung eines Precursors finden wir bei der Biosynthese der Ergotalkaloide durch Clavictps. Dort wird diirch Tryptophan die Ilimet h ylallylt ryp t ophan-Sy n t hase i rid u xier t (ltouu Jms et ul, 1972, KXUPINSK Y et ul. 1076).

%ur Abklasung eiiier Induktorwirkung von Acetat hei Alternark alternata (FR.) KEISSLER miifiten weitere Metabolite, einschliefilich ihrer Strukturanaloga, die auf der Tentoxinbiosynthesesequenz liegen, auf einen entsprechenden Effekt untersucht werden. Bisher kontiten wir eine Stimulierung durch Glycin und I’henylalanin finden.

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Anschrift: Prof. Dr. R. TROGER, Sektion Biologie der Friedrich-Schiller-Universitkit, WB Allge- meine Mikrobiologie, DDR 6900 Jena, Neugasse 24