UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLGICAS
REGULACIN DEL EJE SOMATOTROPO A LARGO PLAZO
TESIS DOCTORAL
NGEL PREZ ROMERO Madrid, 1997 22.063
0=3
un~rnuuumu3674
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
REGULACIN DEL EJE SOMATOTROPO A LARGO PLAZO
Tesis presentada por Angel Perez Romero para optar al grado de
Doctor Universidad Complutense de Madrid 19974
V
0B0 Los Director~s
ngel Prez Romero
Carmen Ariznavarreta
J.A.E Tresguerres
a ms padres ymis hermanosAnay Lusm
En primer lugar, quiero expresar mi ms profundo agradecimiento a
los Dres. Carmen Ariznavarreta yjess A. F. Tresguerres, directores
de esta Tesis Doctoral, por permitirme trabajar con ellos en el
Departamento de Fisiologa de la Facultad de Medicina y tener la
paciencia necesaria para corregirme con el gusto que ambos lo han
hecho. Ambos han sido para mi algo ms que simpesjefesy su carioy
consejos tanto laborales como personales han hecho de miel
investigador que ahora soy. Muchas gracias a Lourdes, Fares, las
Vicentas~y al resto de becariosy profesores del Departamento, por
compartir conmigo el trabajo diario y ayudarme siempre que lo
necesit. Quiero dar las gracias especialmente a la Dra. Blanca
Granados por tener la paciencia necesaria para ensearme como se
trabaja en un laboratorio; mostrndome su especial cario. Tambin a
mi compaera Manan, por compartir conmigo los momentos dulcesy
tambin los amargosy sin la cul difcilmente habra concluido esta
Tesis Doctoral.A
Lucila Kraus, la tcnico de laboratorio ms querida de toda la
Facultad de
Medicina, por darme la oportunidad de conocer a una persona de
tanta calidad humana y profesionat Tambin a sus excelentes
sucesores, Blanca Martnezy Antonio Carmona, con los que tantos
buenos ratos he compartido comentando lajornada futbolstica los
lunes por la maana. Gracias a las Oras. Elena Varay Cruz Garca del
Departamento de Bioqumica de la Facultad de Medicina por llevar a
cabo las determinaciones de somatostatinay por dqarnos utilizar
unay otra vez el sonicador recibindonos siempre con una sonrisa. A
Susana, Manina, la Dra. Isabel Vzquezy el resto del personal del
CIT-INIA por su colaboracin en los experimentos realizados con los
corderos. Tambingracias al Dr. A. Bartkey a toda la gente del
Departa~ento de Fisiologa de la Universidad del Sur de Illinois
(EEUU2 en especial a Emmanuel Dialynas por ser m maestro en el duro
campo de la Biologa Moleculary tambin mi amig. A la Dra. M~ Jess
Delgado del Departamento de Fisiologa Ani#al de la Facultad de CC
Biolgicas, por aceptar la tutora de esta Tesis DoctoraL A mis
amigos y toda la gente que ha estado a mi lado, en especial a Riba,
Maru, Jess, Pascay Merchn porque han sabido escucharme y estar
conmigo en todo momento,y a los que he llegado a aburrir contndoles
mis experimentos con las ratas. A mis padres, mi hermana Anay por
encima de todo mi hermano Luismi, por acompaarme unay otra vez al
laboratorioy por su ayuda con el ordenador sin la que sin dudajams
hubiera acabado este manuscrito. Mi agradecimiento al Ministerio de
Educacin y Cultura, por la boncesin de una Beca Predoctoraly al
Fondo de Investigaciones Sanitarias, entidad tinanciadora del
proyecto de investigacin.
*
ACTH
Hormona
adrenocorticotropa
o
*
IGF-l II Factor de crecimiento similar a la insulina-li II
IOFSPs Protenas ligantes de IGFs lL-1~ 16 Interleuquina 13 16 IRS-1
Sustrato del receptor de insulina-1 JAK-2 Janus quinasa-2 Kb
Kilobases KDa Klodaltons LH Hormona luteinizante LHRH Hormona
liberadora de
corticotropina*
ALS Subunidad cido lbil del complejo de 150 KDa de las IGFBPS
AMPc Adenosn-3-5-monofosfato cclico AP-2 Protena activadora-2 ARNm
Acido ribonucleico mensajero BSA Albmina srica bovina cADN Acido
desoxinibonucleico copia directa del ARN cpm cuentas por minuto CRE
Elemento de respuesta a AMPo CRES Protena que se une al CRE CRH
Hormona liberadora de la hormona adrenocorticotropa EDTA Acido
etilendiaminotetraactco FFAAcidos grasos libres FSH Hormona
folculoestimulante GASA Acido gamma-aminobutrico OC
Glucocorticoides OCRE Elemento de respuesta al receptor deGC OH
Hormona de crecimiento GHBP Protena ligante de OH OHR Receptor de
OH GHRH Hormona liberadora de la OH OMS Glutamato Monosdico h Horas
hOH GH humana hOHRM GHRH humana i.c.v. Intracerebroventricular i.p.
Intraperitoneal i.v. Intravenoso
* * * * * * * *
**
** *
* * * *
gonadotropinas*
MAP quinasa Quinasa activada por
mitgenos * mGH OH de ratn o murina* * *
NF-1 Factor nucle~r-1 oGH OH ovina PACAP Polipptido activador de
la
* *
*
* * *
adenilato ciclasa hipofisaria * ph Pares de bases*
PCR
Reaccin
en
cadena
de
la
*
Polimerasa Pt-1I-2 Factor de transcripcin especifico de la
hpfisis-1/-2 RAR Receptor del cido retinoico rGHGHderata
rOHRHGHRHde rata RA Radoinmunoensayo rpm revoluciones por minuto RT
Transcripcin inversa s.c. Subcutneo SEM Error estndar de la media
SS Somatostatna SSTR Receptor de
* * **
* * * * * * * * * *
* * * **
* *
SS
T3 3,5,3-Triyodotironina
*
* * * * * *
T4 3,5,3,5-Tetrayodotironna o tiroxina TCA Acido tricloroactico
TNF- a Factor de necrosis tumoral a-
TR Receptor de Hormonas tiroideas TRE Elemento de respuesta a TR
TRH Hormona liberadora de TSH TSH Hormona estimulante del tiroides
u hormona tirotropa USF Factor estimulador upstream VOR Receptor de
la vitamina D
* *
U. INTRODUCCIN.1. EJE SOMATOTROPO. 2.OHRH. 2.1. BIOSNTESIS Y
ESTRUCTURA QUMICA. 2.2. LOCALIZACIN. 2.3. ACCIONES BIOLGICAS Y
MECANISMOS DE ACCIN. 2.3.1. Receptores de GHRH. 2.3.2. GHRH y
sntesis de GH. 2.3.3. GHRH y liberacin de GH. 2.3.4. GHRH y
proliferacin de las clulas somatotropas. 3. SOMATOSTATINA. 3.1.
BIOSNTESIS Y ESTRUCTURA QUMICA. 3.2. LOCALIZACIN. 3.3. ACCIONES
BIOLGICAS Y MECANISMOS DE ACCIN. 3.3.1. Receptores de SS. 3.3.2. SS
y actividad somatotropa. 4. HORMONA DE CRECIMIENTO. 4.1. BIOSNTESIS
Y ESTRUCTURA QUMICA. 4.2. PATRN DE SECRECIN. 4.3. PROTENAS
TRANSPORTADORAS.
33 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8
1011 11 11 12 12 13 15
4.4. RECEPTORES.4.5. MECANISMOS DE ACCIN. 4.6. ACCIONES
BIOLGICAS. 4.6.1. Accin anabolizante. 4.6.2. Acciones sobre los
metabolismos glucdico y lipdico. 4.6.3. Accin sobre el crecimiento.
4.6.4. La GH y el sistema inmunitario. 4.7. REGULACIN DE LA
EXPRESIN GNICA DE GH. 4.7.1. Pit-1.
1616 17 17 17 18
2121 22 23 25 25 26 26 28
4.7.2. Hormonas y otras sustancias relacionadas.4.7.3. Factores
ubicuos.
4.7.4. Modelo de control de la transcripcin del gen de la
GH.4.8. CONTROL DE LA SECRECIN DE GH. 4.8.1. Neurotransmisores.
4.8.2. Neuropptidos.
4.8.3. Hormonas. 4.8.4. Factores metablicos. 4.8.5. Mecanismos
de retroalimentacin. 5. SOMATOMEDINAS. 5.1. BIOSNTESIS Y ESTRUCTURA
QUMICA. 5.2. LOCALIZACIN. 5.3. PROTEINAS TRANSPORTADORAS. 5.4.
RECEPTORES Y MECANISMOS DE ACCIN 5.4.1. Receptor de tipo 1. 5.4.2.
Receptor de tipo II. 5.5. ACCIONES BIOLGICAS. 5.5.1. Efectos
agudos. 5.5.2. Efectos crnicos. 5.6. CONTROL DE LOS NIVELES
PLASMTICOS DE LAS IGFS 5.6.1. IGF-I. 5.6.2. IGF-ll. 6. REGULACION
DE LA SECRECIN DE OH A LARGO PLAZO.
30 31 32 35 35 36 36 37 38 38 39 39 39 40 40 41 42
II. OBJETIVOS.
45
III. MATERIAL Y MTODOS.1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIN. 1.1.
RATAS. 1.2. CORDEROS. 1.3. RATONES. 2. MTODOS DE SEGUIMIENTO DE LOS
ANIMALES.2.1. PESO CORPORAL.
4949 4949
50 50 50 so 50 52 52 53 53 53
2.2. MEDIDA DE LA LONGITUD TIBIAL POR MICROKNEMOMETRIA. 2.2.1.
Caractersticas del Microknemmetro. 2.2.2. Procedimiento de medida.
2.3. PRUEBAS DE ESTMULO CON GHRH. 3. TCNICAS QUIRRGICAS. 3.1.
IMPLANTACIN DE MINIBOMBAS OSMTICAS. 3.2. IMPLANTACIN DE
PELLETS.
4. TRATAMIENTOS FARMACOLGICOS. 4.1. TRATAMIENTO NEONATAL CON
GLUTAMATO MONOSDICO. 4.2. GHRH. 4.3. SOMATOSTATINA. MUESTRAS. 5.1.
OBTENCIN DE SANGRE. 5.2. HIPOTLAMO. 5.3. HIPFISIS. 5.4. GLNDULA
SUBMAXILAR. 6. MTODOS ANALITICOS. 6.1. RADIOINMUNOANLISIS:
CARACTERISTICAS GENERALES. 6.1.1. Radioyodacin de la hormona.
6.1.2. Evaluacin del marcaje. 6.1.3. Realizacin y cintica del
anlisis. 6.1.4. Validacin del RA. 6.2. RA DE GH. 6.2.1.
Inmunorreactivos. 6.2.2. Soluciones tampn y suspensiones. 6.2.3.
Radioyodacin de la hormona. 6.2.4. Realizacin del anlisis. 6.2.5.
Validacin del RA. 6.3. RA DE IGF-I. 6.3.1. Inmunorreactivos. 6.3.2.
Soluciones tampn y suspensiones 6.3.3. Radioyodacin de la hormona.
6.3.4. Realizacin del anlisis. 6.3.5. Validacin del RA. 6.4. RA DE
GHRH. 6.4.1. Inmunorreactivos. 6.4.2. Soluciones tampn y
suspensiones. 6.4.3. Radioyodacin de la hormona. 6.4.4. Realizacin
del anlisis. 6.4.5. Validacin del RA.
54 54 54 55 55 55 56 56 57 57 57 58 59 59 60 61 61 61 62 63 64
66 66 66 67 67 68 69 69 69 69 70 70
6. SACRIFICIO DE LOS ANIMALES. RECOGIDA Y PROCESAMIENTO DE
LAS
6.5. RA DE SS. 6.5.1. Inmunorreactivos. 6.5.2. Soluciones tampn
y suspensiones. 6.5.3. Radioyodacn de la hormona. 6.5.4. Realizacin
del anlisis. 6.5.5. Validacin del RA. 6.6. DETERMINACIN DE
PROTENAS. 6.6.1. Reactivos. 6.6.2. Realizacin del anlisis. 6.6.3.
Validacin del mtodo. 6.7. DETECCIN DE ARNm DE GH. 6.7.1. Extraccin
de ARN. 6.7.2. Sntesis de cADN por RT. 6.7.3. Amplificacin del cADN
mediante PCR. 6.7.4. Anlisis del producto PCR. 7. DISEOS
EXPERIMENTALES.
71 71 71 71 72 72 73 73 73 73 74 74 75 76 76 77
7.1. EXPERIMENTO 1: ESTUDIO DEL EFECTO DE DISTINTAS PAUTAS DE
ADMINISTRACIN DE GHRH EN LA RATA MACHO NORMAL. 77
7.2. EXPERIMENTO 2: ESTUDIO DE LA RESPUESTA A LA ADMINISTRACIN
DE GHRH EN LA RATA MACHO DEFICITARIA EN GH. 77 7.3. EXPERIMENTO 3:
ESTUDIO A LARGO PLAZO DEL EFECTO DE LA ADMINISTRACIN PULSTIL DE
GHRH SLO O COMBINADO CON SS EN LA RATA HEMBRA NORMAL. 7.4.
EXPERIMENTO 4: ESTUDIO DE LA RESPUESTA DE LA RATA HEMBRA
DEFICITARIA EN GH A LA ADMINISTRACIN PULSTIL DE GHRH A LARGO PLAZO.
7.5. EXPERIMENTO 5: ESTUDIO DE LA RESPUESTA EN LA RATA HEMBRA
NORMAL Y DEFICITARIA EN GH A LA ADMINISTRACIN CONTINUA A LARGO
PLAZO DE GHRH SLO O COMBINADO CON 55. 81 80 78
7.6. EXPERIMENTO 6: EFECTO A LARGO PLAZO DE DISTINTAS FORMAS DE
ADMINISTRACIN DE GHRH SLO O COMBINAD CON SS EN CORDEROS.7.7.
EXPERIMENTO 7: ESTUDIO DE LA ADMINISTRACIN CONTINUA A
82
LARGO PLAZO DE GHRH MEDIANTE BOMBAS OSMTICAS EN CORDEROS. 83
7.8. EXPERIMENTO 8: REGULACIN DE LA SECRECIN DE GH EN TEJIDOS
EXTRAHIPOFISARIOS SOMETIDOS A ALTAS DOSIS DEGHRI-I. 84 8. ANLISIS
ESTADiSTICO DE LOS DATOS. 85
IV. RESULTADOS.DE GHRH EN LA RATA MACHO NORMAL. 1.1. CONTENIDO
HIPOTALAMICO DE GHRH. 1.2. CONTENIDO HIPOTALAMICO DE SS. 1.3.
NIVELES HIPOFISARIOS DE GH. 1.4. NIVELES PLASMTICOS DE GH. 1.5.
NIVELES PLASMTICOS DE IGF-I. 1.6. EVOLUCIN DEL PESO CORPORAL.
89
1. EXPERIMENTO 1: EFECTO DE DIFERENTES PAUTAS DE ADMINISTRACIN
89 89 89 90 90 91 91
2. EXPERIMENTO 2: EFECTO DE LA OHRH EN LA RATA MACHO DEFICITARIA
92 EN OH. 2.1. CONTENIDO HIPOTALMICO DE ss. 2.2. NIVELES
HIPOFISARIOS DE GH. 2.3. NIVELES PLASMTICOS DE GH. 2.4. NIVELES
PLASMATICOS DE IGF-I. 2.5. EVOLUCIN DEL PESO CORPORAL. 92 92 93 93
95
3. EXPERIMENTO 3: EFECTO DEL TRATAMIENTO A LARGO PLAZO CON 95
INYECCIONES DE OHRH Y DE SS EN LA RATA HEMBRA NORMAL. 3.1.
CONTENIDO HIPOTALMICO DE SS. 3.2. NIVELES HIPOFISARIOS DE GH. 3.3.
NIVELES PLASMTICOS DE GH. 3.4. NIVELES PLASMTICOS DE IGF-I. 95 96
97 97
3.5. EVOLUCIN DEL PESO CORPORAL. 98 4. EXPERIMENTO 4:
ADMINISTRACIN PULSTIL DE OHRH A LARGO PLAZO EN LA RATA HEMBRA
DEFICITARIA EN OH. 4.1. CONTENIDO HIPOTALMICO DE SS. 4.2. NIVELES
HIPOFISARIOS DE GH. 4.3. NIVELES PLASMTICOS DE GH. 4.4. NIVELES
PLASMTICOS DE IGF-l. 4.5. EVOLUCIN DEL PESO CORPORAL. 4.6. EVOLUCIN
DE LA LONGITUD TIBIAL. SLO O CON SS EN LA RATA HEMBRA NORMAL Y
DEFICITARIA EN GH. 5.1. CONTENIDO HIPOTALMICO DE SS. 5.2. PESO DE
LAS HIPFISIS. 5.3. NIVELES HIPOFISARIOS DE GH. 5.4. NIVELES
PLASMTICOS DE GH TRAS LA PRUEBA DE ESTMULO CON GHRH. 5.5. NIVELES
PLASMTICOS DE GH TRAS EL SACRIFICIO. 5.6. NIVELES PLASMTICOS DE
IGF-l. 5.7. EVOLUCIN DEL PESO CORPORAL. 5.8. EVOLUCIN DE LA
LONGITUD TIBIAL. PLAZO EN CORDEROS. 6.1. CONTENIDO HIPOTALMICO DE
GHRH. 6.2. CONTENIDO HIPOTALMICO DE SS. 6.3. NIVELES HIPOFISARIOS
DE GH. 6.4. NIVELES PLASMTICOS DE GH TRAS LA ESTIMULACIN AGUDA CON
GHRH. 6.5. NIVELES PLASMTICOS DE IGF-I. 6.6. EVOLUCIN DEL PESO
CORPORAL. MEDIANTE BOMBAS OSMTICAS EN CORDEROS. 7.2. NIVELES
PLASMTICOS DE IGF-[ 7.3. EVOLUCIN DEL PESO CORPORAL. 115 118 118
119 121 121 108 109 110 110 112 113 113 113 115 99 99 100 101 101
102 103 105 105 105 106
6. EXPERIMENTO 6: ADMINISTRACIN CONTINUA DE OHRH A LARGO
PLAZO
6. EXPERIMENTO 6: EFECTO DE LA ADMINISTRACIN DE GHRH Y SS A
LARGO
7. EXPERIMENTO 7: ADMINISTRACIN CONTINUA DE GHRH A LARGO PLAZO
7.1. NIVELES PLASMTICOS DE GH TRAS ESTIMULACIN CONGHRI-I. 119
8. EXPERIMENTO 8: REGULACIN DE LA SECRECIN DE GH POR GHRH EN 122
TEJIDOS NO HIPOFISARIOS. 8.1. NIVELES PLASMTICOS DE GH. 8.2. PESO
DE LAS GLNDULAS SUBMAXILARES. 8.3. CONTENIDO DE GH EN LAS GLNDULAS
SUBMAXILARES. 8.4. EXPRESIN DEL GEN DE LA GH EN LAS GLNDULAS
SUBMAXILARES. 124 127 127 127 127 128 129 130 131 131 133 133 122
122 122
V. DISCUSIN.1. EFECTO DE LA ADMINISTRACIN DE GHRH EN LA RATA
MACHO.
1.1. ESTUDIOS EN LA RATA MACHO NORMAL. 1.1.1. Contenido
hipotalmico de GHRH y de SS. 1.1.2. Contenido hipolisario y niveles
circulantes de GH. 1.1.3. Niveles plasmticos de IGF-l. 1.1.4. Peso
corporal. 1.2. ESTUDIOS EN LA RATA MACHO DEFICITARIA EN GH. 1.2.1.
Contenido hipotalmico de SS. 1.2.2. Contenido hipofisario y niveles
circulantes de GH. 1.2.3. Niveles plasmticos de IGF-l e incremento
ponderal.
2. ESTUDIO DE LA ADMINISTRACIN DE GHRH Y SS EN LA RATA HEMBRA.
134 134 2.1. ESTUDIOS EN LA RATA HEMBRA NORMAL. 2.1.1. Contenido
hipotalmico de SS. 2.1.2. Contenido hipofisario y niveles
plasmticos de GH. 134 135
2.1.3. Niveles plasmticos de GH tras estimulo agudo con GHRH.
138 138 2.1.4. Niveles circulantes de IGF-I. 2.1.5. Crecimiento.
2.2. ESTUDIOS EN LA RATA HEMBRA DEFICITARIA EN GH. 2.2.1. Contenido
hipotalmico de SS. 2.2.2. Contenido hipofisario y niveles
plasmticos de GH. 2.2.3. Respuesta a la estimulacin aguda con GHRH:
2.2.4. Niveles plasmticos de IGF-I. 2.2.5. Crecimiento. 3. ESTUDIO
DE LA ADMINISTRACIN DE GHRH Y SS EN CORDEROS. 3.1. CONTENIDO
HIPOTALMICO DE GHRH. 3.2. CONTENIDO HIPOTALMICO DE SS. 139 141 141
141 143 144 144 145 145 146
3.3. NIVELES PLASMTICOS Y CONTENIDO HIPOFISARIO DE GH. 3.4.
NIVELES PLASMTICOS DE IGF-I. 3.5. PESO CORPORAL. 4. REGULACIN DE LA
SINTESIS DE OH POR EXTRAHIPOFISARIOS.
147 150 151
OHRH EN TEJIDOS 152 157
VI. CONCLUSIONES. VII. BIBLIOGRAFIA.
161
t
flflLR(OLPAI2JUtU>Lfl
Intmduccin
1. EJE SOMATOTROPO.La sntesis y secrecin de la homiona de
crecimiento (GH) por las clulas somatotropas hipofisarias esta bajo
el control de dos pptidos hipotalmicos: la hormona liberadora de la
GH (GHRH) y la somatostatina (SS). La GH una vez secretada por las
clulas somatotropas actua sobre los tejidos perifricos estimulando
la produccin de somatomedinas, tambin llamadas IGF-I y II (Factor
de crecimiento similar a la insulina-l y -II), mediadoras de muchos
de los efectos1de la GH. Estas hormonas actuan coordinadamente y
constituyen lo que se llama el eje somatotropo (figura 1). Este
sistema est regulado por diversos neurotransmisores, neuropptidos,
hormonas y seales metablicas que actuan en la hipfisis y en el
hipotlamo, y adems dispone de mecanismos de retroalimentacin en los
que estan implicadas la GH, las IGFs, la GHRH y la SS.
HIPOTLAMOSS
Neuropptidos Hormonas Factores metablicos
Oo
IGF.I
rigura 1. Componentes del eje somatotropo.
3
Introduccin
2. GHRH.2.1. BIOSNTESIS Y ESTRUCTURA QUMICA. La GHRH es la
hormona hipotalmica que estimula la sntesis y secrecin de GH. Fue
aislada e identificada en 1982 por los gmpos de W. Vale y R.
Guilemin, a partir de tumores pancreticos. Desde el punto de vista
bioqumico se trata de un pptido perteneciente a la familia del
glucagn y de la secretina. Los genes que codifican la GHRH en la
rata (rGHRH) y en el hombre (hGHRH) son similares. Constan de 5
exones, de los cuales el 2, el 3, el 4 y una parte del 5 codifican
las secuencias de los respectivos precursores. El gen de la hGHRH
se encuentra en el cromosoma 20. El precursor de la rGHRH tiene 104
aminocidos y tras su procesamiento da lugar al pptido maduro de 43
aminocidos, mientras que del gen de la hGHRH se producen dos
precursores, uno de 107 y otro de 108 aminocidos, formados por
procesamiento alternativo del ARN mensajero (ARNm) primario. Estos
dos precursores de la hGHRH, tras sufrir modificaciones
proteolticas, dan lugar a las formas de 40 y 44 aminocidos
presentes en el hipotlamo humano. La secuencia de aminocidos de la
GHRH se encuentra bastante conservada en los mamferos, difiriendo
por ejemplo la forma molecular ovina tan slo en 6 aminocidos
respecto de la humana. La rGHRH es una excepcin a esta homologa, ya
que slo tiene 43 aminocidos y de ellos 14 son diferentes a los de
la hGHRH (figura 2). Sin embargo, las divergencias se encuentran
sobre todo en el extremo carboxilo-terminal, mientras que el
extremo amino-terminal, en el que radica la actividad biolgica,
conserva una alta homologa con la secuencia de la hGHRH (cerca deI
80%).
En cualquier caso, se ha determinado que la actividad biolgica
reside en los primeros 29 aminocidos. Por esta razn, se han
desarrollado pptidos sintticos como el GHRH 1-29, que poseen la
misma potencia que las formas naturales.
hombre cordero rata
YADAIFTNSVR YADAIFTNSYR
KVLGKLSARKLIQ Kl LGKLSARKLLQ
DIMSROQGESNOERGARARL-NHZ DIMNROQGERNQEQGAKvRL-NH 2
4 ADAIFTSSYRRI
LGKLYARK LLH EIMNRQC)GERNOEQRSRFN-NH2
Figura 2. secuencia de aminocidos de la CHRH del hombre, del
cordero y de la rata. En negrita se indican los aminocidos
diferentes respecto a la secuencia de la GHRH humana. Nomenclatura:
A-Ala D-Asp E-Clu F-Phe C-Gly H-His 1-Ile K-Lys L-Leu M-Met N-Asn
Q-Gln R-Arg S-Ser T-Thr V-Val Y-Tyr.
4
1
Introduccin
2.2. LOCALIZACIN. A diferencia de otros neuropptidos, la GHRH
tiene una ditribucin cerebral bastante localizada. La mayor
concentracin de cuernos neuronales productores de GHRH (neuronas
GHRH-rgicas) se encuentra en el hipotlamo mediobasal, sobre todo en
los ncleos arcuato y ventromedial (Merchenthaler y cols 1,984,
Bloch y cols 1984). No obstante, se han encontrado neuronas
productoras deGHRH dispersas por casi todo el hipotlamo, el
hipocampo y la amgdala. De las neuronas GHRI-I-rgicas del ncleo
arcuato, encargadas del control de la actividad somatotropa, parte
una densa trama de axones hacia la eminencia media, donde descargan
en el plexo vascular del sistema porta-hipotlamo-hipofisario
(figura 1). Las neuronas GHRH-rgicas del ncleo ventromedial parecen
proyectar a otras reas hipotalmicas, en las que el pptido podra
funcionar como neuromodulador. Adems, se han localizado fibras que
transrtan GHRH en diversas reas hipotalmicas (regin
periventricular, ncleo paraventricular, rea preptica) y
extrahipotalmicas (sistema lmbico) en las que el pptido parece
intervenir en procesos conductuales y de ingesta de alimentos.
Tambin dentro del cerebro se ha detectado GHRH en concentraciones
apreciables en el lquido cefalorraquideo. Fuera del cerebro se ha
aislado y caracterizado la GHRH en la placenta, el estmago, el
duodeno, el pncreas, la hipfisis, el ovario, el testiculo y los
linfocitos (Cuttler 1996>. En muchos cuernos neuronales y
terminales con GHRH se ha demostrado la coexistencia de este pptido
con dopamina, galanina o neurotensina. Estas molculas podran ser
las mediadoras de la interrelacin observada entre las neuronas
GHRH-rgicas y las productoras de SS, interviniendo enla generacin
del ritmo de secrecin alternante entre ambos pptidos
hipotalmicos.
2.3. ACCIONES BIOLGICAS Y MECANISMOS DE ACCIN. La GHRH estimula
la sntesis y secrecin de GH, e induce la proliferacin de las clulas
somatotropas (Barinaga y cals 1985, Billestrup y cos 1986). Como
sucede con otras muchas hormonas peptdicas, la GHRH realiza sus
acciones biolgicas tras unirse a receptores de membrana.
5
Introduccin
2.3.1. Receptores de GHRH. El receptor de la GHRH en el hombre y
la rata es una protena de 423 aminocidos1 con 7 dominios a-hlice
transmembranares tpicos de los receptores acoplados a protenas G.
Estos receptores se han localizado principalmente en las clulas
somatotropas, aunque tambin se ha encontrado ARNm del receptor de
GHRH en el hipotlamo y el tracto gastrointestinal (Matsubara y cols
1995>. En estos rganos, en los que tambin se sintetiza GHRH, el
receptor mediara las acciones auto/paracrinas de ste pptido. La
unin de la GHRH con su receptor estimula la adenilato ciclasa a
travs de una protena G activadora, resultando en la produccin de
AMP cclico (AMPc). Este segundo mensajero parece ser el mediador de
los efectos de la GHRH sobre los procesos de sntesis y secrecin de
GH, y proliferacin de las clulas somatotropas.
2.3.2. GHRH y sntesis de OH.
Tras la unin de la GHRH a su receptor se suceden toda una serie
de acontecimientos que van a llevar a la activacin de la sntesis
hipofisaria de GH. El mecanismo por el que la GHRH regula este
proceso tiene lugar a nivel de la transcripcin genmica. Hay que
destacar que la GHRH estimula la transcripcin del gen de la GH
independientemente de su accin sobre la liberacin de la hormona, a
pesar de que ambos procesos estan mediados por AMPc (Barinaga y
cols 1985). El aumento de los niveles de AMPc, tras la unin de la
GHRH a su receptor en la clula somatotropa, conduce a la
estimulacin de una protena quinasa A, que fosforila varias protenas
citoplasmticas y nucleares, entre las que se encuentra el factor de
transcripcin CRES (c-AMP-Responsive Element Binding Protein>,
que se une en el ADN a los elementos de respuesta a AMPc
denominados CRE (c-AMPResponsive Eement) y cuya secuencia es
TGACGTCA. No se han podido localizar tales CREs en el promotor del
gen de la GH de la rata (rGH) pero s en el promotor del factor de
transcripcin especfico de la hipfisis-1 (Pit-1), por lo que se ha
propuesto un posible mecanismo de activacin de la expresin de GH
por GHRH a travs de Pit-1 (Ruvkun 1992) (figura 3>. Tambin es
posible que la transcripcin del gen del Pit-1 sea activada por el
calcio, de tal forma que la protena CRES sera fosforilada por una
protena quinasa dependiente del complejo calcio-calmodulina (Sheng
y cols 1991>. La misma secuencia de acontecimientos propuesta
para la transcripcin de la rGH podra ser perfectamente vlida para
el promotor de la GH humana (hGH),6
Introduccin
aunque en ste tambin se han detectado dos secuencias parciales
de CRE (CGTCA) a las que podra unirse el factor de transcripcin
CREB cooperando con el Pit-1 en la regulacin positiva de la
transcripcin del gen de la GH por GHRH en el hombre (Sheppard y
cols 1994). 2.3.3. GHRH y liberacin de GH. La GHRH estimula la
secrecin hipofisaria de GH. La respuesta es inmediata y dependiente
de la dosis dentro de un rango de concentraciones (Wehrenberg y
cols 1984a). El proceso de secrecin de GH esta mediado por Ca los
niveles citoslicos de AMPc. El incremento de la concentracin de
AMPc en el citoplasma de las clulas somatotropas que se observa
tras la unin de GHRH a su recbptor produce la activacin de la
protena quinasa A que, tras actuar sobre canales de Ca2
y por un aumento en
conduce
al aumento en la concentracin intracelular de dicho catin. Este
aumento de los niveles intracelulares de Ca tambin esta mediado por
la desporalizacin inicial que se produce despus de la unin de la
GHRH con su receptor, a travs de la inhibicin de canales de Kl En
ltima instancia, el calcio intracelular formando complejo con la
calmodulina inducira la exocitosis de las vesculas secretoras
portadoras de GH (figura 3). Adems, estudios recientes indican la
posibilidad de que el complejo calciocalmodulina interaccione
directamente con la adenilato ciclasa y la ptotena quinasa A
aumentando su actividad (Mougin y cols 1984). Diversos trabajos
sugieren adems la participacin de las vas del
diacilglcerol-proteina quinasa C y de segundos mensajeros
relacionados con el cido araquidnico en el proceso de liberacin de
GH estimulado por GHRH (Cronin y cols 1985, Canonico y cols
1986>. 2.3.4. GHRH y proliferacin de las clulas somatotropas.
Observaciones realizadas in vivo, en pacientes con tumores
productores de GHRH, indican que este pptido induce proliferacin de
las clulas somatotropas. Este efecto se ha comprobado administrando
GHRH a animales de experimentacin, en los que tras dicho
tratamiento se incrementa tanto el nmero total de clulas
somatotropas como su ndice mittico. Esta accin de la GHRH sobre la
proliferacin celular esta mediada por AMPc y por la protena c-fos,
cuyo contenido y el de su ARNm aumentan tras exponer cultivos
hipofisarios a GHRH (Billestrup y cols 1987) (figura 3>. Existen
trabajos en los
7
Introduccin
que se propone tambin al Pit-1 como posible elemento mediador
del efecto proliferativo de la GHRH (Castrillo y cols 1991) (figura
3>.
3. SOMATOSTATINA.3.1. BIOSNTESIS Y ESTRUCTURA QUiMICA. Los
primeros indicios acerca de la presencia de factores inhibidores de
la secrecin de GH en extractos hipotalmicos aparecieron
accidentalmente en el trabajo del grupo de Kruich y cols en 1968
mientras buscaban un factor liberador de GH. Vados aos despus,
Brazeau y cols (1973) aislaron y caracterizaron este factor
inhibidor de la secrecin de OH, al que llamaron SRIF (Somatotropin
Releaselnhibiting Factor> y al que se conoce habitualmente como
somatostatina (SS>. La SS caracterizada por el grupo de Brazeau
result ser un pptido de 14 aminocidos (SS-14), de estructura cclica
debido a la existencia de dos puentes disulfuro intramoleculares
entre dos cisteinas (figura 4a). Aunque tanto la forma lineal como
la cclica tienen efecto in vitro, la reduccin del puente disulfuro
disminuye significativamente la actividad biolgica de la molcula,
por lo que dicho puente disulfuro parece ser necesario para la unin
con el receptor (Rivier y cols 1975). La regin amino terminal no es
necesaria para la total actividad de la SS, mientras que los
aminocidos de las posiciones 7 a 10 parecen ser esenciales, por lo
que se han sintetizado diferentes anlogos de la SS, en los que se
mantienen tanto los aminocidos 7 a 10 como el puente disulfuro. Un
ejemplo es el Octreotide, que tiene mayor actividad biolgica que la
SS natural y su efecto es ms prolongado gracias a una elevada
resistencia a la degradacin (figura 4b>. Aunque inicialmente se
hablaba de un nico pptido con actividad inhibitoria de la secrecin
de OH, Pradayrol y cols (1980) describieron una nueva forma de SS
con 28 aminocidos (SS-28) que contiene la secuencia de la SS-14 y
adems otros 14 aminocidos adicionales en el extremo N-termina. Al
principio se pens que la SS-28 constitua un precursor de la forma
de 14 aminocidos, pero el hecho de que en las reas hipotalmicas
implicadas en el control somatotropo se produzcan los dos pptidos y
que ambas se liberen a la circulacin portal hace suponer que aunque
la SS-28 pueda ser un precursor, tambin es capaz de actuar como una
hormona en sentido estricto. As, tanto la SS-14 como la SS-28
podran intervenir en el control de la secrecin de GH. No obstante,
la SS-14 es la forma ms abundante en el sistema nervioso
central.
8
Introduccin
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o
9
Introduccin
La SS-14 y la 55-28 proceden de un mismo precursor generado por
la transcripcin de un nico gen. Este precursor, tras pasar por el
aparato de Golgi, es empaquetado en grnulos de secrecin en los que
se produce el procesamiento proteoltico final para dar lugar a las
formas maduras SS-14 y SS-28. Las dos formas moleculares de la SS
estan presentes en los mamferos, existiendo una gran homologa entre
stas. La secuencia de aminocidos de la SS-14 en la rata y en el
hombre es exactamente la misma (Reichlin 1983).
~ 5 Trp
D-Phe-C1ys-Phe~~D-Trp
5Cys Ser- Thr A
Lys
- Phe Thr-
Thr(ol) - Cys - ThrE
Figura 4. Secuencia de aminocidos de la 55-14 (A) y del
octreotide (8).
3.2. LOCALIZACIN. La SS se encuentra ampliamente distribuida por
todo el organismo pero sobre todo a nivel neural, endocrino y
digestivo actuando como neurohormona, neurotransmisor y modulador
paracrino. La mayor concentracin de neuronas productoras de SS
(neuronas SSrgicas) se encuentra en el ncleo periventricular
hipotalmico. Los axones procedentes de este ncleo se dirigen a la
eminencia media en donde contactan con el sistema
porta-hipotlamo-hipofisario. Como veamos anteriormente, en el ncleo
arcuato se localizan las neuronas GHRH-rgicas implicadas en el
control somatotropo. En este mismo ncleo existen tambin neuronas
productoras de SS y adems llegan a l prolongaciones procedentes del
ncleo periventricular, por lo que ambas vas podran intervenir en el
circuito de retroalimentacin de asa ultracorta que opera entre la
GHRH y la SS. Numerosos trabajos han demostrado la existencia de SS
en otras zonas cerebrales (ncleos supraquiasmtico, ventromedial y
caudado, la regin preptica), en el lquido cefalorraquideo y en el
tracto gastrointestinal (estmago, pncreas, intestino),
lo
Introduccin
3.3. ACCIONES BIOLGICAS Y MECANISMOS DE ACCIN. En consonancia
con su amplia distribucin por todo el organismo, la SS acta en
regiones tan diversas como el aparato digestivo o el cerebro, en
las que sus acciones son mayoritariamente inhibitorias. No slo es
un potente inhibidor de la secrecin de GH in vivo e in vitro, sino
tambin de una serie de secreciones endo y exocrinas como insulina,
glucagn, hormona estimulante del tiroides (TSH), renina, gastrina,
CIH, a-amilasa etc. Lo que a nosostros nos ocupar en el presente
apartado es su accin a nivel hipofisario. 3.3.1. Receptores de SS.
Al igual que sucede con la GHRH y otras hormonas proteicas, la SS
ejerce sus acciones unindose a receptores de membrana especficos.
Se han determinado 6 tipos de receptores para SS (SSTR), desde
SSTR1 hasta SSTR5, con dos subtipos de SSTR2 denominados A y B (Bel
y Reisine 1993>. Aunque se ha demostrado la expresin de todos
los tipos de receptores en las clulas somatotropas (OCarrol y
Krempels 1995), los receptores SSTR2A y 2B parecen ser los
mediadores de las acciones de la SS. Los receptores de SS se
encuentran asociados a diferentes protenas G inhibitorias. El
receptor SSTR2A aparece unido a la protena G~ y G0, mientras que el
SSTR2B interacciona con la protena G11 (Reisine y cols
1993>.
3.3.2. SSy actividad somatotropa. La SS se opone, de forma dosis
dependiente, a la prctica totalidad de las acciones estimuladoras
de GHRH en las clulas somatotropas. La SS inhibe tanto la secrecin
de GH basal como la inducida por GHRH u otros estmulos como la
arginina, hipoglucemia insulnica, ejercicio o estrs (Barinaga y
cols 1985). Asimismo, la SS atena el efecto trfico de la GHRH sobre
las clulas somatotropas (Billestrup y cols 1986). Respecto a la
biosntesis de GH, aunque se haba descrito que la SS no jugaba ningn
papel en este proceso (Barinaga y cos 1985, Fukata y cols 1985),
datos recientes parecen indicar que s puede actuar tambin como
inhibidor del incremento de transcripcin genmica dependiente de
GHRH (Devesa y Tresguerres 1996). Tal y como proponen Chen y cols
(1994), estos tres efectos que acabamos de describir, comienzan con
la unin de la SS al receptor de membrana SSTR2B. A continuacin, y a
travs de la protena G11, se inhibe la actividad adenilato cicasa,
producindose un descenso de los niveles de AMPc y de la actividad
protena11
Introduccin
quinasa A. Como consecuencia de este ltimo hecho, decrece la
cascada de fosforilaciones iniciadas por la quinasa A conduciendo
en ltimo trmino al bloqueo de la sntesis y secrecion de la GH y de
la proliferacin de las clulas somatotropas (figura 3>. La accin
negativa de la SS sobre la secrecin de GH tambin esta mediada por
el receptor SSTR2A asociado a las protenas G inhibitorias que antes
comentbamos. La va SSTR2A-G13, actuando directamente sobre canales
de K, estimula la salida de este in al exterior celular produciendo
la hiperpolarizacin de la 2~. Simultneamente, el membrana y la
disminucin de la permeabilidad de sta al Ca complejo SS-SSTR2A
acoplado a la protena G 2 0 actuara sobre canales de Ca inhibiendo
la entrada de ste a la clula. Como consecuencia de estas dos
acciones sobre los canales inicos, disminuye la concentracin
intracelular de Ca2+ con lo que tambin desciende la intervencin de
estos iones en la exocitosis de GH (figura 3).
4. HORMONA DE CRECIMIENTO.4.1. BIOSNTESIS Y ESTRUCTURA QUMICA.
La hormona de crecimiento se sintetiza en las clulas eosinfias de
la hipfisis anterior denominadas somatotropas, que representan el
40-50 % de las clulas hipofisarias. En condiciones normales, estas
clulas contienen entre 5 y 10 mg de GH, lo que la convierte en la
hormona ms abundante de esta glndula. La GH esta codificada por el
gen GH-N, localizado en el hombre en el brazo largo del cromosoma
17 junto a otros 4 genes (CS-L, CS-A, CS-B y GH-V) relacionados por
su homologa estructural y alineados a lo largo de un fragmento de
66.5 Kb formando lo que se llama el cluster de genes de la GH (Chen
y caIs 1989). Todos estos genes proceden de un gen ancestral comn
que divergi hace millones de aos y del que tambin deriv el gen de
la prolactina. El gen GH-N consta de cinco exones y cuatro
intrones, es el nico que se expresa en la hipfisis y codifica para
las variantes de GH de 22 y 20 KDa, aunque datos recientes sugieren
que el gen GH-V u otro gen todava sin identificar podran tambin ser
expresados en la hipfisis (Daz y cols 1993). El procesamiento del
ARNm primario originado a partir del gen GH-N da lugar al ARNm
maduro que a nivel ribosmico se traduce en la forma de 22 KDa en el
90 % de las molculas de transcrito primario. En el 10 % restante
ocurre un procesamiento alternativo por el que se origina la forma
GH de 20 KDa.
12
Introduccin
Una vez formado el producto GH de 22 .
63
Figura 5. Estructura de la CH de 22 KDa. Con trazo ms grueso
aparecen el fragmento cuyo corte origina la forma de 20 KDa y los
dos puentes disulfuro intracatenarios.
4.2. PATRN DE SECRECIN. Como todas las hormonas
adenohipofisarias, la GH se secreta de forma pulstil con perodos de
secrecin rpida denominados picos, intercalados con etapas no
secretoras o valles. El trabajo de Wehrenberg en 1982, demostrando
que el aporte de GHRH era indispensable para la secrecin pulstil de
GH, y el estudio de Tannenbaum y Ling (1984), que sugera la
presencia tambin de SS para la generacin de tal pulsatilidad,
probaba experimentalmente la intervencin de ambos pptidos
hipotalmicos en la secrecin rtmica de la GH. Ms tarde, Plotsky y
Vale en (1985) demostraban en la rata cmo la aparicin de cada pico
de GH era precedido por el vertido de GHRH a la circulacin portal,
a la vez que disminua la liberacin de SS. As, la secrecin
hipofisaria de GH depende de la actuacin coordinada, a nivel
hipofisario, de la GHRH y la SS que a travs de la circulacin portal
llegan a la hipfisis, activndola en el caso de la GHRH o
inhibindola en el de la SS.
13
Introduccin
Segn todo sto, el ritmo secretor de GH se generara por las
secreciones de GHRH y SS con un desfase de 180 0 (Tannenbaum y
Martin 1976) (figura 6>. Aunque de manera hipottica, se piensa
que la GHRH sera la responsable de la amplitud de los episodios de
GH, mientras que la SS, presumiblemente, determinara la frecuencia
y la duracin de los pulsos (Kraicery cols 1988). Sin embargo,
tambin es posible desde el punto de vista terico, que una secrecin
mantenida de GHRH estimule o no la secrecin de GH en funcin de los
niveles de SS. Esta posibilidad ha sido verificada por trabajos de
nuestro propio grupo (Tresguerres y cols 1991), en los que la
infusin continua de GHRH es capaz de mantener un patrn de secrecin
episdica de GH, por lo que bastara con que la secrecin de SS fuera
pulstil para explicarlos picos de GH (figura 6). Al igual que
ocurre con otras hormonas, la modulacin de la frecuencia de pulsos
de GH es clave para la produccin de sus efectos biolgicos (Gevers y
cos 1996). En relacin con sto, la administracin pulstil de GH en
ratas hipofisectomizadas, capaz de generar un perfil plasmtico de
GH similar al fisiolgico con picos cada 3 h, es ms eficaz en cuanto
a estimular el crecimiento que la administracin continua (Robinson
y Clark 1987). Tambin las acciones de la GH en el tejido adiposo y
la produccin heptica de somatomedinas parecen depender de la
pulsatilidad. Por todo esto parece que los tejidos diana de GH son
ms sensibles al patrn con el que la hormona llega a ellos que a la
cantidad total de GH que les alcanza. La secrecin pulstil de GH
podra estar en relacin con la no induccin de procesos de
desensibilizacin de los receptores de GH en los tejidos diana. Los
niveles plasmticos de GH varan considerablemente a lo largo del
desarrollo. Son muy altos durante las etapas fetal y neonatal y
descienden de forma gradual en la infancia. Desde este periodo
hasta la pubertad en la que aumenta drsticamente la GH, los niveles
circulantes de esta hormona permanecen estables. La secrecin de GH
aumenta durante la pubertad como consecuencia del incremento en la
tasa de produccin hipofisaria de esta hormona, lo que se traduce en
una mayor cantidad de GH liberada en cada pico. Luego los niveles
plasmticos de la GH disminuyen progresivamente a partir de la
adolescencia, al reducirse la amplitud de los pulsos de GH.
14
Introduccin
t
o o. c 0 w
_________
.5_______________________
E. o, a o.
GH
3.3 horas
Figura 6. Ritmo secretor de los pptidos hipotalmicos GHRH y SS y
de a CH. En lnea discontfnua aparece la terica secrecin continua de
CHRH.
4.3. PROTENAS TRANSPORTADORAS. Hasta hace poco se pensaba que la
GH circulaba en el plasma de forma libre, pero recientemente se ha
determinado que el 45-50 % de la GH de 22 por lo que inicialmente
no se saba cmo se iniciaba la secuencia de fosforilaciones
observada tras la administracin de GH. En 1993, Argetsinger y cols
identificaron una protena con actividad tirosina quinasa denominada
Janus quinasa-2 (JAK-2>, que se encuentra asociada al
dominio
16
Introduccin
citoplsmico del GHR y que, tras la unin de la GH a su receptor,
se activa, fosforilndose a s misma y al GHR. Una vez fosforilados
la JAK-2 y el GHR, se produce la fosforilacin de varias protenas
citoplasmticas, entre las que se incluyen unas quinasas activadas
por mitgenos (MAP quinasas>, los protenas STAT 1, 3 y 5 y una
protena que es sustrato del receptor de insulina (IRS-1). Las MAl
quinasas y las protenas STAT vana ser la intermediarias de los
procesos de proliferacin y diferenciacin, en los que tambin
intervienen las protenas c-fos y c-jun (Moller y cols 1992,
Sotiropoulos y cols 1996). La protena IRS-1 parece mediar los
efectos tipo insulina que tiene la GH
sobre el transporte de glucosa y la lipognesis. En estos dos
ltimos procesos tambin podra estar implicada una protena quinasa
dependiente de fosfatidilinositol(Ridderstrale y Tomqvist 1994,
Argetsinger y cols 1995>. Aunque el mecanismo que acabamos de
ver parece ser el ms habitual para las acciones de la GH, en
determinadas ocasiones puede realizar sus efectos a
travs de otras vas, como la de la fosfolipasa C-protena quinasa
C, iones Ca
2+
formacin de nucletidos cclicos e incluso la intemalizacin del
complejo hormonareceptor (Arilla y cos 1988, Chou y cols 1990,
Lobie y cols 1994).4.6. ACCIONES BIOLGICAS. 4.6.1. Accin
anabolizante-
La GH acta de forma positiva sobre prcticamente todos los
procesos implicados en la sntesis de protenas (Devesa 1989),
aumentando el transporte de aminocidos al interior celular y
activando tanto la transcripcin como la traduccin. Adems, disminuye
la degradacin de las protenas celulares. Como consecuencia de todas
estas acciones se favorece el depsito de protenas a nivel celular.
Esta accin anabolizante se da en tejidos tan variados como el
hueso, el cartlago, el pncreas, el msculo y sobre todo el hgado en
el que se producen lassomatomedinas.
4.6.2. Acciones sobre los metabolismos glucdico y lipidco.
Los efectos de la GH sobre el metabolismo de los glcidos y los
lpidos pueden clasificarse en acciones de tipo agudo, semejantes a
las de la insulina, y acciones de tipo crnico o antiinsulina.
17
Introduccin
*
Acciones semejantes a las de la insulina.
Este tipo de efectos de la GH ocurren inmediatamente despus de
que el tejido este expuesto a la hormona, y consisten en un aumento
en la captacin y utilizacin de la glucosa por las clulas y un
efecto antilipoltico. No obstante, estas acciones tipo insulina de
la GH parecen no tener un papel fisiolgico importante, puesto que
slo se manifiestan de forma aguda tras el tratamiento con GH en
individuos o animales carentes de ella.
*
Acciones antiinsulina. En un organismo normal, la GH endgena
induce un estado refractario a los
efectos semejantes a los de la insulina que acabamos de
comentar, por lo que de lasacciones de la GH resulta
fundamentalmente un efecto antiinsulina. Estas acciones
van unidas a la presencia de unos niveles plasmticos de GH
elevados, tanto en situaciones fisiolgicas (pico nocturno de GH),
como patolgicos (acromegalia) o tras la administracin crnica de GH,
e incluyen las conocidas clsicamente como acciones diabetgena y
lipoltica.La accin diabetgena de la OH consiste en la disminucin de
la captacin y
utilizacin de glucosa por las clulas, lo que se traduce en un
aumento de la glucemia. La GH tambin produce un aumento del depsito
de glucgeno en el hgado. En lo que se refiere a su accin lipoltica,
la OH produce la liberacin de cidos grasos libres (FFA) del tejido
adiposo aumentando as stos en el plasma y tambin favorece su
posterior oxidacin.4.6.3. Acciones sobre el crecimiento.
Como acabamos de ver, la OH cumple importantes funciones en el
control del metabolismo intermediario. Sin embargo, su efecto ms
obvio es promover el crecimiento tanto somtico como visceral,
mediante el aumento de tamao de las clulas, y estimulando los
procesos de mitosis y diferenciacin especfica de ciertos tipos
celulares, como los condroblastos o las clulas musculares
primarias.La sntesis de protenas es un fenmeno clave para el
crecimiento. Adems, las acciones de la GH sobre los metabolismos
glucdico y lipdico van encaminadas en la obtencin de la energa
necesaria para el proceso de crecimiento,
18
Intmducci6n*
Crecimiento somtico. El crecimiento somtico ocurre
principalmente a expensas del crecimiento
seo que, tras el nacimiento, es directamente dependiente del
sistema GHsomatomedinas, aunque tambin otros factores como las
hormonas tiroideas y losesteroides sexuales intervienen modulando
este proceso a nivel local.
El crecimiento del hueso puede producirse en longitud y, en
espesor. Elaumento del espesor ocurre por aposicin peristica,
mientras que el crecimiento
longitudinal depende del desarrollo del cartlago de crecimiento,
tambin llamado de conjuncin. El cartlago de crecimiento posee un
nico tipo celular, los condrocitos, que se encuentran en diferentes
fases de maduracin. Durante el crecimiento longitudinal del hueso,
estos condrocitos sufren lo que se llama osificacin endocondral,
que engloba las siguientes fases: proliferacin celular,
diferenciacin celular, sntesis de la matriz extracelular,
degeneracin de los condrocitos y mineralizacin de la matriz
crendose nuevo tejido seo. En la etapa de crecimiento siempre
existe una parte del cartlago que no se osifica y que permite que
el hueso siga creciendo hasta alcanzar la pubertad, momento en el
cual el aumento de las concentraciones plasmticas de los esteroides
sexuales osifica completamenteel cartlago, bloqueando su
proliferacin y poniendo fin al crecimiento longitudinal del
organismo. La GH controla el crecimiento seo en longitud
actuando tanto directa como indirectamente a travs de la IGF-I.
Ambas hormonas actuan conjunta y coordinadamente sobre distintas
poblaciones de condrocitos y sus efectos no son idnticos, sino
aditivos e interdependientes (Lindah y cols 1987, Bentham y cols
1993). La GH interviene en el proceso de crecimiento de dos formas
distintas: una mediante su efecto sobre el hgado, y otra
directamente en el cartflago de crecimiento. A nivel heptico
estimula la produccin de IGF-I, de una protena ligante de IGF-I,
denominadas IGFBP-3, y de una subunidad cido lbil (ALS). En el
cartlago de crecimiento actua sobre condroblastos de la zona
germinal, estimulando su expansin clonal y diferenciacin hacia
condrocitos, entrando as stos en la zona proliferatva del cartlago
de crecimiento. Adems, la GH inducira en estos condrocitos la
produccin de IGF-l (Russel y Spencer 1985, Schlechter y cols
1986> (figura 7>.
19
Introduccin
La IGF-I procedente del higado alcanza el cartlago por el
torrente sanguneo, en el que se encuentra junto con la IGFBP-3 y la
ALS formando un complejo de 150 KDa. Una vez en el cartlago, la
hormona se libera mediante un proceso en el que podran intervenir
unas proteasas que,.tras actuar sobre el complejo de 150 KDa, hara
que disminuyera la afinidad de IGFBP-3 por IGF-I. Tanto la IGF-l
local ejerciendo su accin de forma auto y/o paracrina, como la de
procedencia heptica hacindolo de forma endocrina, actuan sobre los
condrocitos ya diferenciados estimulando su proliferacin clonal y
maduracin, con lo que aumenta el volumen del citoplasma de estas
clulas y activando la sntesis de la matriz extracelular por los
condrocitos diferenciados (figura 7).
HIPFISIS
HGADO IGFB
Complejo de 150 kDa
~ Proteasa
CONDROCITOS o
CON DROBLASTO
O
Paracrino
Autocrino
rigura i. Control del crecimiento seo longitudinal por la GH y
la IGF-I.
20
Introduccin
*
Crecimiento visceral. La GH produce el crecimiento y desarrollo
de otros tejidos adems del seo,
como consecuencia de sus ya citadas acciones positivas sobre la
sntesis de protenas y la proliferacin celular. As en la mdula sea
la GH activa la eritropoyesis y la linfopoyesis de forma dosis
dependiente. Tambin el msculo liso y las clulas beta del pncreas
responden directamente in vitro a la GH, ya que a concentraciones
fisiolgicas aumentan la incorporacin de 3H-timidina y el contenido
de ADN.4.6.4 La OH y el sistema inmuntario. Adems de las citadas
acciones de la GH sobre el metabolismo intermediado,
esta hormona tambin participa positivamente en la respuesta
inmunitaria del organismo (Kelly 1990). En el timo existen
receptores para la GH, y en el ratn la administracin de suero
anti-GH atrofia tanto el timo como los ganglios linfticos. Adems,
en las clulas hematopoyticas la GH es un potente mitgeno (lsaksson
y cols 1985). Recientemente se ha demostrado la existencia de
expresin de GH en lneas celulares de leucemia humana (Devesa y cols
1996).
4.7. REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA DE OH.
El gen de la GH tiene una extensin aproximada de 2300 pb y en l
se diferencian las siguientes regiones en sentido 5- 3: - regin 5
no codificante, que contiene el promotor del gen al que se unen los
elementos reguladores y en el que se localizan las secuencias
consenso CATAAA y TATAAA (Caja TATA) caractersticas de los
promotores de los animales eucariotas. regin estructural del gen,
codificante del pre-ARNm de GH y organizada en-
intrones y exones. regin 3 no codificante, en la que se
encuentra la secuencia de-
poliadenilacin. En la figura 8 aparecen los factores que regulan
la transcripcin del gen de la rGHydelahGH.
21
Introduccin
-300
-200
-00
0
+100
rGH
Figura 8. Factores que controlan la expresin gnica de los genes
de la hGH y rCI-I. En blanco se representan los factores que
activan dicho proceso, en gris los que lo inhiben y en rayado los
factores ubicuos. Los nmeros indican la distancia al origen de la
transcripcin en pares de bases.
474. Pit-1.
De todos los factores de transcripcin que interaccionan con el
gen de la GH en la rata y en el hombre, el ms importante y el que
le confiere especificidad tisular es la protena Pit-1. Esta protena
se expresa en las clulas somatotropas, lactotropas y tirotropas, en
las que acta como factor de transcripcin estimulando la expresin de
los genes de la GH, la prolactina y la subunidad f3 de la TSH
(Sharp y Cao 1990, como de la proliferacin de las clulas
somatotropas inducida por dicho pptido (Castrillo y cols 1991).
Asimismo, tambinparece que el Pit-1 desempea una funcin
determinante en la diferenciacin celular
durante el desarrollo de los tipos celulares de la hipfisis
anterior (Dolle y cols 1990) yen la estimulacin de la expresin del
gen del receptor de GHRH (Lin y cos 1992).
Recientemente se ha descrito una variante de Pit-1, denominada
Pit-2, producido por procesamiento alternativo del gen del Pit-1.
Esta nueva protena tambin se une al ADN en los mismos sitios que el
Pit-1, aunque parece tener distintaactividad sobre la transcripcin
del gen de la GH (Vila y cols 1993>.
22
Introduccin
4.7.2. Hormonas y otras sustancias relacionadas.*
Hormonas tiroideas.
Gran parte de los efectos de las hormonas tiroideas (T3 y T4)
sobre el crecimiento parecen realizarse controlando la produccin de
GH en la hipfisis
anterior.En la rata, la T3 y la T4 inducen la expresin del gen
de la rGH (Yaffe y
Samuels 1984) a travs de la unin del receptor de las hormonas
tiroideas (TR) a unelemento de respuesta a dichas hormonas (TRE>
existente en el promotor (figura 8>.
Tambin se ha localizado un TRE adicional en el tercer intrn del
gen de la GH (Sap y cols 1990). Adems, las hormonas tiroideas y el
Pit-1 activan sinrgicamente el promotor del gen de la rGH
(Schaufele y cols 1992). Respecto a la intervencin de la T3 y la T4
en la transcripcin del gen de la hGH, los datos son confusos y
contradictorios. Todava no se ha localizado la secuencia de los
TREs en el promotor del gen de la GH humana (Isaacs y cols 1987,
Morin y cols 1990>.*
Olucocortcoides. Los glucocorticoides (GC) ejercen un control
positivo sobre la expresin del
gen de la GH tanto a nivel transcripcional como
post-transcripcional (Spindler y cols
1982). En estudios in vitro con clulas adenohipofisarias de rata
y humanos se ha visto que los GC incrementan los niveles de ARNm de
rGH y hGH, a travs de la unin del complejo GC-receptor a los
elementos de respuesta a dichos esteroides (GCREs) presentes en el
promotor. En el promotor de hGH se ha demostrado la existencia de
dos GCREs, uno en la zona del promotor y otro en el primer intrn,
mientras que en la rGH parece existir nicamente el del promotor
(Sater y cols 1985,Treacy y cols 1991) (figura 8>. Activina.
*
La activina producida en las clulas gonadotropas hipofisarias
controla de forma paracrina la sntesis de GH. Aunque los mecanismos
de transduccin de la seal de la activina no estan todava
completamente definidos, parece que no acta de forma directa
unindose al promotor de rGH, sino que inhibe la actividad de
laadenilato ciclasa, provocando el descenso de la produccin
somatotropa de Pit-1 (Struthers y cols 1992). La activina puede
actuar sinrgicamente con la SS inhibiendo la expresin de la rGH a
nivel de la adenilato ciclasa (Tasaka y cols 1992).
23
Introduccin
*
IGF-I e Insulina.
Tanto la IGF-l como la insulina disminuyen los niveles de ARNm
tanto de la hGH (Yamashita y cols 1986, Prager y Melmed 1988>
como de la rGH (Melmed y cols 1985, Yamashita y Melmed 1987).
Aunque hay datos que sugieren un efecto directo de estas hormonas
sobre la transcripcin del gen, tambin podran actuar indirectamente
activando factores represores o disminuyendo la estabilidad del
ARNm de la GH. An no se ha determinado la secuencia de nucletidos
implicada en la accin de la IGF-l y la insulina a nivel
transcripcional.*
Acido retinoico. El cido retinoico, metabolito activo de la
vitamina A, interviene en el
crecimiento y desarrollo celulares. En la rata actua tanto de
forma independientecomo sinrgica con la T3 y los GC, aumentando la
expresin del gen de la rGH, a
travs de la unin del receptor del cido retinoico (RAR) al TRE
(Umesono y cols 1988) (figura 8). Recientemente, se ha identificado
un sitio especfico de unin del cido retinoico al promotor del Pit-1
en la rata (Rhodesy cols 1993). Aunque se ha demostrado in vivo un
papel facilitador del cido retinoico sobre la secrecin de GH en el
hombre (Evain-Brion y cols 1994), su mecanismo todava es poco
conocido. No obstante, datos recientes parecen indicar que actua
junto con la vitamina D (Alonso-Sampedro 1997) (figura 8).Vitamina
D.
*
Aunque la vitamina D no modifica la expresin del gen de la rGH,
diferentes estudios indican que inhibe la respuesta mediada por las
hormonas tiroideas y el cido retinoico. Esta accin parece estar
mediada por la unin del receptor de la vitamina D (VDR) al TRE,
impidiendo la unin a ste del receptor de las hormonas tiroideas y
del receptor del cido retinoico (Garca-Villalba y cols 1996)
(figura 8). Existen muy pocos datos en la literatura acerca de la
accin que realiza la vitamina D sobre la transcripcin del gen de la
hGH. No obstante, trabajos muyrecientes indican la posibilidad de
que el receptor de la vitamina D se una al promotor
de la hGH en dos sitios: una primera zona muy cercana a la Caja
TATA y en la que actuara en solitario inhibiendo la transcripcin de
la hGH, y una segunda regin en laque el receptor de la vitamina D
intervendra junto con el receptor del cido retinoico, cooperando
con el Pit-1 en la activacin de la transcripcin (Alonso-Sampedro
1997)
(figura 8>.
24
Introduccin
4.7.3. Factores ubicuos. Aparte de los elementos reguladores de
la transcripcin del gen de la GH que acabamos de ver, tambin se ha
demostrado la intervencin en este proceso de otros factores de
transcripcin presentes en todas las clulas (figura 8).
En la regin promotora del gen de la hGH existen tambin sitios de
unin para el factor de transcripcin Spl, el factor estimulador
upstream (USF>, el factor nuclear-1 (NF-1) y la protena
activadora-2 (AP-2) (Theill y . Por otro lado, diversos estudios
indican que la dopamina activa la secrecin de SS, lo que se
traducira en una disminucin de la liberacin de GH en la hipfisis.
Aunque no puede descartarse que sta sea una accin directa sobre las
neuronasSS-rgicas (, los datos de Arce y cols (1991) sugieren que
la dopamina actua de forma indirecta sobre la secrecin de SS
modulando
negativamente la disponibilidad de noradrenalina (figura 9). Por
lo tanto, la dopamina tendra un papel principalmente modulador de
la secrecin de GH y dependiente del estatus funcional de las vas
implicadas en el control primario de este proceso.*
Vias colinrgicas.
La acetilcolina, actuando sobre receptores muscarnicos, estimula
la secrecin de GH. Se ha propuesto que este sistema sirva como va
final comn para toda una serie de estmulos que inducen secrecin de
GH como el sueo, el ejercicio o la arginina. Esta accin de la
acetilcolina parece realizarse modulando positivamente las vas
aradrenrgicas, lo que conducira a una disminucin de la liberacin de
SS, (Devesa y cols 1991a). Esta accin tambin podra ser llevada a
cabo de forma directa sobre las neuronas productoras de SS (figura
9).*
Serotonina.
Aunque el papel que cumple la serotonina en la regulacin de la
secrecin de GH esta muy poco claro, datos obtenidos en ratas
describen un papel activador de dicho proceso a travs de la
estimulacin de la liberacin de GHRH (Murakami y cols 1986) (figura
9>.
27
Introduccin
*
GABA.
El mecanismo de accin del cido gamma-aminobutrico (GABA) en el
control de GH est poco claro. La administracin aguda de GABA en el
hombre estimula la secrecin de GH a expensas del bloqueo del
vertido de SS a la circulacin portal. Sin embargo, el tratamiento
crnico con agonistas de este neurotransmisor suprime larespuesta de
GH a insulina o arginina (Llorens-Cortes y cols 1992). Como
consecuencia de estas discrepancias, se ha postulado que el
efecto del GABA sobre la GH no sea ms que una accin indirecta
dependiente del tono dopaminrgico central.4.8.2. Neuropptidos.*
PACAP.
El PACAl (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide) es
un polipptido de 38 aminocidos que se aisl inicialmente en el
hipotlamo del cordero y luego se demostr su presencia tambin en el
del hombre (Vigh y cols 1991). Se han localizado receptores
especficos para este pptido en las clulas somatotropas, en las que
produce liberacin de GH por un mecanismo mediado por AMPc (Goth y
cols 1992) (figura 9). A pesar de esto, todava no se ha encontrado
un papel fisiolgico para este pptido en relacin con la secrecin de
GH.*
Pptidos opioides.
La administracin de opioides o derivados produce una brusca
liberacin de GH. Este proceso es inhibido, en la rata, por
anticuerpos anti-GHRH, lo que indica que el mecanismo de accin
puede ser a travs de la liberacin de dicho pptido hipotalmico
(Wehrenberg y cols 1985). Por otro lado, los datos de Delitalia y
cols (1989) sugieren que, en el hombre, este efecto de los pptidos
opioides podra estar mediado por la inhibicin de la secrecin de SS
(figura 9). En cualquier caso, no parece que los opioides
participen en los mecanismos bsicos de control de GH, aunque si es
probable que sean los responsables de la liberacin de la hormona
asociada al estrs o al dolor.
28
Intmduccin
*
Galanina. La galanina es un neuropptido que se encuentra en
altas concentraciones en
el hipotlamo y produce liberacin de GH en el hombre y en la
rata. Las vas mediadoras de esta accin podran ser tanto la
estimulacin de la secrecin de GHRH (Merchenthaler y cols 1993) como
la inhibicin de la liberacin de SS (Davis ycols 1987> (figura
9). Citoquinas. Diversas citoquinas parecen intervenir en la
modulacin de la secrecin de
*
GH, actuando tanto en el hipotlamo como en la hipfisis. La
interleuquina-1j3 (IL-1f3) aumenta los niveles de ARNm de SS y
estimula la liberacin de este pptido a la circulacin portal,
produciendo as la atenuacin de lapulsatilidad de GH (Lumpkin y
Hartmann 1989). El factor de necrosis tumoral-ct (TNF-ct) tambien
actua a nivel hipofisario influyendo de forma negativa tanto sobre
la secrecin basal de GH como sobre la estimulada por GHRH (Gaillard
y cols 1990). La interleuquina-6 (IL-6> estimula la secrecin de
GH en cultivos de clulas hipofisarias, por lo que podra funcionar
como un factor liberador intrahipofisario de sta hormona (Spangelo
y cols 1990).*
Otros pptidos. Varios pptidos presentes tanto en el aparato
digestivo como en el cerebro
parecen estimular la secrecin de GH (Rivier y cols 1977). Entre
estos se encuentra la sustancia P, el pptido intestinal vasoactivo,
la motilina, la neurotensina y la colecistoquinina (Matsumura y
cols 1984>. No obstante, parece bastante improbable que estos
pptidos jueguen un papel fisiolgico en el control de la liberacin
de GH. De la misma forma, aunque diferentes pptidos hipotalmicos
liberadores de hormonas hipofisarias (TRW, CRH, LHRH) no
intervienen en la secrecin de GH en condiciones normales, si parece
que pueden influir sobre el eje somatotropo en situaciones
patolgicas como la acromegalia, la depresin o la anorexia nerviosa
(Maeda y Frohman 1980, Harvey 1990).
29
Introduccin
4.8.3. Hormonas.*
Hormonas tiroideas. Aparte del ya comentado efecto de las
hormonas tiroideas sobre la
transcripcin del gen de la GH, estas hormonas intervienen en la
liberacin de GH actuando a nivel hipotalmico e hipofisario. Las
hormonas tiroideas parecen influir sobre la sntesis de GHRH puesto
que la carencia de stas provoca un descenso de la sntesis del
citado pptido hipotalmico (Katakami y cols 1986b>, lo que
conduce a una disminucin en la produccin somatotropa de GH. Adems,
tambin facilitan la unin de la GHRH a sus receptores y modulan
positivamente el numero de stos (figura 9). Olucocorticoides. Estos
esteroides aumentan la transcripcin tanto del gen de la GH como la
del
e.
gen del receptor de la GHRH (Seifert y cols 1985) (figura 9).
Esta accin facilitadora de los GC sobre la secrecin de GH ocurre
tras ser administrados de forma aguda. Sin embargo, tras el
tratamiento de forma crnica se observa el efecto contrario, esto
es, un descenso de los niveles circulantes de GH, posiblemente como
consecuencia del aumento en la liberacin hipotalmica de SS a travs
de la estimulacin de las vas l3radrenrgicas (Lima y cols 1 993a)
(figura 9). Esteroides sexuales. La secrecin espontnea de GH
presenta un claro dimorfismo sexual tanto en el hombre como en la
rata, que se manifiesta a partir de la pubertad (Tannenbaum y
Martin 1976, Rose y cols 1991>. As, en el varn y en la rata
macho, la secrecin ultradiana de GH muestra episodios de brusca
liberacin entre 4 y 8 veces cada 24 h, mientras que en las mujeres
y en la rata hembra los picos secretores de GH aparecen a
intervalos ms frecuentes y presentan menor amplitud, aunque los
niveles basales entre dos picos consecutivos son ms altos. Este
dimorfismo sexual parece ser el resultado de la accin de los
esteroides sexuales en los perodos neonatal y adulto (Chowen y cols
1993). El estradiol reduce los niveles de GHRH en el hipotlamo y
tiene una accin inhibitoria sobre la SS, que puede estar mediada
por las vas ctradrenrgicas. Por su parte, la testosterona activa la
liberacin de SS e incrementa los niveles del ARNm de GHRH (Chowen y
cos 1989, Devesa y cols 1991b) (figura 9). As, en el macho, un tono
somatostatinrgico elevado, unos niveles hipotalmicos de GHRH altos
y la presencia de testosterona
*
30
Introduccin que potencie la sntesis hipolisaria de GH se
traducen en unos pulsos de GH de elevada amplitud separados por
perdos en los que la GH circulante esta muy baja. Mientras tanto en
la hembra, en la que la concentracin de GHRH en el hipotlamo es
menor que en el macho y donde la SS tiene tambin menor efecto que
en ste, los picos de GH son frecuentes pero de baja amplitud. La
existencia de este dimorfismo sexual en la secrecin de GH parece
tener implicaciones funcionales (Jansson y cois 1985b) que va desde
el crecimiento somtico hasta la induccin enzimtica en el hgado o el
metabolismo lipdico. En la rata macho, la aparicin de picos de GH
de gran amplitud separados por valles, consigue un mayor efecto
sobre el crecimiento que la presencia ms continuada de GH en los
tejidos diana, tal y como ocurre en la rata hembra.
4.8.4. Factores metablicos.*
Olucosa. La hiperglucemia conduce a la inhibicin de la secrecin
de GH, mientras que
el descenso de la glucemia produce la rpida liberacin de esta
hormona. Ambos efectos parecen estar mediados por cambios en la
secrecin de SS de tal forma que la hiperglucemia estimula y la
hipoglucemia, a travs de las vas ctradrenrgicas, inhibe la
liberacin de dicho pptido hipotalmico (Devesa y cols 1991 a). No
obstante tambin se ha postulado la intervencin de la GHRH en los
cambios en la secrecin de GH inducidos por la glucosa (figura 9).
Acidos grasos libres.
*
De forma similar a lo ocurrido con la glucosa, el aumento de los
niveles plasmticos de FFA inhibe la liberacin de GH y su disminucin
la estimula. Aunque inicialmente se aceptaba que estos efectos se
realizaban nicamente a travs de la SS, tambin se ha sugerido un
efecto negativo directo de estos metabolitos a nivel de las clulas
somatotropas, modificando las propiedades de la membrana plasmtica
(Casanueva y cols 1987) (figura 9>. Aminocidos. Aunque no todos
los aminocidos intervienen en el control de GH, algunos como la
arginina o la omitina son estimuladores potentes de su secrecin. El
mecanismo implicado en esta accin parece ser la inhibicin de la
liberacin hipotalmica de SS (Alba-Roth y cols 1988) (figura 9).
*
31
Introduccin
Hipoglucemia Estradiol
AcetilcolinaSerotoniria
GC
Opioldes Galanina H. riroideas Testosterona HipoglucemiaY
o4k
IL -1 l~ Testosterona Hipergiucemia jFFA
Estradiol
y
Dopamiria
oPACAP IL6 H. Tiroideas
AcetilcolinaGASA Opioides Galanina Aminocidos
GOTestosterona
e
o
o. Tambin se ha descrito una accin negativa de IGF-I sobre la
sntesis de GHRH (Uchiyama y cols 1994) (figura 10). Por otro lado,
en la hipfisis adems de provocar la disminucin de los niveles del
ARNm de GH, la IGF-l disminuye la liberacin de GH tanto basal como
estimulada por GHRH (Ceda y cols 1987> (figura 10). Datos
recientes indican que la IGF-l regula negativamente la secrecin de
GH actuando principalmente en la hipfisis (Minami y cols 1997).
32
Introduccin*
Retroalimentacin de asa corta. La administracin de GH inhibe el
efecto estimulante de la GHRH sobre la
liberacin de GH en sujetos tanto normales como deficientes en
esta hormona (Hanew y cols 1988>. En la rata macho consciente se
ha observado que, tras infusiones intravenosas de GH, los pulsos
endgenos desaparecen durante un pendo aproximado de 3 h (Canlsson y
Jansson 1990). Estos efectos podran deberse a la estimulacin de la
liberacin de SS (Chihara y cols 1981, Minami y cols 1997) e
inhibicin de la secrecin de GHRH (Clark y cols 1988b) (figura
10>. Adems, la GH estimula la expresin del gen de la SS
(Pellegrini y cols 1997, Rogers y cols 1988) e inhibe la del gen de
la GHRH (Uchiyama y cols 1994). No obstante, tal y como proponen
diversos autores estas acciones de la GH a nivel hipotalmico podran
ser realizadas directamente por dicha hormona hipofisaria y/o
tambin mediante la IGF-l producida localmente en el hipotlamo (Sato
y Frohman 1993, Becker y cols 1995) cuya sntesis estara reguladapor
la propia GH tal y como sucede en otros tejidos (Hynes y cols 1987,
Wood y cols 1991). Aunque se ha detectado ARNm para el receptor de
GH en la hipfisis (Fraser y cols 1991, Hul y cols 1993), esta
hormona no parece actuar directamente sobre las clulas somatotropas
(Richman y cols 1981, Goodyery cols 1984). Retroalimentacin de asa
ultracorta. Adems de su mutuo antagonismo sobre la clula
somatotropa, varias evidencias morfolgicas y funcionales sugieren
una estrecha interaccin entre GHRH y SS a nivel hipotalmico para
regular la secrecin episdica de GH (Liposits y cols 1988,
Tannenbaum y cols 1990, Slama y cols 1993). Mediante estudios in
vivo e in vitro se ha demostrado que la GHRH activa la secrecin de
SS (Aguila y McCann 1988, Katakami y cols 1986a) (figura 10). Sin
embargo, el signo del efecto de la SS sobre la secrecin de GHRH no
esta claro. La secrecin de GH inducida por la administracin i.c.v.
de SS parece estar mediada por la GHRH ya que este efecto se anula
con la inmunizacin pasiva contra GHRH (Murakami y cols 1987), lo
que apoyara una accin positiva de la SS sobre la GHRH. Por el
contrario, tanto el trabajo de Plotsky y Vale (1985) en el que se
describe el aumento de los niveles de GHRH en sangre portal
hipofasaria despus de la inmunizacin pasiva anti-SS por va i.c.v.,
como los de otros autores (Katakami y cols 1988, Miki y cols 1988)
parecen indicar que la SS inhibe la secrecin de GHRH (figura
10).
*
33
Introduccin Por otro lado, existen evidencias neuroanatmicas que
demuestran la existencia de axones neuronales de GHRH en contacto
directo con dendritas de neuronas GHRH-rgicas (Horvath y Palkovits
1988), lo que sugiere la existencia de un mecanismo de
autorregulacin de su propia liberacin (figura 10>. En relacin
con esto, la inyeccin i.c.v. de GHRH disminuye la secrecin de GH a
travs de la inhibicin de su propia liberacin (Lumpkin y cols 1985).
Tambin podra existir un mecanismo de autorregulacin negativa
similar para la SS (Peterfreund y Vale 1984, Richardson y Twente
1986) (figura 10).
o
o
Figura 10. Mecanismos de retroalimentacin de asa larga (.),
asa corta
.
Las somatomedinas tambin controlan la secrecin de hormonas
proteicas en diferentes tejidos diana como las clulas de la
granulosa ovrica, las clulas de Leydig, las clulas epiteliales del
timo y las clulas foliculares tiroideas (Penhoat y cols 1989,
Giudice 1992). Adems, la IGF-l inhibe directamente la secrecin
hipofisaria de GH, como ya vimos.Aparte de estas acciones sobre la
sntesis proteica, la IGF-l tambin interviene
en procesos de migracin quimiotctica de linfocitos T y de clulas
endoteliales, y en el reconocimiento celular por el sistema
inmunitario (Grant y cols 1987>.5.6. CONTROL DE LOS NIVELES
PLASMATICOS DE LAS IGFs. 5.6.1. IOF-l. it Hormonas. El controlador
principal de la produccin de IGF-l tanto en hgado como en
otros tejidos es la GH. La administracin de GH en animales de
experimentacin tanto normales como deficientes en GH aumenta los
niveles del ARNm de la IGF-l (Mathews y cols 1989). En sujetos
deficientes en GH existe una disminucin de los niveles de IGF-l que
rpidamente revierte al administrar GH exgena, mientras que
individuos acromeglicos presentan unos niveles circulantes de IGF-l
sumamente aumentados.No obstante, otras hormonas como los
esteroides sexuales, la insulina y las
hormonas tiroideas tambin estan implicadas en la regulacin de
los niveles circulantes de IGF-l. El cambio de los niveles
circulantes de los esteroides gonadales durante la pubertad puede
ser la causa del incremento de los niveles circulantes de
40
Introduccin IGF-l asociado al estirn puberal. En la diabetes los
niveles circulantes de esta
hormona estan disminuidos (Fagin y cols 1989).it
Estado nutricional.
El estado nutricional del organismo tambin juega un papel muy
importante enla fabricacin de IGF-l en el hgado, de tal forma que
en situaciones de desnutricin, pese a existir una secrecin normal
de OH, los niveles circulantes de IGF-l estan
disminuidos. Esta situacin se debe a que es necesaria una
entrada adecuada de caloras y aminocidos esenciales de la dieta
para la biosntesis heptica de IGF-l.
it
Edad. La IGF-l tambin depende de la etapa del desarrollo en que
se encuentre el
individuo. Los niveles plasmticos de esta hormona son bajos en
el pendo fetal y van aumentando tras el nacimiento hasta alcanzar
el mximo durante la pubertad, momento a partir de la cul los
niveles circulantes de IGF-l van disminuyendo de forma bastante
paralela a lo que ocurre con la secrecin de OH.5.6.2. IGF-ll. La
produccin de IGF-ll vara segn la etapa del desarrollo en la que
se
encuentre el individuo y adems es dependiente de factores
especficos del tejido en el que se sintetiza. Los niveles
circulantes y tisulares mximos de IGF-ll se alcanzan durante la
etapa fetal. Tras el nacimiento, los niveles plasmticos de IGF-ll
descienden y no se producen cambios durante la etapa puberal
(Widmer y cos1983).
En cuanto a la regulacin de la IGF-ll por factores hormonales es
muy diferente a la de IGF-l. La OH parece ser poco importante en
este proceso (Hynes y cols 1987> y los datos obtenidos al
respecto son contradictorios. As, los valores de la IGF-ll estan
disminuidos en el hipopituitarismo pero sin embargo no se aumentan
en la acromegalia (Widmer y cols 1983). Otras hormonas como los GC,
la hormona folculoestimulante (FSH), la hormona adrenocorticotropa
(ACTH) y la gonadotropina corinica tambin parecen intervenir en la
regulacin de los niveles de la IGF-ll (Daughaday y Rotwein
1989).
41
Introduccin
6. REGULACIN DE LA SECRECIN DE GH A LARGO PLAZO.Numerosos
trabajos han mostrado la eficacia de la GHRH administrada
exgenamente como estimulante de la liberacin de GH, por lo que
dicha forma de tratamiento se ha empleado como alternativa a la
administracin de GH. La mayora de los estudios se centran en el
control de la secrecin de GH por GHRH en perodos inferiores a 24 h,
mientras que la respuesta hipofisaria a la estimulacin prolongada
ms ala de este tiempo con dicho pptido hipotalmico ha sido poco
estudiada hasta el momento.Existen datos que describen la atenuacin
de la respuesta de GH
(desensibilizacin) tras la estimulacin de la hipfisis de forma
continua con GI-IRH durante 24 h, tanto en animales de
experimentacin (Wehrenberg y cols 1984a y1986b, Bilezikjian y cols
1986) como en el hombre (Losa y cols 1984, Vance y cols 1985,
Robinson y cols 1992). Esta circunstancia parece deberse al
descenso en el
nmero de receptores para GHRH en la hipfisis, alteraciones en
los mecanismos de transduccin de la seal al interior de la clula
somatotropa o al vaciamiento hipofisario de GH (Wehrenberg y cos
1986, Bilezikjian y cols 1986, Richardson y Twente 1988, Aleppo y
cols 1997). Se ha observado que la desensibilizacin de las clulas
somatotropas por accin de la GHRH puede ocurrir tambin tras la
administracin de este pptido durante largo tiempo (Hulse y cols
1986, Tresguerres y cols 1993, Devesa y Tresguerres 1996). Sin
embargo, hay datos en la bibliografa que no slo no describen dicho
fenmeno (Sartorio y cols 1986, Dubreuil y cols 1994) sino que
demuestran un aumento de la sensibilidad hipofisaria al tratamiento
prolongado con GHRH (Jansson y cols 1985a, Dubreuil y cols 1987).
Esta discrepancia de resultados depende de la forma de
administracin del pptido, as como de la dosis empleada (Kovacs y
cols 1994). Teniendo en cuenta que el proceso de crecimiento dura
vahos meses en la rata y varios aos en el hombre, es precisamente
la regulacin a largo plazo la que tiene verdadera importancia en
este fenmeno para poder buscar formas de tratamiento alternativas a
la GH, en los retrasos de crecimiento (Tresguerres y cols 1993) y
la posibilidad de utilizar GHRH sera muy importante si se conociera
realmente su mecanismo de control a largo plazo.
42
FIL L~YWWFIW~
Objetivos
Es bien conocido que la GHRH estimula y la SS inhibe la secrecin
de OH en la hipfisis, pero esto es vlido fundamentalmente a corto
plazo. Siendo el
crecimiento un proceso que dura meses en el animal de
experimentacin y aos en el hombre, nos interesaba saber como es
realmente la regulacin deleje somatotropo, responsable del control
de dicho proceso, a largo plazo. Segun esto, los objetivos que nos
fuimos marcando a lo largo de la realizacin de esta Tesis Doctoral
fueron los siguientes:
Investigar el rgimen de administracin de GHRH en la rata macho,
tanto normal como deficiente en OH, que fuera capaz de potenciar o
mantener la secrecinnormal de GH hipofisaria sin disminuir el
contenido glandular de esta hormona.
Al comprobar que la rata macho no pareca ser el modelo
experimental
idneo para nuestros estudios, nos planteamos estudiar si la rata
hembra, normal o deficitaria en GH, se comportaba de distinta forma
ante la administracin de GHRH.
G
Una vez constatado que la rata hembra presenta una mejor
respuesta a
nuestros tratamientos con GHRH, y dado que en este animal la SS
parece jugar un papel preponderante sobre la GHRH en la regulacin
de la GH, se rMantea estudiar el efecto de la administracin de SS
en combinacin con GHRH en ratas hembras normales y deficientes en
GH.
Con objeto de optimizar el modelo animal para nuestras
investigaciones, intentamos determinar la respuesta al tratamiento
con GHRH y ~ de un nuevoanimal de experimentacin: el cordero.Por
otra lado, basndonos en datos de nuestro grupo que mostraban cmo
diferentes tejidos glandulares son capaces de asumir parcialmente
funciones
hipofisarias cuando estan sometidos a la influencia de hormonas
hipotalmicas, nosplanteamos:
Estudiar la sntesis y secrecin de GH en tejidos
extrahipofisarios
sometidos a altas concentraciones locales de GHRH.
45
FIFIL
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Material y Mtodos
1. ANIMALES DE EXPERIMENTACIN.1.1. RATAS. Las ratas que se
utilizaron en los distintos experimentos que componen esta
Tesis Doctoral eran de la cepa Wistar y sus progenitores
procedian de InterfaunaHaran. Se mantuvieron en el animalario de la
Universidad Complutense de Madrid, con licencia n0 28079-15 ABC del
Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin, adecuado a las
normativas vigentes que rigen el uso de los animales
deexperimentacin. El rgimen luminoso fue de 12 h de luz
(8:00-20:00> y 12 h de oscuridad, la temperatura media de 222aC
y la humedad de 50 5 %. En los experimentos en los que los animales
fueron tratados neonatalmente,
la homogeneizacin inicial se hizo el primer o segundo da de
vida, dejando 8-10 animales por madre para que todos tuvieran
similares posibilidades de crecimiento ydesarrollo. Posteriormente
las cras se destetaron a los 22 das de vida,
homogeneizando de nuevo los animales segn el peso corporal con
7-8 animales por jaula desde los 21 hasta los 30 das de vida, a
partir de los cuales se dejaron 4-5 animales en cada jaula. Las
jaulas eran de policarbonato (Macrolon , Panlab, Barcelona); en el
casode los animales adultos las dimensiones de stas fueron
4&5x21.5x14.5 cm,
mientras que en el caso de las hembras preadas o con cras recien
nacidas fueronde 22x20x14.5 cm.
La alimentacin de las ratas madres durante el perodo de cra y de
las cras hasta los 30 das de vida consisti en pienso de cra A-03; a
partir de ese momento se les sumnistr pienso de mantenimiento A-04
(Panlab, Barcelona). En ambos casos, tanto la dieta como el agua de
bebida se administraron ad Iibitum.1.2. CORDEROS.
En los experimentos 6 y 7 se utilizaron corderos machos de raza
Merina, dedos meses de edad. Estos animales fueron mantenidos en
condiciones de
semiestabulacin en las instalaciones del Instituto Nacional de
Investigaciones Agrarias (CIT-INIA, Madrid), bajo condiciones
naturales de luz y humedad propias del mes de abril y con libre
acceso a la comida (Pienso compuesto Visan, Visan Industrias
Zootcnicas S.A., Madrid) y al agua de bebida.
49
Material y Mtodos
1.3. RATONES.
Para el estudio de la regulacin de la secrecin de GH en tejidos
extrahipofisarios (experimento 8), se utilizaron ratones hembras
normales de la cepa Ames de 1.5-2 meses de vida, criados en el
laboratorio del Dr. Bartke y mantenidosen el animalario de la
Facultad de Medicina de la Southem Illinois University en
Carbondale (Illinois>.El fotoperiodo en el que se mantuvieron
dichos ratones fue de 12 h de luz y 12 de oscuridad (6:30-18:30),
la temperatura de 221 0C y la humedad del 40 %. Se
colocaron 4-5 ratones por jaula. Las dimensiones de dichas
jaulas eran 30x15x15 cm. Al igual que las ratas, estos animales
tuvieron libre acceso al agua de bebida y lacomida (Tekland, Harlan
Spragle-Dawley Inc., Madison, Wisconsin>.
Todos los experimentos se llevaron a cabo teniendo en cuenta las
normativas existentes sobre el manejo de animales de
experimentacin.
2. MTODOS DE SEGUIMIENTO DE LOS ANIMALES.2.1. PESO CORPORAL. Las
ratas se pesaron con una balanza Schoehnle, con un error de 1 g
en
pesos inferiores a 320 g y de 2 g desde 320 hasta 1000 g. En el
caso de los corderos el peso se control utilizando una balanza
Tru-Test AG 500-0.1, versin 3.0.2.2. MEDIDA DE LA LONOITUD TIBIAL
POR MICROKNEMOMETRA.
La microknemometra es una tcnica no invasiva de reciente
aplicacin que
permite una medida muy exacta de la longitud de la tibia en
ratas conscientes. El aparato con el que se desarroll la citada
tcnica se denomina Microknemmetro, y ha sido diseado por el Dr.
Hermanussen y fabricado por el Dr. Fahrentholz en Kiel (Alemania).
El error de la medida es de 100 gm (Hermanussen y cols 1995). En
nuestros estudios se emple dicha tcnica para controlar el
crecimiento diario tibial.2.2.1. Caractersticas del
Microknemmetro.
El microknemmetro es un gonimetro digital conectado a una
pantalla electrnica y compuesto por dos brazos articulados,
terminados en unos enganches
metlicos. Estos enganches tienen forma de anillo, de manera que
el superior abarca la rodilla del animal y el inferior recoje el
taln, produciendo una fijacin temporal de la tibia durante el
tiempo que dura la medida del hueso. Entre los dos brazos del50
Material y Mtodos gonimetro se encuentra un muelle que ejerce
una presin constante sobre la pata de la rata de aproximadamente
2.5 Newtons (figura 12).
1~.Muelle Brazos
electrnica
Dedos del observador
=f{Valor unidades arbitrarias 10193)Frmula 1.
, segn el mtodo que se viene utilizando en el Departamento de
Fisiologa desde hace ms de 20 aos. La rata estaba levemente
anestesiada con ter. Los corderos utilizados en los diseos
experimentales 6 y 7 tambin fueron sometidos a pruebas de estmulo,
administrndoseles de forma m.v. 125 ~g GHRH/cordero. Se extrajo
sangre de la yugular externa antes de la administracin de GHRH y a
los 10, 20 y 30 minutos tras la inyeccin del estmulo, con una
jeringa baada en EDTA-salino y con el animal consciente.
52
Material y Mtodos
3. TCNICAS QUIRRGICAS.3.1. IMPLANTACIN DE MINIBOMBAS
OSMTICAS.
Las minibombas osmticas utilizadas para la administracin de GH
en los experimentos 1 y 2, eran Alzet modelo 2001 (Alza
Corporation, Palo Alto, California) de 3 cm de longitud y 0.7 cm de
dimetro. Se implantaron debajo d la piel colocando la rata,
anestesiada con ter, boca abajo y haciendo una leve incisin dorsal
con unas tijeras en la piel, entre el omplato y la lnea media. A
continuacin y con ayuda de unas pinzas se abri el hueco suficiente
para introducir la minibomba en el tejido subcutneo y finalmente se
cosi la piel con seda. En el experimento 7 realizado en corderos,
se emplearon minibombas osmticas Alzet modelo 2ML4, de 5.1 cm de
longitud y 1.4 cm de dimetro. Se colocaron de forma s.c. en el lomo
del cordero, para lo cual en el animal previamente anestesiado con
xilocana se realiz una incisin de unos 2 cm con unas tijeras a
nivel del omplato. Luego se abri un pequeo hueco bajo la piel en el
que sedeposit la minibomba, y a continuacin se cerr el tejido con
grapas. 3.2. IMPLANTACIN DE PELLETS.
Los pellets, fabricados por Innovative Research of America
(Toledo, Ohio>, y del tamao de una pastilla de 0.3 mm de
dimetro, estaban compuestos de una matriz biodegradable que
proporciona una liberacin continua y eficaz del producto activo,
GHRH en nuestro caso. En el experimento 5, medio pellet se coloc
subcutneamente en la parte dorsal del animal, procediendose de
manera similar a la implantacin de las minibombas. En la rata,
previamente anestesida con ter, se realiz un pequeo corte
dorsolateral en la piel, se abri hueco con unas pinzas, se
introdujo el pellet y se cerr con seda la apertura originada. En el
caso de los corderos, utilizando un trocar se realiz un pequeo
hueco detrs de la oreja derecha en el que se deposit un pellet
entero con ayuda de unas pinzas, cerrndose a continuacin la piel
con grapas. Durante el tiempo que dur esta operacin el animal
permaneci despierto y consciente. Para la implantacin de un cuarto
de pellet en el interior de la glndula submaxilar en el experimento
8, en los ratones anestesiados con ter se hizo un corte
longitudinal en la piel y el tejido conjuntivo subyacente para
dejar accesibles ambas glndulas. Sobre la glndula derecha se realiz
una pequea incisin rompiendo interiormente el tejido glandular, y
se deposit el trozo de pellet en el hueco
53
Material y Mtodos
producido, cerrndose a continuacin con catgut de tal forma que
el pellet quedaba embebido en la glndula. Finalmente se colocaron
los tejidos en su posicin original y se cosi la piel con seda. En
los tres casos, a los animales control se les implant un pellet de
placebo, procediendo de la misma forma que con el pellet de
GHRH.
4. TRATAMIENTOS FARMACOLGICOS.4.1. TRATAMIENTO NEONATAL CON
GLUTAMATO MONOSDICO.
El tratamiento neonatal con Glutamato Monosdico (GMS> (Sigma
Chemical Co. St. Louis, Missouri) se realiz en dias alternos,
durante los 10 primeros das de vida de la rata. La dosis diaria que
se administr fue de 4 mglg peso corporal, en una sla inyeccin s.c.
Se prepar una solucin stock con una concentracin de 0.5 mg/pi,
diluyendo 5 g de GMS en 10 ml de solucin salina e inyectndose el
volumen necesario hasta conseguir la dosis apropiada.
4.2. GHRH.
La GHRH utilizada en todos los experimentos fue la misma que en
las pruebas de estmulo, esto es, el pptido sinttico GHRH 1-29. La
dosis, la pauta y la frecuencia de administracin de dicho frmaco
vari segn el diseo experimental. Tanto para las inyecciones como
para las minibombas osmticas, la GHRH se disolvi en solucin salina,
hasta alcanzar la dosis necesaria. En el caso de los experimentos 1
y 2, 5 mg de GHRH se disolvieron en 300 j.il de suero salino que se
introdujeron dentro de cada una de las minibombas con ayuda de una
jeringa a travs de un pequeo orificio existente en uno de los
extremos, de tal forma que con un flujo de liberacin de 1 gl/h, la
minibomba proporcionaba 400 ~gde GHRH al da. Para los corderos del
diseo experimental 7, en cada minibomba se introdujeron 30 mg de
GHRH disueltos en 2 ml de solucin salina. El flujo de liberacin de
estas bombas era de 2.3 gl/h, por lo que cada cordero reciba 900
gg/da.Los pellets que se colocaron en las ratas y los corderos
contenan 25 mg de
GHRH liofilizado, dentro de una matriz biodegradable, cantidad a
liberar en un total de 21 das. En el caso de los ratones los pellet
eran de 5 mg para un total de dosmeses.
54
Material y Mtodos
4.3. SOMATOSTATINA.
La SS que se utiliz en los distintos estudios realizados durante
el desarrollo de esta Tesis Doctoral fue de 2 tipos: de corta y de
larga duracin. La SS de larga duracin fue Sandostatn (Octreotide,
DCI), de Laboratorios Sandoz (Barcelona>. En el caso de las
ratas, cada animal recibi una dosis diaria de 2 ~g, mientras que en
los corderos la dosis administrada fue 10 veces superior, esto es,
20 ~.tg/animal/da. producto activo vena ya en forma lquida, por lo
que se El inyect directamente desde el envase. Se utiliz Somiatn ,
de Laboratorios Serono, como SS de corta duracin. Este frmaco es un
decapptido de sntesis, idntico a la hormona natural, que viene
presentado en viales de 250 ~xg forma de liofilizado. Para su
utilizacin en las en ratas, se reconstituy en 500 pi de suero
salino y la dosis administrada fue de 100 >g/inyeccin,mientras
que en el caso de los corderos, se emple 1 ml para disolver cada
vial, y la dosis fue de 250 gglinyeccin.
5. SACRIFICIO DE LOS ANIMALES. PROCESAMIENTO DE LAS
MUESTRAS.
RECOGIDA
Y
Al final de cada uno de los estudios, las ratas se sacrificaron
por decaptacin con una guillotina, sin anestesia previa, e
inmediatamente despus se recogieron el hipotlamo, la hipfisis y la
sangre troncular. Los ratones fueron primero anestesiados con ter
para tomrseles sangre directamente del corazn por puncin cardada. A
continuacin se procedi a la diseccin de las glndulas submaxilares,
y finalmente fueron decapitados. Tras finalizar los estudios con
los corderos, stos fueron sacrificados en el Matadero de GYPISA
(Pozuelo de Alarcn, Madrid>. Inmediatamente tras la decapitacin
se tomaron el hipotlamo y la hipfisis.5.1. OBTENCIN DE SANGRE.
La sangre troncular recogida tras la decapitacin de las ratas,
la sangre de los ratones obtenida por puncin cardaca, y la sangre
obtenida tras las pruebas de estmulo con GHRH en las ratas y los
corderos se deposit en tubos de propileno con EDTA-salino (2% de
ECTA (Sigma) en suero salino 0.15 M), enfriados en hielo. A
continuacin esta sangre se centrifug a 3000 rpm durante 10 minutos
a 40C en una
55
Material y Mtodos
centrfuga Beckman, Modelo TJ-6. El sobrenadante se decant y se
mantuvo congelado a 200C hasta su anlisis. 5.2. HIPOTLAMO. Para la
extraccin del hipotlamo medio basal tanto en la rata como en el
cordero, primeramente se abri el crneo dejando expuesto el cerebro.
Este se levant con unas pinzas, y tras reconocer el hipotlamo, se
tom cortndolo rostralmente al quiasma ptico, caudalmente por detrs
de los cuerpos mamilares y lateralmente al surco hipotalmico, hasta
el nivel de la comisura anterior. Esta diseccin incluy la eminencia
media y el ncleo arcuato. Una vez extrado el hipotlamo, se congel
inmediatamente en nieve carbnica, para ser conservado a 800C hasta
el momento de su estudio. El hipotlamo se proces homogeneizando el
tejido por ultrasonidos (Branson Sonifier 450) en 1 ml de una
solucin de cido actico 2 M en el caso de las ratas o en 20 ml del
mismo compuesto en el caso de los corderos. Seguidamente se hirvi
el homogeneizado duranteS minutos, y se centrifug 30 minutos a
17000 rpm a 40C, en una centrfuga Beckman Modelo J2-MC. Tras esto
se obtuvo un sobrenadante del que se hicieron diferentes alcuotas
que fueron liofilizadas (Liofilizador Benchtop 3 L. Virtis. The
Virtis Company Inc. Gardiner. Nueva York) y congeladas
![001 .253.0 ACROMEGALIA E GIGANTISMO · 001.253.0 ACROMEGALIA E GIGANTISMO Prestazioni: frequenza 89.01 90.11.4 90.35.1 ORMONE SOMATOTROPO (GH) [P/U] 91.49.2 PRELIEVO DI SANGUE VENOSO](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/5f1402ae8670852560421cc1/001-2530-acromegalia-e-gigantismo-0012530-acromegalia-e-gigantismo-prestazioni.jpg)
