Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob ......Slika 1-1: Značilnosti glive. Znano je, da če so gobe prave vrste, so gojene na pravi temperaturi in vlaţnosti

Andreja Horvat

Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst

gob družine Polyporaceae (luknjarke)

Diplomsko delo

Maribor, 2016

Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst

gob družine Polyporaceae (luknjarke)

Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje

Študentka: Andreja Horvat

Študijski program: univerzitetni študijski program I. stopnje Kemijska

tehnologija

Predvideni strokovni naslov: diplomirana inženirka kemijske tehnologije (UN)

Mentor: prof. dr. Željko Knez

Somentor: dr. Andrej Gregori

Somentorica: Darija Cör, uni. dipl. inž. kem. teh.

Maribor, 2016

Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob druţine Polyporaceae (luknjarke)

I

Kazalo

Kazalo ........................................................................................................................................ I

Seznam tabel ........................................................................................................................... III

Seznam slik ............................................................................................................................. IV

Izjava........................................................................................................................................ V

Zahvala ................................................................................................................................... VI

Povzetek ................................................................................................................................ VII

Abstract ................................................................................................................................ VIII

Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................ IX

1 Uvod .................................................................................................................................. 1

2 Metode dela in materiali .................................................................................................... 3

2.1 Polyporaceae .............................................................................................................. 4

2.1.1 Dlakava slojevka (Stereum hirsutum) ................................................................. 5

2.1.2 Dišeča tramovka (Gleophyllum odoratum) ........................................................ 5

2.1.3 Bukova kresilka (Fomes fomentarius) ................................................................ 6

2.1.4 Pisana ploskocevka (Trametes versicolor) ......................................................... 7

2.1.5 Sploščena pološčenka (Ganoderma applanatum) .............................................. 7

2.1.6 Smrekova kresilača (Fomitopsis pinicola) ......................................................... 8

2.1.7 Grbasta ploskocevka (Trametes gibbosa) ........................................................... 8

2.1.8 Kosmata ploskocevka (Trametes hirsuta) .......................................................... 9

2.1.9 Lekarniška macesnovka (Laricifomes officinalis) ............................................ 10

2.1.10 Brezova odpadljivka (Piptoporus betulinus) .................................................... 10

2.2 Antioksidanti ............................................................................................................ 11

2.3 Ekstrakcija trdno – tekoče ........................................................................................ 13

2.4 Transesterifikacija .................................................................................................... 14

2.5 Plinska kromatografija ............................................................................................. 19

3 Eksperimentalni del ......................................................................................................... 20

3.1 Laboratorijski pribor, aparature in kemikalije ......................................................... 20

3.2 Priprava materiala .................................................................................................... 21

3.3 Klasična ekstrakcija (CE) s heksanom ..................................................................... 21

3.4 Biološka analiza ekstraktov ..................................................................................... 22

3.5 Kemijska analiza ekstraktov .................................................................................... 23


II

4 Rezultati in diskusija........................................................................................................ 26

4.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolov....................................................................... 27

4.2 Določanje AOA z radikalsko metodo (DPPH) ....................................................... 28

4.3 Določevanje vsebnosti MK ...................................................................................... 29

5 Zaključek ......................................................................................................................... 32

6 Literatura.......................................................................................................................... 33

7 Priloge .............................................................................................................................. 36

7.1 Priloga 1 ................................................................................................................... 36

7.2 Priloga 2 ................................................................................................................... 38

7.3 Priloga 3 ................................................................................................................... 40

7.4 Priloga 4 ................................................................................................................... 42

7.5 Priloga 5 ................................................................................................................... 43

7.6 Priloga 6 ................................................................................................................... 44


III

Seznam tabel

Tabela 2-1: Klasifikacija Polyporaceae .................................................................................... 4

Tabela 2-2: Najpogostejše nasičene MK ................................................................................ 17

Tabela 2-3: Najpogostejše nenasičene MK prisotne v naravi ................................................ 17

Tabela 4-1: 10 zdravilnih gob druţine Polyporaceae in rezultati analiz ................................ 26

Tabela 7-1: Vrste gob druţine Polyporaceae .......................................................................... 36

Tabela 7-2: Izkoristki ekstrakcij ............................................................................................. 38

Tabela 7-3: Masa vzorcev za analizo in vlaga ........................................................................ 40

Tabela 7-4: Inhibicija DPPH .................................................................................................. 42

Tabela 7-5: Vsebnosti celokupnih fenolov ............................................................................. 43

Tabela 7-6: Deleţ MK v esktraktih, pridobljenih s CE s heksanom ...................................... 44


IV

Seznam slik

Slika 1-1: Značilnosti glive ....................................................................................................... 1

Slika 2-1: Dlakava slojevka ...................................................................................................... 5

Slika 2-2: Dišeča tramovka ....................................................................................................... 6

Slika 2-3: Bukova kresilka ........................................................................................................ 6

Slika 2-4: Pisana ploskocevka................................................................................................... 7

Slika 2-5: Sploščena ploščenka ................................................................................................. 8

Slika 2-6: Smrekova kresilača................................................................................................... 8

Slika 2-7: Grbaste ploskocevke ................................................................................................. 9

Slika 2-8: Kosmate ploskocevke ............................................................................................... 9

Slika 2-9: Lekarniška macesnovka ......................................................................................... 10

Slika 2-10: Brezova odpadljivka ............................................................................................. 11

Slika 2-11: Reakcija prostega radikala DPPH z antioksidantom ............................................ 12

Slika 2-12: Ekstrakcijska naprava ........................................................................................... 13

Slika 2-13: Shema ekstrakcije trdnih substanc ....................................................................... 14

Slika 2-14: Transesterifikacija triglicerida z alkoholom ......................................................... 15

Slika 2-15: Razlika med nasičenimi in nenasičenimi MK ...................................................... 16

Slika 2-16: Shematski prikaz GC ............................................................................................ 19

Slika 3-1: Klasična ekstrakcija ................................................................................................ 22

Slika 3-2: Mešanica; zgornja faza: heksan z raztopljenimi MK ............................................. 24

Slika 4-1: Vsebnost celokupnih fenolov ................................................................................. 27

Slika 4-2: Odstotek inhibicije DPPH v ekstraktih (% SD) .................................................. 28

Slika 4-3: Deleţ MK v ekstraktih trosnjakov Polyporaceae ................................................... 30

Slika 4-4: Deleţi MK v smrekovi kresilači ............................................................................. 31


V

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledala sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:

Vir: Science Direct (http://www.sciencedirect.com/)

Gesla: Število referenc

Polyporaceae AND antioxidants AND health 84

Polyporaceae AND fatty acids AND gas chromatography 31

Vir: COBISS/OPAC (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid, COBIB.SI)

Gesla: Število referenc

Luknjarke 2

Maščobne kisline IN plinska kromatografija 40

Polyporaceae 6

Trosnjaki 9

Skupno število pregledanih člankov: 23

Skupno število pregledanih knjig: 14

Maribor, avgust 2016 Andreja Horvat


VI

»Nikoli ne smemo obupati nad našimi sanjami in upanji. Resda

zna biti pot kamnita in zavita, toda svet pričakuje tisti poseben

prispevek, za katerega je bil rojen vsak od nas.«

Marilyn Johnson Kondwani

Zahvala

Zahvaljujem se mentorju, red. prof. dr. Ţeljku Knezu, ki mi je

omogočil opravljanje eksperimentalnega dela v laboratoriju za

separacijske procese in produktno tehniko na Fakulteti za kemijo

in kemijsko tehnologijo ter za strokovno pomoč in trud pri

izdelavi moje diplomske naloge.

Izredna zahvala gre tudi somentorici Dariji Cör, uni. dipl. inţ.

kem. teh., za vse nasvete, prijaznost, potrpeţljivost, dostopnost

in vso pomoč pri eksperimentalnem delu.

Prav tako gre zahvala dr. Andreju Gregoriju in Antonu Sokliču,

ki sta priskrbela gobe iz različnih lokacij po Sloveniji, jih

fotografirala ter identificirala.

Iskrena hvala moji druţini in prijateljem, ki so me podpirali,

spodbujali in mi stali ob strani.

Hvala vam,

Andreja


VII

Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob družine Polyporaceae

(luknjarke)

Povzetek

Glavni namen diplomske naloge je bil pridobitev in analiza biološko aktivnih spojin

ekstrakta iz različnih vrst gob druţine Polyporaceae (luknjarke). Osredotočali smo se na več

vrst različnih gob, nabranih na različnih lokacijah po Sloveniji, na različnih vrstah plodišča

ter različni nadmorski višini. Primerjali smo vpliv ţivljenjskega prostora določene vrste na

izkoristek ekstrakcije ter vsebnost maščobnih kislin (MK).

Raziskali smo, kakšni so izkoristki () klasične ekstrakcije (CE) s heksanom, sledila je

karakterizacija ekstraktov glede na tip MK s pomočjo plinske kromatografije (GC). Opravili

smo 31 CE različnih gob iz omenjene druţine. Od tega smo analizirali 10 vrst tistih, ki se

nahajajo v Sloveniji najpogosteje in kaţejo različne zdravilne učinke. Iz pridobljenih

ekstraktov smo določali tudi vsebnost celokupnih fenolov in antioksidativno aktivnost

(AOA) z DPPH metodo, kjer smo določali vsebnost biološko aktivnih snovi (fenolov,

polisaharidov in proteinov).

Pripravki iz raznih zdravilnih gob (sirupi, kapsule, čaji, oljni ekstrakti) uničujejo viruse in

bakterije, izboljšajo prebavo, pomagajo pri alergijah ter premagovanju stresa in so

učinkovita pomoč pri zdravljenju okuţb, grip, sladkornih bolezni, bolezni srca. Mnoge gobe

zaradi svoje antioksidativnosti in velike vsebnosti polisaharidov, triterpenov ter drugih

zdravilnih sestavin pomagajo v boju proti raku, izločajo strupene snovi iz organizma, krepijo

imunski sistem in razstrupljajo telo, uravnavajo raven holesterola, zniţujejo krvni tlak in

koncentracijo maščob v krvi, pripomorejo pa tudi k boljšemu počutju.

Ugotovili smo, da so ekstrakti bogati z MK, fenoli in drugimi spojinami, ki so zelo dobri

lovilci prostih radikalov. Rezultati prikazujejo zelo nizke odstotke inhibicije prostega

radikala DPPH, zato lahko trdimo, da MK niso tako dobri antioksidanti kot nekatere fenolne

spojine (FS).

Ključne besede: Polyporaceae, trosnjaki, klasična ekstrakcija, maščobne kisline,

transesterifikacija, plinska kromatografija, antioksidanti.

UDK: 543.544.3:615.334(043.2)


VIII

Extraction of biologically active compounds from Polyporaceae (bracket

fungi)

Abstract

The main purpose of this thesis was to obtain and analyze the biologically active compounds

from the extracts of different types of Polyporaceae family mushrooms. We focused on

several different types of mushrooms gathered at various locations across Slovenia, on

various types of fruiting bodies and different altitudes. We compared the influence of certain

types of habitat on the efficiency of extraction and fatty acid content (FA).

We tried to explore the efficiency () of conventional extraction (CE) with hexane, followed

by the characterization of the extracts according to the type of FA by gas chromatography

(GC). We performed 31 CE on different mushrooms from the aforementioned family. Out of

these 31, we analyzed 10 of the species most commonly found in Slovenia, which were

showing various healing effects. We determined the total phenolic content and antioxidant

activity using the DPPH

method, where we researched the amount of biologically active

substances (phenols, polysaccharides and proteins).

The preparations made from various medicinal mushrooms (syrups, capsules, teas, oil

extracts) help battle viruses and bacteria, improve digestion, help with allergies and

overcoming stress and are very effective in the treatment of infections, influenza, diabetes,

heart disease. Due to their antioxidant activities and the high levels of polysaccharides,

triterpenes and other active ingredients, many mushrooms help in the fight against cancer;

they also help remove toxins, strengthen the immune system and detoxify the body, regulate

cholesterol levels, lower blood pressure and levels of lipids and improve the general well-

being.

We concluded that the extracts were rich in FA, phenols and other compounds that are

excellent free radical scavengers. The results show a very low percentage of the DPPH

free

radical inhibition. Consequently, we can claim that the FA do not have as many antioxidative

properties as some phenolic compounds.

Key words: Polyporaceae, fruiting bodies, classical extraction, fatty acids,

transesterification, gas chromatography, antioxidants

UDK: 543.544.3:615.334(043.2)


IX

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli

A absorbanca [/]

m masa [g]

V volumen [L]

t čas [min]

T temperatura [°C]

w masni deleţ [mg/g]

q pretok [ml/min]

Grški simboli

izkoristek [%]

omega [/]

valovna dolţina [nm]

masna koncentracija [g/l]

Kratice

AOA antioksidativna aktivnost (ang.: antioxidant activity)

CE klasična ekstrakcija (ang.: classical extraction)

DPPH prosti radikal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil

EMK esencialne maščobne kisline (ang.: essential fatty acid)

FAME metilni estri maščobnih kislin (ang.: fatty acids methyl esters)

FC Folin-Ciocalteu reagent

FID plamensko ionizacijski detektor

FS fenolne spojine

GA galna kislina

GC plinska kromatografija (ang.: gas cromatography)

GC-MS/FID plinska kromatografija z masno spektroskopijo s plamensko ionizacijskim

detektorjem

H2O voda

MeOH metanol


X

MF mobilna faza

MK maščobne kisline (ang.: fatty acid - FA)

MS masni spektrometer

MUFA mononenasičene MK (ang.: monounsaturated fatty acids)

SD standardna deviacija

SF stacionarna faza

SFA nasičene MK (ang.: saturated fatty acids)

PUFA polinenasičene MK (ang.: polyunsaturated fatty acids)


1

1 Uvod

Gobe spadajo v izredno veliko kraljestvo gliv, ki rastejo nad zemljo iz micelija, katerega

sestavljajo prepletene nitke, imenovane hife. [1] Razmnoţujejo se spolno ali nespolno s trosi.

Ko so trosi zreli, jih veter raznaša iz trosnjakov, ob ustrezni vlagi in toploti pa se na plodišču

razvijejo iz podgobja v trosnjak oziroma gobo. Glive so heterotrofni organizmi, ki nimajo

klorofila, da bi si iz CO2 in H2O pod vplivom sončne svetlobe proizvajali sami svojo hrano,

zato so odvisne od drugih organizmov. Največkrat jih najdemo na odmrlih rastlinah, ki jih

razgradijo. [2]

Slika 1-1: Značilnosti glive.

Znano je, da če so gobe prave vrste, so gojene na pravi temperaturi in vlaţnosti ter pravi

podlagi, lahko vsebujejo ogromno hranil in mnogo zdravilnih učinkov. Sveţa goba je

vsebuje velik deleţ vode (do več kot 90 %), beljakovin (od 1,5 do 5 %), maščobnih kislin

(0,3 %), ogljikovih hidratov (3,6 %), prav tako pa so bogate z vitamini (B1, B2, B3, E, D, K)

in rudninskimi snovmi (kot so P, K, Zn, Cu, Fe, Na, Ca…). [3] Zaradi vseh teh sestavin so ţe

starodavna ljudstva cenila vrednost gob in so bili mnenja, da so gobe »rastline nesmrtnosti«.

[4]


2

Dandanes zdravilne gobe uporabljamo kot razna prehrambena dopolnila ali kot zdravila v

obliki sirupov, tablet, kapsul, juh ter čajev. Dokazano je, da imajo gobe ogromno

visokomolekularnih in zapletenih zdravilnih spojin (polisaharidi, triterpenoidi), ki krepijo

imunski sistem, zavirajo nastanek rakavih celic in ščitijo telo pred bakterijskimi in virusnimi

infekcijami. Polisaharidi so namreč po velikosti in teţi zelo podobni bakterijskim celicam,

zato telo reagira z ustvarjanjem protiteles. Gobe vsebujejo ogromno polisaharida po imenu

hitin, ki ga ljudje teţko prebavimo, zato moramo gobe pred zauţitjem prekuhati. Triterpeni

so po zgradbi podobni steroidnim hormonom, ki nam najbolj pomagajo pri premagovanju

stresa. [5] Novejše raziskave so v medicinskih gobah razkrile tudi ogromno antioksidantov

(fenoli, amini) in adaptogenih učinkovin, ki izboljšajo odpornost telesu, uravnavajo raven

holesterola, zniţujejo krvni tlak in koncentracijo maščob v krvi, pripomorejo pa tudi k

boljšemu počutju. Gobe so zaradi svoje posebne celične zgradbe kljub visoki vsebnosti vode

teţko prebavljive, zato jih ne smemo pojesti preveč. [6]

V diplomskem delu smo poskušali raziskati, kakšni so izkoristki ekstrakcije trosnjakov gob z

organskim topilom. V ta namen smo izvedli klasično ekstrakcijo (CE) z organskim topilom

(n-heksan), sledila pa je karakterizacija ekstraktov glede na tip maščobnih kislin (MK) s

pomočjo plinske kromatografije (GC).


3

2 Metode dela in materiali

Za analizo in izdelavo diplomske naloge smo potrebovali različne tehnike in instrumente.

Dr. Andrej Gregori in Anton Soklič sta nabrala, fotografirala ter identificirala več vrst gob iz

druţine Polyporaceae. Imena vseh nabranih in identificiranih gob so zbrana v prilogi 1 v

tabeli 7-1. Fotografije izbranih vrst so prikazane na slikah od 2-1 do 2-10.

Nabrane gobe smo pred ekstrakcijo ustrezno posušili ter nato zmleli do določene velikosti

delcev. Zmleti kosi gob niso smeli biti prefini, saj bi se le-ti lahko povezali v večje delce, ki

bi bili neprepustni za topilo. Izvedli smo CE pri temperaturi vrelišča topila (n-heksan) (T =

69 °C). Goščo smo prefiltrirali, ekstrakt pa uparili.

Na razpolago smo imeli 31 različnih vrst gob, ki smo jih ekstrahirali. Od tega smo desetim

gobam, ki so znane po svojih zdravilnih učinkih, določali antioksidativno aktivnost (AOA) z

radikalsko metodo, vsebnost fenolov in vsebnost MK. Zatehtali smo okrog 5 g materiala in

mu dodali 100 ml topila (v razmerju 1:20). Izračunali smo ekstrakcij, ki so natančneje

prikazani v prilogi 2. Iz pridobljenih ekstraktov smo si pripravili vzorce za analizo s GC, s

pomočjo katere smo določevali MK. Podrobnejši rezultati izračunov vseh gob so zbrani v

prilogah 2 in 3.

Vse metode smo izvedli v laboratoriju za separacijske procese in produktno tehniko na

Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerze v Mariboru.

Laboratorijske metode:

mletje materiala

klasična ekstrakcija (CE)

uparjanje

transesterifikacija

plinska kromatografija (GC)

radikalska metoda


4

2.1 Polyporaceae

Trosnjaki heterogene druţine Polyporaceae (luknjarke), prikazani v prilogi 1, so zelo

razširjeni po celotni Evropi. Gre za veliko vrst gob, ki so različnih oblik in velikosti.

Nahajajo se na drevesnih deblih, vejah ali tleh, kjer preţivijo več mesecev ali let. [2] Telesa

trosnjakov so poličaste ali klasične oblike s klobukom in betom, ki štrlijo kot izrastki na

drevesu ali pa so pritrjena na podlago. Trosovnice so iz majhnih luknjic ali cevk in so

običajno bele ali rumene barve. Njihova naloga je razmnoţevanje in razširjanje trosov, ki se

nahajajo v luknjicah na spodnji strani klobuka. [7]

Gobe imajo običajno kratko ţivljenjsko dobo, vendar se lahko najdejo tudi vrste gob, katerih

trosnjaki preţivijo več let. Večina luknjark je gniloţivk (saprofiti), kar pomeni, da dobijo

hrano iz mrtvih organizmov tako, da razgradijo organske snovi, presnovne produkte pa nato

vsrkavajo. Paraziti (zajedavske glive) rastejo na ţivih drevesih, jih zajedajo in povzročajo

odmiranje. [1]

Klasifikacija Polyporaceae je prikazana v tabeli 2-1, vrste luknjark pa najdemo v prilogi 1.

Tabela 2-1: Klasifikacija Polyporaceae. [8]

Luknjarkam so ţe v preteklosti pripisovali zdravilno moč, saj so le-te predstavljale naravna

zdravila, brez ali z redkimi nezaţelenimi stranskimi učinki. Zaradi velike vsebnosti

zdravilnih sestavin so proizvajale antitumorske in zaviralne snovi ter spodbujale rast novih

zdravih celic, prav tako pa bi naj pripomogle k boljšemu počutju. Kljub svojim zdravilnim

učinkom je zelo malo gob te druţine uvrščenih med uţitne, predvsem zaradi njihove trde

konsistence ter grenkega okusa. V nadaljevanju je opisanih nekaj gob, ki so znane po svojih

zdravilnih učinkih.

Znanstvena klasifikacija

Kraljestvo: Fungi (glive)

Deblo: Basidiomycota (prostotrosnice)

Razred: Agaricomycetes (listarice)

Red: Polyporales (luknjičarji)

Druţina: Polyporaceae (luknjarke)


5

2.1.1 Dlakava slojevka (Stereum hirsutum)

S. hirsutum je neuţitna gniloţivka, ki jo najdemo na odmrlih listnatih drevesih (zlasti na

hrastu) v vseh letnih časih. Ima polkroţno, pahljačasto obliko s tankimi, proţnostnimi

klobuki. Premer trosnjaka se giblje med 3 in 10 cm. [7] Na površini se menjavajo ţametni

koncentrični pasovi različnih barv, spodnja stran klobuka pa je gladka z valovitim robom,

običajno rumene barve. Barva trosnega prahu je bela. [9]

Pri ocenjevanju bioaktivnih spojin so odkrili, da je micelij S. hirsutum v ustreznih

koncentracijah lahko dobro funkcionalno ţivilo, saj deluje antimikrobno. [10]

Slika 2-1: Dlakava slojevka.

2.1.2 Dišeča tramovka (Gleophyllum odoratum)

G. odoratum ima blazinaste, poličaste izrastke na osušenih lesnih delih iglavcev čez vso leto,

široke vse do 20 cm in debele 2–5 cm. Klobuk je temno rjave barve z rumenim robom.

Trosovnico sestavljajo majhne luknjice s trosi bele barve. Značilna je po prijetnem vonju po

pomarančah, vendar je neuţitna. [2]

Izvleček iz G. odoratum je dober antioksidant in deluje kot inhibitor, ki deaktivira delovanje

rakavih celic in encimov, kot so: trombin, tripsin, cistein-proteaza. Izolirani triterpeni

zmanjšujejo verjetnost tromboze. [11]


6

.

Slika 2-2: Dišeča tramovka.

2.1.3 Bukova kresilka (Fomes fomentarius)

Trdo telo neuţitne bukove kresilke je poličaste oblike, premera 5–50 cm in zajeda ţiva

listnata drevesa (predvsem bukev in brezo). Površina trosnjaka je običajno sive barve, lahko

je pa tudi belkasta ali svetlo rumena. Rjavo, ţilavo meso s svetlimi, podolgovatimi porami

ima neprijeten vonj po sadju in oster okus. [2, 7]

Ţe od nekdaj je znano, da se je njene trosnjake uporabljalo v različne namene. V zdravstvu

se jih je uporabljalo za zdravljenje vraslih nohtov, celjenje ran, zaustavljanje krvavitev pri

operacijah, pomirjanje ţivčnega sistema in krepitvi odpornosti telesa, notranjost gobe pa je

bilo uporabno tudi za izdelavo oblačil in podobnih izdelkov (torbe, kape) ali pa za

prenašanje ţerjavice. [9, 12] Ekstrakti odlično delujejo tudi v boju proti tumorjem in pri

preprečevanju zunanjih vnetij. [13]

Slika 2-3: Bukova kresilka.


7

2.1.4 Pisana ploskocevka (Trametes versicolor)

T. versicolor uspeva kot saprofit na odmrlih deblih listnatih dreves v obliki tankih poličastih

klobukov, ki spreminjajo barvo (modra, zelena, rdeča). Klobukovo meso je belo, ţilavo, brez

posebnega vonja in okusa, rob klobuka pa je ščetinast. [7] V Sloveniji je ploskocevka ena

najbolj raziskanih zdravilnih gob. [2]

Zaradi lepega modrega odtenka ploskocevke večkrat uporabljajo za okraske in aranţmaje.

[9] Kitajska ljudstva so jo posušeno ţe od nekdaj uporabljala za zdravljenje pljuč in dihal,

goba pa koristi tudi kot antibiotik. [12] Zaradi velike vsebnosti polisaharidov (PSP in PSK)

ima visoko stopnjo zaviranja rasti rakavih celic, hkrati pa krepi obrambno sposobnost telesa.

[10, 13, 14]

Slika 2-4: Pisana ploskocevka.

2.1.5 Sploščena pološčenka (Ganoderma applanatum)

G. applanatum uspeva kot gniloţivka na drevesnih panjih ali odmrlih deblih v listnatih

gozdovih. Rjav klobuk je ploščate polkroţne oblike z olesenelim mesom, ki ima grenak

okus. Na spodnji strani klobuka je vrsta drobnih luknjic, ki prekrivajo belo trosovnico.

Trosni prah je rjavi. [7]

Imenujejo jo tudi »slikarska goba«, saj ob dotiku bela trosovnica na spodnji strani trosnjaka

spremeni barvo v temno rjavo. [9] Tudi ta goba izboljšuje imunski sistem, deluje

protivirusno in protitumorsko, uravnava prebavo, blaţi bolečine, uravnava krvni tlak in

zaustavlja krvavitve. [12]


8

Slika 2-5: Sploščena ploščenka.

2.1.6 Smrekova kresilača (Fomitopsis pinicola)

F. pinicola je večletna goba ploščate oblike, ki raste posamično ali ena nad drugo na

odmirajočem lesu listavcev ali iglavcev. Zgornji del je temno rjave barve, blizu roba pa ima

svetlo rumene in rdeče pasove. Trosovnica je sestavljena iz okroglih rumenih luknjic, trosi

pa so bele barve. [2, 9] Trdo, ţilavo meso je neuţitno, neprijetnega vonja in okusa.

Študije so pokazale, da deluje protivnetno in protibakterijsko, prav tako pa pomaga pri

zdravljenju raka in hepatitisa. [12]

Slika 2-6: Smrekova kresilača.

2.1.7 Grbasta ploskocevka (Trametes gibbosa)

Ta neuţitna goba raste na odmrlih štorih listnatih dreves poleti in jeseni ter povzroča belo

trohnobo. [2] Zgornja ploskev je običajno bele barve, starejše ploskocevke pa so značilne po

svoji zeleni, z algami porasli površini, zato jih je skoraj nemogoče zamenjati. [9] Mesnati,

tanki, polkroţni trosnjaki vsebujejo ţilavo meso s podolgovatimi porami. Premer trosnjaka je

nekje med 5 in 20 cm, v višino pa lahko zraste do 8 cm. So brez vonja in brez okusa. [7]


9

Slika 2-7: Grbaste ploskocevke.

2.1.8 Kosmata ploskocevka (Trametes hirsuta)

Poleti in jeseni povzroča T. hirsuta največjo škodo na štorih in hlodih listavcev. [2] Tanki,

ploščati trosnjaki v obliki ledvice rastejo iz lesa in povzročajo belo trohnobo. Zgornji starejši

del je dosti bolj opazen od roba klobuka, saj ima daljše ščetine in je porasel z algami.

Spodnji del je obdan z oglatimi porami, ki se s časom spremenijo iz bele barve v sivkasto.

[13]

Tudi ekstrakt kosmate ploskocevke je znan po tem, da deluje proti bakterijam in virusom kot

mnoge druge gobe te druţine. [15]

Slika 2-8: Kosmate ploskocevke.


10

2.1.9 Lekarniška macesnovka (Laricifomes officinalis)

L. officinalis je zajedalka in gniloţivka na iglavcih, predvsem na deblih macesna, ki raste

skozi vse leto. [17] Barve na zgornji razpokani površini se prelivajo med belo, sivo, rumeno,

rjavo, spodnji del pa sestavljajo bele luknjičaste trosovnice, iz katerih nastanejo pokončni

stebrički. Največji trosnjaki tehtajo 10 kg ali več, njihovo meso pa je močnega, grenkega

okusa. [10]

Je zelo redka goba in spada med zaščitene gobe zaradi prekomerne prodaje v lekarah, kar

nam pove ţe njeno ime. Zaradi velike vsebnosti polisaharida hitina, v katerem je do 16 %

agaricinske kisline, so jo uporabljali za zdravljenje tuberkuloze in bronhitisa, koristila pa naj

bi tudi pri pomirjanju in premagovanju stresa. Goba deluje odvajalno, njen prah pa so

uporabljali tudi za ustavljanje krvavitev in celjenje ran. [12] »Agarikon« ni samo močno

protivnetno in antibakterijsko sredstvo, njeni izvlečki kaţejo tudi protivirusne lastnosti. [17]

Slika 2-9: Lekarniška macesnovka.

2.1.10 Brezova odpadljivka (Piptoporus betulinus)

Brezova odpadljivka je poličasto vezana na stoječa debla dreves, predvsem na starih brezah,

in dobro uspeva v hladnem podnebju. [2] Rjavi, polkroţni trosnjak je brez beta, meso

klobuka je belo in mehko. [9]

Goba sicer ni škodljiva, vendar njen grenek okus ne pritegne veliko ljudi. V preteklosti so

njen prah uporabljali za ustavljanje krvavitev, preprečevanje infekcije in celjenje ran, danes

pa se uporablja le še za pomiritev ţivcev, krepitev imunskega sistema ali odpravo

utrujenosti. Raziskave so pokazale, da vsebujejo več zdravilnih sestavin, kot so triterpeni,

fungisteroli in ergosteroli, potrdili pa so tudi prisotnost nukleinskih kislin v izvlečkih, ki so

sposobni onesposobiti viruse in bakterije. [12]


11

Slika 2-10: Brezova odpadljivka.

2.2 Antioksidanti

Hranilne snovi v našem organizmu izgorevajo zaradi vdihanega kisika in tako dobimo

zadostno energijo za svoje delovanje. Ko organska snov reagira z zračnim kisikom, poteče

oksidacija1 in nastanejo nepotrebne, škodljive spojine – prosti radikali. Nastale snovi so

reaktivne in nestabilne, hitro reagirajo z molekulami v našem telesu, posledično pa

povzročijo poškodbe celic in številne bolezni. S pomočjo ustreznih dodatkov v našem telesu

lahko preprečimo vezavo O2 na molekule oz. zaviramo takšne nekontrolirane oksidativne

procese, ki povzročajo staranje organizma, različna rakasta obolenja, nevrodegenerativne

bolezni (demenca, Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen), aterosklerozo, bolezni srca in

oţilja ter nam oslabijo imunski sistem. Takim dodatkom pravimo antioksidanti. [18, 19]

Antioksidanti ali »lovilci prostih radikalov« so organske spojine, ki se veţejo na proste

radikale, ki nastanejo kot stranski produkt celičnega dihanja, in s tem preprečijo, da bi le-ti

reagirali z molekulami v našem telesu. [20]

Med najpomembnejše antioksidante spadajo:

vitamini A (-karoten), E in C, ki jih v telo vnašamo s hrano (sadje, zelenjava,

oreščki), v obliki prehrambenih dopolnil ali kar s kozmetičnimi izdelki;

minerali (Se, Mn, Zn, Cu, Fe, Cr), ki ne delujejo neposredno;

flavonoidi, karotenoidi, koencim Q10, izoflavonoidi, fenolne spojine (polifenoli)…

[21]

Dokazano je, da uţivanje večjih količin antioksidantov zmanjšuje oziroma preprečuje

kronične in degenerativne bolezni. [20]

1 Oksidacija ali »spajanje« elementov s kisikom.


12

Med različnimi viri antioksidantov imajo gobe pomembno vlogo, saj izvlečki iz micelija ali

trosnjakov kaţejo antioksidativne lastnosti. Ekstrakti so bogati s polisaharidi, triterpeni,

polifenoli in proteini. Raziskave so pokazale, da gobe zaradi svojih lastnosti upočasnjujejo

oksidacijo molekul, ki jih povzroča vezava prostih kisikovih intermediatov. So zelo dobri

antioksidanti in delujejo proti mnogim boleznim današnjega časa. [22]

AOA je sposobnost spojine, ki temelji na oksidaciji in nestabilnih intermediatih, ki

sodelujejo v procesu. Določamo jo lahko direktno ali indirektno. Ena izmed najstarejših

metod je indirektna metoda z uporabo stabilnega prostega radikala DPPH, ki ni topen v

vodnih raztopinah, zato se AOA meri v metanolu (MeOH). Ko DPPH reagira z

antioksidantom, dobimo DPPH2 v reducirani obliki, ki povzroči spremembo barve iz močno

vijolične v svetlo rumeno. [23]

Slika 2-11: Reakcija prostega radikala DPPH z antioksidantom.


13

2.3 Ekstrakcija trdno – tekoče

Ekstrakcija je separacijski postopek, v katerem gre za ločevanje topnih komponent iz trdnih

ali tekočih zmesi s primernim topilom. [24]

Slika 2-12: Ekstrakcijska naprava.

CE poteka na tak način, da se zmes in topilo med seboj mešata (slika 2-12). Snovi, ki se

topijo v ekstrakcijskem sredstvu, začnejo prehajati v topilo. Pridobljena snov je ekstrakt

oziroma izvleček. [25]

Pri ekstrakcijskem procesu moramo upoštevati naslednje štiri dejavnike, ki vplivajo na potek

ekstrakcije:

temperatura: Topnost komponente v večini primerih narašča s temperaturo, zato

narašča ekstrakcijska hitrost.

velikost delcev: Majhni, fini delci lahko ovirajo separacijo delcev ali fluida in se lahko

sprimejo v večje delce ter posledično ovirajo pretok fluida.

topilo: Pri masti, olju kot ekstrakcijska sredstva uporabljamo hlapna organska topila,

pri pridobivanju vodotopnih snovi pa vodo. Izbrano topilo mora biti selektivno z nizko

viskoznostjo.

mešanje: Z mešanjem preprečujemo sesedanje delcev. [26]


14

Shema ekstrakcije trdnih substanc je prikazana na sliki 2-13.

Slika 2-13: Shema ekstrakcije trdnih substanc. [26]

2.4 Transesterifikacija

Pri mehanizmu transesterifikacije gre za zamenjavo organskih skupin med alkoholom in

estrom. [27] Ravnoteţna reakcija transesterifikacije se običajno uporablja za razgradnjo

maščob ob dodatku ustreznega katalizatorja (encima lipaze), ki pospeši reakcijo. Vsako

maščobo sestavljajo 3 MK in glicerol (propan-1,2,3-triol), povezani z estrsko vezjo, zato

maščobam rečemo tudi trigliceridi. [28] Razgradnja trigliceridov (slika 2-14) poteka v treh

zaporednih stopnjah, ob vsaki stopnji pa se tvori ena molekula estra. Tako dobimo tri

molekule maščobnih estrov in glicerol, sladkorni alkohol kot stranski produkt. [29]


15

Slika 2-14: Transesterifikacija triglicerida z alkoholom. [29]

Maščobe spadajo v skupino organskih spojin (med lipide) in so nujne za normalno delovanje

našega telesa, saj imajo pomembno vlogo pri skladiščenju energije, zaščiti izolacijske plasti

pod koţo in so sestavine mnogih presnovnih procesov. Odvisne so od dolţine (št. C-atomov)

in nasičenosti verig (št. dvojnih vezi) MK (na sliki 2-14 so označene z R1, R2 in R3) v

različnih razmerjih. V naravi se ne srečamo z maščobami iz enakih MK. Če se maščobe ali

olja v hrani razcepijo, nastanejo MK, ki so poglavitni sestavni del lipidov. [30]

Poznamo (slika 2-15):

nasičene maščobe živalskega izvora, ki so brez dvojnih vezi, H-atomi pa so

enakomerno porazdeljeni na vsakem C-atomu,

nenasičena rastlinska olja, ki vsebujejo vsaj eno dvojno vez in nimajo enakomerno

porazdeljenih H-atomov. [31]

Nasičenim (SFA) lahko rečemo tudi »slabe« maščobe in so najmanj zaţelene, saj preveliki

deleţi SFA povzročijo povišano vsebnost holesterola v krvi, srčno kap, debelost, nevrološke

in druge srčno-ţilne bolezni. Če pride do zamašitev ţil, kisik ne potuje do srca, zato srce

enostavno odpove. Kljub temu da SFA spadajo pod »slabe« maščobe, jih vsaka celica našega

telesa potrebuje za delovanje. 50 % SFA je v vsaki celični membrani. Prispevajo k zgradbi in

funkciji pljuč, srca, kosti, jeter ter imunskega sistema. V naših pljučih se nahaja ena takšnih

maščob, t. i. palmitinska MK (C16:0), ki preprečuje astmo in druge dihalne motnje. Tudi

naša jetra nas s pomočjo SFA varujejo pred slabimi učinki toksinov, med njimi tudi

alkohola. [20]


16

Nasprotno pa poznamo nenasičene, »dobre« maščobe in jih moramo čim več vključiti v

prehrano. Nenasičene maščobe lahko najdemo v naravni cis obliki, ki jih naše telo potrebuje,

ali v trans obliki, ki so za telo tako škodljive kot nasičene maščobe. Najbolj znani sta

oleinska mononenasičena MK (MUFA) (C18:1 -9), ki ima eno dvojno vez ter linolenska

(C18:3 -3) in linolna (C18:2 -6) polinenasičeni MK (PUFA) z dvema dvojnima vezema.

[31] Oleinska MK inhibira sproščanje histamina, to pa je pomembno za zdravljenje vnetja in

alergij. [32] Linolna in linolenska MK spadata pod EMK in sta nujno potrebni za človeški

organizem, vendar ju naš organizem sam ne more proizvesti.

O

OH

CH3

O

OH

CH3

nenasičena MK

nasičena MK

dvojna vez

Slika 2-15: Razlika med nasičenimi in nenasičenimi MK.

Maščobe so nujna sestavina v človeški prehrani, saj telo potrebuje nekatere MK (nenasičene

MK z več dvojnimi vezmi), ki jih samo ne more proizvesti – esencialne maščobne kisline

(EMK). Le-te imajo v našem telesu izreden pomen, saj delujejo kot antioksidanti, kljub temu

pa jim škodi kakršnokoli izpostavljanje visokim temperaturam (pri kuhanju, peki,

hidrogenizaciji ali pri rafinaciji, kjer odstranjujejo nečistoče iz izvlečkov). Pri obdelavi

namreč popolnoma spremenijo svojo obliko in značaj, kar pa lahko postane zdravju

škodljivo (trans MK). [31] Prav tako v prisotnosti zračnega O2 zelo hitro oksidirajo in tvorijo

proste radikale.

Zelo pomembno vlogo imajo tudi olja, ki so bogata z omega-3 (-3) in omega-6 (-6)

maščobami. Uţivati bi jih morali v pribliţno enakih količinah, vendar dandanes zaradi

nepravilne prehrane v jedilnikih prevladujejo -6 maščobe, zmanjšal pa se je vnos zdravih

-3 maščob, ki godijo moţganom, zato je tudi večja moţnost, da se razvije demenca. [20]


17

V tabelah 2-2 in 2-3 so podane najpogostejše SFA, MUFA in PUFA.

Tabela 2-2: Najpogostejše nasičene MK.

Sistematično ime kisline Splošno ime kisline Kemijska formula Skrajšana oznaka

butanojska butirična CH3(CH2)2CO2H C 4:0

pentanojska valerinska CH3(CH2)3CO2H C 5:0

heksanojska kapronska CH3(CH2)4CO2H C 6:0

heptanojska enantionjska CH3(CH2)5CO2H C 7:0

oktanojska kaprolna CH3(CH2)6CO2H C 8:0

nonanojska pelargonska CH3(CH2)7CO2H C 9:0

dekanojska kaprična CH3(CH2)8CO2H C 10:0

hendekanojska undecilinska CH3(CH2)9CO2H C 11:0

dodekanojska lavrinska CH3(CH2)10CO2H C 12:0

tridekanojska tridecilinska CH3(CH2)11CO2H C 13:0

tetradekanojska miristinska CH3(CH2)12CO2H C 14:0

pentadekanojska pentadecilinska CH3(CH2)13CO2H C 15:0

heksadekanojska palmitinska CH3(CH2)14CO2H C 16:0

heptadekanojska margarinska CH3(CH2)15CO2H C 17:0

oktadekanojska stearinska CH3(CH2)16CO2H C 18:0

eikozanojska arahidinska CH3(CH2)18CO2H C 20:0

dokozanojska beheninska CH3(CH2)20CO2H C 22:0

tetrakozanojska lignocerinska CH3(CH2)22CO2H C 24:0

heksakozanojska cerotinska CH3(CH2)24CO2H C 26:0

oktakozanojska montaninska CH3(CH2)26CO2H C 28:0

triakontanojska melisicinska CH3(CH2)28CO2H C 30:0

tritriakontanojska psilicinska CH3(CH2)31CO2H C 33:0

Tabela 2-3: Najpogostejše nenasičene MK prisotne v naravi.

Sistematično ime kisline Splošno ime kisline Skrajšana oznaka

dec-9-enojska / C 10:1

dodec-9-enojska / C 12:1

tetradec-9-enojska miristoleinska C 14:1

heksadec-9-enojska palmitoleinska C 16:1


18

oktadec-6-enojska petroselinska C 18:1

oktadec-9-enojska oleinska C 18:1 n-9

oktadec-11-enojska vaceninska C 18:1 n-7

oktadeka-9:12-dienojska linolna C 18:2 n-6

oktadeka-9:12:15-trienojska α-linolenska C 18:3 n-3

oktadeka-6:9:12-trienojska -linolenska C 18:3 n-6

oktadeka-9:11:13-trienojska eleostearinska C 18:3

eikosa-9-enojska gadoleinska C 20:1

eikosa-5:8:11:14-tetraenojska arahidonska C 20:4 n-6

eikosa-5:8:11:14:17-pentaenojska EPA C 20:5 n-3

dokoza-13-enojska eruična C 22:1

dokoza-7:10:13:16:19-pentaenojska DPA C 22:5 n-3

dokoza-13:16:19-heksaenojska DHA C 22:6 n-3

Za laţje prepoznavanje maščob si pomagamo z označevanjem MK z IUPAC ali trivialnim

imenom ter s simbolom. MK so sestavljene iz verige ogljikov z enojno ali dvojno vezjo. Če

vsebujejo dve ali več dvojnih vezi, je lokacija le-teh izredno pomembna. -6 EMK imajo

dvojno vez na šestem ogljikovem atomu (C-atom) od konca verige MK, -3 pa na tretjem C-

atomu.

Primer: linolna kislina (IUPAC ime: cis,cis-9,12-oktadekadienojska kislina; oznaka: C 18:2,

n-6) je nenasičena -6 EMK z 18 C-atomi in dvema dvojnima vezema.


19

2.5 Plinska kromatografija

GC je postopek ločevanja plinastih ali uplinjenih zmesi. Snovi, ki jih ločujemo, se

porazdelijo v dve fazi. Ena je stacionarna faza (SF), ki se v procesu ne premika, druga je

mobilna faza (MF), ki se premika. SF je lahko drobno zmleta trdnina ali kapljevina. MF je

lahko kapljevina, ki se s SF ne meša, ali plin, ki se v SF ne topi.

MF pri GC je inertni plin (helij, argon, dušik), ki se ne veţe na SF. [25] Izbira SF je

najpomembnejša naloga GC in je odvisna od tega, kakšen vzorec analiziramo. Za nepolarne

vzorce uporabljamo nepolarno SF, za polarne vzorce pa polarne SF. Nosilni plin (MF) ima to

nalogo, da nosi vzorec skozi kolono v detektor.

Slika 2-16: Shematski prikaz GC. [33]

Inertni plin (MF) odnaša vzorec (zmes spojin), ki se ga injicira v komoro, v kromatografsko

kolono, napolnjeno z nosilcem SF (običajno aktivno oglje, aluminijev oksid). Kolona je

najpomembnejši del aparata za GC, saj se v njej loči plinska zmes. Ostali deli aparata sluţijo

le za kontrolo. Spremembe se preko ojačevalnika preoblikujejo v zapis, ki mu pravimo

plinski kromatogram. Ločene snovi v kromatogramu zaznamo v obliki pikov. Površina pikov

je sorazmerna količini snovi. [34]


20

3 Eksperimentalni del

3.1 Laboratorijski pribor, aparature in kemikalije

Steklovina in pribor

bučka z okroglim dnom

ţlička

magnetno mešalo

merilni valj (100 ml)

filtrni papir

steklene viale za ekstrakte

steklene viale za vzorce (2 ml)

nuča z nastavkom za nučiranje in gumico

povratni hladilnik

termometer

steklena pipeta

epruvete

spatula

avtomatske pipete

temne stekleničke (10 ml)

merilna bučka (10 ml)

Aparature

kavni mlinček za mletje

laboratorijska tehtnica

uparjalnik (rotavapor)

grelnik

analitska tehtnica

ultrazvočna kopel

spektrofotometer


21

Kemikalije

n-heksan

destilirana voda

0,5 M H2SO4 v MeOH

NaOH

plinasti N2

MeOH

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH)

Folin-Ciocalteu reagent (FC)

galna kislina (GA)

natrijev (V) karbonat (Na2CO3)

3.2 Priprava materiala

Dr. Andrej Gregori in Anton Soklič sta nabrala več različnih gob druţine Polyporaceae na

različnih lokacijah po Sloveniji. Trosnjake smo narezali na manjše kose in jih posušili na

sobni temperaturi do 30 °C. Posušene trosnjake smo nato zmleli z mlinčkom do določene

velikosti delcev ter jih hranili na suhem mestu do ekstrakcije.

3.3 Klasična ekstrakcija (CE) s heksanom

Naloge smo se lotili tako, da smo zatehtali 5 g suhih in zmletih trosnjakov Polyporaceae v

bučko z okroglim dnom, dodali 100 ml n-heksana. CE smo izvedli pri temperaturi vrelišča

topila (T = 69 °C). CE je potekala 3 ure, nato smo s pomočjo nuče prefiltrirali ekstrakcijsko

zmes. Dobljeno raztopino ekstrakta smo uparili s pomočjo rotavaporja, vendar ne do suhega.

V predhodno stehtane steklene viale smo nato prelili koncentriran ekstrakt. Sledilo je

prepihovanje z dušikom (N2) z namenom, da uparimo ostanek topila in dobimo suho maso

ekstrakta. Na koncu smo ponovno stehtali viale in tako določili maso ekstrakta in izkoristek

CE.

Izkoristek ekstrakcije [%] in maso ekstrakta [mg] smo izračunali po naslednjih enačbah:

100(%).

. mat

ekst

m

m (3.1)

vialaekstvialaekst mmm .. (3.2)


22

Kjer je:

izkoristek [%]

mekst. masa ekstrakta [g]

mmat. masa zatehtatih zmletih trosnjakov [g]

mviala+ekst. masa viale in ekstrakta [g]

mviala masa viale [g]

Slika 3-1: Klasična ekstrakcija.

3.4 Biološka analiza ekstraktov

Določanje antioksidativne aktivnosti (AOA) z radikalsko metodo

AOA ekstraktov smo določali z uporabo DPPH. V 10 ml bučko smo natehtali 10 mg vzorca

in ga raztopili v MeOH do oznake, saj DPPH v H2O ni topen. Vzorec smo dobro premešali

(po potrebi smo uporabili tudi ultrazvočno kopel), da se je ves DPPH raztopil. Pripravili smo

si MeOH razt. DPPH s koncentracijo 1 mg/ml. V temno stekleničko smo odpipetirali 3 ml

razt. DPPH in 77 l razt. ekstrakta ter vse skupaj termostatirali 15 min pri stalni temperaturi

v temnem prostoru. S spektrofotometrom smo nato izmerili absorbanco (A) raztopine ( =

515 nm). Za umerjanje smo po enakem postopku pripravili tudi referenčno razt., le da smo

namesto razt. vzorca odpipetirali 77 l MeOH in takoj izmerili A.


23

AOA [% inhibicije glede na referenčno razt.] smo izračunali po naslednjih enačbah:

100%0

150

C

SC

A

AAinhibicije

(3.3)

Kjer je:

Ac0

absorbanca referenčne raztopine v t = 0 min

As15

absorbanca raztopine vzorca v t = 15 min

3.5 Kemijska analiza ekstraktov

Določanje vsebnosti skupnih fenolov

Vsebnost celokupnih fenolov smo določili na osnovi oksidacijske reakcije FS s Folin-

Ciocateu-jevim (FC) reagentom z merjenjem A nastalega barvnega kompleksa s

spektrofotometrom pri valovni dolţini 760 nm. Kot standard smo uporabili galno kislino

(GA).

Najprej smo si pripravili osnovno raztopino GA v destilirani vodi konc. 0,4 mg/ml. V 10 ml

bučke smo odpipetirali po: 7,5 ml, 5,0 ml, 3,5 ml, 1,0 ml, 0,75 ml, 0,5 ml, 0,25 ml in 0,1 ml

GA ter razredčili z destilirano H2O do oznake. Iz vsake smo odpipetirali po 0,5 ml raztopine

GA, dodali 2,5 ml FC reagenta (razredčimo z destilirano H2O v razmerju 1:10) ter 2 ml

Na2CO3 s konc. 75 g/L. Pripravljene vzorce smo termostatirali na vodni kopeli 5 min pri 50

°C, nato smo jim izmerili A pri 760 nm. [36]

Iz pripravljene razt. ekstrakta s konc. 1 mg/ml smo odpipetirali 0,5 ml razt. ekstrakta in

dodali 2,5 ml razt. FC reagenta ter 2 ml Na2CO3. Za slepi vzorec smo uporabili destilirano

H2O. Enak postopek smo uporabili še za preostale ekstrakte. Vzorce smo pustili na vodni

kopeli 5 min pri 50 °C. Ohlajenim vzorcem smo s spektrofotometrom izmerili A.

S pomočjo predhodne umeritvene krivulje z GA smo izračunali konc. totalnih fenolov v

ekstraktih [mg GA/g ekst.] po sledečih enačbah:

a

bAbsbaAbs GAGA

(3.4)

.razt

ekstrakt

ekstraktV

m (3.5)


24

100ekstrakt

GA

GAekstraktw

(3.6)

Kjer je:

Abs absorbanca (A) razt. vzorca izmerjena pri 760 nm [/]

B odsek premice umeritvene krivulje GA na osi absorbance [/]

A naklon premice umeritvene krivulje GA [ml/mg]

GA konc. GA v razt. ekstrakta [mg/ml]

ekstrakt konc. ekstrakta v razt. vzorca [mg/ml]

wGAekstrakt vsebnost totalnih fenolov [mg GA/g ekst.]

Določevanje vsebnosti maščobnih kislin (MK)

Za ustrezno določevanje vsebnosti MK smo si morali pripraviti vzorce za analizo z GC z

masno spektroskopijo s plamensko ionizacijskim detektorjem (GC-MS/FID).

V stekleno vialo (2 ml) smo zatehtali ekstrakt, ki smo ga razredčili v heksanu. Predhodno

smo si pripravili 0,5 M H2SO4 v MeOH in je dodali 1 ml v vialo ter dobro premešali. Vse

skupaj smo postavili v vodno kopel, ogreto na 50 °C za 60 min. Ko je reakcija potekla, smo s

pomočjo 0,5 M NaOH nevtralizirali naš vzorec do pH 7. Značilno za maščobe je, da se v

vodi ne topijo, se pa topijo v organskih, nepolarnih topilih, zato smo mešanico dodatno

trikrat sprali s heksanom, da sta se fazi ločili med seboj. S stekleno pipeto smo odvzeli

zgornjo fazo heksana z raztopljenimi MK (slika 3-2) in jo prepihali z N2, da smo dobili naše

koncentrate, ki smo jih ponovno stehtali pri sobni temperaturi. Enak postopek smo uporabili

še za preostale ekstrakte.

Slika 3-2: Mešanica; zgornja faza: heksan z raztopljenimi MK.


25

Iz pridobljenih vzorcev smo nato s pomočjo GC-MS/FID določili vsebnost MK v ekstraktih.

1 l vzorca smo injicirali v MS (GC-DSQ II; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA,

ZDA) s FID detektorjem. FID deluje pri visokih temperaturah (200–400 °C), kar preprečuje

kondenzacijo H2O in organskih snovi z višjim vreliščem. Dokler prehaja skozi kolono samo

MF, je ionski tok majhen. Ko pa pride iz kolone še vzorec (organska snov), se ionski tok

ojača in ga lahko natančneje izmerimo.

Nosilni plin (MF) je bil helij (q = 1,4 ml/min), temperatura injektorja ter MS je bila 250 °C.

Začetna temperatura v pečici je bila 50 °C, nato pa se je postopoma povečevala za 25 °C do

230 °C. Končno temperaturo smo vzdrţevali 25 min. Za identifikacijo metilnih estrov MK

(FAME) smo uporabili naslednje standarde: PUFA-3 (polinenasičene MK), FIM-FAME-7

(mešanica metilnih estrov) in mikrobiološko standardno mešanico (bacterial acid methyl

ester CP mixture). [22]


26

4 Rezultati in diskusija

Vemo, da gobe vsebujejo veliko zdravih sestavin, zato smo se v diplomski nalogi

osredotočali na biološko aktivne snovi, ki so prisotne v trosnjakih. Ekstrahirali smo 31

različnih vrst gob druţine Polyporaceae, iz pridobljenih ekstraktov pa smo pripravili vzorce

za analizo. Vse uporabljene vrste gob so prikazane v prilogi 1. V nadaljnjih analizah smo se

bolj osredotočili na 10 gob (Stereum hirsutum, Gleophyllum odoratum, Fomes fomentarius,

Trametes versicolor, Ganoderma applanatum, Fomitopsis pinicola, Trametes gibbosa,

Trametes hirsuta, Laricifomes officinalis, Piptoporus betulinus), ki so najbolj znane po

svojih zdravilnih učinkih, in jim z uporabo prostega radikala DPPH določili AOA, zanimala

pa nas je tudi vsebnost FS in MK.

Tabela 4-1: 10 zdravilnih gob druţine Polyporaceae in rezultati analiz.

Študije so pokazale, da je izkoristek CE () odvisen od temperature in od vrste topila. [22] V

našem primeru smo za topilo izbrali nepolarni heksan, ki se uporablja predvsem za izolacijo

MK, ki so nepolarne. Po končani CE smo izračunali po enačbi 3.1, vsi rezultati pa so

zbrani v tabelah 4-1 in 7-2 (priloga 2).

Najvišji CE smo dobili pri gobi Fomitopsis pinicola, ki znaša 6,445 %. Najniţji CE (le

0,448 %) ima Trametes hirsuta. Ker je pri vseh precej nizek, smo predvidevali, da je v

trosnjakih Polyporaceae nizki deleţ MK.

[%] Inhibicija DPPH [%] Celokupni fenoli [mg GA/g ekst.]

Stereum hirsutum 0,542 1,1061 11,5

Gleophyllum odoratum 0,531 3,4566 14,6

Fomes fomentarius 0,898 5,0639 18,6

Trametes versicolor 1,775 0,3802 9,3

Ganoderma applanatum 0,842 2,1431 12,3

Fomitopsis pinicola 6,445 5,2368 19,6

Trametes gibbosa 0,824 3,2492 13,8

Trametes hirsuta 0,448 2,0567 13,5

Laricifomes officinalis 5,215 2,2122 13,7

Piptoporus betulinus 1,627 3,2838 14,3


27

4.1 Določanje vsebnosti skupnih fenolov

Da bi ugotovili vsebnost fenolov (wGAekstrakt), smo našim vzorcem s konc. 1 mg/ml dodali

ustrezno konc. FC reagenta in Na2CO3 ter s pomočjo predhodne umeritvene krivulje z GA

po enačbah 3.4, 3.5 in 3.6 izračunali deleţ totalnih fenolov v ekstraktih. Vsebnost FS v

ekstraktih trosnjakov Polyporaceae smo podali kot mg GA na g ekstrakta (mg GA/g ekst.

SD). Na sliki 4-1 so prikazane vrednosti fenolov v gramu ekstraktov.

Slika 4-1: Vsebnost celokupnih fenolov.

Največ fenolov vsebujeta trosnjaka Fomitopsis pinicola (19,6 mg GA/g ekst.) in Fomes

fomentarius (18,6 mg GA/g ekst.), najmanj pa jih najdemo v Trametes versicolor (9,3 mg

GA/g ekst.) ter Stereum hirsutum (11,5 mg GA/g ekst.). Vrednosti padajo v naslednjem

vrstnem redu: G. odoratum (14,6 mg GA/g ekst.), P. betulinus (14,3 mg GA/g ekst.), T.

gibbosa (13,8 mg GA/g ekst.), L. officinalis (13,7 mg GA/g ekst.), T. hirsuta (13,5 mg GA/g

ekst.) in G. applanatum (12,3 mg GA/g ekst.).

Raziskave so pokazale nizke vsebnosti skupnih fenolov v ekstraktih, pridobljenih v heksanu,

saj se le-ta uporablja predvsem za ekstrakcijo MK. [35] FS so znani naravni antioksidanti, ki

zaustavljajo oksidacijo lipidov in zavirajo rast velikega št. bakterij, preprečujejo oksidacijo

LDL2 in pripomorejo k boljšemu počutju. [20] Velik vpliv na antioksidacijsko sposobnost

2 LDL je »slabi« holesterol.

11,5

14,6

18,6

9,3

12,3

19,6

13,8 13,5 13,7 14,3

0

5

10

15

20

25

Stereum

hirsutum

Gleophyllum

odoratum

Fomes

fomentarius

T. versicolor Ganoderma

applanatum

Fomitopsis

pinicola

T. gibbosa T. hirsuta Laricifomes

officinalis

Piptoporus

betulinus

Vse

bno

st t

ota

lnih

fen

olo

v [

mg G

A/g

ekst

.]

Vzorec

Celokupni fenoli


28

ima poloţaj in razporeditev hidroksilnih (–OH) skupin na orto mestu ter delokalizacija

elektrona po aromatskem obroču, kar zagotavlja stabilnost. Znano je, da FS zelo rade

oksidirajo, so lovilci prostih radikalov ter inhibitorji oksidacijskih encimov. Večja kot je

vsebnost FS v samem ekstraktu, večja je AOA. [22, 36]

4.2 Določanje AOA z radikalsko metodo (DPPH)

Pripravili smo si razt. vzorcev s konc. 1 mg/ml in izmerili njihovo A v 15 min. (AS15

).

Začetna A referenčne razt. (AC0) je bila 0,5786. Iz AS

15 in AC

0 smo po enačbi 3.3 izračunali

inhibicijo DPPH. AOA ekstraktov, pridobljenih iz trosnjakov Polyporaceae, smo podali kot

% zaviranja DPPH ( SD). Rezultati so nazorneje prikazani na sliki 4-2 in v tabeli 7-4

(Priloga 4).

Slika 4-2: Odstotek inhibicije DPPH v ekstraktih (% SD).

Najvišjo vrednost inhibicije DPPH smo dobili pri trosnjaku Fomitopsis pinicola (5,24 %) in

Fomes fomentorius (5,06 %), najniţjo pa pri Trametes versicolor (0,38 %) ter Stereum

hirsutum (1,11 %). Pri ostalih gobah se vrednosti gibljejo med 2 % ter 3,5 % (v padajočem

vrstnem redu: G. odoratum (3,46 %), P. betulinus (3,28 %), T. gibbosa (3,25 %), L.

officinalis (2,21 %), G. applanatum (2,14 %) in T. hirsuta (2,06 %)).

1,11

3,46

5,06

0,38

2,14

5,24

3,25

2,06 2,21

3,28

0

1

2

3

4

5

6

Stereum

hirsutum

Gleophyllum

odoratum

Fomes

fomentarius

T. versicolor Ganoderma

applanatum

Fomitopsis

pinicola

T. gibbosa T. hirsuta Laricifomes

officinalis

Piptoporus

betulinus

Inhib

icij

a D

PP

H [

%]

Vzorec

AOA


29

Če primerjamo dobljene rezultate totalnih fenolov (slika 4-1) ter inhibicije DPPH (slika 4-2)

vidimo, da so rezultati na prvi pogled zelo podobni. Najvišjo inhibicijo DPPH• smo dobili

pri ekstrakciji F. pinicola, kjer smo določili tudi najvišjo vsebnost FS. Podobno velja za

ostale ekstrakte. V našem primeru višje vsebnosti celokupnih fenolov odraţajo višjo

inhibicijo DPPH•, ni pa vedno tako.

Vrednosti celokupnih fenolov in inhibicije DPPH• so relativno nizke, saj je heksan izrazito

nepolarno topilo, s katerim uspemo ekstrahirati samo nepolarne komponente. Kljub temu

lahko iz danih rezultatov sklepamo, da so v ekstraktih pridobljenih s heksanom v manjši

meri zastopane tudi polarne komponente, kar se odraţa v stopnji inhibicije ter v vrednosti

celokupnih fenolov.

4.3 Določevanje vsebnosti MK

Gobe vsebujejo mnogo zdravilnih sestavin (polisaharidi, steroli, steroidi, terpeni itd.), v

majhni količini pa najdemo tudi MK. Sestavljene so iz C, H in O in običajno vsebujejo od 12

do 22 C-atomov. Dolge MK (14–24 C-atomov), ki so najpogostejše v prehrani, so

palmitinska (C16:0), stearinska (C18:0), arahidinska (C20:0), oleinska (C18:1 -9) in

linolna (C18:2 -6). [22]

Po CE s heksanom smo dobili olje, bogato z MK. Zanimal nas je deleţ teh MK v %, zato

smo izvedli metilno esterifikacijo, pri čemer so nastali FAME. S pomočjo GC smo dobili

kromatograme, na katerih smo primerjali retenzijske čase3 in masne spektre ter tako določili

MK, ki so prevladovale v določenem vzorcu.

Iz ekstraktov smo identificirali 19 MK, od tega 10 nasičenih (SFA) in 9 nenasičenih MK

(MUFA in PUFA), ki vsebujejo od 14 do 24 C-atomov. Primerjava vseh določenih MK v

ekstraktih trosnjakov je prikazana na sliki 4-3. Iz rezultatov v tabeli 7-6 (priloga 6) je

razvidno, da so v vseh ekstraktih prevladovale palmitinska (C16:0), arahidinska (C20:0),

oleinska (C18:1 -9) in linolna (C18:2 -6) MK, kar je tudi v skladu z literaturo. Iz vseh

ekstraktov smo pri CE s heksanom dobili najvišje deleţe 22,4 % nasičene palmitinske

(C16:0) in 38,5 % mononenasičene oleinske (C18:1 -9) MK v sploščeni pološčenki (G.

applanatum) ter kar 60,1 % polinenasičene linolne MK (C18:2 -9) v brezovi odpadljivki

(P. betulinus). Najvišji skupni deleţ SFA ima S. hirsutum (49 %), MUFA ima G.

applanatum (45,1 %) in PUFA ima P. betulinus (60,9 %).

3 Retenzijski čas je čas, ki preteče od trenutka injiciranja zmesi do detekcije pika.


30

Slika 4-3: Deleţ MK v ekstraktih trosnjakov Polyporaceae.

0

10

20

30

40

50

60

70

C15:0 C16:0 C17:0 C18:0 C20:0 C21:0 C22:0 C23:0 C24:0 C16:1

(ω7)

C16:1

(ω9)

C17:1

(ω7)

C18:1

(ω9)

C18:1

(ω7)

C20:1 C18:2

(ω6)

C18:3

(ω6)

C18:3

(ω3)

De

lež

*%+

MK

Deleţ MK v ekstraktih

Stereum hirsutum Gleophyllum odoratum Fomes fomentarius Trametes versicolor Ganoderma applanatum

Fomitopsis pinicola Trametes gibbosa Trametes hirsuta Laricifomes officinalis Piptoporus betulinus


31

Na sliki 4-4 je natančneje prikazana sestava vseh 19 MK v F. pinicola, ki smo jih določali.

Le-ta vsebuje največ polinenasičene linolne kisline (37,5 %), sledita nasičeni arahidinska

(18,4 %) ter palmitinska (17,1 %) in mononenasičena oleinska (12,2 %) MK. Preostale MK

so prav tako pomembne za organizem, vendar so prisotne v manjših količinah (deleţi se

gibljejo med 0 in 5 %). Vseh SFA je 45,2 %, vsebuje pa še 17,1 % MUFA in 37,7 % PUFA.

Podobno velja za preostalih 9 analiziranih vzorcev, le da se deleţi MK med sabo razlikujejo.

Slika 4-4: Deleţi MK v smrekovi kresilači.

Maščobe se v hrani nahajajo kot mešanica MK v različnih razmerjih, ki jih potrebuje vsak

človek, saj omogoča normalni razvoj in delovanje organizma. MK uvrščamo v skupine glede

na dolţino C-atomov oziroma na število dvojnih vezi (SFA, MUFA in PUFA). Raziskave o

vplivu posameznih MK na zdravje pa so pokazale, da le-te različno vplivajo na zdravje

človeka. EMK se zaradi več dvojnih vezi ob prisotnosti O2 cepijo v nestabilne, škodljive

radikale ali pa se ob dovolj visoki temperaturi pretvorijo v trans MK.

MK vsebujejo veliko vitaminov (A, D, E in K) in so zelo dobri antioksidanti, ki preprečujejo

proces oksidacije telesa. Ekstrakti, bogati z MK, imajo zelo dobro sposobnost zaviranja

DPPH. [37]

17%

5%

18%

12%

38%

Smrekova kresilača (F. pinicola)

C14:0

C15:0

C16:0

C17:0

C18:0

C20:0

C21:0

C22:0

C23:0

C24:0

C16:1 (ω7)

C16:1 (ω9)

C17:1 (ω7)

C18:1 (ω9)

C18:1 (ω7)

C20:1

C18:2 (ω6)

C18:3 (ω6)

C18:3 (ω3)


32

5 Zaključek

V diplomski nalogi smo proučevali 10 različnih ekstraktov gob Polyporaceae, ki smo jih

pridobili s CE z nepolarnim heksanom, ki se uporablja predvsem za izolacijo MK, ki so

nepolarne in se raztapljajo v nepolarnem topilu. Ţe pred začetkom laboratorijskega dela smo

pričakovali razlike med vzorci, saj vsaka goba vsebuje različne spojine. Določali smo jim

vsebnost celokupnih fenolov, AOA z DPPH radikalsko metodo in deleţ MK. Ţeleli smo

poiskati trosnjake, ki vsebujejo največ zdravilnih učinkovin in bi jih lahko v prihodnosti

uporabljali kot prehranska dopolnila ali v zdravilne namene.

Gobe vsebujejo mnogo polisaharidov, triterpenov, vitaminov, FS, MK itd., ki imajo

pozitivne učinke na telo. Številne raziskave so pokazale, da so trosnjaki dobra obramba pred

nestabilnimi radikali, ki škodujejo celicam. Prostih radikalov sicer ne moremo izničiti, lahko

pa poskrbimo, da s pravilno prehrano ali z vitaminskimi izdelki vnesemo v telo nekoliko

večje količine antioksidantov, ki preprečijo vezavo O2 in pomagajo zavirati razvoj nekaterih

obolenj: zmanjšujejo tveganje za razvoj raka ter za začetni razvoj ateroskleroze, izboljšujejo

delovanje imunskega sistema, povečujejo telesne sposobnosti in ohranjajo ţivčne celice.

Ugotovili smo, da smo najvišji CE dobili pri smrekovi kresilači (Fomitopsis pinicola), in

sicer kar 6,445 %, zato smo predvidevali, da vsebuje največ FS in MK. Pri določanju

celokupnih fenolov smo dobili nizke rezultate, največ fenolnih antioksidantov pa je vseboval

ekstrakt F. pinicola (19,6 mg GA/g ekst.), kar smo tudi pričakovali. Pri F. pinicoli smo nato

z radikalsko metodo določili še najvišji % zaviranja DPPH (5,2368 %). Dobljeni rezultati

totalnih fenolov ter inhibicije DPPH so bili precej podobni. Večja kot je vsebnost

celokupnih fenolov, višja je stopnja inhibicije DPPH• radikala in s tem je posledično višja

AOA samega ekstrakta. Z veliko verjetnostjo lahko trdimo, da ekstrakti iz trosnjakov F.

pinicole vsebujejo največ biološko aktivnih snovi (fenoli, polisaharidi, proteini) in kaţejo

najboljše antioksidativne lastnosti.

Zanimal nas je tudi deleţ MK v vzorcih, zato smo izvedli metilno esterifikacijo. Identificirali

smo 19 različnih MK, od tega 10 SFA ter 9 MUFA in PUFA. V vseh ekstraktih so

prevladovale nasičena palmitinska (C16:0), nasičena arahidinska (C20:0), mononenasičena

oleinska (C18:1 -9) in polinenasičena linolna (C18:2 -6) MK.


33

6 Literatura

[1] Stušek P. Zgradba in delovanje organizmov. Ljubljana: DZS, 2011.

[2] Læssøe T., Del Conte A. Velika knjiga o gobah. Ljubljana: DZS, 1997.

[3] Gobarsko društvo Bisernica.

http://www.drustvo-bisernica.si/recepti.htm (dostop: 16. 5. 2016)

[4] Pirh B. Medicinske gobe – čudeţ ali prevara? April 2012.

http://filternet.si/dd/clanki/medicinske-gobe-cudez-ali-prevara/ (dostop: 24. 2. 2016)

[5] Čebulj M. Gobe, izvrstne v prehrani in zdravilstvu.

http://www.bonbon.si/default.asp?kaj=1&id=5680212 (dostop: 14. 6. 2016)

[6] Lee H. W., Friedrich A. J. Zdravilna moč gob. Aurea Press, 1999.

[7] Bielli E. Gobe: Spoznavanje, prepoznavanje, nabiranje najbolj razširjenih vrst gob.

Ljubljana: Zaloţba Mladinska knjiga, 2002.

[8] Polyporaceae, wikipedia.

https://en.wikipedia.org/wiki/Polyporaceae (dostop: 14. 6. 2016)

[9] Gminder A., Böhning T. Katera goba je to? Kranj: Narava, 2008.

[10] Stamets P. Medical Mushrooms.

http://www.medicalmushrooms.net/ (dostop: 14. 6. 2016)

[11] Humar M. Dišeča tramovka. Ljubljana: Biotehniška fakulteta, 2011.

[12] Vrhovec B. Zdravilne gobe Slovenije in 100 okusnih gob. Kranj: Narava, 2010.

[13] Gregori A. Zdravilne gobe rastejo predvsem na lesu.

http://www.goba.eu/wp-content/uploads/2013/10/Les_2012_01-02_Gregori-zdravilne-

gobe-rastejo-predvsem-na-lesu.pdf (dostop: 14. 6. 2016)

[14] Gregori A. Medicinal mushrooms native to Slovenia – Zdravilne gobe rastoče v

Sloveniji. Acta biologica slovenica. 56, št. 2: 9–22, 2013.

[15] Sivaprakasam E., Kavitha D., Balakumar R., Sridhar S., Suresh Kumar J.

Antimicrobical Activity of whole fruiting bodies of trametes hirsuta. India:

International Journal of Pharmaceutical Sciences and Drug Research, 2011.

[16] Dakskobler I., Seliškar A., Podgornik G. Razširjenost in ekologija vrste Laricifomes

officinalis Kott. & Povzar v Julijskih Alpah. Gozdarski vestnik, 2011.

[17] Stamets P. Agarikon: Ancient Mushrooms for Modern Medicine, september 2012.

http://www.huffingtonpost.com/paul-stamets/agarikon-mushroom_b_1861947.html

(dostop: 16. 6. 2016)


34

[18] Fakulteta za farmacijo. Farmacevtska kemija 3: Antioksidanti.

http://www.ffa.uni-

lj.si/fileadmin/datoteke/FK/Gradiva_FK/2010/Seminarji/Antioksidanti.pdf (dostop: 6.

8. 2016)

[19] Zabukovec S. Antioksidanti, februar 2010.

http://www.viva.si/Zdrav-na%C4%8Din-prehrane/3402/Antioksidanti?index=1

(dostop: 6. 8. 2016)

[20] Perlmutter D. Poţgani moţgani. Ljubljana: UMco, 2015.

[21] Turk D. Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi

organskih topil in superkritičnih fluidov. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko

tehnologijo, 2014.

[22] Cör D. Ekstrakcije bioloških materialov s subkritičnimi in superkritičnimi fluidi.

Maribor: FKKT, 2016.

[23] Škerget M., Makovšek K., Perko T. Navodila za vaje iz prehrambene tehnologije.

Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2014.

[24] Extraction, wikipedia.

https://en.wikipedia.org/wiki/Extraction_(chemistry) (dostop: 16. 6. 2016)

[25] Duden. Kemija: leksikon. Trţič: Učila International, 2008.

[26] Knez Ţ., Škerget M. Termodifuzijski separacijski procesi (zbrano gradivo). Maribor:

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2009.

[27] Transesterification, wikipedia.

https://en.wikipedia.org/wiki/Transesterification (dostop: 10. 6. 2016)

[28] Timberlake K. C. Organic and Biological Chemistry: structures of life. San Francisco:

The Benjamin Cummings Publishing Company, 2002.

[29] Turičnik M. Maščobne kisline v ekstraktu pistacije. Maribor: Univerza v Mariboru,

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2015.

[30] Atkins P. W., Clugston M. J., Frazer M. J., Jonec R. A. Y. Kemija – zakonitosti in

uporaba. Ljubljana: Tehniška zaloţba Slovenije, 1995.

[31] Vrhovnik T. Maščobe v prehrani, julij 2006.

http://www.cenim.se/prehrana/mascobe-v-prehrani/ (dostop: 14. 6. 2016)

[32] Viuf B. »Alergije – laţni alarm v imunskem sistemu«. Science illustrated. Avgust,

2016, št. 81, str. 50, 51.


35

[33] Preloţnik B. Plinska kromatografija z masno spektrometrijo: analiza prostih

maščobnih kislin v krvi človeka. Maribor: Fakulteta za naravoslovje in matematiko,

2011.

[34] Brodnjak Vončina D. Analizna kemija II. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko

tehnologijo, 2006.

[35] Abram V., Simčič M. Fenolne spojine kot antioksidanti. Ljubljana: Biotehniška

fakulteta.

[36] Stanojevič M. Fenoli in flavonodini antioksidanti naravnega izvora. Ljubljana:

Slovenski kemijski portal, 2016.

[37] Maščobe v prehrani.

http://www.e-vitamin.si/mascobe.html (dostop: 16. 6. 2016)


36

7 Priloge

7.1 Priloga 1

Tabela 7-1: Vrste gob druţine Polyporaceae.

Zaporedna št. Slovensko ime Latinsko ime Podlaga Lokacija

1 pisana ploskocevka Trametes versicolor hrast Bevke

2 dlakava slojevka Stereum hirsutum hrast Bevke

3 osmojena bjerkandera Bjerkandera adusta smreka Bevke

4 dišeča tramovka Gleophyllum odoratum smreka/jelka Bevke



7 smrekova jirhovka Ichnoderma resinaceus smreka Naklo

8 osmojena bjerkandera Bjerkandera adusta hrast Naklo

9 bukova kresilka Fomes fomentarius hrast Naklo

10 pisana ploskocevka Trametes versicolor bukev Naklo




14 pozemska roţa Thelephora terrestris bukev Naklo


37


16 sploščena pološčenka Ganoderma applanatum bukev Naklo

17 dišeča tramovka Gleophyllum odoratum smreka Naklo

18 smrekova kresilača Fomitopsis pinicola smreka Naklo

19 grbasta ploskocevka Trametes gibbosa bukev Naklo

20 kosmata ploskocevka Trametes hirsuta bukev Naklo

21 ribezov plutač Phelinus ribis trdoleska Radovna

22 bukova kresilka Fomes fomentarius leska Radovna

23 tribarvna zvitocevka Daedalopsis tricolor leska Radovna

24 rdečeča zvitocevka Daedalopsis confragosa vrba Radovna

25 brestova uhljevka Auricularia mesentericha brest Radovna

26 sploščena pološčenka Ganoderma applanatum brest Radovna

27 smrekova kresilača Fomitopsis pinicola smreka Radovna

28 smrekova kresilača Fomitopsis pinicola smreka Radovna

29 pepelasti zvitoluknjičar Cerrena unicolor bukev Radovna

30 lekarniška macesnovka Laricifomes officinalis macesen

31 brezova odpadljivka Piptoporus betulinus breza Mostec - Ljubljana


38

7.2 Priloga 2

Tabela 7-2: Izkoristki ekstrakcij.

Slovensko ime mzatehte [g] Vtopila [ml] mprazni lonček [g] mpolni lonček [g] mekstrakt [g] mekstrakt [mg] [%]

pisana ploskocevka 2,03 20 10,5074 10,5135 0,0061 6,1 0,300


dlakava slojevka 5,00 50 10,6851 10,7122 0,0271 27,1 0,542

osmojena bjerkandera 2,87 30 10,4693 10,4854 0,0161 16,1 0,561

dišeča tramovka 5,01 50 10,4650 10,4916 0,0266 26,6 0,531

dišeča tramovka 5,00 50 10,4567 10,5392 0,0825 82,5 1,650

dišeča tramovka 5,00 50 10,6525 10,7100 0,0575 57,5 1,150

smrekova jirhovka 5,01 50 10,4932 10,5126 0,0194 19,4 0,387

osmojena bjerkandera 5,01 100 10,6135 10,6610 0,0475 47,5 0,948

bukova kresilka 4,01 80 10,4654 10,5014 0,0360 36 0,898





pozemska roţa 5,00 100 10,5000 10,5909 0,0909 90,9 1,818


sploščena pološčenka 5,01 100 10,5608 10,6030 0,0422 42,2 0,842


39

dišeča tramovka 4,00 80 10,5243 10,5426 0,0183 18,3 0,458

smrekova kresilača 5,01 100 10,5244 10,8473 0,3229 322,9 6,445

grbasta ploskocevka 4,99 100 10,4015 10,4426 0,0411 41,1 0,824

kosmata ploskocevka 5,02 100 10,5901 10,6126 0,0225 22,5 0,448

ribezov plutač 5,02 100 10,6606 10,6778 0,0172 17,2 0,343

bukova kresilka 5,00 100 10,4362 10,5763 0,1401 140,1 2,802

tribarvna zvitocevka 5,01 100 10,6136 10,6397 0,0261 26,1 0,521

rdečeča zvitocevka 5,04 100 10,5430 10,5721 0,0291 29,1 0,577

brestova uhljevka 5,01 100 10,6146 10,6227 0,0081 8,1 0,162

sploščena pološčenka 5,01 100 10,5038 10,5506 0,0468 46,8 0,934



pepelasti zvitoluknjičar 5,01 100 10,4955 10,6277 0,1322 132,2 2,639

lekarniška macesnovka 5,06 100 10,5293 10,7932 0,2639 263,9 5,215

brezova odpadljivka 5,01 100 10,8144 10,8959 0,0815 81,5 1,627


40

7.3 Priloga 3

Tabela 7-3: Masa vzorcev za analizo in vlaga.

Slovensko ime mvzorec [mg] mprazno vijalo [mg] mpolno vijalo [mg] mvzorca [mg] vlaga [%]

dlakava slojevka 2378,56 2383,99 5,43 10,77

osmojena bjerkandera 2380,55 2382,59 2,04 10,77

dišeča tramovka 2349,76 2354,48 4,72

dišeča tramovka 9,20 2348,49 2354,07 5,58

dišeča tramovka 10,65 2337,13 2342,52 5,39 15,47

smrekova jirhovka 2398,07 2399,84 1,77 9,07

osmojena bjerkandera 9,49 2340,16 2343,00 2,84 9,45

bukova kresilka 9,19 2378,92 2383,50 4,58 8,61

pisana ploskocevka 2342,27

pisana ploskocevka 9,02 2363,88 2366,30 2,42 8,38

pisana ploskocevka 2361,56 2363,93 2,37 10,09

pisana ploskocevka 7,21 2357,86 2361,05 3,19 9,35

pozemska roţa 8,09 2379,55 2383,43 3,88 11,05

pisana ploskocevka 8,29 2355,04 2359,22 4,18

sploščena pološčenka 8,90 2356,35 2360,08 3,73 10,32

dišeča tramovka 4,93 2378,83 2381,94 3,11 11,96

smrekova kresilača 18,95 2362,29 2368,25 5,96 11,29


41

grbasta ploskocevka 10,59 2353,38 2355,66 2,28 11,13

kosmata ploskocevka 7,87 2347,51 2351,96 4,45 9,83

ribezov plutač 6,50 2390,70 2393,76 3,06 11,73

bukova kresilka 11,08 2380,36 2384,28 3,92 12,38

tribarvna zvitocevka 2351,03 2354,48 3,45 10,74

rdečeča zvitocevka 9,75 2344,64 2350,78 6,14 10,56

brestova uhljevka 2383,02 2384,50 1,48 10,16

sploščena pološčenka 9,53 2369,37 2375,01 5,64 9,43

smrekova kresilača 2354,21 2374,68 20,47 6,40

smrekova kresilača 17,20 2354,52 2359,93 5,41 11,73

pepelasti zvitoluknjičar 20,31 2373,82 2377,06 3,24 9,45

lekarniška macesnovka 13,42 2351,03 2359,11 8,08 8,95

brezova odpadljivka 12,81 2349,70 2356,34 6,64 9,85


42

7.4 Priloga 4

Tabela 7-4: Inhibicija DPPH.

Zaporedna št. As

15 Inhibicija DPPH [%] SD

Stereum hirsutum 2 0,5722 1,1061 0,30

Gleophyllum odoratum 4 0,5586 3,4566 0,12

Fomes fomentarius 9 0,5493 5,0639 0,35

Trametes versicolor 15 0,5764 0,3802 0,01

Ganoderma applanatum 16 0,5662 2,1431 0,15

Fomitopsis pinicola 18 0,5483 5,2368 0,46

Trametes gibbosa 19 0,5598 3,2492 0,42

Trametes hirsuta 20 0,5667 2,0567 0,12

Laricifomes officinalis 30 0,5658 2,2122 0,33

Piptoporus betulinus 31 0,5596 3,2838 0,22


43

7.5 Priloga 5

Tabela 7-5: Vsebnosti celokupnih fenolov.

Zaporedna št. wGAekstrakt [mg GA/g ekst.] SD

Dlakava slojevka (Stereum hirsutum) 2 11,5 0,25

Dišeča tramovka (Gleophyllum odoratum) 4 14,6 0,10

Bukova kresilka (Fomes fomentarius) 9 18,6 0,30

Pisana ploskocevka (Trametes versicolor) 15 9,3 0,10

Sploščena pološčenka (Ganoderma applanatum) 16 12,3 0,60

Smrekova kresilača (Fomitopsis pinicola) 18 19,6 0,30

Grbasta ploskocevka (Trametes gibbosa) 19 13,8 0,50

Kosmata ploskocevka (Trametes hirsuta) 20 13,5 0,44

Lekarniška macesnovka (Laricifomes officinalis) 30 13,7 0,30

Brezova odpadljivka (Piptoporus betulinus) 31 14,3 0,60


44

7.6 Priloga 6

Tabela 7-6: Deleţ MK v esktraktih, pridobljenih s CE s heksanom.

MK 2 4 9 15 16 18 19 20 30 31

C14:0 0,6 0,02 0,5 0,02 0,2 0,02 0,1 0,04 0,5 0,01 0,9 0,01 0 0 0,2 0 0,3 0,01 0,1 0

C15:0 0,8 0,01 0,9 8 0,01 0,3 0,02 0,6 0,01 2,7 0,06 0,9 0,04 0,6 0,01 0,5 0,01 0,2 0,02 0,6 0,01

C16:0 16,5 0,03 13,6 0,03 14,9 0,05 13,1 0,05 22,4 0,03 17,1 0,03 12,8 0,03 13,6 0,03 11,6 0,02 13,5 0,03

C17:0 0,2 0,05 0,4 0,02 0,6 0,02 0,2 0,02 0,3 0,01 0,2 0,02 0,8 0,04 0,5 0,02 0,4 0,01 0,6 0,02

C18:0 4,9 0,01 5,5 0,01 6,1 0,01 3,8 0,02 1,9 0,01 4,8 0,01 4,2 0,04 3,6 0,03 4 0,05 6,7 0,03

C20:0 19,6 0,04 13,5 0,03 17,3 0,02 18,1 0,03 0,2 0,02 18,4 0,02 16,7 0,02 15,9 0,01 16,4 0,06 0,2 0,03

C21:0 0,1 0,01 0 0 0,6 0,01 0,2 0,01 0,3 0,03 0 0,03 0,1 0,01 0,2 0,01 0,1 0,02 0,9 0,01

C22:0 4,6 0,06 6,2 0,05 2,5 0,04 1,5 0,06 0,9 0,02 0,1 0,04 5,2 0,01 3,2 0,01 3,3 0,01 2,3 0,03

C23:0 1,6 0,05 1,3 0,07 0,3 0,3 0,2 0,05 0,3 0,02 2,1 0,02 3 0,06 4,1 0,06 2,6 0,05 2,1 0,06

C24:0 0,1 0,02 4,6 0,02 3,1 0,01 0 0,01 0,1 0,01 0,7 0,01 0 0 0,1 0 0 0,02 0 0

Σ SFA 49,0 46,5 45,9 37,8 29,6 45,2 43,4 41,9 38,9 26,9

C16:1 (ω7) 1,1 0,06 0,9 0,01 1,6 0,01 1,7 0,01 2,1 0,02 1,4 0,02 0,3 0,06 0,5 0,02 0,7 0,01 0,1 0,02

C16:1 (ω9) 0,6 0,02 0,1 0,06 0,1 0,05 0,5 0,03 0,7 0,02 0,1 0,04 0,1 0,01 0,2 0,04 0,6 0,04 0 0,04

C17:1 (ω7) 0,1 0,01 0,2 0,01 0,6 0,01 0,2 0,01 0,6 0,03 0,2 0,03 0,4 0,03 0,6 0,03 0,1 0,03 0,2 0,03

Documents

Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz različnih vrst gob ......Slika 1-1: Značilnosti glive. Znano je, da če so gobe prave vrste, so gojene na pravi temperaturi in vlaţnosti