Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi, 3(2), 79-84, 2000

DNA Polimerase sebagai Model Kajian BiomolekulEnzim Termostabil Isolat! oka I

Agustina L.N.A, Akhmaloka*, H. Pramono*

Jurusan Kimia, FMIPA Universitas Diponegoro Semarang*) PPAU Bioteknologi Institut Teknologi Bandung

AbstrakEkstremozim merupakan bahan kajian penelitian yang banyak dilakukan dalam dekade terakhir.Enzim ini merupakan biokatalis yang sangat efektif digunakan dalam proses industri. Salah satusumber ekstremozim yang cukup potensial adalah bakteri termofilik, tumbuh pada sumber airpanas. Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber air panas, tetapi sampai saat inibelum banyak peneliti yang mengeksplorasi bakteri termofilik. Salah satu bakteri termofilik dariCimanggu, suatu sumber air panas di sekitar Bandung yang memiliki suhu sekitar 80°C telahberhasil diisolasi. DNA polimerase dipilih sebagai enzim model untuk mempelajari strukturfungsi dari enzim termostabil. Kloning terhadap gen pengkode DNA polimerase dilakukandengan pendekatan pustaka genom dan amplifikasi genom menggunakan teknik PCR. Primerdirancang berdasarkan homologi urutan nukleotida gen pengkode DNA polimerase dariThermus aquaticus dan Thermus thermophilus. Primer P1-P3 mengamplifikasi empat fragmenberukuran 1 kb, 1,4 kb, 1,6 kb dan 1,8 kb yang tidak saling overlap. Dalam hal ini fragmen DNA1 kb telah ditentukan urutan nukleotidanya.

Kata kunci:Ekstremofil, enzim termostabil, DNA polimerase, kloning, pustaka genom

AbstractRecently, there are a lot of researches about extremozyme. These enzymes are biocatalist, whicheffectively used in industry. Once of extremozyme source is thermophilic bacteria that live inhot-spring. Indonesia has many hot springs but so far just a few researchers that explore thesebacteria. Thermophilic bacteria has been isolated from Cimanggu, hot-spring in Bandung. DNApolymerase has been chosen as protein model to understand structure function of thermostableenzyme. Cloning DNA polymerase gene were done using genomic library and polymerase chainreaction technique. The primers were constructed from homologous study of DNA polymerasesequence published, Taq and Tth. Primers P1-P3 amplified four DNA fragments do not overlapeach other with different size of 1 kb, 1,4 kb, 1,6 kb and 1,8 kb. The 1 kb DNA fragment hasbeen sequenced.

Key word:extremozyme, thermostable enzyme, DNA polymerase, genomic library

Telah dipresentasikan dalam Seminar Nasional Peran Peneliti Wanita di Jurusan KimiaFMIPA Undip tanggal 27 April 2000.

Biokatalis dariekstremofil.mikroorganisme ekstrim (ekstremozim)makin diminati karena memilikibeberapa sifat terapan lebih

PENDAHULUANKemajuan bidang biokatalis

dalam dekade terakhir ditandai denganmeningkatnya pencarian bakteri

No. artikel:69/2000 79

Agustina LNA :DNA Polimerase...

amplifikasi fragmen DNA in vitro.Tehnik ini telah mempunyai banyakaplikasi diantaranya dalam proseskloning, analisis DNA, diagnosispenyakit keturunan, deteksi urntanasam nukleat dan organisme patogendan penentuan jenis kelamin janin.

Studi struktur fungsi enzimDNA polimerase termostabil isolatlokal diperlukan enzim dalam jumlahbanyak dan mumi. Dalam rangkatujuan tersebut di atas maka dilakukanpendekatan rekayasa genetika yaitumengklon gen pengkode DNApolimerase dengan pendekatanmenggunakan tehnik PCR dan pustakagenom

menguntungkan terutama bagi industri.Ekstremozim merupakan enzim yangbisa digunakan secara efektif padatemperatur, pH, atau pelarut organikekstrim dalam proses industri. Selainperannya di dalam bidang industri,penelitian terhadap bakteri ekstemofiljuga memiliki peran penting dalamperkembangan ilmu pengetahuanterutama dalam studi filogeni. Dimanadiduga bahwa bakteri-bakteriekstremofil merupakan organismepaling awal yang hidup di bumi.Sebelumnya dikemukakan teori bahwaorganisme di dimia terbagi atas duagolongan berdasar garis evolusinyayaitu organisme prokariot danorganisme eukariot. Namun hasilpenelitian yang telah dilakukan olehsekelompok peneliti terhadap seluruhgen Methanococcus jannaschii yaitusuatu ekstremofil penghasil metan,menunjukkan adanya tiga garis evolusiyaitu bakteri, archaea dan eukariot,setelah membandingkan molekul RNAribosom dari berbagai organisme.

Salah satu sumber ekstremofilyang cukup potensial adalah sumber airpanas. Secara geografis kawasanIndonesia merupakan wilayah yangkaya akan sumber air panas sebagaiwahana bagi pertumbuhan bakteritermofilik, tetapi sampai saat ini belumbanyak dieksplorasi. Dalam rangkapemanfaatan bakteri termofilik galurlokal, maka dilakukan studi biomolekulterhadap bakteri tersebut.

Dalam penelitian ini DNApolimerase telah dipilih sebagai enzimmodel untuk mempelajari strukturfungsi dari enzim termostabil. DNApolimerase termostabil merupakanenzim yang sangat berguna dalamtehnik PCR dimana tehnikoperasionalnya menjadi lebih praktisdan bisa dilakukan otomatisasi. PCRmerupakan suatu tehnik sintesis dan

METODOLOGI PENELITIAN

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalampenelitian ini adalah bakteri termofilikyang diisolasi dari sumber air panasCimanggu. Phenil Methyl SulphonylFlouride (PMSF), (-merkaptoetanol,DNase, dan bahan kimia lain diperolehdari Sigma. [(-35S]dATP dan [(-32P]dCTP diperoleh dari Pharmacia.Untuk keperluan manipulasi genetika,sebagai sel inang digunakan E. coliMOSBlue dan E. coli DH5( Vektoryang dipakai adalah vektor-TpMOSB/ue dan kosrnid pHC 79.Enzim-enzim untuk karakterisasi danmanipulasi DNA in vitro diperoleh dariAmersham. DNA polimerase Taq dandNTP diperoleh dari Pharmacia,Biotech, USA.

Pertumbuhan Bakteri termofilik

Bakteri hasilditumbuhkan dalamBertani pH 7 dimana untuk media padatditambahkan 6% bacto agar (Maniatis,1989). Selanjutnya media cair maupun

isolasimedia Luria

No. artikel:69/2000 80

Jumal Kimia Sains dan Aplikasi, 3(2), 79-84, 2000

padat yang telah diinokulasi denganbakteri termofilik diinkubasi padatemperatur 70°C.

Randal K. Saikimenurut(Innis,et.al.,1990) dan desain primermenurut metode PCR (Newton, C.R.dan Graham, A.,1994). Primerdirancang menggunakan programkomputer Primer Detective danGenmon. Sintesis primer dilakukandengan alat DNA Synthesizer. Untukmengamplifikasi gen dirancang duapasang primer dimana panjang masing-masing primer adalah 23 pb denganpola sebagai berikut :

Perancangan Primer

Perancangan primer didasarkan padaurutan DNA dari gen pengkode DNApolimerase Taq dan Tth yang memilikipanjang sekitar 3 kb. Daerah yangdipilih untuk perancangan primersedemikian rupa sehingga primer dapatmengamplifikasi open reading framedari gen. Seleksi primer dilakukan

PP

PP

Urutan nukleotida masing-masing primer :PI : 5’> GCG GTC TAC GGC TTC GCC AAG AG >3’P2 : 5’> TCC CCT ATC CCC ACC TCC ACC TC >3’P3 : 5*> GGG GTG GTG TTG GAA GGG TCC AG >3’P4 : 5’> CTG GAC CCT TCC AAC ACC ACC CC >3’

Amplifikasi DNA Target

Isolasi DNA kromosomdilakukan dengan metode lisis alkali(Marmur, 1961), dan selanjutnyadipakai sebagai templat dalam prosesPCR. Amplifikasi DNA targetdilakukan dengan bantuan dua pasangprimer yaitu P1-P3 dan P2-P4, yangmasing-masing akan mengamplifikasifragmen berukuran sekitar 1 kb dan 1,4kb. Proses PCR dilakukan menurutlnnis,M.A.(Innis,et.al.,1990) dalam 30 siklusdengan sedikit modifikasi yaitudenaturasi pada 94°C, 1 menit;annealing pada 50°C, 1 menit; danpemanjangan rantai pada 72°C, 1 menit

Kloning fragmen PCR

Fragmen DNA hasil PCRmumi diligasi dengan vektor-TpMOSBlue. Transformasi sel inang E.coli MOSBlue menggunakan hasilreaksi ligasi dilakukan dengan metodaheat shock

Karakterisasi Plasmid Rekombinan

plasmiddilakukan dengan cara pemotongandengan enzim restriksi, analisis

metoda

KarakterisasiGelfand,H.dan

menggunakanhibridisasi Southern blotting, dansekuensing menggunakan AutomaticSequencer ABI PRISM

fragmen

No. artikel: 69/2000 81

Agustina LNA :DNA Polimerase...

Pembuatan Pustaka Genom

DNA kromosom dipotongparsial dengan menggunakan Sau3A Idan dilakukan pemisahan fragmenmelalui metoda elektroforesis gelagarosa. Fragmen-fragmen berukuranlebih kurang 40 kb diisolasi dan diligasidengan kosmid pHC 79. Hasil reaksiligasi dilakukan in vitro packaging dan

ditransfeksi ke E. coli DH5a.

Kloning dan Karakterisasi FragmenHasil PCR

Kloning terhadap fragmen hasil PCRtemyata menimjukkan adanya pita-pitalain yang tidak tampak pada hasilelektroforesiskemungkinan karena kurang spesifik.Pasangan primer P1-P3 menghasilkanempat fragmen dengan ukuran sekitarlkb, 1,4 kb, 1,6 kb, dan 1,8 kb;sedangkan pasangan primer P2-P4temyata mengamplifikasi dua fragmendengan ukuran sekitar 2 kb dan 0,6 kb.

Terhadapfragmen dilakukan hibridisasi satusama lain untuk menguji homologimasing-masinghibridisasi dengan metoda Southernblotting menunjukkan bahwa fragmen-fragmen tersebut berbeda satu samalain, salah satu hasil pengujiandiperlihatkan pada gambar 2. Dugaanbahwa terdapat daerah tumpang tindihantara fragmen 1 kb dan 2 kb temyatatidak ditunjukkan oleh hasil hibridisasiSouthern blotting.

gel agarosa,

HASIL DAN PEMBAHASAN:

Amplifikasi DNA Target

Amplifikasi menggunakan primer PI¬PS dirancang untuk mendapatkanfragmen DNA sepanjang 1 kb, namunhasil amplifikasi selalu menghasilkanlebih dari satu fragmen yang tampaksejajar dengan pita berukuran 1419 pbdari standar DNA pUC19 IHinf I.Sedangkan hasil amplifikasi denganpasangan primer P2-P4 adalah satu pitaberukuran 2 kb. Hasil PCR yangmenghasilkan lebih dari satu fragmenmenunjukkan bahwa spesifitas primerrendah, sehingga masih perlu dilakukanseleksi untuk menentukan fragmenyang diinginkan.

masing-masing

fragmen. Hasil

|>U(7

//m/IIlnsilPCK V Hindi11(Pl-1'3)

llasil PCR(P2-P4)

2313(1

o.i|ft6557 <•1361 /.

2322/2037

Vmo

517396211

m

Gambar 1. Fragmen-fragmen hasil PCR yang tampak pada gel agarosa. (a) HasilPCR dengan primer P1-P3, (b) Hasil PCR dengan primer P2-P4.

No. artikel: 69/2000 82

Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi, 3(2), 79-84, 2000

j I 2 J 4 5 ft 7 X 9 10 I 2 3 4 5 ft 7 8 9 10

Iafew®;/ . 1

amwatWiira|

23130| 041ft

' ft557,\*43ft r '

I. A7///m/ III2. I kb/PCIl3. 2 kb/BN4. 2 kh/KP5. 1 kb/ PCU6. K/BN7. K1,0/BN

8. K1,4/BN

9. Kl.ft10. K1,R

v/

*2322 <2027' hKg b; .!.

•:{

Gambar 2. Hasil autoradiografi hibridisasi Southern blotting. Hibridisasi dilakukanterhadap flagmen 1 kb; 1,4 kb; 1,6 kb; 1,8 kb, dan 2 kb, dengan pelacak(probe) flagmen 1 kb. Keterangan : BN = RamH 1 - Nde I, EP = KcoR 1 -Pst 1, K = klon.

CCGTGTTTGGTACGTTTGTGGTAAAATGTTTGAAAGATGCGTTCAATCACCAAACTTGTTTCGCATCAAACTACAATCACCATCGGCTTTTTTTTTCAACCTTCAGTAAAGAATGTTGTGCAAATGCTTTCAAATTGAGTCTGCCGCGCGTTACAAGCGGACCACCCC

GAGCTGTGACC \GTC.V\GAT

I VGIGCCC lieCAGGAGATTG(. %CCTTG U GCTGCTCCTAGGnCATCCC \

r\c*cTGC.v\rCCAA rGATGAc.rrciK.i r rer.vxAircGArCATCAATCATCTGTGTAAACCTTCC \C\(iT

TTGCACGATCCTGGAGCAGG

(CCATACCGC

CCTTCAAAGAGTTGCCATTG\Tf \ T AC AAA

GCAAGG \A ITCCGGCATC \c

ATGTCA rCAATTGGTCATGGGCAGCAAGACGGCGCGCCATGCTGCATCGAAACGCAGTAGAAGTCCTTAGAACTGGGCAGATTTGAAGCTACTACACCATCCCTTCCAAC

GO rrcGccAAIG \c i:\mui,< \( rc\ikiTTTGic.rTrrGAGA1 1 VCC.rIKKir.UXTTI\nG\mcic

GCTGCiAAGATACCAGATCGA\rr\r vucciWACGACAGI'TGAfCTrCiTTrACAAGAAGCTTTTTCATGCMTTCAGTCA

GC rGTAACCA

4MI AGAGTAAGCAMi ACCTTGATCG541 ATCTTGTGAA'71 GTCGCCATCAvi» iTcrrcACiT631 Y\( \0GTGW*61 GCCCGCCAAC:>oi AGCTTCTTGG721 GCCTTTACCC751 GATCACGATT781 AAATGCTTrTmi TACATCGTAGH4| GCGTTTTAAGS71 TGAGCCTTCT001 TCKXJCCCCAA*>31 GC.AAGCATCA061 TGCTTCTGGA

I GOGGTCTACOII UAIVVWO•I <,IG-\CCGIO.

*>1 \TGGAAGMT121 \CC\AGACC\151 WCMinTCT-.'ll GUAAIUCA::i mwGCTTcrZn WCAGCTTCA

SOI \GG\I0GCCA• . r \c \c G \GG <

J6I GAGGCTTGCA:«l \TGUTATCT421 TGGACCCATA451 AA\r\CTrC6

Gambar 3. Urutan nukleotida fragmen 1 kb, Panjang fragmen 988 pb dan diawalidengan urutan primer P1

sama yaitu P3-P3. Sedangkan fragmen1 kb diamplifikasi oleh pasanganprimer P1-P3.

karakterisasi Fragmen DNA HasilAmplifikasi

Hasil sekuensing parsialterhadap masing-masing plasmidrekombinan yang mengandung fragmenhasil PCR menunjukkan fenomenayang unik, dimana fragmen 0,6 kb dan2 kb temyata diamplifikasi olehsepasang primer yang sama yaitu P4-P4. Fragmen 1.4 kb, 1,6 kb, dan 1,8 kbdiamplifikasi sepasang primer yang

Berdasarkan hasil sekuensingparsial di atas dapat disimpulkan bahwafragmen DNA yang diamplifikasi olehpasangan primer P4-P4 dan P3-P3bukan merupakan bagian dan gen yangdiinginkan, tetapi hasil amplifikasi dariprimer yang tidak spesifik. Dengandemikian hanya fragmen 1 kb yangdikarakterisasi lebih lanjut. Hasil

No. artikel: 69/2000 83

Agustina LNA:DNA Polimerase...

penentuan urutan nukleotida fragmen 1. kb menunjukkan bahwa pasanganprimer P1-P3 mengamplifikasi DNAsepanjang 988 basa seperti tampakpada gambar 3.

3.Asakura,K., Komatsubara,H., Soga,S.,Yomo,T., Oka,M., Emi,S., andUrabe,I. , (1993), “ Cloning,Nucleotide Sequence, andExpression in Escherichia coliof DNA Polymerase Gene (PolA) FromThermophilus HB-8”, J.Ferment. Bioeng. 76, 265-269

4.Edwards,C. /‘Microbiology ofExtreme Environments”, Me.Hill. Publishing Company,1990

5.Elie,C., De Recondo, A., andP., (1989),

DNAPolymerase from die Archae-

Sulfolobusacidocaldarius, Purification,Characterization,Immunological Properties,Biochem 178.619-626.

Kesimpulan : Thermus

Amplifikasi fragmen DNAkromosom bakteri termofilik isolatlokal menggunakan tehnik PCR denganprimer homolog gen DNA polimeraseTaq dan Tth menghasilkan beberapafragmen DNA. Hasil studi homologimenunjukkan bahwa masing-masingfragmen mengamplifikasi daerah yangberbeda. Fragmen 1,4 kb, 1,6 kb, 1,8 kbdan 2 kb bukan merupakan fragmenyang diharapkan karena diamplifikasioleh primer P3-P3 dan P4-P4.Penentuan urutan nukleotida fragmen 1kb menunjukkan bahwa primer P1-P3mengamplifikasi fragmen DNAsepanjang 988 pb

Forterre,“Thermostable

bacterium

and

6. Eom, S.H., Wang, J., and Steitz, T.A,Structure of Taq Polymerasewith DNA at the PolymeraseActive Site,.Nature, 382, 1996,278-281.

7.Innis,M.A.

Ucapan terima kasih kepada :TORAY, atas bantuan dananya untukpenelitian ini dan Direktur PAU-Bioteknologi ITB,memberikan kesempatan kepadakelompok Termofilik untuk melakukanpenelitian di laboratorium RekayasaGenetika PAU.

Gelfand,H./’Optimization of PCR: PCRProtocols. A guide to Methodsand Applications”, AcademicPress. Inc., California, 1990

8.Ito, J. and Braihwaite, (1991),“Compilation and Alignment ofDNA Polymerase Sequences”,Nucleic Acids Research,

vol.3,208-2189.Madigan, M.T. and Marrs, B.L. ,

(1997), “ Extremophiles ”,Scientific American, pp. 67-71.

10.Marmur,J., (1961), “A Procedure forIsolation of Deoxiribonucleic

andtelahyang

Pustaka :1.Adams, Michael,W.W. (1993),

“Enzymes and Proteins fromOrganism that Grow Near and

100°C”,Annu.Rev.Microbiol.47,627-Above

6582.Adams,W.W. and Kelly,R.M. (1995),

EnzymesMicroorganism in ExtremeEnvironments”, Chemical andEngineering News, SpecialReport

from Acid from Microorganisms”, J.Molecular Biology, vol.3.208-218

No. artikel:69/2000 84