1

Elastas+ neutrofila granulocyter och

CD20+ B-celler i parodontit- respektive

periimplantitvävnad

A. Haglund

F. Rebelo Dessborn

Handledare: H. Jansson, A. Ljunggren

Masteruppsats (30hp) Malmö högskola

Tandläkarprogrammet Odontologiska Fakulteten Mars, 2012 205 06 Malmö

2

Abstract

The purpose of the current study was to investigate the presence and localization of neutrophil

granulocytes (Neutrophil Elastase+) and B-cells (CD20+) in patients with chronic

periodontitis and/or peri-implantitis. These cells play an important role in the adaptive as well

as the innate immune system, and can be considered as representative for responses of

different character. Inflamed tissue consisting of epithelia and connective tissue was collected

from twenty sites (thirteen with periodontitis and seven with peri-implantitis) on sixteen

individuals undergoing surgical treatment. The biopsies were prepared

immunohistochemically (Dako’s Two-Step Polymer Method) and analyzed in microscopes.

On tissue-level a longer pocket epithelium and a greater inflammatory infiltrate in the apical

portion was observed in peri-implantatis. The apical half of the peri-implant tissue generally

indicated a more local inflammatory infiltrate in the contact area than in periodontitis, both

concerning B-cells and neutrophil granulocytes. The level of vascularisation was also higher.

B-cells were predominant in both conditions and had a general distribution in most cases.

Neutrophil granulocytes occurred in a smaller extent than B-cells, above all in periodontitis.

Sammanfattning

Målet med denna studie var att undersöka förekomst och lokalisering av neutrofila

granulocyter (Neutrophil Elastase+) och B-celler (CD20+) hos patienter med kronisk

parodontit och/eller periimplantit. Dessa celler utgör viktiga delar av det specifika respektive

ospecifika försvaret och kan ses som representanter för inflammatoriska svar av olika

karaktär. Inflammerad vävnad innefattande epitel och bindväv insamlades från tjugo lokaler

(tretton med parodontit och sju med periimplantit) på sexton individer som behandlades

kirurgiskt. Vävnaden preparerades immunohistokemiskt (Dako’s Two-Step Polymer Method)

3

och analyserades i mikroskop. På vävnadsnivå iakttogs i samband med periimplantit ett längre

fickepitel samt ett kraftigare inflammatoriskt cellinfiltrat längst apikalt. Den apikala hälften av

periimplantitvävnaden uppvisade som regel mer lokalt koncentrerade inflammatoriska infiltrat

vid kontaktytan än parodontitvävnaden, både gällande B-celler som neutrofila granulocyter.

Graden av vaskularisering var även högre. B-celler dominerade i förekomst vid båda

tillstånden och hade ofta en generell spridning i vävnaden. Neutrofila granulocyter förekom i

mindre utsträckning än B-celler, framförallt vid parodontit.

Förkortningar

IHC: Immunohistokemi

NE+: Infärgning med antikropp Neutrophil Elastase.

ICT: Inflammatoriskt cellinfiltrat

Inledning

Under de senaste 30 åren har den implantatstödda protetiken intagit en allt större roll i

behandlingen av helt eller partiellt tandlösa patienter. Långtidsprognosen anses idag vara

mycket god, ur såväl funktionellt som estetiskt perspektiv (1). Behandlingsformen är dock

långt ifrån komplikationsfri och misslyckanden förekommer fortfarande (2). I en systematisk

översiktartikel från 2002 rapporterades en implantatförlust på 2-5 % under de första fem åren.

Av dessa kunde 40-60 % härledas till biologiska komplikationer (3). Enligt Esposito et al.

(2000) tyder sammantaget kliniska, radiologiska och histologiska fynd på två etiologiska

huvudfaktorer vid implantatförluster, infektion och för stor ocklusal belastning i relation till

benstödet (4). En annan systematisk review som också granskade överlevnaden av

singelimplantat under en femårsperiod rapporterade 54 implantatförluster av totalt 1558

4

(96,8 % överlevnad). Efter belastning uppskattades den årliga förlustsfrekvensen av fixturer

till 0,28. I studien kunde man även rapportera att en stor del av implantatförlusterna var

relaterade till faktorer som direktinstallation eller tidiga belastningar (5).

Den mjuk- och hårdvävnad som omger det osseointegrerade implantatet uppvisar vissa

likheter med parodontiet. En stor skillnad är dock att de kollagena fibrerna ligger parallellt

med implantatytan och inte fäster till den, istället för att vinkelrätt ansluta till rotcementet (2).

När en tand går förlorad försvinner även det kärlplexus som omgett och försörjt

parodontalligamentet och rothinnan. Detta innebär att det implantat som senare installeras i

regionen, kommer omges av en stödjevävnad med förändrad karaktär avseende

vaskularisering (6).

Trots det relativt omfattande forskningsunderlag som idag finns på periimplantit, är

kunskapen avseende etiologi, patogenes och behandling fortfarande bristfällig. Det finns ett

stort antal studier gjorda på human vävnad i hänseende till parodontit, men endast ett fåtal när

det gäller periimplantit. Majoriteten av forskningen har skett på mjukvävnadsnivå. Dessutom

har en stor del av de kliniska studierna utförts på små populationer och framförallt baserat på

biologiskt material från djur, främst hundar, där infektion skapats på konstgjord väg (4, 7, 8).

Även om parodontit och periimplantit uppvisar flera likheter, har man kliniskt iakttagit en

tidvis snabbare progression av vävnadsnedbrytning kring implantat än tänder. Denna

accelererade destruktion härleds av vissa författare till rent histologiska olikheter i den

kringliggande vävnaden. Samtidigt kan det antas att skillnader i det immunologiska svaret

ligger bakom iakttagelsen. I experimentella studier på hund, fick biofilm ackumuleras ostört

på såväl tand- som på implantatytor under en 3-månadersperiod (7). Placket uppvisade då

5

liknande sammansättning på tand och implantat. Utöver detta kunde man visa att den apikala

utsträckningen samt den totala storleken av det inflammatoriska infiltratet var signifikant

(nästan trefaldigt) större i mukosan kring implantat än gingivan runt tänder. Av detta drogs

slutsatsen att värdens svar till den bakteriella utmaningen efter tre månader var mer uttalad

vid implantatmucosit än gingivit. Man kunde dock inte dra några slutsatser om huruvida

liknande mönster gäller för benvävnaden.

Även i kliniska studier utförda på människor har man påvisat en större extension av det

inflammatoriska infiltratet hos periimplantit än vid parodontit. Plasmaceller och lymfocyter

dominerade i båda tillstånden, medan neutrofila granulocyter och makrofager relativt sätt

återfanns i större antal vid periimplantit (9).

Parodontit och periimplatit är båda sjukdomar där immunsystemet spelar en central roll.

Celler från både det specifika och ospecifika försvaret är aktiva såväl skyddande som

nedbrytande av den omgivande vävnaden. De celltyper som väckt stort intresse de senaste

åren är B-celler och neutrofila granulocyter. B-celler är en viktig del av det specifika

immunförsvaret. De kan aktiveras direkt av ett antigen eller via kontakt med en T-lymfocyt

som bundit till det aktuella antigenet. Resultatet blir en s.k. klonal expansion, där B-cellen

multipliceras till mängder av identiska celler. Dessa utmognar till stora plasmaceller, dvs.

högspecialiserade effektorceller som utsöndrar mängder med antigenspecifika antikroppar.

Några av B-cellerna blir även minnesceller (10).

Neutrofila granulocyter utgör en grupp av vita blodkroppar som tillsammans med basofila och

eosinofila granuclocyter ofta benmäns som PMN-celler (polymorfonukleära granulocyter).

6

Cellerna karaktäriseras av stora mängder cytoplasmatiska granula samt den typiska

flerformiga cellkärnan. Av de cirkulerande leukocyterna utgör neutrofiler ca 50-60 % av den

totala mängden. Neutrofiler har en kort livslängd (3-4 dygn) och utgör tillsammans med

makrofagerna första linjens försvar vid infektion eller vävnadsskada. De kan fagocytera

patogener och har en ansenlig arsenal av exocytosiska vesiklar innehållande bland annat

lysozym och elastas (10). Celltypen tros spela en avgörande roll i bennedbrytningsprocessen

vid parodontit och anses var ett tecken på en inflammation av mer akut karaktär (11).

Samtidigt har studier visat påvisat en förhöjd elastasaktivitet i det gingivala exudatet vid

periimplantit i förhållande till kliniskt opåverkade implantat (12). Den forskning som gjorts på

cellsammansättningen vid mucosit och periimplantit ger dock spretande svar. Studier har

redovisat mycket varierande resultat på förekomst av olika immunologiska celltyper i hård-

och mjukvävnader kring implantat (1, 7, 9, 13, 14).

Målet med arbetet var att undersöka förekomst och lokalisering av neutrofila granulocyter

(Neutrophil Elastase+) och B-celler (CD20+) hos patienter med kronisk parodontit och/eller

periimplantit. Intresset för dessa celltyper beror, utöver de tidigare nämnda skillnaderna som

observerats, på att neutrofila granulocyter och B-celler utgör viktiga delar av det specifika

respektive ospecifika försvaret. De kan därför ses som representanter för inflammatoriska svar

av olika karaktär, dvs. det kroniska och det mer akuta.

Material och metod

Vävnadsinsamling

Inflammerad vävnad innefattande epitel och bindväv insamlades från tjugo lokaler (tretton

med parodontit och sju med periimplantit) på sexton (fem män och elva kvinnor,

åldersintervall 30-79 år, medelålder 51,28 år) vuxna, frivilliga individer som behandlades

7

kirurgiskt för parodontit och/eller periimplantit vid två specialistkliniker i Skåne. Tre

vävnadsprov erhölls ifrån avdelningen för Parodontologi vid Odontologiska fakulteten,

Malmö högskola och sjutton ifrån Parodontologiavdelningen på Centrum för

Specialisttandvård i Kristianstad, Folktandvården Skåne. De gingivala biopsierna utgjordes av

proximala lokalisationer kring tänder och implantat som avlägsnades från den uppfällda

lambåns mest koronala del. Vävnadsproverna avidentifierades och sparades i biobanken (enl.

Socialstyrelsen godkänd nr. 497) på avdelningen för Oral Patologi, vid Odontologiska

fakulteten på Malmö Högskola. Proverna tilldelades här ett forskningsnummer, i detta fall

inom intervallen F5 till F9 samt F11 till F21.

Etisk prövning

Protokollet för projektet granskades och godkändes av Odontologiska fakultetens etiska

kommitté vid Malmö högskola. Samtliga patienter informerades om projektets syfte och

disposition innan ingreppen utfördes och fick i samband med detta godkänna sitt deltagande

skriftligen på en samtyckesblankett.

Preparering

Efter biopsitagning fixerades vävnaden i formalin under minst 24 timmar, varefter en

dehydreringsprocess utfördes genom successiv ökning av etanolhalt. Inför

paraffininbäddningen befriades vävnaden från alkohol via s.k. clearing, med xylen som

intermedium. Efter avslutad clearing impregnerades vävnadsbitarna med smält paraffin,

varefter de bäddades in. 3µm snitt erhölls med rotationsmikrotom och placerades på positivt

laddade objektivglas. Varje preparat snittades i serier om fem, dvs. två per antikropp samt en

Mayer’s hematoxylin-eosin (HTX) standardinfärgning.

8

Immunohistokemi

Vävnaderna avparaffinerades med xylen och hydrerades med etanol i sjunkande

koncentrationer (100-96 %) till destillerat vatten. De preparat som skulle färgas in med

antikroppar för B-celler sänktes först ner i TEG-buffertlösning (Tetraetylen glykol) och

förbehandlades med värmemedierad s.k. ”Antigen Retrieval” (program 98C-S30M) i

mikrovågsugn MicroMED T/T Mega till 98°C. Härigenom bröts de metylenbryggor av

korsbundna proteiner som uppstått under fixeringen och som blockerar antigena

bindingsplatser, epitoper. Eftersom epitoperna för antigen mot neutrofil elastas är känsliga för

värme utfördes för dessa ingen förbehandling.

Preparering skedde med Dako’s Two-Step Polymer Method (EnVision™, Dako Sweden AB,

Stockholm). Denna indirekta metod bygger på inbindning och märkning av aktuella epitoper

genom primära antikroppar, till vilka markerande sekundära antikroppar sedan fäster. För att

reducera bakgrundsinfärgning inkuberades glasen först i BSA-buffert (Bovine serum

albumin), som blockerar reaktiva ospecifika bindningsplatser. De primära antikropparna

utgjordes av Neutrophil Elastase, DAKO M0752, klon NP57 (1:200, Dako Antibody Diluent)

för neutrofila granulocyter samt CD20, DAKO M0755, klon L26 (1:200, Dako Antibody

Diluent) för B-celler. Som positiv kontroll för CD20+ B-celler användes human tonsillvävnad

och för neutrofil elastas utgjordes den av human Lingua geografica. Inkubering i HPBK

(Väteperoxidas blocking solution) förhindrar ytterligare antigeninbinding innan sekundär

antikropp tillsätts. För visualisering användes Dako REAL™ EnVision™ Detection System,

Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse. Till den sekundära antikroppen binder här

detektionsreagensen ENV, varefter DAB-lösning (diaminbenzidin + substratbuffert

väteperoxidas) tillsätts. Detta substratsystem producerar en skarpt brunaktig fällning vid

platsen för målantigenet.

9

Sköljning och placering i TRIS-buffert under en minut skedde mellan varje steg.

Hematoxylin-färgning (Dako REAL™ Hematoxylin), utfördes sedan som motfärgning för att

tydliggöra övriga strukturer. Detta basiska färgämne binder till ribonukleinsyror, exempelvis i

cellkärnor och ribosomer som då färgas klarblått (15).

Analys

Genomförandet, analysen och sammanställningen skedde enligt blindtestmetoden, för att

undvika bias. Analysen utfördes av två observatörer. Innan analysen kalibrerade

observatörerna sig i ljusmikroskop (Nikon Eclipse 80i, Nikon instruments Europe,

Amstelveen, Nederländerna). Snitten granskades i mikroskop (Motic BA300, Motic Europe,

Barcelona, Spanien) och kategoriserades individuellt av observatörerna, med fokus på

förekomst av neutrofil elastas och CD20+ celler samt lokaliseringen i den aktuella vävnaden.

Resultaten jämfördes och sammanställdes. För fotografering användes ljusmikroskop Nikon

Eclipse 80i (Nikon Instruments Europe, Amstelveen, Nederländerna), kamera Nikon DS-2Mv

(Nikon Instruments Europe, Amstelveen, Nederländerna) samt dataprogrammet NIS-

Elements Microscope Imaging Software (Nikon Instruments Europe, Amstelveen,

Nederländerna).

Resultat

Generellt kunde vi på vävnadsnivå iaktta skillnader i utseende vid parodontit och

periimplantit. Den vävnad där inflammationen skedde kring implantat uppvisade längre

fickepitel (Bild 1) samt ett kraftigare inflammatoriskt cellinfiltrat längst apikalt.

10

Periimplantitvävaden var innan fixering mer ödematös och som regel rikare på

granulationsvävnad. Den kom ofta trasig och i flera bitar, istället för en hel sammansatt

vävnad vilket fallet var vid parodontit. Histologiskt utgjorde sårytan på 3 av 7

periimplantitbiopsier mer än hälften av den totala längden. Liknande observationer gjordes ej

vid parodontit.

Det inflammatoriska infiltratet och den närmst kringliggande vävnaden vid periimplantit var

generellt rikligare vaskulariserad än vid parodontit (Bild 2). Den apikala hälften av

periimplantitvävnaden uppvisade som regel mer lokala inflammatoriska infiltrat vid

kontaktytan än parodontitvävnaden, både gällande B-celler som neutrofila granulocyter

(Bild 3). Inflammationscellsförekomsten vid parodontit varierade, men var som regel mer

generellt spridd. B-celler dominerade i förekomst vid båda tillstånden och uppvisade också

den en generell spridning i vävnaden. Vid parodontit låg cellerna dock som ett band under

basalmembranet i flertalet snitt (Bild 4).

Neutrofila granulocyter förekom i mindre utsträckning än B-celler, framförallt vid parodontit.

Oftast dominerade neutrofila granulocyter i anslutning till sårytor eller kärlrik

granulationsvävnad (Bild 5,6,7). På vissa periimplantitpreparat sågs en mer generell

infiltration av granulocyter, som då även vandrat upp genom epitelcellslagret ut mot

kontaktytan (Bild 8). Ett antal vävnadssnitt, såväl parodontit som periimplantit, uppvisade

endast väldigt få eller strikt lokala infiltrat av B-celler och/eller neutrofila granulocyter.

11

Diskussion

Resultatet av detta projekt bygger på uppskattningar av ett begränsat och i vissa fall

svårjämförlig urval. Det varierade utseendet innebär att entydiga svar gällande förekomst och

lokalisering av neutrofila granulocyter och B-celler är svåra att ge. Studiens omfattning är

dock jämförbar med tidigare forskning på periimplantit hos människor (8) och en rad tydliga

trender kan identifieras.

Periimplantitvävnadens konsistens efter biopsitagning var som regel mer ödematös och kom

sällan i sammanhängande bitar. Histologiskt iakttogs ett förlängt fickepitel vid periimplantit,

som regel uttunnat och inflammatoriskt reaktivt apikalt åt (Bild 1). Liknande fynd har tidigare

redovisats av Berglundh et al. (8, 14) där en av slutsatserna även var att sårytan i fickas mest

apikla del stod i direkt kontakt med implantatet. Detta stämmer överens med fynden i vår

studie (Bild 6).

Vid parodontit var inflammationen mer allmän och de inflammatoriska cellerna sprida

koronalt (Bild 4). Det ICT som observerades vid periimplantit låg ofta djupt och utgjordes av

mycket kärlrik bindväv, i princip till den grad att bindvävens karaktäristiska kollagena fibrer

var helt ersatta (Bild 2). Detta är ett tecken på frånvaro av sjukdom, vilket antagligen beror på

att antigen inte förkommer på den närstående kontaktytan (17). Samtidigt uppvisade den

koronala delen en fibrös och inflammatoriskt sett cellfri bindväv (Bild 9). Detta stämmer

överens med observationer i tidigare studier av Berglundh el al. (8) samt av Ericsson et al.

(16). Berglundh et al kunde på humant biopsimaterial visa ett mer uttalat ICT vid

periimplantit än vid parodontit, samt att den förstnämnda i de flesta fallen var lokaliserad

apikalt om fickepitelet.

12

Neutrofiler och B-celler återfanns vid både parodontit och periimplantit, men som regel med

stora skillnader i antal. De parodontitbiopsier vi hade att tillgå visade en klar tendens till att

domineras av B-celler, samtidigt som neutrofila granulocyter i några av dessa var fåtaliga

eller saknades helt. Detta ligger i linje med tidigare redovisade resultat av Nussbaum och

Shapira (18) om att neutrofiler dominerar i det tidiga stadiet, dvs. gingivit, för att sedan

kraftigt avta i takt med utvecklingen av parodontit. Berglundh (8) är inne på samma spår,

“Plasmaceller och lymfocyter dominerade i båda lesionerna, medan neutrofila granulocyter

och makrofager återfanns i större relativa proportioner vid periimplantit än vid parodontit”.

Även de neutrofila granulocyternas lokalisation skiljde sig mellan parodontit och

periimplantit. På parodontitbiopsierna tycktes B-cellsansamlingar formera sig på två distinkta

sätt, antingen som breda band under basalmembranet (Bild 4) eller som spridda laterala stråk

genom bindväven. I de fall av parodontit där neutrofiler kunde identifieras, var de framförallt

lokaliserade djupt och perivaskulärt.

Tidigare studier har dragit slutsatser om att neutrofiler vid parodontit skapar en barriär mellan

epitel och plack i sulcus (19), vilket kan förhindra bakteriell invasion av den underliggande

bindväven (13, 20). Detta fenomen kunde vi inte observera vid parodontit. Däremot kunde det

ses vid periimplantit hos ett antal individer. Det föreföll i dessa fall som att neutrofiler vandrar

upp genom epitelcellslagret och lägger sig i den skadade keratinytan (Bild 8). Detta kan

tänkas vara en konsekvens av att epitelcellslagret skadats. Härmed rekryteras PMN-celler

kemotaktiskt genom att de celler som befinner sig i omgivningen signalerar för en akut

infektion. PMN-cellerna utgör tillsammans med natural killer celler kroppens insatsstyrka (21,

22). Detta första svar är dock inte enbart skyddande. Scott et al beskrev i en nyligen

13

publicerad artikel det neutrofila skyddet som ett tveeggat svärd, där en överaktivitet kan

orsaka vävnadsskada samt förlänga och förstärka den parodontala sjukdomen (23).

I samtliga parodontitbiopsier kunde neutrofila granulocyter och/eller B-celler identifieras.

6 av 7 periimplantitbiopsier uppvisade omfattande ICT. Dock skedde ingen infärgning av

neutrofilt elastas eller CD20 i ett av vävnadsproven. I tidigare studier har man visat att den

inflammatoriska processen i vissa periimplantitlesioner tycktes gå i skov. Detta innebär att

mer stabila perioder varvades med perioder av snabbare progression, där den infekterade

vävnaden nådde den alveolära benmärgen (7). Den periimplantitbiopsi där infärgning uteblev

kan tänkas representera en mer stabil fas av sjukdomsförloppet.

Det fanns potentiella felkällor i studien. Urvalet utgjordes av de patienter som fanns

tillgängliga på de två aktuella klinikerna och som behandlades kirurgiskt under perioden

augusti 2011 till november 2011. Detta medförde en ojämn fördelning mellan de två

sjukdomstillstånden. Det begränsade antalet patienter som behandlades medförde att vi ej

kunde ta hänsyn till anamnesiska uppgifter såsom allmänsjukdomar, medicinering eller

tobaksbruk. Dessa kan tänkas påverka sjukdomsförloppet. Biopsierna avlägsnades av olika

operatörer, vilket kan ha inneburit variationer i utförande och omfattning. Den tid vävnaden

fick ligga i formalin kan ha varierat eftersom en del av vävnaden skickades per post. Detta

kan ha inneburit skillnader i antalet metylenbryggor av korsbundna proteiner, vilket har en

inverkan på antalet epitoper tillgängliga för antikroppar. Immunohistokemin utfördes

dessutom vid olika tillfällen, samt manuellt av två individer. Detta medför att mindre

variationer i metoden kan tänkas ha förekommit.

14

Konklusion

Kliniskt utgjordes biopsierna vid parodontit av en sammanhängande vävnadsbit med fast

konsistens. Periimplantitvävnaden var däremot trasig och ödematös. På vävnadsnivå

uppvisade periimplantitbiopsierna betydligt rikligare vaskularisering. Intakt fickepitel sågs

generellt betydligt längre apikalt vid periimplantit i jämförelse med parodontit. På cellnivå

dominerade B-celler i förhållande till neutrofila granulocyter vid båda inflammationstyperna.

Lokaliseringen av det inflammatoriska infiltratet var vid parodontit mer generellt spridd

medan periimplantitvävnaden ofta uppvisade kraftiga, lokala ansamlingar vid tandköttsfickans

mest apikala del.

Referenser

1. Xu L, Yu Z, Lee HM, Wolff MS, Golub LM, Sorsa T. Characteristics of collagenase-2

from gingival crevicular fluid and peri-implant sulcular fluid in periodontitis and peri-

implantitis patients: pilot study. Acta Odontol Scand. 2008; 66: 219-224.

2. Meffert RM. Periodontitis vs. peri-implantitis: the same disease? The same treatment? Crit

Rev Oral Biol Med. 1996; 7: 278-291.

3. Berglundh T, Persson L, Klinge B. A systematic review of the incidence of biological and

technical complications in implant dentistry reported in prospective longitudinal studies of at

least 5 years. J Clin Periodontol. 2002; 29 Suppl 3: 197-212; discussion 232-3.

4. Esposito M, Thomsen P, Ericson LE, Sennerby L, Lekholm U. Histopathologic

observations on late oral implant failures. Clin Implant Dent Relat Res. 2000; 2: 18-32.

15

5. Jung RE, Pjetursson BE, Glauser R, Zembic A, Zwahlen M, Lang NP. A systematic review

of the 5-year survival and complication rates of implant-supported single crowns. Clin Oral

Implants Res. 2008; 19: 119-130.

6. Scardina GA, Pisano T, Messina M, Rallo A, Messina P. "In vivo" evaluation of the

vascular pattern in oral peri-implant tissues. Arch Oral Biol. 2011; 56: 148-152.

7. Heitz-Mayfield LJ, Lang NP. Comparative biology of chronic and aggressive periodontitis

vs. peri-implantitis. Periodontol 2000. 2010; 53: 167-181.

8. Berglundh T, Zitzmann NU, Donati M. Are peri-implantitis lesions different from

periodontitis lesions? J Clin Periodontol. 2011; 38 Suppl 11: 188-202.

9. Gualini F, Berglundh T. Immunohistochemical characteristics of inflammatory lesions at

implants. J Clin Periodontol. 2003; 30: 14-18.

10. Murphy KP, Janeway CA, Walport M, Ehrenstein M, Travers P. Janeway's

immunobiology, (7th edition). New York: Garland Science; 2008.

11. Ohlsson K, Olsson I. The neutral proteases of human granulocytes. Isolation and partial

characterization of two granulocyte collagenases. Eur J Biochem. 1973; 36: 473-481.

12. Hultin M, Gustafsson A, Hallström H, Johansson LA, Ekfeldt A, Klinge B.

Microbiological findings and host response in patients with periimplantitis. Clin Oral

Implants Res. 2002; 349-58.

13. Gemmell E, Yamazaki K, Seymour GJ. Destructive periodontitis lesions are determined

by the nature of the lymphocytic response. Crit Rev Oral Biol Med. 2002; 13: 17-34.

16

14. Berglundh T, Gislason O, Lekholm U, Sennerby L, Lindhe J. Histopathological

observations of human periimplantitis lesions. J Clin Periodontol. 2004; 31: 341-347.

15. Dako M. Dako REAL™ EnVision™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse

K5007. 201205 (3rd edition).

16. Ericsson I, Berglundh T, Marinello C, Liljenberg B, Lindhe J. Long-standing plaque and

gingivitis at implants and teeth in the dog. Clin Oral Implants Res. 1992; 99-103.

17. Mackler BF, Frostad KB, Robertson PB, Levy BM. Immunoglobulin bearing lymphocytes

and plasma cells in human periodontal disease. J Periodontal Res. 1977; 37-45.

18. Nussbaum G, Shapira L. How has neutrophil research improved our understanding of

periodontal pathogenesis? J Clin Periodontol. 2011; 49-59.

19. Attström R SH. Effect of experimental neutropenia on initial gingivitis in dogs. Scand J

Dent Res. 1979; 7-23.

20. Hemmerle J FR. Bacterial invasion of periodontal tissuesafter experimental

immunosuppression in rats. J Biol Buccale. 1991; 271-82.

21. Kobayashi SD, Voyich JM, Burlak C, DeLeo FR. Neutrophils in the innate immune

response. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2005; 505-17.

22. Bhatnagar N, Hong HS, Krishnaswamy JK, Haghikia A, Behrens GM, Schmidt RE et al.

Cytokine-activated NK cells inhibit PMN apoptosis and preserve their functional capacity.

Blood. 2010; 1308-16.

17

23. Scott DA, Krauss J. Neutrophils in periodontal inflammation. Front Oral Biol. 2012; 15:

56-83. Epub 2011 Nov 11.

Bilder

Bild 1. F14 C HTX. Periimplantitvävnad med långt fickepitel och intakt kontaktyta. Bindväven är

fibrös och innehåller få inflammatoriska celler. Snittets nedre begränsning ses i bild 3. Ursprunglig

förstoring x4.

18

Bild 2. F20 HTX. Rikligt vaskulariserad bindväv i ICT vid periimplantit. Pilarna pekar på tvärsnittade

blodkärl med infärgade blodkroppar. Ursprunglig förstoring x4.

Bild 3. F14 C. Skillnaden i lokalisation mellan neutrofila granulocyter och B-celler i

periimplantitvävnad. (A) NE+: Neutrofila granulocyter i den inflammerade kontaktytan. (B) CD20+:

Kraftiga ansamlingar av B-celler djupt i apikal riktning såväl mot implantatytan (IMPL.) som mot

benet (BEN). Ursprunglig förstoring x4.

19

Bild 4. F13B. CD20+: Kraftigt infärgat band av B-celler i hela lamina propria vid parodontit.

Ursprunglig förstoring x4.

Bild 5. F20. NE+: Granulationsvävnad vid periimplantit dominerad av neutrofila granulocyter. Snittet

är karaktäristiskt för periimplantitvävnaden, där neutrofila granulocyter alltid sågs tätt i anslutning till

kärlrik bindväv. Ursprunglig förstoring x10.

20

Bild 6. F5 NE+: Neutrofila granulocyter i anslutning till såryta vid parodontit. Dessa ansamlingar av

neutrofila granulocyter, i nära anslutning till infektionskällan, sågs både vid parodontit och vid

periimplantit. Ursprunglig förstoring x4.

Bild 7. F20 (A) NE+: Täta ansamlingar av neutrofila granulocyter generellt i bindväven vid

periimplantit. (B) CD20+: Enstaka, glest spridda B-celler. Ursprunglig förstoring x4.

21

Bild 8. F11. NE+: Neutrofila granulocyter lokaliserade i, och strax under epitelet som legat an

implantatet. Tunt epitellager med insprängda granulocyter, vilket uteslutande observerades vid

periimplantit. Ursprunglig förstoring x4/x10.

Bild 9. F14C, NE+: Inflammatoriskt cellfattig koronal del av periimplantitbiopsi. Vid parodontit

observerades motsatt ett mer generellt ICT spritt i hela bindväven, se bild 4. Ursprunglig förstoring x4.

22

Tabeller

Snittjocklek 3 µm. Varje biopsi snittades i serier om fem, dvs. två per antikropp samt en

Mayer’s hematoxylin-eosin (HTX) standardinfärgning. Antikropparna utgjordes av CD20+

för B-celler och Neutrophil Elastase+ för neutrofila granulocyter. Biopsierna granskades med

mikroskop i förstoringarna x4, x10 och x40. Efter granskning grupperades biopsierna utefter

diagnos. Resultatet sammanställdes i tabellerna nedan.

1. Parodontitvävnad.

Biopsi,

nr

HTX

CD20+

NE+

Tendens

F5

Två sammanhållna

bitar. Epitel och

bindväv, en mindre sår

yta på en vävnadsbiten.

Inflammationsceller i

hela bindväven.

ICT utgörs i huvudsak av

CD20+ celler.

Kraftigt infärgat i sårytan

nära anslutning till

tanden.

Övervägande

CD20+ celler i

bindväven.

Elsatas i såryta

och den

närliggande

vävnaden.

F6

Huvudsakligen

bindväv, den mest

koronara delen är

epitelklädd. En del

granulationsvävnad.

Cellrik bindväv.

Små, täta,

cellansamlingar på djupet

i anslutning till tandytan.

Små områden med

Elastas+, Kraftigast

infärgat vid såryta och

granulationsvävnad –

glesare än CD20.

Något fler B-

celler, ffa i ICT.

Elastas återfinns

vid såryta och

kärl.

F7

Epitel och cellfattig

bindväv. Avsaknad av

såryta.

Inga celler.

Mindre cell-

ansamlingar, spridda i

bindväv/epitel som legat

ann mot tandytan.

Få PMN-celler,

inga B-celler.

F8

Lång biopsi i flera

olika delar. Epitel och

fibrös bindväv. En

mindre sår yta i

kontaktepitelet.

Kraftiga välavgränsade

infärgningar strax under

epitelet.

Litet infärgat område

precis under epitelet i

sårytan.

Betydligt fler

B-celler, som

lokaliserat sig

som ett band i

anslutning till

basalmembranet.

23

F12

Epitel, ben- och

benvävnad. Inget

tydligt ICT, endast

utspridda stråk av

celler i bindväven.

Kraftigt infärgad central

ansamling med utgående

stråk av celler.

Endast väldigt fåtal

infärgade mängd elastas,

i närheten av epitellagret

och vad som förfaller var

ett litet sår med

anslutande kärl.

Betydligt fler B-

celler. De lilla

mängd Elastas

som finns är ffa

kring kärl.

F13 A

Epitel klädd bindväv.

Intakt och väl-

avgränsad vävnad. ICT

går som ett brett band

under epitelcellslagret.

Den underliggande

bindväven är cellfattig.

Stora cellansamlingar

lokaliserade som ett brett

band strax under epitelet.

I princip ingen

infärgning.

Betydligt fler B-

celler i ett band

under epitel.

F13 B

Epitel klädd bindväv.

Intakt och

välavgränsad vävnad.

ICT går som ett brett

band under

epitelcellslagret. Den

underliggande

bindväven är cellfattig.

Brett band av celler strax

under basalmembranet.

Inga infärgade celler.

Betydligt fler B-

celler i ett band

under epitel

F15

Epitel, bindväv och

granulationsvävnad.

Bindväven innehåller

fibrösa områden

varvade med mer

cellrika.

Utspridda koncentrerade

kluster av B-celler på

flera platser över hela

snittet.

Enstaka celler utspritt

över snittet, främst i blod

eller kärl.

Betydligt fler B-

celler.

F16 A

Bitar med epitel och

bindväv, eller bara

bindväv. Generellt

cellrik bindväv.

Granulationsvävnad.

Enstaka utspridda

B-celler generellt samt

tätare, mindre

ansamlingar lokalt.

Kraftigt infärgat i

granulationsvävnaden. I

bitarna med epitel och

bindväv i betydligt lägre

grad och då främst i

anslutning till blod.

Fler PMN-celler

generellt, dock i

princip

uteslutande i

granulations-

vävnad eller

blod.

F16 B

Kraftigt epitel. Cellrik

bindväv generellt, men

främst apikalt åt.

Kraftigt infärgat stråk

nära snittytan samt

talrika, men mer

utspridda B-celler

djupare ner i bindväven.

Neutrofilt elasats

uteslutande vid kärl eller

i anslutning till blod.

Fler B-celler,

PMN-cellerna

lokaliserade i

granulations-

vävnad.

F18

Epitel och mycket

cellfattig, fibrös

bindväv.

Kraftigt infärgande lokala

kluster, samt enstaka

spridda B-celler i

bindväven.

Små mängder neutrofilt

elastas, huvudakligen i

anslutning till blodkärl.

En del lokala

ansamlingar av

B-celler, få

PMN-celler.

24

F19

Flera större bitar. En

med epitel och

bindväv, andra med

endast bindväv.

I biten med epitel ses

stråkiga cellinfiltrat i

bindväven. I övriga bitar

finns enstaka, kraftiga

och välavgränsad

ansamlingar.

Ingen neutrofil elastas på

någon av vävnadsbitarna.

En del B-celler,

inga PMN-

celler.

F21

Flera mindre bitar. En

bit med epitel och lite

bindväv, resten

antingen eller.

Benvävnad.

Ansamlingar av B-celler i

lokalt i bindväven, strax

under epitelet.

Mindre mängd neutrofil

elastas vid sårytan av

snittets mest apikala del.

B-celler lokalt i

bindväven, få

PMN-celler vid

sårytan.

2.Periimplantitvävnad

Biopsi,

nr

HTX

CD20+

Elastas+

Tendens

F9

Epitel och bindväv ses,

men vävnaden är trasig

och i bitar. Orientering

är svår.

Cellansamling centralt i

bindväven. B-cellerna

dominerar kraftigt.

Ytterst lite infärgat

neutrofilt elastas.

Något fler B-

celler lokaliserade

centralt i

bindväven. Få

PMN-celler.

F11

Epitel och bindväv,

välavgränsat. Stort

ICT, som upptar mer

än halva kontaktytan.

Enstaka utspridda celler,

samt ett kluster nära

implantatytan.

Uspridda infärgningar

strax under och i epitel,

ffa vid implantatytan.

Neutrofilt elastas ses

även i blodkärl.

Mycket fler

PMN-celler.

F14 A

Endast fibrös bindväv,

svår orientering.

Inga infärgade celler.

Ingen neutrofil elastas.

Inga B- eller

PMN-celler.

F14 B

Hyperkeratiniserat

epitel och bindväv.

Mindre cellansamling

djupast ner i fickan.

Ingen neutrofil elastas.

Få B-celler, inga

PMN-celler.

F14 C

Epitel och bindväv

Stora cellansamlingar

djupt i bindväven

Mindre mängd

neutrofilt elastas intill

implantatytan

Fler B-celler, få

PMN-celler

25

F17

Epitel och bindväv,

med epitelbitar

insprängt i bindväven

Cellrikt i det epitel som

är lokaliserat i bindväven

Infärgningar i blod,

samt insprängt i

epitelet i bindväven

Något fler B-

celler, få PMN-

celler

F20

Flera bitar, bestående

främst av kärltät

bindväv. Sparsamt med

epitel.

Enstaka B-celler spridda

i bindväven

Väldigt mycket

neutrofilt elastas och

infärgade celler

generellt i hela

bindväven

Mycket fler

PMN-celler

Bilaga

Immunohistokemi, manuell körning:

1. Preparat samt kontroller till antikropparna snittas på Plus-glas. Två snitt placeras per

glas och torkas 40 min i torkskåp vid 65°C.

2. Avparafiniering till destillerat vatten.

3 x 7 min Xylen

3x 7 min ABS

2 x 3 min 96 % sprit

5 min dest H2O

3. De snitt vars primära antikropp utgörs av CD20 placeras i bägare med TEG-buffert

och behandlas med mikrovågor under 20 minuter, med en maxtemperatur på 98°C.

Övriga snitt gick direkt till steg 6.

4. Bägaren placeras under rinnande H2O i 10 min.

5. Glasen placeras 5 min i dest H2O.

6. Glasen placeras 5 min i TRIS-buffert.

7. Vävnaden täcks med 150-200 (beroende på snittstorlek) µl BSA och glasen placeras 5

min i inkubationskammare.

8. Glasen sköljs av och placeras i kyvett med TRIS-buffert 1 min.

9. Glasen torkas av på baksidan, täcks med 150-200 µl primär antikropp och inkuberas i

25 min för CD20 (1:200, DAKO M0755, klon L26) respektive 45 min för Neutrophil

26

Elastase (1:200, DAKO M0752, klon NP57).

10. Glasen sköljs av och placeras i kyvett med TRIS-buffert 1 min.

11. Glasen torkas av på baksidan och täcks med 150-200 µl HPBK och inkuberas i 5 min.

12. Glasen sköljs av och placeras i kyvett med TRIS-buffert 1 min.

13. Glasen torkas av på baksidan och täcks med 150-200 µl ENV och inkuberas i 25 min.

14. Glasen sköljs av och placeras i kyvett med TRIS-buffert 1 min.

15. Glasen torkas av på baksidan och täcks med 150-200 µl DAB och inkuberas i 5 min.

16. Glasen sköljs av och placeras i kyvett med TRIS-buffert 1 min.

17. Glasen torkas av på baksidan och täcks med 150-200 µl HTX och inkuberas i 1 min.

18. Glasen sköljs av och placeras i dest H2O i 5 min, 96 % sprit i 3-5 min, ABS i 2 min,

Isopropanol i 2 min varefter montering sker.