Pneumonologie 144, 182--190 (1971) © by Springer-Verlag 1971

Elektronenmikroskopisehe Untersuehungen zum Problem der Lungendifferenzierung vor und naeh der Geburt bet Ratten*

W. NOACK u n d H. J. ME~KER

II. Anatomisches Institut der Freien Universit~t Berlin (Direktor: Prof. Dr. W. Schwarz)

Electron Microscopic Studies o] Lung Di//erentiation o/Rats Ante and Post Partum

Abstract. Rat lungs were studied by light and electron-microscopy. Moreover, the lungs of rat embryos (day 15) were cultivated in a modified Trowell solution. I t could be observed that on day 16 a.p. the lungs looked like a tubular gland. The tubuli were lined with cuboid epithelia. On day 18 first differentiations into type I cells (membranous pneumonocytes) and type II cells (granular pneumonocytes) were noted. Lamellar bodies occur as late as day 19. At the same time, the rough cndoplasmic reticulum increases and is now mainly localized in the apical cellular region. Especially on day 17 and 18 a.p. the vascular system increases by proliferation. On day 22 the morphological maturation has come to an end in most parts of the lungs. Until day 8 p.p., however, some parts still show an immature stage; lumina are hardly to be seen, and the type I I cells have flattened only to a small degree. Moreover, studies in cultures have sho~,al that the differentiation of the epithelial cells represents a genuine process which proceeds without any functional involvcment. The typical structural formation of the terminal parts of the lungs into alveoli is, however, closely related to the mesenchymal and vascular growth and functional involvement.

Zusammen/assung. Wir untersuchten die Lungen yon Ratten licht- und elektxonenmikro- skopisch. Dariiberhinaus wurden die Lungen yon 15 Tags alten Rattenfeten in ether modi- fizierten Trowell-L6sung kultiviert und wie oben untersucht. Dabei fanden wit, dab die Lunge am Tag 16 a.p. das Aussehen ether tubuliiren Driise h~t. Die Tubuli sind mit hohen kubischen Epithelien ausgekleidet. Erste Differenzierungen in Dcckzellcn und Nischenzellen beginnen am Tag 18. Am Tag 19 treten dann erstmals Lamellark6rper auf. Gleiehzeitig ist das rauhe ER vermehrt und nach apikal verlagert. Das Gcf~i/3system w~chst besonders am Tag 17 und 18 a.p. durch Sprossung. Die morphologischc Reifung ist bis zum Tage 22 in den iiberwiegenden Teilen der Lunge abgeschlossen. Bis zum Tags 8 p.p. zeigen jcdoeh noch immer vcreinzclte Bezirke Zeichen grol]er Unreife, die Lumina sind hier kaum erSffnet, die Deckzellen haben sieh erst wenig abgeflacht. Versuche mit Kulturen haben dariiberhinaus gezeigt, dal~ die Diffe- renzierung der Epithelzellen wohl einen genuinen Vorgang darstellt und sich auch ohne funktionelle Beanspruchung entwickelt. Die typische Strukturierung der terminalen Lungen- bezirke in Alveolen h~ingt jedoeh eng mit dem Mesenchyru. und Gefgl~wachstum und der funktionellen Beanspruehung zusammen.

Das AAF-Sys tem (Surfactant) ist ffir die Funkt ions t i i ch t igke i t der Lunge yon gvoi]er Wicht igkei t (Avery, 1962; Mendenhal l u. Mendenhall , 1964; Pat t le , 1966; Schoedel u. Rfifer, 1968; Scarpelli, 1968). Seine chemische Zusammcnse tzung ist in jfingster Zeit in zahlreichen VerSffentl ichungen aufgeld~rt worden (Klaus et al., t 9 6 I ; Pa t t le u. Thomas, 1961; Abrams, 1966). Die genaue Morphologie dieses Systems und die seiner Bi ldungss t£ t t en ist, fiir die Beur te i lung der Lungenre i fung yon grol~em Interesse (~¥eibel u. Gil, 1968; Buck ingham et al., 1966). F i i r die

* Mit Unterstiitzung der DFG im Rahmen des SFB ,,Embryonal-Pharmakologie".

Elektronenmikroskopisehe Untersuchungen bei Rat~en 183

Aufblfihung der Lunge im Moment der Geburt ist eine weitgehende Ausdifferen- zierung des Lungengewebes zu diesem Zeitpunkt Voraussetzung. Dabei soltte die Lunge folgende morphologische Reifezeichen zeigen: Eine weitgehende Septierung der Lunge, eine Differenzierung der Lungenepithelien in Deekzellen und Nischen- zellen, eine epitheliale und endothcliale Basalmembran, einen engen Kontakt der Gef/~Be zum Alveolarlumen mit starker Abflachung der Endothelien.

Mehr noch als bei reffen Feten ist der Differenzierungsgrad yon Lungen Frfih- geborener ffir deren Lebensf//higkei~ yon /ibcrragender Bcdeutung. Neben einer Reihe anderer Faktoren k6nnte n/~mlich auch eine mangelhafte Ausdifferenzierung der Lunge f/ir das Nieh~/iberleben Friihgeborener wesentlich mitentscheidend sein und in einigen Fgllen bei sons~iger Organreife limitierend wirkcn.

Die Kenntnis der priinatalen Lungenmorphologie, insbesondere die der sp/it- fetalen Phase kann deshalb Hinweise auf die Lungenfunktion und damR die Lebensf&higkeig Neugeborener geben. Wir haben datum die Lungen yon Ratten- feten zwischen dem Tag 16 ante partum und dem Tag 10 post partum untersucht. (Weitere Ergebnisse siehe Noack, 1970; Noack u. Schwarz, 1971.)

Dabei interessierten folgende 4 Gesichtspunkte vornehmlich :

1. Die Vergnderung der Lunge bei der Entwicklung yon einem drfisigen Organ zum Atmungsorgan und damit verbunden die Differenzierung der Epithelien zu den t3rpischen atveolgren Deckzellen und ~Tischenzellen der reifen Lunge.

2. Der Entstehungsort und der Entstehungszeitpunkt der Lamellark6rper. 3. Die Entwicklung des rauhen ER in den Nischenzellcn, als dem m6glichen

Syn~heseort ffir die Eiweifie in der Hypophase. 4. Die Entstehung und Anordnung des GefgBsystems in der Lunge und dessen

m6glicher EinfluB auf die endgfiltige Lungenstruktur.

Material und Meth0den

Untersucht wurden Lungen von Ratt~nembryonen (Wistar-Stamm FW 68) mit umge- kehrtem Tag-lN~cht-Rhythmus. Die Begat.tung erfolgte zwisehen 7.30 und 9.30 Uhr. Die ersten 24 Std nach der Befruchtung werden als Tag 0 bezeichnet. Fixation mit modifizierter Karnovsky-L6sung, Nachfixierung mit 1~/o OsOa. Entw~isserung in der aufsteigenden Aeeton- reihe und Einbettung in Mikropal (Ferak, Berlin). Untersuehung der Priiparate im Lieht- mikroskop (Giemsa) und im Elmiskop 1 und la. Zur Kultivierung der Lunge benutzten wit eine modifizierte Trowell-Kultur. Einbettung und Untersuchung erfolgte wie oben.

Befunde

Am Tag 16 finden sich die typischen Strukturen einer tubul/~ren Drfise mi~ hohen kubischcn Lungenepithelien. Die Alveolarlumina sind weitgehend un- er6ffnet. In den basalen Zellbereichen findet sich reichlieh rauhes EI~. Eine Basal- rnembran an der Grenze zum Bindegewebsraum ist gerade ira Entstehen begriffen, jedoch noch nicht vollstitndig kondensicrt. Im epithelialen Lungengewebe werden reichlieh Mitosen angetroffen. Am Tag 18 beginnt die Differenzierung in alveol~re Deckzellen und Nischenzellen, wobei die Nischenzellen reich an Glykogen sind und eine Vergr6flerung des Golgi-Apparates aufweisen. Gleichzeitig zeigt sich in diesen Zellen eine Verlagerung des rauhen ER in die apikalen Zellbezirke und eine starke Zunahme dieser mit Ribosomcn besetzten Mcmbransysteme. Am Tag 19 treten erste Lamellark6rper, die Vorstufen des Oberfl/~chenfihns, also Prosekretgranula

184 W. Noack und H. J. Merker:

Abb. 1. Lunge Tag 17 a.p. Hohe kubische Lungenepithelien (E). Die apikalen Zellmembranen tragen zahlreiche Mikrovilli (/7). L Lumen, B Bindegewebe. VergrSlterungg 1 : 6000

Elektronenmikroskopische Untersuchungen bei Ratten 185

darstellen, in den Nischenzellen auf. Sie zeigen h/~ufig enge Nachbarschaft zum Golgi-Apparat. AuSerdem treten membranbegrenzte Vesikel mit elektronen- dichtem Inhalt auf. Die alveol/~ren Deckzellen sind nun st/~rker abgeflacht, der Bindegewebsraum zwischen den Hohlr/~umen mit abgeflachten Epithelien ist schmaler geworden. Diese Entwicklung setzt sich bis zum Tag 22, dem Geburts- termin, fort. Dabei wird der Bindegewebsraum an einigen Stellen noeh welter verschm~lert, so dab erste Septierungen zu erkennen sind. In diesen Bezirken zeigt die Blut-Luft-Barriere bereits alle Reffezeichen: maximal abgeflachte Deck- zellen, eine verschmolzene epitheliale und endotheliale Basalmembran, stark an das Alveolarlumen angen£herte Bluteapillaren mit diinn ausgezogenen Endo- thelien. Die Zahl der LamellarkSrper hat stark zugenommen. Im Alveolarlumen werden reiehlich myelin/~hnliche Figuren und Gitterstrukturen angetroffen.

In den ersten 8 Tagen post partum zeigen jedoch einige Lungenbezirke immer noch Zeichen grol3er Unreife. Echte Septierungen fehlen in diesen Regionen, die Blutcapillaren haben keine enge Nachbarschaft zur gasaustauschenden Ober- fl/~che. Eine endgiiltige Reffung des gesamten Systems wird erst am Tag 10 post partum gefunden.

Entwieklung des Geliillsystems

Das Gcf/~13system ist am Tag 16 nur sp/~rlich entwickelt. Wenige Gef/~13e liegcn im Bindegewebsraum. Sie haben noch keinen Kontakt zu den Epithelien. Daneben finden sich plumpe Zellen, die durch ,,tight junctions" miteinander verbunden shad und die kleine Lumina zwischen sich freilassen. Ihre Oberfl/~ehe ist h/~ufig dureh Forts/~tze unregelm/~flig gestaltet. Ihr Cytoplasma enth/flt neben vielen freien Polysomen zahlreiche andere Zellorganellen. Dieses Bild entspricht Schnitten durch GefaBsprossungen. Solehe Vorg/~nge waren am Tag 17 und 18 besonders deutlich zu beobachten, so daft mit dem Tag 19 die Gef/iBe an Zahl erheblich zugenommen hatten. Bis zum Geburtstermin am Tag 22 gewinnen die Capillaren unter Abflachung ihrer Endothelien und Ausbildung einer Basalmembran r~um- lich AnsehluB an die Alveolarlumina. Im endgiiltigen Zustand betr/igt der Ab- stand zwischen den Zellmembranen der Endothelzelle und der Deckzelle etwa 0,2--0,4

Lungenkulturen Dariiberhinaus wurden 15 Tage alte Lungen 3, 7 und 10Tage lang kultiviert.

(Noack et al., 1970) Dabei land sich nach 7 Tagen Aufenthalt in der Kultur eine wcitgehende Ausdifferenzierung der Lungenepithelien. Auch die Flimmer- und Becherzellen der Bronchen waren roll ausgebildet. Die Endabschnitte der Driisen- schl/~uche sind weitlumig er6ffnet, ohne jedoch eine alveolcn/ihnliche Einschnfirung zu zeigen. Ein Gef/il3wachstum erfolgt nicht. Die typischc Lungcnstrukturierung wie sic in vivo erfolg~, kann also nicht gesehen werden.

Ergebnisse Zusammenfassend ergaben sich bei unseren Untersuehungen folgende Er.

gebnisse : 1. Die Lunge wird a]s drfisiges Organ angelegt und differenziert sich erst kurz

vor der Geburt in das Atmungsorgan. Erste Differenzierungen in alveolKre Deck- zellen und Nischenzellen beginnen am Tag 18.

186 W. Noack und H. J. Merker:

Abb. 2. Lunge Tag 21 a.p. BegiImende Septierung der Lunge. Ausdifferenzierung in Nischen- zellen (N) und alveol~re Deekzellen (D). L Lamellar-KSrper, M myelini~hnliche Figuren.

K Capillare. VergrSBerung 1:12000

Elektronenmikroskopische Untersuchungen bei Ratten 187

Abb. 3. Lunge Tag g post partum. Fehlende Septierung in diesem Lungenbezirk. N Nischen- zellen, D Deckzellen, L Alveolarlumen. Vergr613erung 1 : 12000

188 W. Noaek und H. J . Merker:

Abb. 4. Aussprossung eines Gef~l]es am Tag 17 a.p. ~ (/z) Kontaktstellen zwischen Endothel- zellen (=) . VergrSBerung 1:12000

Abb. 5. Elektronenmikroskopisches Bild einer embryonalen Lunge vom Tag 15, die 7 Tage kultiviert wurde. F Flimmerepithelzelle, K Kinocilien. VergrSBerung 1 : 18000

Eiektronenmikroskopische Untersuchungen bei Ratten 189

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Abb. 6. Liehtmikroskopisches Bild einer embryonalen Lunge vom Tag 15, die 3 Tage kultiviert wurde. Noeh weitgehend driisige Struktur der Lunge. Vergr6Berung 1:350

L _ _ •

Abb. 7. 15 Tage aite embryonale Lunge, 7 Tage kultiviert. Vergr6Berung der Lumina jedoch ohne deutliche Alveoleneinteilung. Vergr6Berung 1 : 400

2. Die Vorstufen ffir das AAF-System (Surfactant), welcher fiber das rein mechanische Moment der Einatmung hinaus erst eine Aufbl/ihung und damit Funktionstfichtigkeit der Lunge erlaubt, werden am Tag 19 bei der Rat te ge- bildet. Dem voraus geht eine erhebliche Vergr6Berung des Golgi-Apparates. Das

190 W. Noack und H.J. Merker: Elcktroncnmikroskopische Untersuchungen bei Ratten

Auft re ten der Lamellark6rper am Tag 19 stellt einen wiehtigen Zei tpunkt in der Entwieklung dar und ist fiir die Frage nach dem ~ber leben yon Frfihgeborenen mitentscheidend.

3. Die Vermehrung des rauhen E R in den Nischenzellen und seine Verlagerung in die apikalen Zellbezirke nahezu gleichzeitig mit dem Auftre ten der Lamellar- k6rper k6nnte mit einer Synthese und Sekretion yon Eiweil~en als den m6glichen Bausteinen der Hypophase in Zusammenhang stehen.

4. Das Gef~Bsystem erf~hrt dureh Sprossung am Tag 17 und 18 ante p a r t u m eine starke Ausbildung. 3, 7 und 10 Tage alte Kul turen von 15 Tage alten Lungen zeigen, dab eine Entwicklung der Epithel ien und deren spezfllsche Differen- zierungen auch in vitro erfolgen. Das Gef~Bsystem ist jedoeh fiir die endgfiltige Lungens t ruk tur yon gro~er Bedeutung (Noack et al., 1970). I n der Kul tu r k o m m t cs lediglich zur Ausbi ldung grol~er Lumina ohne Alveoleneinteilung. Dazu ist offenbar kein mechanisehes Moment (Einatmung) n6tig, sondern die Differenzie- rung steUt einen genuinen, genetisch fixierten Vorgang dar. Das Gef/iBsystem und die Tex tu r des Bindegewebes spielen wahrscheinlich cine Rolle bei der Struktu- r ierung der Endabsehni t t e in Alveolen.

Literatur Abrams, M. E.: Isolation and quantitative estimation of puhnonary surface-active lipoprotein.

J. appl. Physiol. 21, 718--720 (1966). Avery, M. E. : The alveolar lining layer: a review of studies on its role in pulmo,mry mechanics

and in pathogenesis of atelectasis. Pediatrics 80, 324--330 (1962). Buckingham, S., Heinemann, O. H., Sommers, S. C., McNary, W. F.: Phospholipid Synthesis

in large pulmonary alveolar cell. Amer. J. Path. 48, 1027--1042 (1966). Klaus, M. H., Clements, J. A., Havel, R. J, : Composition of surface-active material isolated

from beef lung. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.) 47, 1858--1859 (1961). Mendenhall, R. M., Mendenhall, A. L.: Lung alveolar surfactan~, hmg eIasticity and lung

stability. Nature 21, 747--749 (1964). Noack, W.: Das elektronenmikroskopische Bild des Lungenepithels yon Rattenembryonen

yore Tag 16 his zur Geburt. Acta anat. (Basel) 1970 (ira Druek). -- Schwarz, W. : E]ektronenmikroskoplsche Untersuchungen fiber die Entwicklung der Lunge

bei Ratten (16. Tag a.p. -- 10. Tag p. p.). Z. Anat. Entw.-Gesch. Im Druck. -- Zimmermann, B., Mcrker, H. J. : Elektronenmikroskopische Untersuchungen an embryo-

nalen Rattenlungen (Tag 15) in dcr Gewcbekultur. Z. Anat. Entwickl.-Gesch. 182~ 325-- 338 (1970)

Pattle, R. E. : Surface tension and the lining of the lung alveoli. In: Advances in respiratory physiology, hrsg. yon C. G. Caro, S. 83--105. London: Edward Arnold Ltd., 1966.

-- Thomas, L. C. : Lypoprotein composition of the film lining of the lung. Nature (Lond.) 844, 1189 (1961).

Scarpelli, E. M.: Lung surfactant: Dynamic properties, metabolic pathways and possible significance in the pathogenesis of the respiratory distress syndrome. Bull. N. Y. Acad. Med. 44, 431--443 (1968).

Sehoedel, W., Riifer, R. : Ver~inderungen der 0berfl~ehenverh£1tnisse in den Lungenalveolen als Ursache yon Atetektasen und gesf~rter Atemmeehanik. D~sch. reed. ~/Vschr. 93, 1623--

1628 (1968). Weibel, E. 1%., Gil, J. : Electron microscopic demonstration of an extracellular duplex lining

layer of alveoli. Resp. Physiol. 4, 42--57 (1968). Dr. W. Noack II. Anatomisches Institut der Freien Universit~it Berlin BRD-1000 Berlin 33, Deutschland KSnigin -Luise-Stral]e 15