TEHNICA

IMUNOENZIMATICA

CE ESTE TEHNICA IMUNOENZIMATICA?

ELISA=Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Metoda de detectare a unor molecule (proteine, carbohidrati, etc.) cu ajutorul complexelor antigen-anticorp conjugate cu o enzima

Foarte sensibila (pg/ml) Cantitativa sau calitativa Utilizeaza anticorpi monoclonali si enzime

PRODUCEREA ANTICORPILOR MONOCLONALI

Plasmocite producatoare de Ac

Antigen

Fuzionarea celulelor HIBRIDOM Mielom

Anticorpii monoclonali sunt purificati

Clonele dorite se cultiva sau se congeleaza

Testarea clonelor

Hibridoamele se separa si se cultiva

Cultivarea hibridoamelor

Mentinerea hibridoamelor in soareci

ENZIMELE

Enzime=catalizatori biochimici, compusi care maresc viteza reactiilor chimice ce se desfasoara in sistemele biologice, fara sa se consume in cursul lor

Intensitatea reactiei ~ cantitatea de enzima Enzime utilizate:

Peroxidaza Fosfataza alcalina Glucozoxidaza G6PH

ENZIMELE

Substraturi: substante cromogene, care formeaza produsi de reactie colorati (cromofore)

Enzima + substrat cromofor citire la spectrofotometru

PROBE BIOLOGICE

Ser Plasma Urina Scaun Lichid sinovial LCR Lichid de lavaj bronsic

PLACA PENTRU ELISA

96 godeuri Plastic pe care adera usor proteinele

TIPURI DE ELISA

ELISA necompetitiva “sandwich”

ELISA competititiva

ELISA indirecta (dozarea Ac)

ELISA “SANDWICH”

Ag trebuie sa prezinte ≥2 epitopi (identici sau diferiti)

Ac primar (Ac1): Imobilizat in faza solida in godeurile placii Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2): Marcat enzimatic

ELISA “SANDWICH”

1. Se pipeteaza proba (cu Ag) in godeurile cu Ac1 fixat

2. Se incubeaza complexe Ag-Ac1

3. Se spala excesul de Ag (Ag liber)4. Se pipeteaza Ac2 (marcat enzimatic)5. Se incubeaza complexe Ac1-Ag-Ac2

6. Se spala excesul de Ac2 (Ac2 liber)7. Se adauga substratul colorarea mediului

de reactie ~ cantitatea de Ag din proba8. Se citeste la spectrofotometru

ELISA “SANDWICH”

ELISA COMPETITIVA

Ac primar (Ac1): Specific pentru Ag de determinat Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2): Specific pentru Fc al Ac1 Marcat enzimatic

ELISA COMPETITIVA

1. Se amesteca proba (cu Ag) cu o cantitate cunoscuta de Ac1, in solutie

2. Se pipeteaza amestecul in godeurile cu Ag fixat

3. 2 situatii: Exces de Ag Exces de Ac1

ELISA COMPETITIVA

Exces de Ag: Solutie (cu Ag) + Ac1 Ag-Ac1 + Ag libere Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)

nu se formeaza complexe Ag-Ac1 fixe Se spala Ag-Ac1 libere si Ag libere Se pipeteaza Ac2 in godeuri nu se formeaza

complexe Ag-Ac1 - Ac2 fixe Se spala Ac2 liber (tot Ac2, de fapt) Se adauga substratul nu apare nicio reactie

incolor

ELISA COMPETITIVA

Exces de Ac1 : Solutie (cu Ag) + Ac1 Ag-Ac1 + Ac1 liberi Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)

complexe Ag-Ac1 fixe Se spala Ag-Ac1 libere Se pipeteaza Ac2 in godeuri complexe Ag-

Ac1-Ac2 fixe Se spala Ac2 liber Se adauga substratul colorarea mediului de

reactie i.p. cantitatea de Ag din proba Se citeste la spectrofotometru

ELISA COMPETITIVA

ELISA INDIRECTA

Dozarea Ac Ag fixat in godeuri, specific Ac de determinat Ac primar (Ac1):

=Ac de determinat Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2): Specific pentru Fc al Ac1 Marcat enzimatic

ELISA INDIRECTA

Se pipeteaza proba (cu Ac1) in godeurile cu Ag fixat

Se incubeaza complexe Ag-Ac1 fixe Se spala Ac1 liber Se pipeteaza Ac2 Se incubeaza complexe Ag-Ac1-Ac2 fixe Se spala Ac2 liber Se adauga substratul colorarea mediului de

reactie ~ cantitatea de Ac1 din proba Se citeste la spectrofotometru

ELISA INDIRECTA

ELISA

AVANTAJE

Sensibila Reproductibila Cantitati mici de reactivi (ieftina) Determina si Ag, si Ac Automata (rapida) Noniradianta

APLICATII

Hormoni Markeri tumorali Droguri, medicamente Citokine Ag virale (HIV!), bacteriene, parazitare Ac (HIV!)

TEST HIV

TEST DE SARCINA